WO2021020474A1 - 吸着剤を用いた抗体の精製方法 - Google Patents

吸着剤を用いた抗体の精製方法 Download PDF

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WO2021020474A1
WO2021020474A1 PCT/JP2020/029150 JP2020029150W WO2021020474A1 WO 2021020474 A1 WO2021020474 A1 WO 2021020474A1 JP 2020029150 W JP2020029150 W JP 2020029150W WO 2021020474 A1 WO2021020474 A1 WO 2021020474A1
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WO
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antibody
purification method
zeolite
silicon dioxide
inorganic compound
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PCT/JP2020/029150
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French (fr)
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康成 江島
石原　尚
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協和キリン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying an antibody and a method for producing an antibody including the purification method.
  • Such proteins are generally produced by culturing recombinant cells into which a vector containing a gene encoding the protein of interest is inserted.
  • the culture solution contains impurities such as a wide variety of medium-derived components, host cell-derived components, and protein-derived by-products, so that the impurities reach the purity required for pharmaceuticals. It is very difficult and challenging to achieve both separation and purification of the protein of interest and production of the protein of interest in large quantities and efficiently.
  • the protein purification method is generally performed by a combination of different modes of chromatography. Chromatography separates the protein of interest from impurities, for example, based on differences in molecular charge, hydrophilicity, size, etc.
  • the purification processes include a capture step using protein A and a subsequent polishing step.
  • the polishing step is an antibody-derived by-product such as a host cell-derived component or an antibody-derived polymer (High Molecular Weight Light Species; hereinafter also referred to as HMWS) contained in the purification intermediate after the capture step, and leaked protein A. It is performed for the purpose of removing impurities such as.
  • HMWS High Molecular Weight Light Species
  • HMWS High Molecular Weight Light Species
  • the non-adsorption mode can be purified with a higher load amount than the adsorption / desorption mode, and is easy to operate (Non-Patent Document 1).
  • AEX and HIC are performed in a non-adsorption mode.
  • purification of the antibody by CEX is performed in an adsorption / desorption manner.
  • Patent Document 1 there is known a method of performing CEX in a non-adsorption mode by controlling pH and conductivity (Patent Document 1).
  • HMWS is removed by CEX or HIC.
  • Host cell-derived impurities are removed by AEX, HIC or CEX. (Non-Patent Document 1).
  • Activated clay and aluminum silicate are inorganic compounds in which aluminum oxide and silicon dioxide are bonded in arbitrary proportions. These are porous and have excellent adsorption properties, and are mainly used as inexpensive materials derived from natural products for removing pigments of vegetable oils, dehydrating industrial products, and adsorbing dioxins in incinerators. Zeolites are a general term for crystalline aluminosilicates, and are characterized by having a uniform pore diameter and having cation exchange properties.
  • Zeolites have the property of adsorbing biopolymers such as proteins, so their use as a chromatography carrier is being studied. It is known that the pH of a sample containing a biopolymer to be adsorbed affects the adsorption, and the adsorption is maximized near the isoelectric point (pI) of the biopolymer (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 The silicon / aluminum ratio (Si / Al 2 ratio) and three-dimensional structure of zeolite differ depending on the manufacturing method, and as a result, properties such as hydrophobicity and ion exchange are also different. It is known that the biopolymers that can be adsorbed differ depending on the zeolite (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Documents 3 and 4 a method of purifying IgG from a mixed sample of two types of proteins using zeolite A or zeolite X is known (Non-Patent Documents 3 and 4). These are methods in which an antibody is adsorbed on zeolite to remove impurities, and then the antibody is eluted.
  • An object of the present invention is to provide an antibody or the like produced by the production method.
  • the present inventor surprisingly separated antibodies and impurities in a non-adsorption mode using an inexpensive inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide. , A method for purifying an antibody was found, and the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following [1] to [22].
  • a purification method for an antibody wherein an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide is used to separate the antibody and impurities in a non-adsorption mode to obtain an antibody having a reduced impurity content.
  • the purification method according to [1], wherein the antibody is a recombinant antibody.
  • the purification method according to [1] or [2], wherein the impurity is at least one selected from a host cell protein, an antibody-derived polymer, an antibody-derived degradation product, and DNA.
  • the silica / alumina ratio is 1-5.
  • Aluminum silicate is Galeon Neutral D2-Y (Mizusawa Industrial Chemicals, Inc., Galleon is a registered trademark) or Neobead SA (Mizusawa Industrial Chemicals, Inc., Neobead is a registered trademark), in [6] or [7].
  • the purification method described. [9] The purification method according to any one of [1] to [5], wherein the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide is activated clay. [10] The purification method according to [9], wherein the activated clay has at least one property selected from the following (i) to (iv).
  • the specific surface area is 100 to 400 m 2 / g.
  • the pore volume is 0.2 to 0.6 mL / g.
  • the average pore diameter is 3 to 10 nm.
  • the silica / alumina ratio is 6-10.
  • a method for producing an antibody at a lower cost than the prior art a method for purifying an antibody in a non-adsorption mode using an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide, and a method for producing an antibody including the purification method. , And an antibody produced by the production method.
  • FIG. 1 shows the HMWS adsorption rate after treating the culture supernatant of MabA with various zeolites.
  • the vertical axis shows the HMWS adsorption rate (%).
  • the white, gray and black graphs show the results when 124 mg, 248 mg and 496 mg of zeolite were added, respectively.
  • FIG. 2 shows the recovery rate after treating the culture supernatant of MabA with various zeolites.
  • the vertical axis shows the recovery rate (%).
  • the white, gray and black graphs show the results when 124 mg, 248 mg and 496 mg of zeolite were added, respectively.
  • FIG. 3 (A) and 3 (B) show elution patterns of MabA culture supernatants analyzed by size exclusion chromatography before and after zeolite (HSZ-660HOA) (Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark) treatment.
  • FIG. 3A shows an elution pattern before treatment with an adsorbent
  • FIG. 3B shows an elution pattern after treatment with an adsorbent.
  • FIGS. 4 (A) and 4 (B) show elution patterns of crude MabD samples analyzed by size exclusion chromatography before and after treatment with zeolite (HSZ-660HOA) (Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark). Shown.
  • FIG. 4A shows an elution pattern before treatment with an adsorbent
  • FIG. 4B shows an elution pattern after treatment with an adsorbent.
  • the present invention relates to a purification method for an antibody, which uses an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide to separate the antibody and impurities in a non-adsorption mode to obtain an antibody having a reduced impurity content.
  • the antibody examples include mouse antibody, llama antibody, chimeric antibody, humanized antibody, human antibody, and antibody obtained by modifying the Fc region thereof.
  • the molecular form of the antibody e.g., IgG, IgM, IgA, IgD , IgE, Fab, Fc, Fc- fusion protein, VH, VL, VHH, Fab '2, scFv, scFab, etc. scDb or scDbFc the like.
  • the purification method of the present invention is provided with an antibody-containing aqueous solution containing the target antibody and impurities.
  • the antibody-containing aqueous solution for example, a composition obtained from a living body such as plasma, serum, milk or urine, cells producing an antibody obtained by using gene recombination technology or cell fusion technology, or a culture of bacteria such as Escherichia coli.
  • a composition obtained from a living body such as plasma, serum, milk or urine, cells producing an antibody obtained by using gene recombination technology or cell fusion technology, or a culture of bacteria such as Escherichia coli.
  • examples thereof include compositions obtained from sap, transgenic non-human animals, plants, insects, etc., or compositions obtained using cell-free protein synthesis technology.
  • Examples of cells that produce an antibody include transformed cells in which a gene encoding a desired antibody is incorporated into a host cell.
  • host cells examples include cell lines such as animal cells, plant cells, and yeast cells.
  • CHO cells Chinese hamster ovary cells
  • mouse myeloma cells NS0 cells mouse myeloma cells NS0 cells
  • SP2 / 0 cells rat myeloma cells YB2 / 0 cells
  • IR983F cells Syrian hamster kidney-derived cells BHK.
  • namalva cells which are human myeloma cells, embryonic stem cells, fertilized egg cells and the like.
  • any medium suitable for culturing each cell is used.
  • the medium for culturing the animal cells it is used for culturing normal animal cells.
  • a medium is used.
  • any medium such as a serum-containing medium, a medium containing no animal-derived components such as serum albumin or a serum fraction, a serum-free medium, or a protein-free medium is used, but a serum-free medium or a protein-free medium is preferable. Is used.
  • RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], Dalveco modified MEM (DMEM) medium [Viro]. , 8,396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Virological Medicine, 73,1 (1950)], F12 medium [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53,288 (1965)], Iskov modified Dulbecco medium (IMDM medium) [J.
  • EX-CELL302 medium EX-CELL-CD-CHO medium, EX-CELL 325 medium (above, SAFC Bioscience), CD-CHO medium, CD DG44 medium (above).
  • Invigen manufactured by Invitrogen
  • IS CD-CHO medium manufactured by Urban Scientific
  • RPMI1640 medium DMEM medium, F12 medium, IMDM medium, EX-CELL302 medium, CD-CHO medium, IS CD-CHO medium and the like are preferable.
  • physiologically active substances or trophic factors necessary for the growth of cells producing antibodies can be added as needed.
  • These additives may be contained in the medium in advance before culturing, or may be additionally supplied to the culture solution as an additional medium or solution during culturing.
  • the method of additional supply may be in any form such as one solution or a mixed solution of two or more kinds, and the method of addition may be continuous or intermittent.
  • transgenic non-human animals, plants or insects that produce antibodies include non-human animals, plants or insects in which a gene encoding an antibody is incorporated into cells.
  • Non-human animals include, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, dogs, sheep, pigs, goats, cows or monkeys.
  • Plants include, for example, tobacco, potatoes, tomatoes, carrots, soybeans, rape, alfalfa, rice, wheat, barley or corn.
  • Examples of the method for producing the antibody-containing aqueous solution include the methods described in International Publication No. 2007/062245 or International Publication No. 2007/114496.
  • examples of the antibody-containing aqueous solution include those obtained from living organisms such as plasma or urine containing the antibody, and antibody-containing aqueous solutions obtained in the purification step. Specific examples thereof include a cell removal solution, a precipitate removal solution, an alcohol fractionation solution, a salting out fractionation solution, a chromatography eluate, and the like.
  • an antibody-containing aqueous solution obtained from a living body such as plasma, serum, milk or urine, an antibody-containing aqueous solution obtained from a transgenic non-human animal, plant or insect, and a gene recombination technique were established.
  • examples thereof include an antibody-containing aqueous solution obtained from cells or a solution obtained by removing cells from an antibody-containing aqueous solution obtained in the purification step.
  • a method of centrifuging from a cell culture solution a cross-flow filtration method (tangential flow filtration method), a filtration method using a depth filter, a filtration method using a membrane filter, a dialysis method, or a method in which these methods are combined.
  • examples thereof include a solution obtained by removing cells by means of.
  • an antibody-containing aqueous solution obtained from a living body such as plasma, serum, milk or urine
  • an antibody-containing aqueous solution obtained from a transgenic non-human animal, a plant or an insect obtained from a transgenic non-human animal, a plant or an insect
  • a gene recombination technique for example, an antibody-containing aqueous solution obtained from a living body such as plasma, serum, milk or urine, an antibody-containing aqueous solution obtained from a transgenic non-human animal, a plant or an insect, and a gene recombination technique are used.
  • a solution in which a precipitate is removed after coagulation precipitation (flocuration) or biphasic separation by addition of a surfactant, a salt, an amino acid, a polymer or the like can be mentioned.
  • the method for removing the precipitate include a centrifugal separation method, a cross-flow filtration method (tangential flow filtration method), a depth filter filtration method, a membrane filter filtration method, a dialysis method, or a method combining these methods. Can be mentioned.
  • an antibody-containing aqueous solution obtained from a living body such as plasma, serum, milk or urine, an antibody-containing aqueous solution obtained from a transgenic non-human animal, a plant or an insect, and a gene recombination technique are used.
  • Examples include painting fluid. Specific examples thereof include a fractionation solution obtained by a method such as a low-temperature ethanol fractionation method.
  • an antibody-containing aqueous solution obtained from a living body such as plasma, serum, milk or urine, an antibody-containing aqueous solution obtained from a transgenic non-human animal, a plant or an insect, and a gene recombination technique are used.
  • the antibody-containing aqueous solution obtained from the cells established in the above the antibody-containing aqueous solution obtained by using the cell-free protein synthesis technique, or the antibody-containing aqueous solution obtained in the purification step, ammonium sulfate, sodium sulfate, sodium citrate, chloride.
  • a fractionation solution prepared by adding a salt such as sodium or potassium chloride and precipitating an antibody are examples of a fractionation solution prepared by adding a salt such as sodium or potassium chloride and precipitating an antibody.
  • an antibody-containing aqueous solution obtained from a living body such as plasma, serum, milk or urine, an antibody-containing aqueous solution obtained from a transgenic non-human animal, a plant or an insect, and a gene recombination technique are used.
  • the antibody-containing aqueous solution obtained from the established cells, the antibody-containing aqueous solution obtained by using the cell-free protein synthesis technique, or the antibody-containing aqueous solution obtained in the purification step is adsorbed on a carrier or membrane used for chromatography. Examples thereof include an antibody eluate obtained by eluting with an appropriate eluate or passing through a column or membrane containing a carrier or the like in a non-adsorption mode.
  • Examples of the carrier or membrane used for chromatography include an affinity carrier, an ion exchange carrier, an ion exchange membrane, a gel filtration carrier, a hydrophobic interaction carrier, a reverse phase carrier, a hydroxyapatite carrier, a fluoroapatite carrier, and a sulfated cellulose carrier. , Sulfated agarose carrier, mixed mode (multimodal) carrier, activated charcoal and the like.
