JP6640799B2 - 蛋白質の精製方法 - Google Patents
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Description
本発明は蛋白質の精製方法及び該精製方法を含む蛋白質の製造方法に関する。特に、本発明は、抗体の精製方法及び該精製方法を含む抗体の製造方法に関する。
遺伝子組換え技術の発達によって、種々の蛋白質を有効成分とする医薬品が供給されるようになった。特に近年は数多くの抗体を有効成分とする医薬品が開発、上市されている。また、これら蛋白質を大量かつ効率的に製造することは、バイオ医薬品産業にとってますます重要な問題となっている。
このような蛋白質は、一般にその目的とする蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターを挿入された組換え細胞を培養することによって産生される。その培養液には、目的とする蛋白質の他に、多種多様の培地由来成分、宿主細胞由来成分または蛋白質由来の副生成物等の不純物が含まれているため、医薬品として要求される純度まで不純物を分離し目的の蛋白質を精製すること及び目的の蛋白質を大量かつ効率的に製造することを両立させることは、非常に困難かつ挑戦的である。
蛋白質の精製方法は、一般に異なるモードのクロマトグラフィーの組み合わせで行われる。クロマトグラフィーは、例えば、電荷、親水性の程度または分子の大きさ等に基づいて、目的の蛋白質と不純物を分離する。
特に、目的の蛋白質が抗体である時は、プロテインＡまたはプロテインＧが抗体のＦｃ鎖などの特定部位に結合する性質を利用して、抗体の精製にプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーまたはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーがクロマトグラフィーの１つとして使用される（特許文献１）。
しかし、一般に使用されているプロテインＡアフィニティ担体は、イオン交換担体または疎水担体等に比べて非常に高価であり、工業的な医薬品製造等で大規模に抗体を精製する場合には、使用する担体量も膨大となることから、その結果、製造コストの増大が避けられない課題となっている。
また、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーまたはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーは、一般には目的の抗体を特異的に担体に吸着させ、吸着した担体を洗浄することで不純物と分離し、最後に目的の抗体を担体から溶出する吸着モードを使用する。この際、洗浄及び溶出に用いるバッファーは異なる為、クロマトグラフィー装置の大型化に伴って、バッファータンク等の付属する製造設備も大型化または複雑化する。更に操作も煩雑となる為、これら全てが製造コスト増大の要因となっている。
以上のような理由で、蛋白質を有効成分とする医薬品の製造コストは、低分子化合物を有効成分とする医薬品の製造コストに比べて非常に高く、この克服が課題となっている。即ち、蛋白質の精製に要するコストの低減がこの分野で望まれている。
一方、目的の蛋白質を含む培養液には宿主細胞から溶出した酵素類が含まれており、蛋白質の精製の過程において、この酵素類により目的の蛋白質が分解、修飾、酸化または還元等を受けることが知られている。この為、酵素類の阻害剤を添加し、目的の蛋白質を分解、修飾、酸化または還元等を受けずに精製する方法が検討されている（特許文献２）。しかし、酵素類の阻害剤を蛋白質の精製に用いた場合には、別途該阻害剤を除去する工程が必要となり、更に阻害剤によっては精製された蛋白質の品質に影響を及ぼす可能性もあることから、必ずしも該阻害剤の添加は最良の方法とは言えない。抜本的な解決方法の１つに、宿主細胞由来の酵素類を除去することが考えられるが、クロマトグラフィー等を利用するしかなく、該酵素類の簡便な除去方法は知られていない。
活性炭は、幅広い非特異的な吸着特性と天然由来等による安価な素材として、化学品製造、食品製造、下水や排水の処理、浄水処理及び低分子医薬品製造等の工業分野にて吸着剤または脱色剤等の用途で使用されている。しかし、その幅広い非特異的な吸着特性から、一般に前記の不純物との分離といった高度な蛋白質の精製に活性炭を使用することは困難であると考えられており、活性炭を用いた蛋白質の精製方法は知られていない。
本発明は、従来の蛋白質の精製方法より製造コストの低減または労力の軽減が可能であり、且つ従来の蛋白質の精製方法と同等以上の不純物との分離特性を有する精製方法、特に抗体の精製において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーに代わる精製方法、及び該精製方法を含む蛋白質の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決する為に鋭意研究をした結果、驚くべきことに、安価な活性炭を用いて非吸着モードにて蛋白質と不純物とを分離し、蛋白質を精製する方法、特に抗体の精製において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーに代えて活性炭を用いた精製方法を見出し、本発明を完成した。
本発明は以下（１）〜（１４）に関する。
（１）蛋白質の精製方法であって、活性炭を用いて、蛋白質と不純物とを分離し、不純物含量が低下した蛋白質を取得する精製方法。
（２）蛋白質の分子量が３００００以上である、（１）に記載の精製方法。
（３）蛋白質が糖蛋白質である、（１）または（２）に記載の精製方法。
（４）糖蛋白質が抗体である、（３）に記載の精製方法。
（５）蛋白質が遺伝子組換え蛋白質である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の精製方法。
（６）不純物が宿主細胞蛋白質、蛋白質由来の重合体、蛋白質由来の分解物またはＤＮＡのいずれかである、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の精製方法。
（７）非吸着モードで分離を行う、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の精製方法。
（８）ｐＨが３〜８で分離を行う、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の精製方法。
（９）活性炭が木質系活性炭である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の精製方法。
（１０）活性炭の平均細孔直径が０．５〜５ｎｍである、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の精製方法。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の精製方法を含む、蛋白質の製造方法。
（１２）プロテインＡクロマトグラフィーを使用しない、（１１）に記載の製造方法。
（１３）陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィーまたは混合モードクロマトグラフィーの何れか１のクロマトグラフィーを含む、（１１）または（１２）に記載の製造方法。
（１４）少なくとも１つの吸着モードのクロマトグラフィーを含む、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１５）（１１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法により製造された蛋白質。
（１）蛋白質の精製方法であって、活性炭を用いて、蛋白質と不純物とを分離し、不純物含量が低下した蛋白質を取得する精製方法。
（２）蛋白質の分子量が３００００以上である、（１）に記載の精製方法。
（３）蛋白質が糖蛋白質である、（１）または（２）に記載の精製方法。
（４）糖蛋白質が抗体である、（３）に記載の精製方法。
（５）蛋白質が遺伝子組換え蛋白質である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の精製方法。
（６）不純物が宿主細胞蛋白質、蛋白質由来の重合体、蛋白質由来の分解物またはＤＮＡのいずれかである、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の精製方法。
（７）非吸着モードで分離を行う、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の精製方法。
（８）ｐＨが３〜８で分離を行う、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の精製方法。
（９）活性炭が木質系活性炭である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の精製方法。
（１０）活性炭の平均細孔直径が０．５〜５ｎｍである、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の精製方法。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の精製方法を含む、蛋白質の製造方法。
（１２）プロテインＡクロマトグラフィーを使用しない、（１１）に記載の製造方法。
（１３）陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィーまたは混合モードクロマトグラフィーの何れか１のクロマトグラフィーを含む、（１１）または（１２）に記載の製造方法。
（１４）少なくとも１つの吸着モードのクロマトグラフィーを含む、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１５）（１１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法により製造された蛋白質。