  • a molecule having an ion exchange group for example, a sulfate group, a methyl sulfate group, a sulfophenyl group, a sulfopropyl group, a carboxymethyl group, a quaternary ammonium group, or a quaternary aminoethyl group.
  • a diethylaminoethyl group or the like can be used as a base carrier or membrane, for example, a polymer such as cellulose, cepharose, agarose, chitosan, acrylic acid polymer or styrene-divinylbenzene copolymer and a derivative thereof (including crosslinked polymer), silica particles, etc.
  • Q Sepharose XL, Q Sepharose FF, DEAE Sepharose FF, ANX Sepharose FF, Capto Q, Capto DEAE or Capto Q ImpRes (above, GE Healthcare, Capto is a registered trademark)
  • TO -650 or TOYOPEARL SuperQ-650 (above, Tosoh, TOYOPEARL is a registered trademark)
  • Fractogel DEAE, Fractogel TMAE, Fractogel TMAE Hicap or Eshmuno Q aboveve, Merck Millipore), Cell ), Mustang Q (manufactured by Paul), Sartobind Q, Sartobind STIC (manufactured by Sartorius), SP Sepharose FF, CM Sepharose FF, SP Sepharose XL or Capto S (manufactured by GE Healthcare), Por Or Poros 50 XS (above, manufactured by Applied Biosystems), Eshmuno S, Fractogel COO-, Fractogel
  • the affinity carrier examples include a carrier in which a molecule having an affinity for the target antibody, for example, protein A, protein G, protein L, or the like is directly or indirectly bound to the same base carrier as described above.
  • a carrier in which a molecule having an affinity for the target antibody for example, protein A, protein G, protein L, or the like is directly or indirectly bound to the same base carrier as described above.
  • MabSelect, Protein A Sepharose FF, MabSelect Xtra, MabSelect SuRe, MabSelect SuRe LX Protein G Sepharose FF or Capto L (above, GE Healthcare FF or Capto L (above, GE Healthcare)
  • Examples include, but are not limited to, Protein vA Ultra, Protein Ultraplus (above, manufactured by Merck Millipore, Protein is a registered trademark) and the like.
  • the gel filtration carrier examples include a carrier made of a polymer composed of dextran, allyl dextran, N, N'-methylenebisacrylamide, cellulose, agarose, styrene, divinylbenzene, polyvinyl alcohol, silica, chitosan and the like.
  • a carrier made of a polymer composed of dextran, allyl dextran, N, N'-methylenebisacrylamide, cellulose, agarose, styrene, divinylbenzene, polyvinyl alcohol, silica, chitosan and the like Specifically, for example, Sephacryl (registered trademark) S series, Sepharose (registered trademark) series, Sephadex (registered trademark) series, Superdex (registered trademark) series or Sephacryl (registered trademark) series (all manufactured by GE Healthcare).
  • hydrophobic interaction carrier a molecule having hydrophobicity, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, a tert-butyl group, an octyl group, an ether group, a phenyl group and the like can be used as described above.
  • examples thereof include carriers directly or indirectly bound to the base carrier of.
  • Phenyl Sepharose 6 Fast Flow high-sub
  • Phenyl Sepharose 6 Fast Flow low-sub
  • Octyl Sepharose 4 Phenyl Group 4 Fast Flow or Butyl, Ltd.
  • Phenyl Group Phenyl Group, Phenyl Group, Phenyl Group, Phenyl Group, Phenyl Group, Phenyl Group, Phenyl Group, Phenyl Group, Phenyl Group, Phenyl Group, Phenyl Group, Phenyl Group.
  • Examples of the reversed-phase carrier include a carrier in which a hydrocarbon group is directly or indirectly bonded to a solid phase matrix.
  • Examples of the hydrocarbon group include a trimethyl group, a butyl group, a phenyl group, an octyl group or an octadecyl group, and a functional group having a modified terminal thereof. Specific examples thereof include, but are not limited to, the RESOURCE RPC series or the SOURCE RPC series (above, GE Healthcare, RESOURCE is a registered trademark).
  • hydroxyapatite carrier examples include, but are not limited to, CHT Ceramic Hydroxyapatite Type I or Type II (all manufactured by Bio-Rad).
  • fluoroapatite carrier examples include, but are not limited to, CFT Ceramic Fluorapatite (manufactured by Bio-Rad).
  • two or more kinds of functional groups having different selectivity are directly or indirectly applied to the base carrier similar to the above.
  • Examples include carriers bound to. Specifically, for example, Capto adhere or Capto MMC (above, GE Healthcare), HEA HyperCel, PPA HyperCel or MEP HyperCel (above, Paul) or TOYOPEARL MX-Trp-650M (Tosoh, TOYOPE). Is a registered trademark), but is not limited to these.
  • activated charcoal examples include carborafine, strong egret, refined egret, special egret, egret A, egret C, egret C-1, egret DO-2, egret DO-5, egret DO-11, egret DC, egret DO, Shirasagi Gx, Shirasagi G, Shirasagi GH, Shirasagi FAC-10, Shirasagi M, Shirasagi P, Shirasagi PHC, Shirasagi Gc, Shirasagi GH, Shirasagi GM, Shirasagi GS, Shirasagi GT, Shirasagi GAA, Shirasagi AP, Shirasagi GG Shirasagi TAC, Shirasagi MAC, Shirasagi XRC, Shirasagi NCC, Shirasagi SRPX, Shirasagi Wc, Shirasagi LGK,
  • the antibody-containing aqueous solution may be subjected to the purification method of the present invention after removing insoluble substances such as particles in advance and removing the insoluble substances.
  • a method for removing insoluble matter such as particles for example, a centrifugation method, a cross-flow filtration method (tangential flow filtration method), a filtration method using a depth filter, a filtration method using a membrane filter, a dialysis method, or a combination of these methods is used. There are several methods. Further, after adjusting the pH, conductivity, buffer solution or antibody concentration of the antibody-containing aqueous solution described later, or the antibody loading amount per unit volume or unit weight of the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide, as necessary. It is used in the purification method of the present invention.
  • an ultrafiltration membrane As a method for adjusting the pH, conductivity, buffer or antibody concentration, or the antibody loading amount per unit volume or unit weight of the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide, for example, an ultrafiltration membrane was used. Ultrafiltration method and the like can be mentioned.
  • the ultrafiltration membrane includes not only a normal ultrafiltration membrane but also an ultrafiltration membrane to which a positive or negative charge is added.
  • an ultrafiltration membrane to which a positive or negative charge is added.
  • Pelicon 3 Ultracell Membrane Pelicon 3 Biomax Membrane, Pelicon 2 Ultracell Membrane or Pelicon 2 Biomax Membrane (all manufactured by Merck Millipore), Omega Membrane (manufactured by Paul) or Kvick Membrane (manufactured by Merck Millipore). GE Healthcare), etc., but not limited to these.
  • the impurities include host cell protein (HCP), antibody-derived polymer (HMWS), antibody-derived degradation products, denaturation, removal of sugar chain components, oxidation or deamidination, and other antibody-derived modifications.
  • HCP host cell protein
  • HMWS antibody-derived polymer
  • antibody-derived degradation products denaturation, removal of sugar chain components, oxidation or deamidination, and other antibody-derived modifications.
  • body DNA, media-derived components, culture additives, enzymes eluted from host cells or protein A mixed in the capture step, preferably host cell proteins, antibody-derived polymers, antibody-derived degradation products or DNA is mentioned.
  • the antibody-derived polymer includes any polymer in which a plurality of antibody molecules are associated or aggregated, but a soluble polymer is preferable. Specific examples include, but are not limited to, dimers, trimers, tetramers, or polymers in which five or more antibody molecules are associated or aggregated.
  • examples of antibody-derived degradation products include those in which the disulfide bond or peptide bond of the antibody is cleaved. Specifically, a part or all of the heavy chain or the light chain of the monoclonal antibody is shed, but the present invention is not limited thereto. Further, a Fab fragment, a Fab fragment in which the heavy chain and the light chain are further cleaved, and the like are also included.
  • Examples of the enzymes eluted from the host cell include glycolytic enzymes, protein hydrolases, oxidoreductases and the like.
  • glycolytic enzyme examples include neuraminidase (sialidase), galactosidase, glycanase and the like.
  • proteolytic enzyme examples include serine protease, esterase, cysteine protease, trypsin-like protease, aminopeptidase, aspartic protease, and catepsin.
  • oxidoreductase examples include thioredoxin-related enzymes such as thioredoxin reductase.
  • amino acid isomerase examples include transglutaminase and the like.
  • any inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide suitable for the production of pharmaceuticals can be used, and one type of silicon dioxide and aluminum oxide can be used.
  • the inorganic compound containing aluminum oxide may be used alone, or the inorganic compound containing two or more types of silicon dioxide and aluminum oxide may be mixed or not mixed.
  • inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide examples include zeolite, activated clay, aluminum silicate, acidic clay, kaolin or bentonite, preferably zeolite, activated clay or aluminum silicate, and particularly preferably. Zeolites or aluminum silicates are mentioned, most preferably zeolites.
  • Zeolites used in the present invention include zeolites of any structure, and examples thereof include A-type, ⁇ -type, ZSM-5-type, ferrierite-type, mordenite-type, L-type, and Y-type zeolites.
  • zeolite used in the present invention a mordenite type or ⁇ type zeolite is preferable, and a mordenite type zeolite is more preferable.
  • the zeolite used in the present invention contains a template or counter cation in the crystal structure.
  • the template is also referred to as a structure defining agent.
  • the counter cation includes any positively charged atom or atomic group, and examples thereof include a proton, an ammonium ion, a sodium ion, and a potassium ion. Proton is preferable as the counter cation contained in the zeolite used in the present invention.
  • the specific surface area of the zeolite used in the present invention is preferably 100 to 800 m 2 / g, more preferably 150 to 700 m 2 / g, and even more preferably 350 to 600 m 2 / g. Most preferably, it is 350 to 500 m 2 / g.
  • the pore diameter of the zeolite used in the present invention is preferably 0.2 to 1 nm, more preferably 0.5 to 0.8 nm, and even more preferably 0.6 to 0.75 nm. , 0.65 to 0.75 nm, most preferably.
  • the silica / alumina ratio of the zeolite used in the present invention is preferably 2 to 1500, more preferably 10 to 1500, and even more preferably 15 to 300.
  • zeolite used in the present invention examples include Zeolam A-3, Zeolam A-4, Zeolam A-5, Zeolam F-9, Zeolam NSA-700, HSZ-920NHA, HSZ-930NHA, HSZ-.
  • the specific surface area of the activated clay used in the present invention is preferably 100 to 400 m 2 / g, more preferably 200 to 350 m 2 / g, and even more preferably 240 to 310 m 2 / g. ..
  • the pore volume of the active clay used in the present invention is preferably 0.2 to 0.6 mL / g, more preferably 0.3 to 0.5 mL / g.
  • the average pore diameter of the active clay used in the present invention is preferably 3 to 10 nm, more preferably 5 to 7 nm.
  • the silica / alumina ratio of the active clay used in the present invention is preferably 6 to 10.
  • jars used in the present invention include galleon earth NVZ, galleon earth NV, galleon earth V2R or galleon earth V2 (above, Mizusawa Industrial Chemicals Co., Ltd., galleon and galleon earth are registered trademarks).
  • examples include, but are not limited to, jar SA35, jar SA1 or jar R-15 (above, Toshin Kasei Co., Ltd.) or ACTAL20X, ACTAL20 or ACTAL10 (above, Nikki Universal Co., Ltd.).
  • the specific surface area of aluminum silicate used in the present invention is preferably 300 to 800 m 2 / g, and more preferably 500 to 600 m 2 / g.
  • the pore volume of aluminum silicate used in the present invention is preferably 0.1 to 0.5 mL / g, more preferably 0.25 to 0.4 mL / g.
  • the average pore diameter of aluminum silicate used in the present invention is preferably 1.5 to 4 nm, more preferably 2 to 3 nm.
  • the silica / alumina ratio of aluminum silicate used in the present invention is preferably 1 to 5, more preferably 3.5 to 4.5.
  • aluminum silicate used in the present invention include, but are limited to, galleon-neutral D2-Y or neo-bead SA (above, Mizusawa Industrial Chemicals, Inc., galleon and neo-bead are registered trademarks). Not done.
  • the acidic clay used in the present invention include Mizuka Ace # 20, Mizuka Ace # 200, Mizuka Ace # 600, and Mizulite (above, Mizusawa Industrial Chemicals Co., Ltd. and Mizuka Ace are registered trademarks). Not limited to.
  • kaolin used in the present invention examples include Hydrite TS90, Hydrite UF90 or Kaopaque 10 (Hayashi Kasei Co., Ltd.) or RC-1 or Glomax LL (Takehara Chemical Industry Co., Ltd.). However, it is not limited to these.
  • bentonite used in the present invention include Kunipia-F, Kunipia-G, Moistonite-U, Moistonite-S or Moistnite-HC (Kunimine Industries, Ltd., Kunipia and Moistonite). (Registered trademark), etc., but not limited to these.
  • the means of the purification method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a batch method, a membrane treatment method, a column chromatography method, and the like, and silicon dioxide of an appropriate type and / or shape according to each means. And inorganic compounds including aluminum oxide are selected. If necessary, the form of particles in which an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide is enclosed in a porous polymer or gel, or an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide using a support agent such as polypropylene or cellulose or a fiber or the like. It can also be used in the form of a film or a cartridge in which powder is sandwiched between films that have been adsorbed, fixed or molded.
  • the crystal structure, specific surface area, pore diameter, silica / alumina ratio and / or pH of the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide to be used can be appropriately selected by the target antibody and the means of the purification method.
  • the purification method of the present invention is carried out in a non-adsorption mode.
  • the non-adsorption mode is to bring an antibody-containing aqueous solution into contact with an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide, and recover the non-adsorbed fraction without adsorbing the target antibody on the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide.