本発明により、従来の蛋白質の精製方法より製造コストの低減または労力の軽減が可能であり、且つ従来の蛋白質の精製方法と同等以上の不純物との分離特性を有する精製方法、特に抗体の精製において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーに代わる精製方法、及び該精製方法を含む蛋白質の製造方法が提供される。本発明により製造された蛋白質は、医薬品として有用である。
本発明は、蛋白質の精製方法であって、活性炭を用いて、蛋白質と不純物とを分離し、不純物含量が低下した蛋白質を取得する精製方法に関する。
本発明において、蛋白質としては、例えば、糖鎖を有しない天然若しくは非天然の蛋白質、天然若しくは非天然の糖蛋白質、またはそれらの誘導体等が挙げられる。糖蛋白質またはそれらの誘導体としては、糖鎖が異なる分子からなる組成物であってもよい。
蛋白質としては、好ましくは分子量が３００００以上、より好ましくは分子量が５００００以上の蛋白質が挙げられる。
具体的には、例えば、エリスロポエチン、ダルベポエチン、アンチトロンビン（α体若しくはβ体、またはそれらの混合物）、インターフェロン類、インターロイキン類、プロテインＳ、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、トロンボモジュリン、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、顆粒球マクロファージ刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、トロンボポエチンまたは巨核球増殖促進因子ＭＧＤＦ（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ）、繊維芽細胞成長因子ＦＧＦ、上皮細胞成長因子ＥＧＦ、インスリン様成長因子ＩＧＦ、脳由来神経栄養因子ＢＤＮＦ、毛様態神経栄養因子ＣＴＮＦ若しくはグリア細胞由来神経栄養因子ＧＤＮＦ、または抗体およびそれらの誘導体などが挙げられるが、好ましくは抗体、より好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。
抗体としては、例えば、マウス抗体、ラマ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらのＦｃ領域等を改変した抗体等が挙げられ、分子型としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｃ−融合蛋白、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ’２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｓｃＤｂまたはｓｃＤｂＦｃ等が挙げられる。
本発明の精製方法には、目的とする蛋白質及び不純物を含む蛋白質含有水溶液が供される。
蛋白質含有水溶液としては、例えば、血漿、血清、乳若しくは尿など生体から得られた組成物、遺伝子組換え技術若しくは細胞融合技術を用いて得られた蛋白質を生産する細胞または大腸菌等の菌類の培養液、トランスジェニック非ヒト動物、植物若しくは昆虫等から得られた組成物、あるいは無細胞蛋白質合成技術を用いて得られた組成物等が挙げられる。
蛋白質を生産する細胞としては、例えば、宿主細胞に所望のたん白質をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換細胞等が挙げられる。
宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞または酵母細胞等の細胞株が挙げられる。
具体的には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ラットミエローマ細胞であるＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞、胚性幹細胞、または受精卵細胞等が挙げられる。
蛋白質を生産する細胞を培養する培地としては、各々の細胞の培養に適した培地であればいずれも用いられるが、例えば、動物細胞を培養する培地としては、通常の動物細胞の培養に用いられる培地が用いられる。例えば、血清含有培地、血清アルブミン若しくは血清分画物などの動物由来成分を含まない培地、無血清培地、または無蛋白培地等、いずれの培地も用いられるが、好ましくは無血清培地または無蛋白培地が用いられる。
具体的には、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ−ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ ３２５培地（以上、ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＤ ＤＧ４４培地（以上、インビトロジェン社製）若しくはＩＳ ＣＤ−ＣＨＯ培地（アーバインサイエンティフィック社製）、またはこれらの改変培地、混合培地もしくは濃縮培地等が用いられ、好ましくは、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地またはＩＳ ＣＤ−ＣＨＯ培地等が用いられる。
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ−ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ ３２５培地（以上、ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＤ ＤＧ４４培地（以上、インビトロジェン社製）若しくはＩＳ ＣＤ−ＣＨＯ培地（アーバインサイエンティフィック社製）、またはこれらの改変培地、混合培地もしくは濃縮培地等が用いられ、好ましくは、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地またはＩＳ ＣＤ−ＣＨＯ培地等が用いられる。
また、必要に応じて蛋白質を生産する細胞の生育に必要な生理活性物質または栄養因子等を添加することができる。これらの添加物は、培養前に予め培地に含有させるか、培養中に添加培地または添加溶液として培養液へ適宜追加供給する。追加供給の方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態でもよく、また、添加方法は連続または断続のいずれでもよい。
蛋白質を生産するトランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫としては、蛋白質をコードする遺伝子が細胞内に組み込まれた非ヒト動物、植物または昆虫が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはサル等が挙げられる。植物としては、例えば、タバコ、ポテト、トマト、ニンジン、ソイビーン、アブラナ、アルファルファ、コメ、小麦、大麦またはコーン等が挙げられる。
蛋白質含有水溶液の生産方法としては、例えば、国際公開第２００８／１２０８０１号、日本国特開平３−１９８７９２号公報、国際公開第２０１０／０１８８４７号、国際公開第２００７／０６２２４５号または国際公開第２００７／１１４４９６号等に記載の方法が挙げられる。
また、本発明において、蛋白質含有水溶液としては、蛋白質を含有する血漿または尿等生体から得られるものの他、精製する工程で得られる蛋白質含有水溶液も含まれる。具体的には、例えば、細胞除去液、沈殿物除去液、アルコール分画液、塩析分画液、クロマトグラフィー溶出液等が挙げられる。
細胞除去液としては、血漿、血清、乳若しくは尿等生体から得られた蛋白質含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫より得られた蛋白質含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られた蛋白質含有水溶液または精製する工程で得られる蛋白質含有水溶液より、細胞を除去した溶液等が挙げられる。具体的には、例えば、細胞培養液より遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法等によって細胞を除去して得られる溶液が挙げられる。
デプスフィルターとしては、具体的には、例えば、ミリスタックプラスＨＣデプスフィルター、ミリスタックプラスＤＥデプスフィルター、ミリスタックプラスＣＥデプスフィルター（メルクミリポア社製）、スープラＰデプスフィルター（ポール社製）、ザルトクリアーＰＢデプスフィルター、ザルトクリアーＰＣデプスフィルター（ザルトリウス社製）、ゼータプラスＳＰデプスフィルター、ゼータプラスＡＰデプスフィルター、ゼータプラスＬＡデプスフィルター、ゼータプラスデリピッドデプスフィルター、ゼータプラスＺＡデプスフィルターまたはゼータプラスＥＸＴ荷電デプスフィルター（住友スリーエム社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。
沈殿物除去液としては、血漿、血清、乳若しくは尿等生体から得られた蛋白質含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫より得られた蛋白質含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られた蛋白質含有水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られた蛋白質含有水溶液または精製する工程で得られる蛋白質含有水溶液より、低ｐＨ処理またはカプリル酸、有機溶剤、ポリエチレングリコール、界面活性剤、塩、アミノ酸若しくはポリマー等の添加により凝集沈殿（フロキュレーション）または二相分離を行った後に、沈殿物を除去した溶液等が挙げられる。沈殿物の除去方法としては、例えば、遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法等が挙げられる。
低ｐＨ処理のｐＨとしては、好ましくｐＨ３〜６であり、塩酸、酢酸、クエン酸またはリン酸等の酸の添加により調整される。