  • impurities can be removed from silicon dioxide and aluminum oxide without adsorbing the target antibody to the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide. It is possible to recover an antibody in which the impurity content is reduced in the non-adsorbed fraction by adsorbing it on the containing inorganic compound.
  • a purification method including equilibration of an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide with a buffer solution can be mentioned. Equilibration is performed by contacting a buffer adjusted to the appropriate pH and concentration with an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide. For example, a method of passing an appropriate amount of a buffer solution through an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide, or a method of mixing the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide with the buffer solution for an appropriate time can be mentioned. Whether or not it is equilibrated can be confirmed by measuring the pH of the buffer solution after contact with the inorganic compound.
  • the pH of the buffer solution after contact with the inorganic compound is ⁇ 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0 before contact.
  • it is .8, 0.9 or 1
  • the inorganic compounds containing silicon dioxide and aluminum are equilibrated.
  • the pH of the antibody-containing aqueous solution to be contacted with the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide, or the buffer solution used for equilibrating the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide is preferably 4 to 9, more preferably. It is 5 to 9, particularly preferably 6 to 9, and even more preferably 7.5 to 8.5.
  • salts constituting the above-mentioned antibody-containing aqueous solution or buffer solution used for equilibrium for example, phosphate, citrate, acetate, succinate, maleate, borate, Tris (base). , HEPES, MES, PIPES, MOPS, TES, Tricine and the like. These concentrations are preferably 0.01 mol / L to 0.5 mol / L.
  • the above salt is, for example, 0.01 mol / L to 0.5 mol / L, preferably 0.01 mol / L to 0.5 mol / L sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium citrate, sodium sulfate, and the like. It can also be used in combination with other salts such as ammonium sulfate.
  • the buffer solution component may be used in combination with, for example, amino acids such as glycine, alanine, arginine, serine, threonine, glutamic acid, aspartic acid or histidine, sugars such as glucose, sucrose, lactose and sialic acid or derivatives thereof. You can also do it.
  • the temperature of the antibody-containing aqueous solution to be contacted with the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide or the buffer solution used for equilibrating the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide is preferably 4 ° C. to 60 ° C., more preferably 10. ° C to 50 ° C, particularly preferably 20 ° C to 40 ° C.
  • an antibody having a reduced impurity content can be obtained with a high recovery rate.
  • the impurity content the content of the polymer derived from the antibody can be preferably 5% or less, more preferably 2% or less, and particularly preferably 1% or less. Whether or not the impurity content has decreased can be confirmed by, for example, calculating the ratio of impurities adsorbed on the inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide (impurity adsorption rate).
  • the HMDS adsorption rate is 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 70% or more, 80% or more or 90% or more. It is preferable that there is.
  • the recovery rate can be preferably 35% or more, more preferably 45% or more, still more preferably 60% or more.
  • the analytical method usually used in antibody purification can be applied to the measurement of the contents of antibodies and impurities.
  • the content of the antibody is the absorbance or the affinity HPLC method such as protein A
  • the content of the host cell protein is the ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method, the Western blotting method, the electrochemical luminescence method, etc.
  • the content of antibody-derived degradation products is determined by gel filtration HPLC, ion exchange HPLC, polyacrylamide gel electrophoresis, light scattering or ultracentrifugation, etc., and DNA is analyzed by picogreen method, Thrshold method, QPCR method, etc. Each can be measured.
  • the present invention also relates to a method for producing an antibody, which comprises a purification method for separating an antibody and an impurity using an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide to obtain an antibody having a reduced impurity content.
  • the purification method using an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide can be combined with other purification methods.
  • a purification method to be combined with a purification method using an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide any method suitable for the production of pharmaceuticals can be used, and examples thereof include chromatography, alcohol fractionation, and precipitation removal. Examples thereof include salting out, buffer exchange, concentration, dilution, filtration, virus inactivation, and virus removal.
  • the purification method to be combined with the purification method using an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide may be a combination of a plurality of types and numbers.
  • these purification methods can be carried out before and after the purification method using an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide.
  • Examples of the carrier or membrane used for chromatography combined with the purification method using an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide include an affinity carrier, an ion exchange carrier, an ion exchange membrane, a gel filtration carrier, and a hydrophobic interaction similar to those described above. Examples thereof include carriers, reversed-phase carriers, hydroxyapatite carriers, fluoroapatite carriers, sulfated cellulose carriers, sulfated agarose carriers, mixed mode carriers and the like.
  • Chromatography combined with a purification method using an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide is performed in an adsorption mode or a non-adsorption mode depending on the purpose.
  • Chromatography includes, for example, protein A chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, mixed mode chromatography and activated charcoal chromatography.
  • the adsorption mode in the chromatography means that the aqueous solution to be subjected to the chromatography is brought into contact with the carrier or the membrane, the target antibody is adsorbed on the carrier or the membrane, and then washed if necessary, and then washed. It means that the adsorbed fraction is recovered by eluting with a buffer solution in which the pH, conductivity, buffer solution component, salt concentration, additives, etc. are changed.
  • the non-adsorption mode in the chromatography means that the aqueous solution to be subjected to the chromatography is brought into contact with the carrier or the membrane, and the non-adsorption fraction is recovered without adsorbing the target antibody on the carrier or the membrane. To do.
  • Examples of the method for producing an antibody of the present invention include a method for producing an antibody (All negative chromatography) in which all chromatography combined with a purification method using an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide is performed in a non-adsorption mode. Be done.
  • the aqueous solution used for chromatography combined with the purification method using an inorganic compound containing silicon dioxide and aluminum oxide or the buffer solution used for washing is suitable for pH, conductivity, buffer solution component, salt concentration, additives, etc., respectively. Select the conditions.
  • the difference in physicochemical properties between the target antibody and the compound to be separated for example, the difference in isoelectric point, charge, hydrophobicity, molecular size or three-dimensional structure.
  • the elution method of the adsorption mode a one-step elution method in which a buffer solution having a specific salt concentration or pH that reduces the affinity between the target antibody and the carrier is passed to elute, or a stepwise salt concentration or pH is used.
  • the stepwise method for eluting the target antibody by changing the pH or the gradient method for eluting the target antibody by continuously changing the salt concentration or pH can be mentioned.
  • the salts constituting the buffer solution include phosphate, citrate, acetate, succinate, maleate, borate, Tris (base), HEPES, MES, PIPES, MOPS, TES or Tricine. And so on.
  • the above salts can also be used in combination with other salts such as, for example, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium citrate, sodium sulphate or ammonium sulphate.
  • the buffer solution component may be used in combination with, for example, amino acids such as glycine, alanine, arginine, serine, threonine, glutamic acid, aspartic acid or histidine, sugars such as glucose, sucrose, lactose and sialic acid or derivatives thereof. You can also do it.
  • an antibody having a reduced impurity content can be obtained with a high recovery rate.
  • the impurity content the content of the polymer derived from the antibody can be preferably 5% or less, more preferably 2% or less, and particularly preferably 1% or less.
  • the recovery rate can be preferably 35% or more, more preferably 45% or more, still more preferably 60% or more.
  • Example 1 Examination of adsorption effect of antibody polymer from culture supernatant of active clay and aluminum silicate A CHO cell culture solution containing IgG-type human monoclonal antibody (MabA) was clarified by precision filtration, and citric acid and aluminum silicate were clarified. A culture supernatant adjusted to pH 7.0 was prepared using trishydroxymethylaminomethane. The antibody concentration of the prepared culture supernatant was 4.63 mg / mL.
  • the concentration of the antibody contained in the filtrate was measured by HPLC using a Protein A affinity column, and the recovery rate was calculated.
  • the recovery rate is defined as a value calculated by the following formula.
  • the ratio of the antibody polymer (HMWS) in the filtrate was measured by size exclusion chromatography, and the HMWS adsorption rate of each adsorbent was calculated.
  • the HMWS adsorption rate is defined as a value calculated by the following formula.
  • the content of HMWS in the culture supernatant represents the ratio (%) of the peak area of HMWS to the total peak area of HPLC.
  • HMWS adsorption rate (%) ⁇ [HMWS content (%) of culture supernatant before adsorbent treatment]-[HMWS content (%) of culture supernatant after adsorbent treatment] ⁇ ⁇ [Adsorbent HMWS content (%) of culture supernatant before treatment] ⁇ 100
  • Table 1 shows the HMWS adsorption rate and recovery rate of various adsorbents.
  • Galleon Earth, Galleon and Neobead are registered trademarks.
  • the HMWS adsorption rate of both activated clay and aluminum silicate increased in proportion to the amount of each adsorbent added, and the effect of reducing the content of HMWS in the culture supernatant was observed. It was. Under the condition that 247 mg of the adsorbent was added to 4 mL of the culture supernatant, the recovery rate was 67% or more and the HMWS adsorption rate was 94% or more for all four types of activated clay.
  • the recovery rate was 98% and the HMWS adsorption rate was 76% when Galleon Neutral D2-Y (Mizusawa Industrial Chemicals, Inc., galleon is a registered trademark) was used.
  • Neobead SA Mozusawa Industrial Chemicals Co., Ltd., Neobead is a registered trademark
  • the antibody recovery rate was 100% and the HMWS adsorption rate was 45%.
  • Example 2 Examination of the correlation of the adsorption effect of HMWS from the culture supernatant with the amount of aluminum silicate (Galleon Neutral D2-Y) (Mizusawa Industrial Chemicals Co., Ltd., Galleon is a registered trademark) Among them, galleon neutral D2-Y (Mizusawa Industrial Chemicals Co., Ltd., galleon is a registered trademark), which is one of aluminum silicates and has a high antibody recovery rate and a relatively high HMWS adsorption rate, has an HMWS adsorption rate with respect to the amount added. And the correlation of recovery rate was evaluated.
  • a CHO cell culture solution containing IgG1 type human monoclonal antibody (MabA) was clarified by microfiltration, and a culture supernatant adjusted to pH 7.6 was prepared using citric acid and trishydroxymethylaminomethane.
  • the antibody concentration of the prepared culture supernatant was 6.15 mg / mL.
  • Galleon Neutral D2-Y (Mizusawa Industrial Chemicals Co., Ltd., Galleon is a registered trademark) was added to 3 mL of this solution, and the mixture was inverted and mixed for about 16 hours.
  • the adsorbent was centrifuged at 2900 xg for 10 minutes and filtered through a microfiltration membrane (Merck's Millex GV 0.22 ⁇ m, Millex is a registered trademark) to remove the adsorbent.
  • the HMWS adsorption rate and recovery rate were calculated by the method described in Example 1, and the optimum amount of adsorbent added was evaluated. The results are shown in Table 2.
  • the optimum addition amount showing a high adsorption rate while maintaining the recovery rate is 560 mg, which is 0.033 mg / mg in terms of the antibody treatment amount (mg) per unit adsorbent (1 mg). It became clear that the amount was optimal.
  • the CHO cell culture solution containing the four types of antibodies shown in Table 3 was clarified by microfiltration, and a culture supernatant adjusted to pH 6.0 was prepared using citric acid and trishydroxymethylaminomethane.
  • galleon-neutral D2-Y (Mizusawa Industrial Chemicals, Inc., galleon is a registered trademark) was added to 4 mL of each culture supernatant, and the amount of antibody processed (mg) per unit adsorbent (mg) was 0.033 mg / mg. It was added so as to be (Table 3), and mixed by inversion for about 16 hours.
  • the adsorbent was centrifuged at 2900 G for 10 minutes and filtered through a microfiltration membrane (Merck's Millex GV 0.22 ⁇ m, Millex is a registered trademark) to remove the adsorbent.
  • Example 4 Examination of adsorption effect of HMWS in culture supernatant by zeolite A CHO cell culture solution containing IgG1 type human monoclonal antibody (MabA) was clarified by precision filtration to obtain citric acid and trishydroxymethylaminomethane. A culture supernatant adjusted to pH 6.0 was prepared. The antibody concentration of the prepared culture supernatant was 4.07 mg / mL.
  • 124 types of zeolites manufactured by Tosoh Co., Ltd. shown in Table 4 were added in an amount of 124, 248 or 496 mg, respectively, and mixed by inversion for about 16 hours.
  • the admixture was centrifuged at 2900 xg for 10 minutes and filtered through a microfiltration membrane (Merck's Millex GV 0.22 ⁇ m, Millex is a registered trademark) to remove zeolite.
  • the HMWS adsorption rate and recovery rate were calculated by the method described in Example 1, and the performance of each zeolite was evaluated.
  • the HMWS adsorption rate of various zeolites is shown in FIG. 1, and the recovery rate is shown in FIG.
  • HMWS adsorption rate in proportion to the amount of zeolite added, and the effect of reducing the content of HMWS in the culture supernatant was observed. .. Further, among them, 930NHA, 960HOA, 980HOA, 990HOA, 660HOA and 690HOA showed a recovery rate of 70% or more and an HMWS adsorption rate of 50% or more when 248 mg or 496 mg of zeolite was added to 4 mL of the culture supernatant. It was clarified that it has the effect of adsorbing HMWS highly selectively from the supernatant.
  • 930NHA, 960HOA, 980HOA and 990HOA belong to beta-type zeolite, and 660HOA and 690HOA belong to mordenite-type zeolite, suggesting that zeolites having these crystal structures are suitable for selective adsorption of HMWS.
  • FIGS. 3 (A) and 3 (B) The elution patterns analyzed by size exclusion chromatography on the sample treated with 660HOA are shown in FIGS. 3 (A) and 3 (B).
  • FIG. 3A shows an elution pattern before treatment with an adsorbent
  • FIG. 3B shows an elution pattern after treatment with an adsorbent.
  • the peak area was clearly smaller after the treatment with the adsorbent, suggesting that zeolite has an adsorption effect on HMWS.