アルコール分画液としては、血漿、血清、乳若しくは尿等生体から得られた蛋白質含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫より得られた蛋白質含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られた蛋白質含有水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られた蛋白質含有水溶液または精製する工程で得られた蛋白質含有水溶液より、アルコール等を添加することで調製された分画液等が挙げられる。具体的には、例えば、低温エタノール分画法等の手法で得られる分画液が挙げられる。
塩析分画液としては、血漿、血清、乳若しくは尿等生体から得られた蛋白質含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫より得られた蛋白質含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られた蛋白質含有水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られた蛋白質含有水溶液または精製する工程で得られた蛋白質含有水溶液より、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム等の塩を添加し、蛋白質を析出させることで調製された分画液等が挙げられる。
クロマトグラフィー溶出液としては、血漿、血清、乳若しくは尿等生体から得られた蛋白質含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫より得られた蛋白質含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られた蛋白質含有水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られた蛋白質含有水溶液または精製する工程で得られた蛋白質含有水溶液をクロマトグラフィーに用いられる担体または膜に吸着させ、適当な溶出液で溶出すること、または非吸着させることにより得られた、蛋白質溶出液等があげられる。
クロマトグラフィーに用いられる担体または膜としては、アフィニティ担体、イオン交換担体、イオン交換膜、ゲルろ過担体、疎水性相互作用担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、硫酸化アガロース担体、混合モード（マルチモーダル）担体等が挙げられる。
イオン交換担体またはイオン交換膜としては、イオン交換基を有する分子、例えば、硫酸基、メチル硫酸基、スルフォフェニル基、スルフォプロピル基、カルボキシメチル基、４級アンモニウム基、４級アミノエチル基またはジエチルアミノエチル基等を、ベース担体または膜、例えば、セルロース、セファロース、アガロース、キトサン、アクリル酸重合体若しくはスチレン−ジビニルベンゼン共重合体などのポリマーおよびその誘導体（架橋ポリマーを含む）、シリカ粒子、ガラス粒子、セラミック粒子またはその表面処理粒子等で構成されたポリマー等に直接または間接的に結合した担体または膜が挙げられ、具体的には、例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０（以上、東ソー社製）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ Ｈｉｃａｐ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｑ（以上、メルクミリポア社製）、セルファインＭＡＸ−Ｑ（ＪＮＣ社製）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（ポール社製）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ（以上、ザルトリウス社製）、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｃａｐｔｏ Ｓ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＸＳ（以上、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ−、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＯ３ −、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＥ Ｈｉｃａｐ（以上、メルクミリポア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｓ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ ＣＭ−６５０（以上、東ソー社製）、セルファインＭＡＸ−Ｓ（ＪＮＣ社製）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ（ポール社製）またはＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ（ザルトリウス社製）、ダイヤイオンＰＫ、ダイヤイオンＰＡ、ダイヤイオンＣＲ、ダイヤイオンＣＲ、ダイヤイオンＡＭＰ（以上、三菱化学社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。
アフィニティ担体としては、目的とする蛋白質に親和性を有する分子、例えば、ヘパリン、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬ等を、前記と同様のベース担体に直接または間接的に結合した担体が挙げられ、具体的には、例えば、Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）、プロセップ−ヘパリン（メルクミリポア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｈｅｐａｒｉｎ−６５０（東ソー社製）、Ｈｅｐａｒｉｎ ＨｙｐｅｒＤ（ポール社製）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｌ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、Ｐｒｏｓｅｐ ｖＡ Ｈｉｃａｐａｃｉｔｙ、Ｐｒｏｓｅｐ ｖＡ Ｕｌｔｒａ、Ｐｒｏｓｅｐ Ｕｌｔｒａｐｌｕｓ（以上、メルクミリポア社製）等が挙げられる。
ゲルろ過担体としては、例えば、デキストラン、アリルデキストラン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、セルロース、アガロース、スチレン、ジビニルベンゼン、ポリビニルアルコール、シリカまたはキトサン等で構成されたポリマーからなる担体が挙げられ、具体的には、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ、Ｓｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷシリーズ、ＴＳＫｇｅｌ ＰＷシリーズ（以上、東ソー社製）、Ｂｉｏ ｇｅｌ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｂｉｏ ｇｅｌ Ｐ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（以上、バイオラッド社製）、セルファインＧＨ、セルファインＧＣＬ（以上、ＪＮＣ社製）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＧＦ０５、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＧＦ２０００、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ（以上、ポール社製）またはフラクトゲル ＢｉｏＳＥＣ（メルクミリポア社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
疎水相互作用担体としては、疎水性を有する分子、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、オクチル基、エーテル基またはフェニル基等を、前記と同様のベース担体に直接または間接的に結合した担体が挙げられ、具体的には、例えば、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ−ｓｕｂ）、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｌｏｗ−ｓｕｂ）、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｈｅｘｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｅｔｈｅｒ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＰＰＧ−６００、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６００、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｓｕｐｅｒ Ｂｕｔｙｌ−５５０（以上、東ソー社製）、Ｍａｃｔｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−Ｂｕｔｙｌ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ（以上、バイオラッド社製）、ＱＭＡ Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ、Ｍｅｔｈｙｌ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ（以上、ポール社製）、フラクトゲル Ｐｈｅｎｙｌ（Ｓ）、フラクトゲル Ｐｒｏｐｙｌ（Ｓ）（以上、メルクミリポア社製）、フェニル−セルロファイン（ＪＮＣ社製）、ダイヤイオンＨＰ、ダイヤイオンＳＰ（以上、三菱化学社製）ブチル化キトパール、フェニル化キトパール（以上、富士紡ホールディングズ社製）等が挙げられる。
逆相担体としては、例えば、炭化水素基を固相マトリックスに、直接または間接的に結合した担体が挙げられる。炭化水素基としては、例えば、トリメチル基、ブチル基、フェニル基、オクチル基またはオクタデシル基及びこれらの末端を改変した官能基等が挙げられる。具体的には、例えば、ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＲＰＣシリーズまたはＳＯＵＲＣＥ ＲＰＣシリーズ（以上、ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
ヒドロキシアパタイト担体としては、例えば、ＣＨＴ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ ＩまたはＴｙｐｅ ＩＩ（以上、バイオラッド社製）が挙げられるが、これに限定されない。また、フルオロアパタイト担体としては、例えば、ＣＦＴ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｆｌｕｏｒｏａｐａｔｉｔｅ（バイオラッド社製）等が挙げられるが、これに限定されない。
硫酸化セルロース担体または硫酸化アガロース担体としては、例えば、セルファインサルフェイト、セルファインサルフェイトｍ、セルファインサルフェイトｃ、硫酸化セルロファインｍ、硫酸化セルロファインｃ、硫酸化セルファインｍまたは硫酸化セルファインｃ（以上、ＪＮＣ社製）またはＣａｐｔｏ ＤｅＶｉｒＳ（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
混合モード担体としては、異なる選択性を有する２種類以上の官能基、好ましくは前記と同様のイオン交換基および前記と同様の疎水性相互作用基を、前記と同様のベース担体に直接または間接的に結合した担体が挙げられ、具体的には、例えば、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＨＥＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（以上、ポール社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍ（東ソー社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において蛋白質が抗体である場合、蛋白質含有水溶液としては、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーを用いずに得られた蛋白質含有水溶液、より好ましくはプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを用いずに得られた蛋白質含有水溶液が挙げられる。
更に、蛋白質含有水溶液は、粒子等の不溶物が存在する場合には予めそれらを除去し、不溶物を除去した後に本発明の精製方法に供してもよい。粒子等の不溶物の除去方法としては、例えば、遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法が挙げられる。また、必要に応じて後述の蛋白質含有水溶液のｐＨ、導電率、緩衝液、蛋白質濃度または活性炭の単位体積あたりの蛋白質付加量等を調整した後に本発明の精製方法に供される。
ｐＨ、導電率、緩衝液、蛋白質濃度または活性炭の単位体積あたりの蛋白質付加量等を調整する方法としては、例えば、限外ろ過膜を用いた限外ろ過法等が挙げられる。
限外ろ過膜としては、通常の限外ろ過膜の他、プラスまたはマイナスの電荷が付加された限外ろ過膜も含まれ、具体的には、例えば、ペリコン３ウルトラセル膜、ペリコン３バイオマックス膜、ペリコン２ウルトラセル膜、ペリコン２バイオマックス膜（以上、メルクミリポア社製）、オメガメンブラン（ポール社製）、Ｋｖｉｃｋ膜（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明において、不純物としては、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）、蛋白質由来の重合体、蛋白質由来の分解物、変性、糖鎖成分の除去、酸化若しくは脱アミド等を受けた蛋白質由来の修飾体、ＤＮＡ、培地由来成分、培養添加物または宿主細胞から溶出した酵素類等が挙げられ、好ましくは宿主細胞蛋白質、蛋白質由来の重合体、蛋白質由来の分解物またはＤＮＡが挙げられる。
宿主細胞から溶出した酵素類としては、例えば、糖除去酵素類、蛋白質加水分解酵素類または酸化還元酵素類等が挙げられる。
糖除去酵素としては、具体的には、例えば、ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、ガラクトシダーゼまたはグリカナーゼ等が挙げられる。蛋白質分解酵素としては、具体的には、例えば、セリンプロテアーゼ、エステラーゼ、システインプロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼまたはカテプシン等が挙げられる。酸化還元酵素としては、具体的には、例えば、チオレドキシンレダクターゼ等のチオレドキシン関連酵素等が挙げられる。アミノ酸異性化酵素としては、具体的には、例えば、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。
本発明の精製方法に用いられる活性炭としては、医薬品の製造に適した活性炭であればいずれも用いられ、１種類の活性炭を単独で使用しても、２種類以上の活性炭を単独または混合して用いてもよい。
活性炭としては、例えば、鉱物系活性炭または植物系活性炭等が挙げられる。鉱物系活性炭としては、具体的には、例えば、石炭系活性炭、石油系活性炭等が挙げられ、植物系活性炭としては、具体的には、例えば、木質系活性炭またはやし殻活性炭等が挙げられ、好ましくは木質系活性炭が挙げられる。
活性炭の原料としては炭素質の物質であればいずれも用いられるが、例えば、おが屑、木炭、素灰、草炭、ピート若しくは木材チップ等の木質、やし殻、亜炭、褐炭若しくは無煙炭等の石炭、石炭ピッチ、石油ピッチ、オイルカーボン、レーヨン、アクリロニトリルまたはフェノール樹脂等が挙げられる。
活性炭の製造方法としては、特に限定されないが、例えば、高温で塩化亜鉛若しくは燐酸等の薬品を添加、浸透させ、高温で炭化反応させる薬液賦活法または炭化した原料及び水蒸気、二酸化炭素、空気若しくは燃焼ガス等のガスを高温で反応させるガス賦活法が挙げられる。
活性炭の形状としては、医薬品の製造に適した形状であればいずれも用いられるが、例えば、粉砕炭、顆粒炭、球状炭若しくはペレット炭等の粒状活性炭、ファイバー若しくはクロス等の繊維状活性炭またはシート状、成形体若しくはハニカム状等の特殊成形活性炭、粉末活性炭等が挙げられる。
また、プラス若しくはマイナスの電荷が付加された活性炭またはポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＨＥＭＡ）、ヘパリン、セルロース若しくはポリウレタン等の表面修飾剤で修飾された活性炭も本発明の活性炭に含まれる。
活性炭の平均細孔直径としては、特に限定されないが、通常は０．１〜２０ｎｍ、好ましくは０．５〜５ｎｍ、より好ましくは１〜３ｎｍである。
具体的には、例えば、カルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、特製白鷺、白鷺Ａ、白鷺Ｃ、白鷺Ｃ−１、白鷺ＤＯ−２、白鷺ＤＯ−５、白鷺ＤＯ−１１、白鷺ＤＣ、白鷺ＤＯ、白鷺Ｇｘ、白鷺Ｇ、白鷺ＧＨ、白鷺ＦＡＣ−１０、白鷺Ｍ、白鷺Ｐ、白鷺ＰＨＣ、白鷺Ｇｃ、白鷺ＧＨ、白鷺ＧＭ、白鷺ＧＳ、白鷺ＧＴ、白鷺ＧＡＡ、白鷺ＧＯＣ、白鷺ＧＯＸ、白鷺ＡＰＲＣ、白鷺ＴＡＣ、白鷺ＭＡＣ、白鷺ＸＲＣ、白鷺ＮＣＣ、白鷺ＳＲＣＸ、白鷺Ｗｃ、白鷺ＬＧＫ、白鷺ＫＬ、白鷺ＷＨ、白鷺Ｗ、白鷺ＷＨＡ、白鷺ＬＨ、白鷺ＫＬ、白鷺ＬＧＫ、白鷺ＭＡＣ−Ｗ、白鷺Ｓ、白鷺Ｓｘ、白鷺Ｘ２Ｍ、白鷺Ｘ７０００、白鷺Ｘ７１００、白鷺ＤＸ７−３、モルシーボン（以上、日本エンバイオケミカルズ社製）、ＡＣＦ、太閤（以上、富士ケミカル社製）、ＧＬＣ（以上、クラレケミカル社製）、太閤Ｓ、太閤Ｋ、太閤Ｑ（以上、フタムラ化学社製）、ＧＡＣ、ＣＮ、ＣＧ、ＣＡＰ／ＣＧＰ、ＳＸ、ＣＡ（以上、日本ノリット社製）等が挙げられる。
本発明の精製方法の手段としては、特に限定されないが、例えば、バッチ法、膜処理法またはカラムクロマトグラフィー法等が挙げられ、それぞれの手段に応じて適切な活性炭の形状が選択される。必要に応じて、多孔性ポリマー若しくはゲルに活性炭を封入した粒子等の形態またはポリプロピレン若しくはセルロース等のサポート剤若しくは繊維等を用いて活性炭を吸着、固定若しくは成形した膜若しくはカードリッジ等の形態等にて使用することも出来る。具体的には、ＣＵＮＯ活性炭フィルターカードリッジ、ゼータプラス活性炭フィルターカードリッジ（住友スリーエム社製）、ミリスタックプラス活性炭フィルター（メルクミリポア社製）、スープラＡＫＳフィルター（ポール社製）、アドール（以上、ユニチカ社製）、Ｋフィルター、活性炭シート（以上、東洋紡社製）、へマックス（クラレ社製）、ヘモソーバ（旭化成メディカル社製）、へモカラム（テルモ社製）、へセルス（帝人社製）等が挙げられる。
また、目的の蛋白質及び前記精製方法の手段により、用いる活性炭の充填密度、粒度、堅度、乾燥減量、強熱残分、比表面積、細孔容積またはｐＨ等を適宜選択することも出来る。
本発明の精製方法は、好ましくは非吸着モードで行われる。非吸着モードとは、蛋白質含有水溶液を活性炭と接触させ、目的の蛋白質を該活性炭に吸着させずに非吸着画分を回収することを意味する。具体的には、予め蛋白質含有液のｐＨ、導電率、緩衝液、蛋白質濃度、活性炭の単位体積あたりの蛋白質負荷量、温度または活性炭への接触時間等を調整し、活性炭に接触させることにより、目的の蛋白質を活性炭に吸着させずに不純物を活性炭に吸着させ、非吸着画分に不純物含量が低下した蛋白質を回収することが出来る。