  • Example 5 Examination of adsorption effect of zeolite (HSZ-660HOA) (Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark) on HMWS from a culture supernatant of zeolite (HSZ-660HOA) (Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark) In order to evaluate the adsorption effect on HMWS derived from various antibodies, the following tests were conducted.
  • the CHO cell culture solution containing the three types of antibodies shown in Table 5 was clarified by microfiltration to prepare a culture supernatant.
  • HSZ-660HOA Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark
  • the adsorbent was centrifuged at 2900 xg for 10 minutes and filtered through a microfiltration membrane (Merck's Millex GV 0.22 ⁇ m, Millex is a registered trademark) to remove the adsorbent.
  • Example 6 Examination of adsorption effect on HMWS in crudely purified sample of zeolite (HSZ-660HOA) (Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark) Included in the crudely purified sample obtained by purifying the culture supernatant containing MabA. The adsorption effect of zeolite (HSZ-660HOA) (Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark) on the HMWS was evaluated.
  • the culture supernatant containing MabA or MabD obtained in the same manner as in Example 1 was loaded on MabSelect SuRe manufactured by GE, washed with 10 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.0), and then washed with 100 mM glycine-hydrochloric acid buffer (pH 7.0). Elution was carried out at pH 3.2), the pH was neutralized to 7.0 with trishydroxymethylaminomethane, and a crudely purified sample was prepared.
  • HSZ-660HOA Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark
  • Table 6 The amount of HSZ-660HOA (Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark) shown in Table 6 was weighed and equilibrated by the following method. Equilibration used 100 mM phosphate buffer (pH 7).
  • zeolite has an effect of adsorbing HMWS not only from the culture supernatant but also from the crude sample regardless of the type of antibody.
  • FIGS. 4 (A) and 4 (B) The elution patterns analyzed by size exclusion chromatography on the crudely purified samples containing Mab D before and after purification by 660HOA are shown in FIGS. 4 (A) and 4 (B).
  • FIG. 4A shows an elution pattern before treatment with an adsorbent
  • FIG. 4B shows an elution pattern after treatment with an adsorbent.
  • the peak area of HMWS becomes smaller after treatment with the adsorbent [peak area before reaction: 987430 ( ⁇ V * sec), peak area after reaction. : 388219 ( ⁇ V * sec)] also suggested that zeolite has an adsorption effect on HMWS.
  • Example 7 Examination of the optimum pH of the adsorption effect on HMWS in a crudely purified sample of zeolite (HSZ-660HOA) (Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark) The crude obtained by purifying the culture supernatant containing MabD. The adsorption effect of zeolite (HSZ-660HOA) (Tosoh Corporation, HSZ is a registered trademark) on HMWS contained in the purified sample was evaluated.
  • HSZ-660HOA zeolite
  • the crudely purified sample of MabD obtained by the same method as in Example 6 was adjusted to pH 6, 7 or 8 with hydrochloric acid and trishydroxymethylaminomethane.
  • the amounts of HSZ-660HOA shown in Table 7 were weighed and equilibrated by the method shown in Example 6. Equilibration used 100 mM phosphate buffer (pH 6, 7 or 8).
  • inorganic powders containing silicon atoms and aluminum atoms such as activated clay, aluminum silicate and zeolite, can be used for purification of antibodies in a non-adsorption mode.

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Abstract

本発明は、従来技術より低いコストで抗体製造を行う方法として、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いて、非吸着モードで抗体を精製する方法、該精製方法を含む抗体の製造方法、および該製造方法により製造される抗体などを提供することを目的とする。本発明は、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いて、非吸着モードで抗体を精製する方法、該精製方法を含む抗体の製造方法、および該製造方法により製造される抗体に関する。

Description

吸着剤を用いた抗体の精製方法
　本発明は、抗体の精製方法及び該精製方法を含む抗体の製造方法に関する。
　遺伝子組換え技術の発達によって、種々の蛋白質を有効成分とする医薬品が供給されるようになった。特に近年は数多くの抗体を有効成分とする医薬品が開発、上市されている。また、これら蛋白質を大量かつ効率的に製造することは、バイオ医薬品産業にとってますます重要な問題となっている。
　このような蛋白質は、一般にその目的とする蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターを挿入された組換え細胞を培養することによって産生される。その培養液には、目的とする蛋白質の他に、多種多様の培地由来成分、宿主細胞由来成分または蛋白質由来の副生成物等の不純物が含まれているため、医薬品として要求される純度まで不純物を分離し目的の蛋白質を精製すること及び目的の蛋白質を大量かつ効率的に製造することを両立させることは、非常に困難かつ挑戦的である。
　蛋白質の精製方法は、一般に異なるモードのクロマトグラフィーの組み合わせで行われる。クロマトグラフィーは、例えば、分子の電荷、親水性または大きさ等の違いに基づいて、目的の蛋白質と不純物を分離する。
　特に、目的の蛋白質が抗体の場合、精製プロセスの多くは、プロテインAを使用するキャプチャーステップおよび、その後のポリッシングステップを含む。ポリッシングステップは、キャプチャーステップの後の精製中間体に含まれる宿主細胞由来成分または抗体由来の重合体（Ｈｉｇｈ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｓｐｅｃｉｅｓ；以下ＨＭＷＳとも記載する）などの抗体由来の副生成物、漏出したプロテインＡなどの不純物を除去する目的で行われる。ポリッシングステップでは、陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＣＥＸ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ａｎｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＡＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　ｉｎｔｅｒａｃｔｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＩＣ）およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー精製が行われる。
　これらのカラムクロマトグラフィーは、物質およびクロマトグラフィー条件ごとにカラム担体への吸着性が異なることを利用する。目的とする抗体がカラム担体に吸着される場合、抗体をカラム担体に吸着させた後にカラムの洗浄を行うことにより、カラム担体に吸着されない物質を除去した後、導電率又はｐＨを変化させ、抗体を溶出させる。このような様式のカラムクロマトグラフィーは吸脱着様式と呼ばれる。一方、目的とする抗体がカラム担体に吸着されない場合、抗体と不純物を含む溶液をカラムに通過させることにより、カラム担体に吸着される物質を除去することができる。このような様式のカラムクロマトグラフィーは非吸着（フロースルー）様式と呼ばれる。非吸着様式は吸脱着様式に比べ高いロード量で精製を行うことができることに加え、操作が簡便である（非特許文献１）。一般的にＡＥＸやＨＩＣは非吸着様式で行われる。また、ＣＥＸによる抗体の精製は、吸脱着様式で行われる。しかし、ｐＨおよび導電率を制御することにより、非吸着様式でＣＥＸを行う方法が知られている（特許文献１）。
　これらカラムクロマトグラフィーにより除去される不純物の種類は、クロマトグラフィー担体ごとに異なる。例えばＨＭＷＳはＣＥＸまたはＨＩＣにより除去される。宿主細胞由来の不純物はＡＥＸ、ＨＩＣまたはＣＥＸにより除去される。（非特許文献１）。
　活性白土およびケイ酸アルミニウムは酸化アルミニウムおよび二酸化ケイ素が任意の割合で結合した無機化合物である。これらは多孔質で優れた吸着特性を持ち、天然物由来の安価な素材として主に植物油の色素の除去、工業用の脱水、焼却場でのダイオキシンなどの吸着に用いられている。また、ゼオライトは結晶性アルミノケイ酸塩の総称であり、細孔径が均一で陽イオン交換性を持つという特徴がある。
　ゼオライトはタンパク質等の生体高分子を吸着する性質があるため、クロマトグラフィー担体としての使用が研究されている。吸着される生体高分子を含む試料のｐＨが吸着に影響し、生体高分子の等電点（ｐＩ）付近で吸着が最大になることが知られている（非特許文献２）。
　ゼオライトのケイ素／アルミニウム比（Ｓｉ／Ａｌ２　ｒａｔｉｏ）や三次元構造は製造方法によって異なり、その結果、疎水性およびイオン交換性などの性質も異なる。ゼオライトごとに、吸着できる生体高分子は異なることが知られている（非特許文献２）。
　抗体精製方法としては、ゼオライトＡまたはゼオライトＸを用い、２種類のタンパク質の混合サンプルからＩｇＧを精製する方法が知られている（非特許文献３、４）。これらは、抗体をゼオライトに吸着させ、不純物を除去した後、抗体を溶出する方法である。
　しかしながら、ゼオライトを担体に用いた、非吸着様式で抗体を精製する方法は知られておらず、また、組み換え蛋白質医薬品や抗体医薬品の工業的製造工程において、ゼオライトを精製基材として適用した報告例はない。
日本国特表２０１０－５２８０７６号公報
Ａ．Ａ．Ｓｈｕｋｌａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｂ　２００７，８４８，２８－３９ Ｍ．Ｍａｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２００１，７（７），１５５５－１５６０ Ｙ．Ｃ．Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５，１７，５６４－５６９ Ｙ．Ｃ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９９８，１４，３３２－３３７
　本発明は、従来技術より低いコストで抗体製造を行う方法として、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いて、非吸着モードで抗体を精製する方法、該精製方法を含む抗体の製造方法、および該製造方法により製造される抗体などを提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決する為に鋭意研究をした結果、驚くべきことに、安価な、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いて非吸着モードにて抗体と不純物とを分離し、抗体を精製する方法を見出し、本発明を完成した。
　本発明は以下［１］～［２２］に関する。
［１］抗体の精製方法であって、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いて、非吸着モードで抗体と不純物とを分離し、不純物含量が低下した抗体を取得する精製方法。
［２］抗体が遺伝子組換え抗体である、［１］に記載の精製方法。
［３］不純物が宿主細胞蛋白質、抗体由来の重合体、抗体由来の分解物及びＤＮＡから選ばれる少なくとも１である、［１］または［２］に記載の精製方法。
［４］不純物が抗体由来の重合体である、［１］または［２］に記載の精製方法。
［５］二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物が活性白土、ケイ酸アルミニウムまたはゼオライトである、［１］～［４］のいずれか１に記載の精製方法。
［６］二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物がケイ酸アルミニウムである、［１］～［５］のいずれか１に記載の精製方法。
［７］ケイ酸アルミニウムが以下の（ｉ）～（ｉｖ）から選ばれる少なくともいずれか１つの特性を持つ、［６］に記載の精製方法。
（ｉ）比表面積が３００～８００ｍ２／ｇである。
（ｉｉ）細孔容積が０．１～０．５ｍＬ／ｇである。
（ｉｉｉ）平均細孔直径が１．５～４ｎｍである。
（ｉｖ）シリカ／アルミナ比が１～５である。
［８］ケイ酸アルミニウムがガレオンニュートラルＤ２－Ｙ（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）またはネオビードＳＡ（水澤化学工業株式会社、ネオビードは登録商標）である、［６］または［７］に記載の精製方法。
［９］二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物が活性白土である［１］～［５］のいずれか１に記載の精製方法。
［１０］活性白土が以下の（ｉ）～（ｉｖ）から選ばれる少なくともいずれか１つの特性を持つ、［９］に記載の精製方法。
（ｉ）比表面積が１００～４００ｍ２／ｇである。
（ｉｉ）細孔容積が０．２～０．６ｍＬ／ｇである。
（ｉｉｉ）平均細孔直径が３～１０ｎｍである。
（ｉｖ）シリカ／アルミナ比が６～１０である。
［１１］ケイ酸アルミニウムがガレオンアースＮＶＺ、ガレオンアースＮＶ、ガレオンアースＶ２ＲまたはガレオンアースＶ２（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）である、［９］または［１０］に記載の精製方法。
［１２］二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物がゼオライトである、［１］～［５］のいずれか１に記載の精製方法。
［１３］ゼオライトが以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）から選ばれる少なくともいずれか１つの特性を持つ、［１２］に記載の精製方法。
（ｉ）比表面積が１００～８００ｍ２／ｇである。
（ｉｉ）細孔直径が０．２～１ｎｍである。
（ｉｉｉ）シリカ／アルミナ比が２～１５００である。
［１４］ゼオライトが、β型またはモルデナイト型のゼオライトである、［１２］または［１３］に記載の精製方法。
［１５］ゼオライトが、カウンターカチオンとしてプロトンを含む、［１２］～［１４］のいずれか１に記載の精製方法。
［１６］抗体と不純物との分離をｐＨ４～９で行う、［１］～［１５］のいずれか１に記載の精製方法。
［１７］抗体と不純物との分離をｐＨ６～９で行う、［１］～［１５］のいずれか１に記載の精製方法。