活性炭に接触させる蛋白質含有水溶液のｐＨは、好ましくは２〜９であり、より好ましくは３〜８である。特に、蛋白質が抗体である場合、活性炭に接触させる蛋白質含有水溶液のｐＨは、好ましくは２〜８であり、より好ましくは３〜７であり、特に好ましくは４〜６であり、最も好ましくは４〜５である。また、蛋白質含有水溶液を構成する塩として、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ等が挙げられる。これらの濃度は好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、例えば、０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の他の塩と組み合わせて用いることも出来る。更に、緩衝液成分には、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくはヒスチジン等のアミノ酸、グルコース、スクロース、ラクトース、シアル酸等の糖若しくはその誘導体等と組み合わせて用いることも出来る。
活性炭に接触させる蛋白質含有水溶液の温度は、好ましくは４℃から６０℃、より好ましくは１０℃から５０℃、特に好ましくは２０℃から４０℃である。
本発明において、活性炭の非吸着画分を回収することで、不純物含量が低下した蛋白質を高い回収率で得ることが出来る。具体的には、不純物含量として、宿主細胞蛋白質の含量が好ましくは蛋白質１ｍｇあたり１０００００ｎｇ以下、より好ましくは蛋白質１ｍｇあたり１００００ｎｇ以下、特に好ましくは蛋白質１ｍｇあたり１０００ｎｇ以下、蛋白質由来の重合体の含量が好ましくは５％以下、より好ましくは４％以下、特に好ましくは３％以下、蛋白質由来の分解物が好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、特に好ましくは４％以下、最も好ましくは３％以下で得ることが出来る。回収率としては、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、宿主細胞蛋白質の低減率（ＨＣＰ ＬＲＶ）としては、好ましくは１以上、より好ましくは１．５以上、特に好ましくは２以上で得ることが出来る。
本発明において、不純物含量が低下した蛋白質の回収率、不純物含量は、通常蛋白質精製において用いられる分析法を適用することが出来る。例えば、回収率は吸光度またはプロテインＡなどのアフィニティＨＰＬＣ法等、宿主細胞蛋白質の含量はＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法、ウエスタンブロッティング法または電気化学発光法等、蛋白質由来の重合体若しくは蛋白質由来の分解物はゲルろ過ＨＰＬＣ法、イオン交換ＨＰＬＣ法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、光散乱法または超遠心法等、ＤＮＡはピコグリーン法、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法またはＱＰＣＲ法等の分析法によりそれぞれ測定することが出来る。
本発明において、不純物含量が低下した蛋白質の回収率、不純物含量は、通常蛋白質精製において用いられる分析法を適用することが出来る。例えば、回収率は吸光度またはプロテインＡなどのアフィニティＨＰＬＣ法等、宿主細胞蛋白質の含量はＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法、ウエスタンブロッティング法または電気化学発光法等、蛋白質由来の重合体若しくは蛋白質由来の分解物はゲルろ過ＨＰＬＣ法、イオン交換ＨＰＬＣ法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、光散乱法または超遠心法等、ＤＮＡはピコグリーン法、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法またはＱＰＣＲ法等の分析法によりそれぞれ測定することが出来る。
また、本発明は、活性炭を用いて、蛋白質と不純物とを分離し、不純物含量が低下した蛋白質を取得する精製方法を含む、蛋白質の製造方法に関する。
本発明の製造方法において、活性炭と組み合わせる精製方法としては、医薬品の製造に適した方法であればいずれも用いられるが、例えば、クロマトグラフィー、アルコール分画、沈殿物除去、塩析、緩衝液交換、濃縮、希釈、ろ過、ウイルス不活性化、ウイルス除去等が挙げられる。活性炭と組み合わせる精製方法は、複数の種類、数を組み合わせてもよい。また、これらの活性炭と組み合わせる精製方法は、活性炭を用いた精製方法の前後を問わず実施することが出来る。
活性炭と組み合わせるクロマトグラフィーに用いられる担体または膜としては、前記と同様のアフィニティ担体、イオン交換担体、イオン交換膜、ゲルろ過担体、疎水性相互作用担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、硫酸化アガロース担体、混合モード担体等が挙げられる。
本発明において蛋白質が抗体である場合、活性炭を用いた精製方法と組み合わせるクロマトグラフィーには、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーを含めない製造方法、より好ましくはプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを含めない製造方法が挙げられる。蛋白質が抗体である場合、活性炭と組み合わせるクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーまたはその組み合わせが挙げられる。
活性炭と組み合わせるクロマトグラフィーは、その目的に応じて吸着モードまたは非吸着モードで行われる。好ましくは、活性炭と組み合わせるクロマトグラフィーのうち、少なくとも１つのクロマトグラフィーは吸着モードで行われる。
該クロマトグラフィーにおける吸着モードとは、該クロマトグラフィーに供する水溶液を該担体または該膜に接触させ、目的の蛋白質を該担体または該膜に吸着させた後、必要に応じて洗浄を行い、その後、ｐＨ、電気伝導度、緩衝液成分、塩濃度または添加物等を変更した緩衝液で溶出させて吸着画分を回収することを意味する。該クロマトグラフィーにおける非吸着モードとは、該クロマトグラフィーに供する水溶液を該担体または該膜と接触させ、目的の蛋白質を該担体または該膜に吸着させずに非吸着画分を回収することを意味する。
本発明の蛋白質の製造方法において、例えば、活性炭と組み合わせる全てのクロマトグラフィーが非吸着モードで行われる蛋白質の製造方法（Ａｌｌ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）が挙げられる。
また、本発明において蛋白質が抗体である場合、例えば、活性炭と用いた精製方法の後に、引き続き非吸着モードで行われる陰イオン交換クロマトグラフィー、更に引き続き吸着モードで行われる陽イオン交換クロマトグラフィーを行う製造方法、または活性炭と用いた精製方法の後に、引き続き吸着モードで行われる陽イオン交換クロマトグラフィー、更に引き続き非吸着モードで行われる陰イオン交換クロマトグラフィーを行う製造方法等が挙げられる。
活性炭と組み合わせるクロマトグラフィーに供する水溶液または洗浄に使用する緩衝液は、ｐＨ、電気伝導度、緩衝液成分、塩濃度または添加物等について、それぞれ好適な条件を選定する。
クロマトグラフィーの条件を選定する上で、目的の蛋白質と分離したい化合物との物理化学的性質の違い、例えば、等電点、電荷、疎水性度、分子サイズまたは立体構造等の違いを利用することが出来る。吸着モードの溶出方法としては、目的の蛋白質と担体との親和性が低下するような特定の塩濃度またはｐＨの緩衝液を通液して溶出させる一段階溶出法、段階的に塩濃度またはｐＨを変化させて目的の蛋白質を溶出させるステップワイズ法または連続的に塩濃度またはｐＨを変化させて目的の蛋白質を溶出させるグラジエント法が挙げられる。
緩衝液を構成する塩としては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅ等が挙げられる。また上記の塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのような他の塩と組み合わせて用いることも出来る。更に、緩衝液成分には、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくはヒスチジン等のアミノ酸、グルコース、スクロース、ラクトース、シアル酸等の糖若しくはその誘導体等と組み合わせて用いることも出来る。
本発明の製造方法により、不純物含量が低下した蛋白質を高い回収率で得ることが出来る。具体的には、不純物含量として、宿主細胞蛋白質の含量が好ましくは蛋白質１ｍｇあたり１００ｎｇ以下、より好ましくは蛋白質１ｍｇあたり１０ｎｇ以下、蛋白質由来の重合体の含量が好ましくは３．５％以下、より好ましくは１％以下、蛋白質由来の分解物が好ましくは３．５％以下、より好ましくは１％以下で得ることが出来る。回収率としては、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上で得ることが出来る。
以下、実施例により本発明について更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１ Ｍａｂ Ａ精製その１（活性炭を含む非吸着モード精製）
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約６００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離及びフィルターで除去した。得られた清澄化液をトリス溶液で中和し、ペリコン３ウルトラセル膜（ミリポア社製、３０ｋＤ、０．１１ｍ２）で約６倍に濃縮した。濃縮後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）でバッファー交換し、濃縮／バッファー交換溶液を得た。
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約６００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離及びフィルターで除去した。得られた清澄化液をトリス溶液で中和し、ペリコン３ウルトラセル膜（ミリポア社製、３０ｋＤ、０．１１ｍ２）で約６倍に濃縮した。濃縮後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）でバッファー交換し、濃縮／バッファー交換溶液を得た。
次いで、以下の手順で活性炭を含むＭａｂ Ａ精製を全て非吸着モードにて実施した。まず、得られた濃縮／バッファー交換溶液を活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ａとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ａを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。
得られた活性炭溶出液Ａを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。
得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液にクエン酸ナトリウムを１０ｍｍｏｌ／Ｌ相当添加後、塩酸にてｐＨ７．０に調整した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）をクエン酸溶液にて、ｐＨ７．０に調整した平衡化緩衝液で平衡化した混合モードクロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、１０ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分の一部をＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ溶出液としてプールした。
得られたＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ溶出液を、酢酸を用いてｐＨ４．５に調整後、活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ｂとしてプールした。得られた活性炭溶出液ＢをＭａｂ Ａ最終精製品とした。
Ｍａｂ Ａ最終精製品の重合体含有率及び分解物含有率についてゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて、宿主細胞蛋白質含有量についてＥＬＩＳＡ法を用いて分析した。
Ｍａｂ Ａ最終精製品の分析結果を図１、２及び３に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ａ精製品が取得できた。
Ｍａｂ Ａ最終精製品の分析結果を図１、２及び３に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ａ精製品が取得できた。
実施例２ Ｍａｂ Ｂ精製その１（活性炭を含む非吸着モード精製）
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約６００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離及びフィルターで除去した。得られた清澄化液をトリス溶液で中和し、ペリコン３ウルトラセル膜（ミリポア社製、３０ｋＤ、０．１１ｍ２）で約６倍に濃縮した。濃縮後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）でバッファー交換し、濃縮／バッファー交換溶液を得た。
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約６００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離及びフィルターで除去した。得られた清澄化液をトリス溶液で中和し、ペリコン３ウルトラセル膜（ミリポア社製、３０ｋＤ、０．１１ｍ２）で約６倍に濃縮した。濃縮後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）でバッファー交換し、濃縮／バッファー交換溶液を得た。
次いで、以下の手順で活性炭を含むＭａｂ Ｂ精製を全て非吸着モードにて実施した。まず、得られた濃縮／バッファー交換溶液を活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ａとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ａを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液Ａとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ａを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液Ａとしてプールした。
得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液Ａにクエン酸ナトリウムを１０ｍｍｏｌ／Ｌ相当添加後、塩酸にてｐＨ７．０に調整した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）をクエン酸溶液にて、ｐＨ７．０に調整した平衡化緩衝液で平衡化した混合モードクロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、１０ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分の一部をＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ溶出液としてプールした。
得られたＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ溶出液を、酢酸を用いてｐＨ４．５に調整後、活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ｂとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ｂを、トリス溶液を用いてｐＨ８．０に調整後、フィルターろ過を行い、フィルターろ過液を得た。得られたフィルターろ過液を１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液Ｂとしてプールした。得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液ＢをＭａｂ Ｂ最終精製品とした。
Ｍａｂ Ｂ最終精製品の重合体含有率、分解物含有率及び宿主細胞蛋白質含有量について実施例１と同様の方法を用いて分析した。
Ｍａｂ Ｂ最終精製品の分析結果を図１、２及び３に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ｂ精製品が取得できた。
Ｍａｂ Ｂ最終精製品の分析結果を図１、２及び３に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ｂ精製品が取得できた。
実施例３ Ｍａｂ Ｃ精製その１（活性炭を含む非吸着モード精製）
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｃ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約６００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離及びフィルターで除去した。得られた清澄化液をトリス溶液で中和し、ペリコン３ウルトラセル膜（ミリポア社製、３０ｋＤ、０．１１ｍ２）で約６倍に濃縮した。濃縮後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．１）でバッファー交換し、濃縮／バッファー交換溶液を得た。
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｃ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約６００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離及びフィルターで除去した。得られた清澄化液をトリス溶液で中和し、ペリコン３ウルトラセル膜（ミリポア社製、３０ｋＤ、０．１１ｍ２）で約６倍に濃縮した。濃縮後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．１）でバッファー交換し、濃縮／バッファー交換溶液を得た。
次いで、以下の手順で活性炭を含むＭａｂ Ｃ精製を全て非吸着モードにて実施した。まず、得られた濃縮／バッファー交換溶液を活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータプラスＥＸＴ荷電デプスフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ａとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ａを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．１）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。
得られた活性炭溶出液Ａを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．１）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。