［１８］抗体と不純物との分離をｐＨ７．５～８．５で行う、［１］～［１５］のいずれか１に記載の精製方法。
［１９］前処理として、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物の、緩衝液による平衡化を行うことを含む、［１］～［１８］のいずれか１に記載の精製方法。
［２０］［１］～［１９］のいずれか１に記載の精製方法を含む、抗体の製造方法。
［２１］プロテインＡクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーおよび活性炭クロマトグラフィーの少なくともいずれか１を含む、［２０］に記載の製造方法。
［２２］［２０］または［２１］に記載の製造方法により製造された抗体。
　本発明によって、従来技術よりも低いコストで抗体製造を行う方法として、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いて、非吸着モードで抗体を精製する方法、該精製方法を含む抗体の製造方法、および該製造方法により製造される抗体などが提供される。
図１は、ＭａｂＡの培養上清を各種ゼオライトで処理した後のＨＭＷＳ吸着率を示す。縦軸はＨＭＷＳ吸着率（％）を示す。白色、灰色および、黒色のグラフは、それぞれ、ゼオライトを１２４ｍｇ、２４８ｍｇおよび４９６ｍｇ添加したときの結果をそれぞれ示す。 図２は、ＭａｂＡの培養上清を各種ゼオライトで処理した後の回収率を示す。縦軸は回収率（％）を示す。白色、灰色および、黒色のグラフは、それぞれ、ゼオライトを１２４ｍｇ、２４８ｍｇおよび４９６ｍｇ添加したときの結果をそれぞれ示す。 図３（Ａ）及び（Ｂ）は、ゼオライト（ＨＳＺ－６６０ＨＯＡ）（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）処理前および後のＭａｂＡの培養上清をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した溶出パターンを示す。図３（Ａ）は吸着剤で処理前の溶出パターン、図３（Ｂ）は吸着剤で処理後の溶出パターンをそれぞれ示す。 図４（Ａ）及び（Ｂ）は、ゼオライト（ＨＳＺ－６６０ＨＯＡ）（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）処理前および後の、ＭａｂＤの粗精製試料を、サイズ排除クロマトグラフィーで分析した溶出パターンを示す。図４（Ａ）は吸着剤で処理前の溶出パターン、図４（Ｂ）は吸着剤で処理後の溶出パターンをそれぞれ示す。
　本発明は、抗体の精製方法であって、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いて、非吸着モードで抗体と不純物とを分離し、不純物含量が低下した抗体を取得する精製方法に関する。
　抗体としては、例えば、マウス抗体、ラマ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらのＦｃ領域等を改変した抗体等が挙げられる。抗体の分子型としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｃ－融合蛋白、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ’２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｓｃＤｂまたはｓｃＤｂＦｃ等が挙げられる。
　本発明の精製方法には、目的とする抗体及び不純物を含む抗体含有水溶液が供される。
　抗体含有水溶液としては、例えば、血漿、血清、乳若しくは尿など生体から得られた組成物、遺伝子組換え技術若しくは細胞融合技術を用いて得られた抗体を生産する細胞または大腸菌等の菌類の培養液、トランスジェニック非ヒト動物、植物若しくは昆虫等から得られた組成物、または無細胞蛋白質合成技術を用いて得られた組成物等が挙げられる。
　抗体を生産する細胞としては、例えば、宿主細胞に所望の抗体をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換細胞等が挙げられる。
　宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞または酵母細胞等の細胞株が挙げられる。
　具体的には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ラットミエローマ細胞であるＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞、胚性幹細胞、または受精卵細胞等が挙げられる。
　抗体を生産する細胞を培養する培地としては、各々の細胞の培養に適した培地であればいずれも用いられるが、例えば、動物細胞を培養する培地としては、通常の動物細胞の培養に用いられる培地が用いられる。例えば、血清含有培地、血清アルブミン若しくは血清分画物などの動物由来成分を含まない培地、無血清培地、または無蛋白培地等、いずれの培地も用いられるが、好ましくは無血清培地または無蛋白培地が用いられる。
　具体的には、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０２培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ－ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ　３２５培地（以上、ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）、ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＣＤ　ＤＧ４４培地（以上、インビトロジェン社製）若しくはＩＳ　ＣＤ－ＣＨＯ培地（アーバインサイエンティフィック社製）、またはこれらの改変培地、混合培地もしくは濃縮培地等が用いられる。これらの中でも、好ましくは、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０２培地、ＣＤ－ＣＨＯ培地またはＩＳ　ＣＤ－ＣＨＯ培地等が挙げられる。
　また、必要に応じて抗体を生産する細胞の生育に必要な生理活性物質または栄養因子等を添加することができる。これらの添加物は、培養前に予め培地に含有させるか、培養中に添加培地または添加溶液として培養液へ適宜追加供給する。追加供給の方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態でもよく、また、添加方法は連続または断続のいずれでもよい。
　抗体を生産するトランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫としては、例えば、抗体をコードする遺伝子が細胞内に組み込まれた非ヒト動物、植物または昆虫が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはサル等が挙げられる。植物としては、例えば、タバコ、ポテト、トマト、ニンジン、ソイビーン、アブラナ、アルファルファ、コメ、小麦、大麦またはコーン等が挙げられる。
　抗体含有水溶液の生産方法としては、例えば、国際公開第２００７／０６２２４５号または国際公開第２００７／１１４４９６号等に記載の方法が挙げられる。
　また、本発明において、抗体含有水溶液としては、例えば、抗体を含有する血漿または尿等生体から得られるものの他、精製する工程で得られる抗体含有水溶液が挙げられる。具体的には、例えば、細胞除去液、沈殿物除去液、アルコール分画液、塩析分画液、クロマトグラフィー溶出液等が挙げられる。
　細胞除去液としては、例えば、血漿、血清、乳若しくは尿等生体から得られる抗体含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫より得られる抗体含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られる抗体含有水溶液または精製する工程で得られる抗体含有水溶液より、細胞を除去した溶液等が挙げられる。具体的には、例えば、細胞培養液より遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法等によって細胞を除去して得られる溶液が挙げられる。
　沈殿物除去液としては、例えば、血漿、血清、乳若しくは尿等生体から得られた抗体含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫より得られた抗体含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られた抗体含有水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られた抗体含有水溶液または精製する工程で得られる抗体含有水溶液より、低ｐＨ処理またはカプリル酸、有機溶剤、ポリエチレングリコール、界面活性剤、塩、アミノ酸若しくはポリマー等の添加により凝集沈殿（フロキュレーション）または二相分離を行った後に、沈殿物を除去した溶液等が挙げられる。沈殿物の除去方法としては、例えば、遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法等が挙げられる。
　アルコール分画液としては、例えば、血漿、血清、乳若しくは尿等生体から得られた抗体含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫より得られた抗体含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られた抗体含有水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られた抗体含有水溶液または精製する工程で得られた抗体含有水溶液より、アルコール等を添加することで調製された分画液等が挙げられる。具体的には、例えば、低温エタノール分画法等の手法で得られる分画液が挙げられる。
　塩析分画液としては、例えば、血漿、血清、乳若しくは尿等生体から得られた抗体含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫より得られた抗体含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られた抗体含有水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られた抗体含有水溶液または精製する工程で得られた抗体含有水溶液より、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム等の塩を添加し、抗体を析出させることで調製された分画液等が挙げられる。
　クロマトグラフィー溶出液としては、例えば、血漿、血清、乳若しくは尿等生体から得られた抗体含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫より得られた抗体含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られた抗体含有水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られた抗体含有水溶液または精製する工程で得られた抗体含有水溶液をクロマトグラフィーに用いられる担体または膜に吸着させ、適当な溶出液で溶出すること、または非吸着モードで、担体等を封入したカラムまたは膜等を通過させることにより得られた、抗体溶出液等が挙げられる。
　クロマトグラフィーに用いられる担体または膜としては、例えば、アフィニティ担体、イオン交換担体、イオン交換膜、ゲルろ過担体、疎水性相互作用担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、硫酸化アガロース担体、混合モード（マルチモーダル）担体または活性炭等が挙げられる。
　イオン交換担体またはイオン交換膜としては、イオン交換基を有する分子、例えば、硫酸基、メチル硫酸基、スルフォフェニル基、スルフォプロピル基、カルボキシメチル基、４級アンモニウム基、４級アミノエチル基またはジエチルアミノエチル基等を、ベース担体または膜、例えば、セルロース、セファロース、アガロース、キトサン、アクリル酸重合体若しくはスチレン－ジビニルベンゼン共重合体などのポリマーおよびその誘導体（架橋ポリマーを含む）、シリカ粒子、ガラス粒子、セラミック粒子またはその表面処理粒子等で構成されたポリマー等に直接または間接的に結合した担体または膜が挙げられる。具体的には、例えば、Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＸＬ、Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ、ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ、ＡＮＸ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ、Ｃａｐｔｏ　Ｑ、Ｃａｐｔｏ　ＤＥＡＥまたはＣａｐｔｏ　Ｑ　ＩｍｐＲｅｓ（以上、ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏは登録商標）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐ　Ｑ－６５０またはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＳｕｐｅｒＱ－６５０（以上、東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬは登録商標）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　ＴＭＡＥ　ＨｉｃａｐまたはＥｓｈｍｕｎｏ　Ｑ（以上、メルクミリポア社製）、セルファインＭＡＸ－Ｑ（ＪＮＣ社製）、Ｍｕｓｔａｎｇ　Ｑ（ポール社製）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ　Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ　ＳＴＩＣ（以上、ザルトリウス社製）、ＳＰ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ、ＣＭ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ、ＳＰ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＸＬまたはＣａｐｔｏ　Ｓ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、Ｐｏｒｏｓ　５０　ＨＳまたはＰｏｒｏｓ　５０　ＸＳ（以上、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｅｓｈｍｕｎｏ　Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　ＣＯＯ－、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　ＳＯ３－またはＦｒａｃｔｏｇｅｌ　ＳＥ　Ｈｉｃａｐ（以上、メルクミリポア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐ　Ｓ－６５０またはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐ　ＣＭ－６５０（以上、東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬは登録商標）、セルファインＭＡＸ－Ｓ（ＪＮＣ社製、セルファインは登録商標）、Ｍｕｓｔａｎｇ　Ｓ（ポール社製）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ　Ｓ（ザルトリウス社製）またはダイヤイオンＰＫ、ダイヤイオンＰＡ、ダイヤイオンＣＲまたはダイヤイオンＡＭＰ（以上、三菱化学社製、ダイヤイオンは登録商標）等が挙げられるがこれらに限定されない。
　アフィニティ担体としては、目的とする抗体に親和性を有する分子、例えば、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬ等を、前記と同様のベース担体に直接または間接的に結合した担体が挙げられる。具体的には、例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ　ＬＸ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦまたはＣａｐｔｏ　Ｌ（以上、ＧＥヘルスケア社製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔは登録商標）、Ｐｒｏｓｅｐ　ｖＡ　ＨｉｃａｐａｃｉｔｙまたはＰｒｏｓｅｐ　ｖＡ　Ｕｌｔｒａ、Ｐｒｏｓｅｐ　Ｕｌｔｒａｐｌｕｓ（以上、メルクミリポア社製、Ｐｒｏｓｅｐは登録商標）等が挙げられるがこれらに限定されない。
　ゲルろ過担体としては、例えば、デキストラン、アリルデキストラン、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド、セルロース、アガロース、スチレン、ジビニルベンゼン、ポリビニルアルコール、シリカまたはキトサン等で構成されたポリマーからなる担体が挙げられる。具体的には、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）　Ｓシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）シリーズ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）シリーズ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）シリーズまたはＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）シリーズ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　ＨＷシリーズまたはＴＳＫｇｅｌ（登録商標）　ＰＷシリーズ（以上、東ソー社製）、Ｂｉｏ　ｇｅｌ　ＡｇａｒｏｓｅまたはＢｉｏ　ｇｅｌ　Ｐ　Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（以上、バイオラッド社製、Ｂｉｏ　ｇｅｌは登録商標）、セルファインＧＨまたはセルファインＧＣＬ（以上、ＪＮＣ社製、セルファインは登録商標）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　ＧＦ０５、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　ＧＦ２０００またはＵｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ（以上、ポール社製、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌは登録商標）またはフラクトゲル　ＢｉｏＳＥＣ（メルクミリポア社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　疎水性相互作用担体としては、疎水性を有する分子、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、オクチル基、エーテル基またはフェニル基等を、前記と同様のベース担体に直接または間接的に結合した担体が挙げられる。具体的には、例えば、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ－ｓｕｂ）、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ｌｏｗ－ｓｕｂ）、Ｏｃｔｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　ＦｌｏｗまたはＢｕｔｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｈｅｘｙｌ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｂｕｔｙｌ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｐｈｅｎｙｌ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｅｔｈｅｒ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＰＰＧ－６００、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｂｕｔｙｌ－６００またはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｓｕｐｅｒ　Ｂｕｔｙｌ－５５０（以上、東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬは登録商標）、Ｍａｃｔｒｏ－Ｐｒｅｐ　ｔ－ＢｕｔｙｌまたはＭａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ　Ｍｅｔｈｙｌ（以上、バイオラッド社製）、ＱＭＡ　Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ、Ｍｅｔｈｙｌ　Ｃｅｒａｍｉｃ　ＨｙｐｅｒＤ（以上、ポール社製）、フラクトゲル　Ｐｈｅｎｙｌ（Ｓ）またはフラクトゲル　Ｐｒｏｐｙｌ（Ｓ）（以上、メルクミリポア社製）、フェニル－セルロファイン（ＪＮＣ社製）、ダイヤイオンＨＰまたはダイヤイオンＳＰ（以上、三菱化学社製、ダイヤイオンは登録商標）またはブチル化キトパールまたはフェニル化キトパール（以上、富士紡ホールディングズ社製、キトパールは登録商標）等が挙げられるがこれらに限定されない。
　逆相担体としては、例えば、炭化水素基を固相マトリックスに、直接または間接的に結合した担体が挙げられる。炭化水素基としては、例えば、トリメチル基、ブチル基、フェニル基、オクチル基またはオクタデシル基及びこれらの末端を改変した官能基等が挙げられる。具体的には、例えば、ＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＲＰＣシリーズまたはＳＯＵＲＣＥ　ＲＰＣシリーズ（以上、ＧＥヘルスケア社製、ＲＥＳＯＵＲＣＥは登録商標）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ヒドロキシアパタイト担体としては、例えば、ＣＨＴ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　Ｔｙｐｅ　ＩまたはＴｙｐｅ　ＩＩ（以上、バイオラッド社製）が挙げられるが、これに限定されない。また、フルオロアパタイト担体としては、例えば、ＣＦＴ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｆｌｕｏｒｏａｐａｔｉｔｅ（バイオラッド社製）等が挙げられるが、これに限定されない。
　混合モード担体としては、異なる選択性を有する２種類以上の官能基、好ましくは前記と同様のイオン交換基および前記と同様の疎水性相互作用基を、前記と同様のベース担体に直接または間接的に結合した担体が挙げられる。具体的には、例えば、Ｃａｐｔｏ　ａｄｈｅｒｅまたはＣａｐｔｏ　ＭＭＣ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＨＥＡ　ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ　ＨｙｐｅｒＣｅｌまたはＭＥＰ　ＨｙｐｅｒＣｅｌ（以上、ポール社製）またはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＭＸ－Ｔｒｐ－６５０Ｍ（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬは登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　活性炭としては、例えば、カルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、特製白鷺、白鷺Ａ、白鷺Ｃ、白鷺Ｃ－１、白鷺ＤＯ－２、白鷺ＤＯ－５、白鷺ＤＯ－１１、白鷺ＤＣ、白鷺ＤＯ、白鷺Ｇｘ、白鷺Ｇ、白鷺ＧＨ、白鷺ＦＡＣ－１０、白鷺Ｍ、白鷺Ｐ、白鷺ＰＨＣ、白鷺Ｇｃ、白鷺ＧＨ、白鷺ＧＭ、白鷺ＧＳ、白鷺ＧＴ、白鷺ＧＡＡ、白鷺ＧＯＣ、白鷺ＧＯＸ、白鷺ＡＰＲＣ、白鷺ＴＡＣ、白鷺ＭＡＣ、白鷺ＸＲＣ、白鷺ＮＣＣ、白鷺ＳＲＣＸ、白鷺Ｗｃ、白鷺ＬＧＫ、白鷺ＫＬ、白鷺ＷＨ、白鷺Ｗ、白鷺ＷＨＡ、白鷺ＬＨ、白鷺ＫＬ、白鷺ＬＧＫ、白鷺ＭＡＣ－Ｗ、白鷺Ｓ、白鷺Ｓｘ、白鷺Ｘ２Ｍ、白鷺Ｘ７０００、白鷺Ｘ７１００、白鷺ＤＸ７－３またはモルシーボン（以上、日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）、ＡＣＦまたは太閤（以上、富士ケミカル社製、太閤は登録商標）、ＧＬＣ（以上、クラレケミカル社製）、太閤Ｓ、太閤Ｋまたは太閤Ｑ（以上、フタムラ化学社製、太閤は登録商標）、またはＧＡＣ、ＣＮ、ＣＧ、ＣＡＰ／ＣＧＰ、ＳＸまたはＣＡ（以上、日本ノリット社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　更に、抗体含有水溶液は、粒子等の不溶物が存在する場合には予めそれらを除去し、不溶物を除去した後に本発明の精製方法に供してもよい。粒子等の不溶物の除去方法としては、例えば、遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法が挙げられる。また、必要に応じて後述の抗体含有水溶液のｐＨ、導電率、緩衝液もしくは抗体濃度、または、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物の単位体積もしくは単位重量あたりの抗体負荷量等を調整した後に本発明の精製方法に供される。
　ｐＨ、導電率、緩衝液もしくは抗体濃度、または、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物の単位体積もしくは単位重量あたりの抗体負荷量等を調整する方法としては、例えば、限外ろ過膜を用いた限外ろ過法等が挙げられる。
　限外ろ過膜としては、通常の限外ろ過膜の他、プラスまたはマイナスの電荷が付加された限外ろ過膜も含まれる。具体的には、例えば、ペリコン３ウルトラセル膜、ペリコン３バイオマックス膜、ペリコン２ウルトラセル膜またはペリコン２バイオマックス膜（以上、メルクミリポア社製）、オメガメンブラン（ポール社製）またはＫｖｉｃｋ膜（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明において、不純物としては、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）、抗体由来の重合体（ＨＭＷＳ）、抗体由来の分解物、変性、糖鎖成分の除去、酸化若しくは脱アミド等を受けた抗体由来の修飾体、ＤＮＡ、培地由来成分、培養添加物、宿主細胞から溶出した酵素類またはキャプチャーステップで混入するプロテインA等が挙げられ、好ましくは宿主細胞蛋白質、抗体由来の重合体、抗体由来の分解物またはＤＮＡが挙げられる。
　本発明において、抗体由来の重合体には、複数の抗体分子が会合または凝集したものであればいかなるものも含まれるが、可溶性の重合体であることが好ましい。具体的には、二量体、三量体、四量体、または５つ以上の抗体分子が会合または凝集した重合体が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において、抗体由来の分解物としては、例えば抗体のジスルフィド結合またはペプチド結合が開裂したものが挙げられる。具体的には、モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖の一部または全てが脱落したものが挙げられるがこれらに限定されない。またＦａｂ断片、Ｆａｂ断片の 重鎖と軽鎖がさらに開裂したものなども包含される。
　宿主細胞から溶出した酵素類としては、例えば、糖分解酵素類、蛋白質加水分解酵素類または酸化還元酵素類等が挙げられる。
　糖分解酵素としては、具体的には、例えば、ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、ガラクトシダーゼまたはグリカナーゼ等が挙げられる。蛋白質分解酵素としては、具体的には、例えば、セリンプロテアーゼ、エステラーゼ、システインプロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼまたはカテプシン等が挙げられる。酸化還元酵素としては、具体的には、例えば、チオレドキシンレダクターゼ等のチオレドキシン関連酵素等が挙げられる。アミノ酸異性化酵素としては、具体的には、例えば、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。
　本発明の精製方法に用いられる二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物としては、医薬品の製造に適した、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物であればいずれも用いられ、１種類の二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を単独で使用しても、２種類以上の二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を混合した後に、または混合せずに用いてもよい。
　二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物としては、例えば、ゼオライト、活性白土、ケイ酸アルミニウム、酸性白土、カオリンまたはベントナイトが挙げられ、好ましくはゼオライト、活性白土またはケイ酸アルミニウムが挙げられ、特に好ましくはゼオライトまたはケイ酸アルミニウムが挙げられ、最も好ましくはゼオライトが挙げられる。
　本発明で使用されるゼオライトとしては、いかなる構造のゼオライトも含まれ、例えば、Ａ型、β型、ＺＳＭ－５型、フェリエライト型、モルデナイト型、Ｌ型またはＹ型のゼオライトが挙げられる。本発明で使用されるゼオライトとしては、モルデナイト型またはβ型のゼオライトが好ましく、モルデナイト型がより好ましい。
　また、本発明で使用されるゼオライトは結晶構造中にテンプレートまたはカウンターカチオンを含む。前記テンプレートとは、構造規定剤ともいう。前記カウンターカチオンとしては、正の電荷を帯びている原子または原子団であればいずれも含まれ、例えば、プロトン、アンモニウムイオン、ナトリウムイオンまたはカリウムイオンが挙げられる。本発明で使用されるゼオライトに含まれるカウンターカチオンとしては、プロトンが好ましい。
　本発明で使用されるゼオライトの比表面積は、１００～８００ｍ２／ｇであることが好ましく、１５０～７００ｍ２／ｇであることがより好ましく、３５０～６００ｍ２／ｇであることがさらに好ましく、３５０～５００ｍ２／ｇであることが最も好ましい。本発明で使用されるゼオライトの細孔直径は０．２～１ｎｍであることが好ましく、０．５～０．８ｎｍであることがより好ましく、０．６～０．７５ｎｍであることがさらに好ましく、０．６５～０．７５ｎｍであることが最も好ましい。本発明で使用されるゼオライトのシリカ／アルミナ比は２～１５００であることが好ましく、１０～１５００であることがより好ましく、１５～３００であることがさらに好ましい。
　本発明で使用されるゼオライトとして、具体的には例えば、ゼオラムＡ－３、ゼオラムＡ－４、ゼオラムＡ－５、ゼオラムＦ－９、ゼオラムＮＳＡ－７００、ＨＳＺ－９２０ＮＨＡ、ＨＳＺ－９３０ＮＨＡ、ＨＳＺ－９４０ＮＨＡ、ＨＳＺ－９３１ＨＯＡ、ＨＳＺ－９４０ＨＯＡ、ＨＳＺ－９４１ＨＯＡ、ＨＳＺ－９６０ＨＯＡ、ＨＳＺ－９８０ＨＯＡ、ＨＳＺ－９９０ＨＯＡ、ＨＳＺ－８２０ＮＨＡ、ＨＳＺ－８４０ＮＨＡ、ＨＳＺ－８２２ＨＯＡ、ＨＳＺ－８４０ＨＯＡ、ＨＳＺ－８９０ＨＯＡ、ＨＳＺ－８９１ＨＯＡ、ＨＳＺ－７２０ＮＨＡ、ＨＳＺ－７７０ＮＡＡ、ＨＳＺ－７２０ＫＯＡ、ＨＳＺ－７２２ＨＯＡ、ＨＳＺ－６４２ＮＡＡ、ＨＳＺ－６２０ＨＯＡ、ＨＳＺ－６４０ＨＯＡ、ＨＳＺ－６６０ＨＯＡ、ＨＳＺ－６９０ＨＯＡ、ＨＳＺ－５００ＫＯＡ、ＨＳＺ－３４１ＮＨＡ、ＨＳＺ－３２０ＮＡＡ、ＨＳＺ－３２０ＨＯＡ、ＨＳＺ－３３０ＨＵＡ、ＨＳＺ－３３１ＨＳＡ、ＨＳＺ－３５０ＨＵＡ、ＨＳＺ－３６０ＨＵＡ、ＨＳＺ－３８５ＨＵＡまたはＨＳＺ－３９０ＨＵＡ（以上、東ソー株式会社、ゼオラム及びＨＳＺは登録商標）またはジークライト　ＳＧＷ、またはジークライトＳＧＷ－Ｂ（以上、ジークライト株式会社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明で使用される活性白土の比表面積は、１００～４００ｍ２／ｇであることが好ましく、２００～３５０ｍ２／ｇであることがより好ましく、２４０～３１０ｍ２／ｇであることがさらに好ましい。本発明で使用される活性白土の細孔容積は０．２～０．６ｍＬ／ｇであることが好ましく、０．３～０．５ｍＬ／ｇであることがより好ましい。本発明で使用される活性白土の平均細孔直径は３～１０ｎｍであることが好ましく、５～７ｎｍであることがより好ましい。本発明で使用される活性白土のシリカ／アルミナ比は６～１０であることが好ましい。
　本発明で使用される活性白土として、具体的には例えば、ガレオンアースＮＶＺ、ガレオンアースＮＶ、ガレオンアースＶ２ＲまたはガレオンアースＶ２（以上、水澤化学工業株式会社、ガレオン及びガレオンアースは登録商標）、活性白土　ＳＡ３５、活性白土　ＳＡ１または活性白土　Ｒ－１５（以上、東新化成株式会社）またはＡＣＴＡＬ２０Ｘ、ＡＣＴＡＬ２０またはＡＣＴＡＬ１０（以上、日揮ユニバーサル株式会社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明で使用されるケイ酸アルミニウムの比表面積は、３００～８００ｍ２／ｇであることが好ましく、５００～６００ｍ２／ｇであることがさらに好ましい。本発明で使用されるケイ酸アルミニウムの細孔容積は０．１～０．５ｍＬ／ｇであることが好ましく、０．２５～０．４ｍＬ／ｇであることがより好ましい。本発明で使用されるケイ酸アルミニウムの平均細孔直径は１．５～４ｎｍであることが好ましく、２～３ｎｍであることがより好ましい。本発明で使用されるケイ酸アルミニウムのシリカ／アルミナ比は、１～５であることが好ましく、３．５～４．５であることがより好ましい。
　本発明で使用されるケイ酸アルミニウムとして、具体的には例えば、ガレオンニュートラルＤ２－ＹまたはネオビードＳＡ（以上、水澤化学工業株式会社、ガレオン及びネオビードは登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明で使用される酸性白土として、具体的には例えば、ミズカエース＃２０、ミズカエース＃２００、ミズカエース＃６００またはミズライト（以上、水澤化学工業株式会社、ミズカエースは登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明で使用されるカオリンとして、具体的には例えば、Ｈｙｄｒｉｔｅ　ＴＳ９０、Ｈｙｄｒｉｔｅ　ＵＦ９０またはＫａｏｐａｑｕｅ　１０（以上、林化成株式会社）またはＲＣ－１またはＧｌｏｍａｘ　ＬＬ（以上、竹原化学工業株式会社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明で使用されるベントナイトとして、具体的には例えば、クニピア－Ｆ、クニピア－Ｇ、モイストナイト－Ｕ、モイストナイト－Ｓまたはモイストナイト－ＨＣ（以上、クニミネ工業株式会社、クニピア及びモイストナイトは登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の精製方法の手段としては、特に限定されないが、例えば、バッチ法、膜処理法またはカラムクロマトグラフィー法等が挙げられ、それぞれの手段に応じて適切な種類および／または形状の、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物が選択される。必要に応じて、多孔性ポリマー若しくはゲルに二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を封入した粒子等の形態またはポリプロピレン若しくはセルロース等のサポート剤若しくは繊維等を用いて二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を吸着、固定若しくは成形した膜若しくは膜で粉体を挟んだカートリッジ等の形態等にて使用することも出来る。
　また、目的の抗体及び前記精製方法の手段により、用いる二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物の結晶構造、比表面積、細孔径、シリカ／アルミナ比および／またはｐＨ等を適宜選択することも出来る。
　本発明の精製方法は非吸着モードで行われる。非吸着モードとは、抗体含有水溶液を二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物と接触させ、目的の抗体を該二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物に吸着させずに非吸着画分を回収することを意味する。具体的には、予め抗体含有水溶液のｐＨ、導電率、緩衝液、抗体濃度、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物の単位体積あたりの抗体負荷量、温度または二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物への接触時間等を調整し、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物に接触させることにより、目的の抗体を二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物に吸着させずに不純物を二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物に吸着させ、非吸着画分に不純物含量が低下した抗体を回収することが出来る。