得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプール液にクエン酸／クエン酸ナトリウムを１０ｍｍｏｌ／Ｌ相当添加後、塩酸にてｐＨ６．０に調整した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．１）をクエン酸溶液にて、ｐＨ６．０に調整した平衡化緩衝液で平衡化した混合モードクロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、１０ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分の一部をＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ溶出液としてプールした。
得られたＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ溶出液を、酢酸を用いてｐＨ４．５に調整後、活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ｂとしてプールした。得られた活性炭溶出液ＢをＭａｂ Ｃ最終精製品とした。
Ｍａｂ Ｃ最終精製品の重合体含有率、分解物含有率及び宿主細胞蛋白質含有量について実施例１と同様の方法を用いて分析した。
Ｍａｂ Ｃ最終精製品の分析結果は図１、２及び３に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ｃ精製品が取得できた。
Ｍａｂ Ｃ最終精製品の分析結果は図１、２及び３に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ｃ精製品が取得できた。
実施例４ Ｍａｂ Ａ精製その２（活性炭を含む非吸着モード精製）
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約１００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離で除去し、清澄化液を得た。
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約１００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離で除去し、清澄化液を得た。
次いで、以下の手順で活性炭を含むＭａｂ Ａ精製を全て非吸着モードにて実施した。まず、得られた清澄化液を活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ａとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ａを１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ミリポア社製、ＰｒｏＲｅｓ Ｓ、３ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、７カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分の一部をＰｒｏＲｅｓ Ｓ溶出液としてプールした。
得られたＰｒｏＲｅｓ Ｓ溶出液を活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ｂとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ｂを５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で４倍に希釈後、トリス溶液で中和し、フィルターろ過した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液をＭａｂ Ａ最終精製品とした。
得られた活性炭溶出液Ｂを５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で４倍に希釈後、トリス溶液で中和し、フィルターろ過した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液をＭａｂ Ａ最終精製品とした。
Ｍａｂ Ａ最終精製品の重合体含有率、分解物含有率及び宿主細胞蛋白質含有量について実施例１と同様の方法を用いて分析した。
Ｍａｂ Ａ最終精製品の分析結果を図４、５及び６に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ａ精製品が取得できた。
Ｍａｂ Ａ最終精製品の分析結果を図４、５及び６に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ａ精製品が取得できた。
実施例５ Ｍａｂ Ｂ精製その２（活性炭を含む非吸着モード精製）
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約１００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離で除去し、清澄化液を得た。
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約１００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離で除去し、清澄化液を得た。
次いで、以下の手順で活性炭を含むＭａｂ Ｂ精製を全て非吸着モードにて実施した。まず、得られた清澄化液を活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ａとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ａを１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ミリポア社製、ＰｒｏＲｅｓ Ｓ、３ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、７カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分の一部をＰｒｏＲｅｓ Ｓ溶出液としてプールした。
得られたＰｒｏＲｅｓ Ｓ溶出液を活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ｂとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ｂを５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で４倍に希釈後、トリス溶液で中和し、フィルターろ過した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓ溶出液としてプールした。得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液をＭａｂ Ｂ最終精製品とした。
得られた活性炭溶出液Ｂを５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で４倍に希釈後、トリス溶液で中和し、フィルターろ過した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓ溶出液としてプールした。得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液をＭａｂ Ｂ最終精製品とした。
Ｍａｂ Ｂ最終精製品の重合体含有率、分解物含有率及び宿主細胞蛋白質含有量について実施例１と同様の方法を用いて分析した。
Ｍａｂ Ｂ最終精製品の分析結果を図４、５及び６に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ｂ精製品が取得できた。
Ｍａｂ Ｂ最終精製品の分析結果を図４、５及び６に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ｂ精製品が取得できた。
実施例６ Ｍａｂ Ｃ精製その２（活性炭を含む非吸着モード精製）
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｃ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約１００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離で除去し、清澄化液を得た。
予め精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｃ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約１００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離で除去し、清澄化液を得た。
次いで、以下の手順で活性炭を含むＭａｂ Ｃ精製を全て非吸着モードにて実施した。まず、得られた清澄化液を活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ａとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ａを１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５） からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ミリポア社製、ＰｒｏＲｅｓ Ｓ、３ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分の一部をＰｒｏＲｅｓ Ｓ溶出液としてプールした。
得られたＰｒｏＲｅｓ Ｓ溶出液を活性炭フィルター（キュノ社製、ゼータカーボンフィルター、２５ｃｍ２）に通液し、活性炭溶出液Ｂとしてプールした。
得られた活性炭溶出液Ｂを５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で４倍に希釈後、トリス溶液で中和し、フィルターろ過した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液をＭａｂ Ｃ最終精製品とした。