　本発明の精製方法の一態様として、前処理として、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物の、緩衝液による平衡化を行うことを含む精製方法が挙げられる。平衡化は、適切なｐＨおよび濃度に調整された緩衝液を二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物と接触させることにより行われる。例えば、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物に適切な量の緩衝液を通過させる方法、または二酸化ケイ素およびアルミニウムを含む無機化合物を緩衝液と適切な時間混和させる方法が挙げられる。平衡化されているかどうかは、該無機化合物に接触させた後の緩衝液のｐＨを測定することにより確認できる。例えば、無機化合物に接触させた後の緩衝液のｐＨが、接触前のｐＨ±０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１であるときに、二酸化ケイ素およびアルミニウムを含む無機化合物は平衡化されている。
　二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物に接触させる抗体含有水溶液、または二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物の平衡化に使用される緩衝液のｐＨは、好ましくは４～９であり、より好ましくは５～９であり、特に好ましくは６～９であり、さらに好ましくは７．５～８．５である。また、上記抗体含有水溶液または平衡化に使用される緩衝液を構成する塩として、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ等が挙げられる。これらの濃度は好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ～０．５ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、例えば、０．０１ｍｏｌ／Ｌ～０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ～０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の他の塩と組み合わせて用いることも出来る。更に、緩衝液成分には、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくはヒスチジン等のアミノ酸、グルコース、スクロース、ラクトース、シアル酸等の糖若しくはその誘導体等と組み合わせて用いることも出来る。
　二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物に接触させる抗体含有水溶液または二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物の平衡化に使用される緩衝液の温度は、好ましくは４℃から６０℃、より好ましくは１０℃から５０℃、特に好ましくは２０℃から４０℃である。
　本発明において、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物の非吸着画分を回収することで、不純物含量が低下した抗体を高い回収率で得ることが出来る。具体的には、不純物含量として、抗体由来の重合体の含量が好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下で得ることが出来る。不純物含量が低下したかどうかは、例えば二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物に吸着された不純物の割合（不純物吸着率）を算出することにより確認できる。特に不純物が抗体由来の重合体（ＨＭＤＳ）の場合、ＨＭＤＳ吸着率は１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上であることが好ましい。回収率としては、好ましくは３５％以上、より好ましくは４５％以上、さらに好ましくは６０％以上で得ることが出来る。
　本発明において、抗体および不純物の含量の測定には、通常抗体精製において用いられる分析法を適用することが出来る。例えば、抗体の含量は、吸光度またはプロテインＡなどのアフィニティＨＰＬＣ法等、宿主細胞蛋白質の含量はＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法、ウエスタンブロッティング法または電気化学発光法等、抗体由来の重合体若しくは抗体由来の分解物の含量はゲルろ過ＨＰＬＣ法、イオン交換ＨＰＬＣ法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、光散乱法または超遠心法等、ＤＮＡはピコグリーン法、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法またはＱＰＣＲ法等の分析法によりそれぞれ測定することが出来る。
　また、本発明は、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いて、抗体と不純物とを分離し、不純物含量が低下した抗体を取得する精製方法を含む、抗体の製造方法に関する。
　本発明の製造方法において、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いた精製方法は、他の精製方法と組み合わせることができる。二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いた精製方法と組み合わせる精製方法としては、医薬品の製造に適した方法であればいずれも用いられるが、例えば、クロマトグラフィー、アルコール分画、沈殿物除去、塩析、緩衝液交換、濃縮、希釈、ろ過、ウイルス不活性化、ウイルス除去等が挙げられる。二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いた精製方法と組み合わせる精製方法は、複数の種類、数を組み合わせてもよい。また、これらの精製方法は、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いた精製方法の前後を問わず実施することが出来る。
　二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いた精製方法と組み合わせるクロマトグラフィーに用いられる担体または膜としては、前記と同様のアフィニティ担体、イオン交換担体、イオン交換膜、ゲルろ過担体、疎水性相互作用担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、硫酸化アガロース担体、混合モード担体等が挙げられる。
　二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いた精製方法と組み合わせるクロマトグラフィーは、その目的に応じて吸着モードまたは非吸着モードで行われる。クロマトグラフィーとしては、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーおよび活性炭クロマトグラフィーが挙げられる。
　前記クロマトグラフィーにおける吸着モードとは、該クロマトグラフィーに供する水溶液を該担体または該膜に接触させ、目的の抗体を該担体または該膜に吸着させた後、必要に応じて洗浄を行い、その後、ｐＨ、導電率、緩衝液成分、塩濃度または添加物等を変更した緩衝液で溶出させて吸着画分を回収することを意味する。該クロマトグラフィーにおける非吸着モードとは、該クロマトグラフィーに供する水溶液を該担体または該膜と接触させ、目的の抗体を該担体または該膜に吸着させずに非吸着画分を回収することを意味する。
　本発明の抗体の製造方法としては、例えば、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いた精製方法と組み合わせる全てのクロマトグラフィーが非吸着モードで行われる抗体の製造方法（Ａｌｌ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）が挙げられる。
　二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いた精製方法と組み合わせるクロマトグラフィーに供する水溶液または洗浄に使用する緩衝液は、ｐＨ、導電率、緩衝液成分、塩濃度または添加物等について、それぞれ好適な条件を選定する。
　クロマトグラフィーの条件を選定する上で、目的の抗体と分離したい化合物との物理化学的性質の違い、例えば、等電点、電荷、疎水性度、分子サイズまたは立体構造等の違いを利用することが出来る。吸着モードの溶出方法としては、目的の抗体と担体との親和性が低下するような特定の塩濃度またはｐＨの緩衝液を通液して溶出させる一段階溶出法、段階的に塩濃度またはｐＨを変化させて目的の抗体を溶出させるステップワイズ法または連続的に塩濃度またはｐＨを変化させて目的の抗体を溶出させるグラジエント法が挙げられる。
　緩衝液を構成する塩としては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅ等が挙げられる。また上記の塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのような他の塩と組み合わせて用いることも出来る。更に、緩衝液成分には、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくはヒスチジン等のアミノ酸、グルコース、スクロース、ラクトース、シアル酸等の糖若しくはその誘導体等と組み合わせて用いることも出来る。
　本発明の製造方法により、不純物含量が低下した抗体を高い回収率で得ることが出来る。具体的には、不純物含量として、抗体由来の重合体の含量が好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下で得ることが出来る。回収率としては、好ましくは３５％以上、より好ましくは４５％以上、さらに好ましくは６０％以上で得ることが出来る。
　以下、実施例により本発明について更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］活性白土、ケイ酸アルミニウムによる培養上清からの抗体重合体の吸着効果の検討
　ＩｇＧ型ヒトモノクロナール抗体（ＭａｂＡ）を含むＣＨＯ細胞培養液を精密ろ過により清澄化し、クエン酸及びトリスヒドロキシメチルアミノメタンを用いてｐＨ７．０に調整した培養上清を調製した。調製した培養上清の抗体濃度は４．６３ｍｇ／ｍＬであった。
　次にこの溶液４ｍＬに、表１に示す水澤化学工業社製の４種類の活性白土及び２種類のケイ酸アルミニウムのいずれか１つをそれぞれ６２、１２３または２４７ｍｇずつ添加し、約１６時間転倒混和した。使用した吸着剤のうち、２種類のケイ酸アルミニウムの特性を表２に示す。混和液は２９００ｘｇで１０分間遠心分離し、精密ろ過膜（メルク社製Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ　０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘは登録商標）でろ過し、各吸着剤を除去した。
　ろ液中に含まれる抗体の濃度を、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティカラムを用いたＨＰＬＣにて測定し、回収率を算出した。回収率は次の計算式により算出される値と定義する。
［回収率（％）］＝［吸着剤処理後抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）］÷［吸着剤処理前抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）］×１００
　さらに、サイズ排除クロマトグラフィーによってろ液中の抗体の重合体（ＨＭＷＳ）の割合を測定し、各吸着剤のＨＭＷＳ吸着率を算出した。ＨＭＷＳ吸着率は次の計算式により算出される値と定義する。式中、培養上清のＨＭＷＳの含量は、ＨＰＬＣの総ピーク面積に対するＨＭＷＳのピーク面積の割合（％）を表す。
［ＨＭＷＳ吸着率（％）］＝｛［吸着剤処理前の培養上清のＨＭＷＳの含量（％）］－［吸着剤処理後の培養上清のＨＭＷＳの含量（％）］｝÷［吸着剤処理前の培養上清のＨＭＷＳの含量（％）］×１００
　各吸着剤の性能をＨＭＷＳ吸着率及び回収率で評価した。各種吸着剤のＨＭＷＳ吸着率および回収率を表１に示す。表１中、ガレオンアース、ガレオン及びネオビードは登録商標である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、いずれの活性白土およびケイ酸アルミニウムも各吸着剤の添加量に比例してＨＭＷＳ吸着率が高まっており、培養上清中からＨＭＷＳの含有量を低減させる効果が見られた。培養上清４ｍＬに吸着剤２４７ｍｇを添加する条件では、４種類すべての活性白土に関して、回収率は６７％以上であり、９４％以上のＨＭＷＳ吸着率を示した。
　また吸着剤がケイ酸アルミニウムの場合、ガレオンニュートラルＤ２－Ｙ（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）を使用すると、回収率は９８％、ＨＭＷＳ吸着率は７６％であった。また、ネオビードＳＡ（水澤化学工業株式会社、ネオビードは登録商標）を使用すると抗体の回収率は１００％、ＨＭＷＳ吸着率は４５％であった。
　以上の結果より、活性白土及びケイ酸アルミニウムは、培養上清からＨＭＷＳを高選択的に吸着する効果を持つことが明らかになった。
［実施例２］ケイ酸アルミニウム（ガレオンニュートラルＤ２－Ｙ）（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）の添加量に対する培養上清からのＨＭＷＳの吸着効果の相関についての検討
　評価した吸着剤の中で抗体の回収率が高く、比較的ＨＭＷＳ吸着率が高かった、ケイ酸アルミニウムのひとつであるガレオンニュートラルＤ２－Ｙ（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）について、添加量に対するＨＭＷＳ吸着率及び回収率の相関を評価した。
　ＩｇＧ１型のヒトモノクロナール抗体（ＭａｂＡ）を含むＣＨＯ細胞培養液を精密ろ過により清澄化し、クエン酸及びトリスヒドロキシメチルアミノメタンを用いてｐＨ７．６に調整した培養上清を調製した。調製した培養上清の抗体濃度は６．１５ｍｇ／ｍＬであった。
　次にこの溶液３ｍＬにガレオンニュートラルＤ２－Ｙ（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）を７０、１４０、２８０、５６０または１１２０ｍｇ添加し、約１６時間転倒混和した。混和液は２９００ｘｇで１０分間遠心分離し、精密ろ過膜（メルク社製　Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ　０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘは登録商標）でろ過し、吸着剤を除去した。
　ろ液について実施例１に記載の方法でＨＭＷＳ吸着率及び回収率を算出し、最適な吸着剤の添加量を評価した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、ガレオンニュートラルＤ２－Ｙ（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）の添加量が５６０ｍｇまでは、添加量を２倍にすると、ＨＭＷＳ吸着率は約２０％向上し、回収率はほぼ１００％を維持した。一方で添加量が１１２０ｍｇの条件では、添加量５６０ｍｇの条件と比べ、吸着率はほとんど向上しない一方で、回収率は８８．９％に低下した。以上の結果より、回収率を維持しながら高い吸着率を示す添加量として最適なのは５６０ｍｇであり、単位吸着剤（１ｍｇ）あたりの抗体の処理量（ｍｇ）に換算すると０．０３３ｍｇ／ｍｇの処理量が最適であることが明らかになった。
［実施例３］ケイ酸アルミニウム（ガレオンニュートラルＤ２－Ｙ）（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）の様々な抗体種の培養上清からのＨＭＷＳに対する吸着効果の確認試験
　種々の抗体由来のＨＭＷＳに対する、ケイ酸アルミニウム（ガレオンニュートラルＤ２－Ｙ）（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）の吸着効果を評価した。
　表３に示す４種類の抗体を含むＣＨＯ細胞培養液を、精密ろ過により清澄化し、クエン酸及びトリスヒドロキシメチルアミノメタンを用いてｐＨ６．０に調整した培養上清を調製した。
　次にそれぞれの培養上清４ｍＬに、ガレオンニュートラルＤ２－Ｙ（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）を、単位吸着剤（ｍｇ）あたりの抗体の処理量（ｍｇ）が０．０３３ｍｇ／ｍｇとなるように添加し（表３）、約１６時間転倒混和した。混和液は２９００Ｇで１０分間遠心分離し、精密ろ過膜（メルク社製Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ　０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘは登録商標）でろ過し、吸着剤を除去した。
　それぞれのろ液について実施例１に記載の方法でＨＭＷＳ吸着率及び回収率を算出した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、抗体の種類によってＨＭＷＳ吸着率に差は見られたものの、いずれの培養上清においても９０％以上の回収率を維持しながら４０％以上のＨＭＷＳ吸着率を示した。以上より、ガレオンニュートラルＤ２－Ｙ（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）は、抗体の種類に依らず、培養上清から高選択的にＨＭＷＳを吸着する効果を持つことが明らかになった。
［実施例４］ゼオライトによる培養上清中のＨＭＷＳの吸着効果の検討
　ＩｇＧ１型のヒトモノクロナール抗体（ＭａｂＡ）を含むＣＨＯ細胞培養液を精密ろ過により清澄化し、クエン酸及びトリスヒドロキシメチルアミノメタンを用いてｐＨ６．０に調整した培養上清を調製した。調製した培養上清の抗体濃度は４．０７ｍｇ／ｍＬであった。
　次にこの溶液４ｍＬに、表４に示す東ソー社製の３８種類のゼオライトを、それぞれ１２４、２４８または４９６ｍｇずつ添加し、約１６時間転倒混和した。混和液は２９００ｘｇで１０分間遠心分離し、精密ろ過膜（メルク社製Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ　０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘは登録商標）でろ過し、ゼオライトを除去した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　得られたサンプルについて、実施例１に記載の方法でＨＭＷＳ吸着率及び回収率を算出し、各ゼオライトの性能を評価した。各種ゼオライトのＨＭＷＳ吸着率を図１に、回収率を図２に示す。
　図１に示すように、３８種類のゼオライトのうち２４種類はゼオライトの添加量に比例してＨＭＷＳ吸着率が向上しており、培養上清中のＨＭＷＳの含有量を低減させる効果が見られた。さらにその中で９３０ＮＨＡ、９６０ＨＯＡ、９８０ＨＯＡ、９９０ＨＯＡ、６６０ＨＯＡおよび６９０ＨＯＡは、培養上清４ｍＬに２４８ｍｇまたは４９６ｍｇのゼオライトを添加したときに７０％以上の回収率および５０％以上のＨＭＷＳ吸着率を示し、培養上清から高選択的にＨＭＷＳを吸着する効果を持つことが明らかになった。
　９３０ＮＨＡ、９６０ＨＯＡ、９８０ＨＯＡおよび９９０ＨＯＡはベータ型ゼオライトに、また６６０ＨＯＡおよび６９０ＨＯＡはモルデナイト型ゼオライトに属しており、これらの結晶構造を持つゼオライトがＨＭＷＳの選択的吸着に適していることが示唆された。
　６６０ＨＯＡで処理した試料についてサイズ排除クロマトグラフィーで分析した溶出パターンを図３（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図３（Ａ）は吸着剤で処理前の溶出パターン、図３（Ｂ）は吸着剤で処理後の溶出パターンをそれぞれ示す。図３（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ピークの面積が吸着剤で処理した後では明らかに小さくなっていることからも、ゼオライトがＨＭＷＳの吸着効果を持つことが示唆された。
［実施例５］ゼオライト（ＨＳＺ－６６０ＨＯＡ）（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）による培養上清からのＨＭＷＳに対する吸着効果の検討
　ゼオライト（ＨＳＺ－６６０ＨＯＡ）（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）の、種々の抗体由来のＨＭＷＳに対する吸着効果を評価するため、以下の試験を行った。
　表５に示す３種類の抗体を含むＣＨＯ細胞培養液を、精密ろ過により清澄化し、培養上清を調製した。これらの培養上清４ｍＬに対して表５に示す量のＨＳＺ－６６０ＨＯＡ（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）を添加し、約１６時間転倒混和した。混和液は２９００ｘｇで１０分間遠心分離し、精密ろ過膜（メルク社製Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ　０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘは登録商標）でろ過し、吸着剤を除去した。
　ろ液について、実施例１に記載の方法でＨＭＷＳ吸着率及び回収率を算出した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、抗体の種類によって吸着率に差は見られたものの、いずれの培養上清を使用した場合でも、８６％以上の回収率を維持しながら３０％以上のＨＭＷＳ吸着率を示した。以上より、ゼオライトは抗体の種類に依らず、培養上清から選択性高くＨＭＷＳを吸着する効果を持つことが明らかになった。
［実施例６］ゼオライト（ＨＳＺ－６６０ＨＯＡ）（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）による粗精製試料中のＨＭＷＳに対する吸着効果の検討
　ＭａｂＡを含む培養上清を精製して得られる粗精製試料に含まれるＨＭＷＳに対する、ゼオライト（ＨＳＺ－６６０ＨＯＡ）（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）の吸着効果を評価した。実施例１と同様の方法で得られたＭａｂＡまたはＭａｂＤを含む培養上清をＧＥ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅに負荷し、１０ｍＭ　トリス－塩酸バッファー（ｐＨ７．０）で洗浄したのち、１００ｍＭ　グリシン－塩酸バッファー（ｐＨ３．２）で溶出させ、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを用いてｐＨを７．０に中和し、粗精製試料を調製した。
　表６に示す量のＨＳＺ－６６０ＨＯＡ（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）を秤量し、次に示す方法で平衡化を行った。平衡化は１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を使用した。
　平衡化方法；ＨＳＺ－６６０ＨＯＡ（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）にバッファーを４０ｍＬ添加し、約１時間転倒混和した。混和液は２０００ｘｇで１０分間遠心分離し上清を除去した。除去した上清のｐＨが７になるまでバッファーの添加、除去を繰り返した。
　平衡化したゼオライトにＭａｂＡまたはＭａｂＤを含む粗精製試料を４ｍＬずつ添加し、約１６時間転倒混和した。混和液は２０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を精密ろ過膜（メルク社製Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ　０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘは登録商標）でろ過し、ゼオライトを除去した。
　ろ液について、実施例１に記載の方法でＨＭＷＳ吸着率を算出した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　抗体の種類によって吸着率に差は見られたものの、いずれの粗精製試料においてもＨＭＷＳの吸着効果が見られた。以上より、ゼオライトは抗体の種類に依らず、培養上清だけでなく、粗精製試料からもＨＭＷＳを吸着する効果を持つことが明らかになった。
　６６０ＨＯＡによる精製前と後のＭａｂ　Ｄを含む粗精製試料についてサイズ排除クロマトグラフィーで分析した溶出パターンを図４（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図４（Ａ）は吸着剤で処理前の溶出パターン、図４（Ｂ）は吸着剤で処理後の溶出パターンをそれぞれ示す。図４（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ＨＭＷＳのピークの面積が吸着剤で処理した後では小さくなっている［反応前のピーク面積：９８７４３０（μＶ＊秒）、反応後のピーク面積：３８８２１９（μＶ＊秒）］ことからも、ゼオライトがＨＭＷＳの吸着効果を持つことが示唆された。
［実施例７］ゼオライト（ＨＳＺ－６６０ＨＯＡ）（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）による粗精製試料中のＨＭＷＳに対する吸着効果の至適ｐＨの検討
　ＭａｂＤを含む培養上清を精製して得られる粗精製試料に含まれるＨＭＷＳに対する、ゼオライト（ＨＳＺ－６６０ＨＯＡ）（東ソー株式会社、ＨＳＺは登録商標）の吸着効果を評価した。
　実施例６と同様の方法で得られたＭａｂＤの粗精製試料を塩酸及びトリスヒドロキシメチルアミノメタンでｐＨを６、７または８に調整した。表７に示す量のＨＳＺ－６６０ＨＯＡを秤量し、実施例６に示す方法で平衡化を行った。平衡化は１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６、７または８）を使用した。
　平衡化したゼオライトに、ｐＨ調整後のＭａｂＤを含む粗精製試料を４ｍＬずつ添加し、約１６時間転倒混和した。混和液は２０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を精密ろ過膜（メルク社製　Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ　０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘは登録商標）でろ過し、ゼオライトを除去した。
　ろ液について、実施例１に記載の方法でＨＭＷＳ吸着率を算出した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、いずれのｐＨに調整した粗精製試料においてもＨＭＷＳの吸着効果が見られた。その中でもｐＨ８のとき最もＨＭＷＳの吸着率が高かった。以上より、ゼオライトによる重合体の吸着のために最適なｐＨは８であることが明らかになった。
　以上より、活性白土、ケイ酸アルミニウムおよびゼオライトなどの、ケイ素原子およびアルミニウム原子を含む無機紛体は、非吸着モードによる抗体の精製に利用できることが示された。
　本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。本出願は、２０１９年７月３１日付けで出願された日本特許出願（特願２０１９－１４１７６８）に基づいており、その全体が引用により援用される。

Claims (22)

  1. 　抗体の精製方法であって、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物を用いて、非吸着モードで抗体と不純物とを分離し、不純物含量が低下した抗体を取得する精製方法。
  2. 　抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項１に記載の精製方法。
  3. 　不純物が宿主細胞蛋白質、抗体由来の重合体、抗体由来の分解物及びＤＮＡから選ばれる少なくとも１である、請求項１または２に記載の精製方法。
  4. 　不純物が抗体由来の重合体である、請求項１または２に記載の精製方法。
  5. 　二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物が活性白土、ケイ酸アルミニウムまたはゼオライトである、請求項１～４のいずれか１項に記載の精製方法。
  6. 　二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物がケイ酸アルミニウムである、請求項１～５のいずれか１項に記載の精製方法。
  7. 　ケイ酸アルミニウムが以下の（ｉ）～（ｉｖ）から選ばれる少なくともいずれか１つの特性を持つ、請求項６に記載の精製方法。
    （ｉ）比表面積が３００～８００ｍ２／ｇである。
    （ｉｉ）細孔容積が０．１～０．５ｍＬ／ｇである。
    （ｉｉｉ）平均細孔直径が１．５～４ｎｍである。
    （ｉｖ）シリカ／アルミナ比が１～５である。
  8. 　ケイ酸アルミニウムがガレオンニュートラルＤ２－Ｙ（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）またはネオビードＳＡ（水澤化学工業株式会社、ネオビードは登録商標）である、請求項６または７に記載の精製方法。
  9. 　二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物が活性白土である、請求項１～５のいずれか１項に記載の精製方法。
  10. 　活性白土が以下の（ｉ）～（ｉｖ）から選ばれる少なくともいずれか１つの特性を持つ、請求項９に記載の精製方法。
    （ｉ）比表面積が１００～４００ｍ２／ｇである。
    （ｉｉ）細孔容積が０．２～０．６ｍＬ／ｇである。
    （ｉｉｉ）平均細孔直径が３～１０ｎｍである。
    （ｉｖ）シリカ／アルミナ比が６～１０である。
  11. 　ケイ酸アルミニウムがガレオンアースＮＶＺ、ガレオンアースＮＶ、ガレオンアースＶ２ＲまたはガレオンアースＶ２（水澤化学工業株式会社、ガレオンは登録商標）である、請求項９または１０に記載の精製方法。
  12. 　二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物がゼオライトである、請求項１～５のいずれか１項に記載の精製方法。
  13. 　ゼオライトが以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）から選ばれる少なくともいずれか１つの特性を持つ、請求項１２に記載の精製方法。
    （ｉ）比表面積が１００～８００ｍ２／ｇである。
    （ｉｉ）細孔直径が０．２～１ｎｍである。
    （ｉｉｉ）シリカ／アルミナ比が２～１５００である。
  14. 　ゼオライトが、β型またはモルデナイト型のゼオライトである、請求項１２または１３に記載の精製方法。
  15. 　ゼオライトが、カウンターカチオンとしてプロトンを含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の精製方法。
  16. 　抗体と不純物との分離をｐＨ４～９で行う、請求項１～１５のいずれか１項に記載の精製方法。
  17. 　抗体と不純物との分離をｐＨ６～９で行う、請求項１～１５のいずれか１項に記載の精製方法。
  18. 　抗体と不純物との分離をｐＨ７．５～８．５で行う、請求項１～１５のいずれか１項に記載の精製方法。
  19. 　前処理として、二酸化ケイ素および酸化アルミニウムを含む無機化合物の、緩衝液による平衡化を行うことを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の精製方法。
  20. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載の精製方法を含む、抗体の製造方法。
  21. 　プロテインＡクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーおよび活性炭クロマトグラフィーの少なくともいずれか１を含む、請求項２０に記載の製造方法。
  22. 　請求項２０または２１に記載の製造方法により製造された抗体。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5795918A (en) * 1980-12-04 1982-06-15 Saikin Kagaku Kenkyusho:Kk Purification of immunoglobulin
JPS606622A (ja) * 1983-06-24 1985-01-14 Fujirebio Inc 免疫グロブリンの精製方法
JP2001129392A (ja) * 1999-11-08 2001-05-15 Takeda Chem Ind Ltd 吸着剤
WO2007062245A2 (en) 2005-11-25 2007-05-31 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Human monoclonal antibody human cd134 (ox40) and methods of making and using same
WO2007114496A1 (ja) 2006-04-06 2007-10-11 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha 新規抗ｃｄ９８抗体
JP2010528076A (ja) 2007-06-01 2010-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 免疫グロブリン精製
JP2015117272A (ja) * 2013-12-17 2015-06-25 日立化成株式会社 高分子の精製方法および精製された高分子、それを用いた半導体用接着剤。
JP2017226678A (ja) * 2012-08-07 2017-12-28 協和発酵キリン株式会社 蛋白質の精製方法
JP2019141768A (ja) 2018-02-19 2019-08-29 株式会社オメガ 被処理水の処理方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5795918A (en) * 1980-12-04 1982-06-15 Saikin Kagaku Kenkyusho:Kk Purification of immunoglobulin
JPS606622A (ja) * 1983-06-24 1985-01-14 Fujirebio Inc 免疫グロブリンの精製方法
JP2001129392A (ja) * 1999-11-08 2001-05-15 Takeda Chem Ind Ltd 吸着剤
WO2007062245A2 (en) 2005-11-25 2007-05-31 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Human monoclonal antibody human cd134 (ox40) and methods of making and using same
WO2007114496A1 (ja) 2006-04-06 2007-10-11 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha 新規抗ｃｄ９８抗体
JP2010528076A (ja) 2007-06-01 2010-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 免疫グロブリン精製
JP2017226678A (ja) * 2012-08-07 2017-12-28 協和発酵キリン株式会社 蛋白質の精製方法
JP2015117272A (ja) * 2013-12-17 2015-06-25 日立化成株式会社 高分子の精製方法および精製された高分子、それを用いた半導体用接着剤。
JP2019141768A (ja) 2018-02-19 2019-08-29 株式会社オメガ 被処理水の処理方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. A. SHUKLA ET AL., JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B, vol. 848, 2007, pages 28 - 39
J. EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 147, 1978, pages 923
M. MATSUI ET AL., CHEMISTRY-EUROPEAN JOURNAL, vol. 7, no. 7, 2001, pages 1555 - 1560
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 53, 1965, pages 288
PROCEEDING OF THE SOCIETY FOR THE BIOLOGICAL MEDICINE, vol. 73, 1950, pages 1
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, vol. 199, 1967, pages 519
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396
Y C. HUANG ET AL., ENZYME MICROB. TECHNOL., vol. 17, 1995, pages 564 - 569
Y C. YU ET AL., BIOTECHNOL. PROG., vol. 14, 1998, pages 332 - 337

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