得られた活性炭溶出液Ｂを５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で４倍に希釈後、トリス溶液で中和し、フィルターろ過した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１１ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液をＭａｂ Ｃ最終精製品とした。
Ｍａｂ Ｃ最終精製品の重合体含有率、分解物含有率及び宿主細胞蛋白質含有量について実施例１と同様の方法を用いて分析した。
Ｍａｂ Ｃ最終精製品の分析結果を図４、５及び６に示す。本精製方法により、重合体含有率及び分解物含有率がそれぞれ１％未満、宿主細胞蛋白質含有量が１０ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満のＭａｂ Ｃ精製品が取得できた。
実施例７ Ｍａｂ Ａ精製その３（活性炭を含む精製）
精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約２００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離で除去し、清澄化液Ａを得た。
精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約２００ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離で除去し、清澄化液Ａを得た。
次いで、得られた清澄化液Ａ約６０ｍＬに活性炭（日本エンバイロケミカル社製、白鷺Ｐ）を添加し、混合した。その後、混合した溶液を遠心分離及びフィルターろ過し、活性炭溶出液を得た。
得られた活性炭溶出液を５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液で４倍に希釈後、トリス溶液でｐＨ８．０に調整した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。
得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を、酢酸溶液でｐＨ５．０に調整した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（アプライドバイオシステムズ社製、ＰＯＲＯＳ ＸＳ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。次に０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）から塩濃度を徐々に増加させる塩濃度勾配（１０カラム容量）にて溶出した。カラム溶出画分の一部をＰＯＲＯＳ ＸＳ溶出液としてプールした。ＰＯＲＯＳ ＸＳ溶出液をＭａｂ Ａ最終精製品とした。
実施例８ Ｍａｂ Ｂ精製その３（活性炭を含む精製）
精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約２２５ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離で除去し、清澄化液Ｂを得た。
精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清約２２５ｍＬを酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿を遠心分離で除去し、清澄化液Ｂを得た。
次いで、得られた清澄化液Ｂ約６０ｍＬに活性炭（日本エンバイロケミカル社製、白鷺Ｐ）を添加し、混合した。その後、混合した溶液を遠心分離及びフィルターろ過し、活性炭溶出液を得た。
得られた活性炭溶出液を５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液で４倍に希釈後、トリス溶液でｐＨ８．０に調整した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。
得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を、酢酸溶液でｐＨ５．１に調整した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（アプライドバイオシステムズ社製、ＰＯＲＯＳ ＸＳ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。次に０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）から塩濃度を徐々に増加させる塩濃度勾配（１０カラム容量）にて溶出した。カラム溶出画分の一部をＰＯＲＯＳ ＸＳ溶出液としてプールした。ＰＯＲＯＳ ＸＳ溶出液をＭａｂ Ｂ最終精製品とした。
実施例９ Ｍａｂ Ａ精製品、Ｍａｂ Ｂ精製品の分析
実施例７及び比較例１により得られたＭａｂ Ａ精製中間体及び最終精製品、実施例８及び比較例２により得られたＭａｂ Ｂ精製中間体及び最終精製品について、以下の分析を行った。精製各工程の回収率及び精製工程全体を通じた総回収率をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析した。
実施例７及び比較例１により得られたＭａｂ Ａ精製中間体及び最終精製品、実施例８及び比較例２により得られたＭａｂ Ｂ精製中間体及び最終精製品について、以下の分析を行った。精製各工程の回収率及び精製工程全体を通じた総回収率をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析した。
Ｍａｂ Ａ及びＭａｂ ＢのプロテインＡ精製、活性炭精製での各工程回収率及び総回収率の結果を図７及び図８に示す。活性炭精製の総回収率は、プロテインＡ精製の総回収率とほぼ同程度であり、４０％以上の高回収率であった。
精製中間体及び最終精製品の重合体含有率及び分解物含有率を、ゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて分析した。Ｍａｂ Ａ及びＭａｂ ＢのプロテインＡ精製、活性炭精製での精製中間体及び最終精製品の重合体含有率を図９及び図１１、分解物含有率を図１０及び図１２にそれぞれ示す。
いずれのモノクローナル抗体についても、最終精製品（陽イオン）において、重合体含有率および分解物含有率は両精製方法で同程度であった。一方で、プロテインＡ精製工程と活性炭精製工程での重合体含有率および分解物含有率を比較した場合、活性炭精製工程の方がプロテインＡ精製工程より重合体含有率および分解物含有率は低く、２％未満であった。
精製中間体及び最終精製品の蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量をＥＬＩＳＡ法により分析した。Ｍａｂ Ａ及びＭａｂ ＢのプロテインＡ精製、活性炭精製での精製中間体及び最終精製品の蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量を図１３及び図１４に示す。
いずれのモノクローナル抗体についても、プロテインＡ精製工程と活性炭精製工程での宿主細胞蛋白質含有量は同程度であった。また、最終精製品においても、宿主細胞蛋白質含有量は同程度であり１０ ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満であった。
以上の結果から、プロテインＡを用いた精製と比べて活性炭を用いた精製によって得られた精製中間体の宿主細胞蛋白質の含有量は同程度である一方、重合体含有率および分解物含有率は活性炭を用いた精製は低く、活性炭を用いた精製によってより不純物含量が低下した蛋白質を取得できることが確認された。
実施例１０ 活性炭による抗体の分解抑制
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含む培養上清を酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿をフィルターを用いて除去し、清澄化液を得た。
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含む培養上清を酢酸でｐＨ４．５に調整した。生成した沈殿をフィルターを用いて除去し、清澄化液を得た。
次いで、得られた清澄化液に活性炭（日本エンバイロケミカル社製、白鷺Ｐ）を添加し、混合した。２４時間保持後、活性炭を除いた上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。コントロールとして、活性炭を添加していないものを上記と同一の操作をし、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図１５に示す。コントロール（Ｃ）は、清澄化液（Ａ）と比較して分解物のバンドが増加したが、活性炭添加（Ｂ）は、分解物バンドが増加しなかった。
以上の結果から、活性炭の添加により分解物の生成が抑制されることが確認された。
実施例１１ 活性炭による抗体の還元抑制
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｄ）を含む培養上清に活性炭（日本エンバイロケミカル社製、白鷺Ｐ）を添加し、混合した。活性炭除去後、２４時間嫌気状態とした。２４時間保持後、上清を非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。コントロールとして、活性炭を添加していないものを上記と同一の操作をし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｄ）を含む培養上清に活性炭（日本エンバイロケミカル社製、白鷺Ｐ）を添加し、混合した。活性炭除去後、２４時間嫌気状態とした。２４時間保持後、上清を非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。コントロールとして、活性炭を添加していないものを上記と同一の操作をし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図１６に示す。培養上清（Ａ）と比較してコントロール（Ｃ）では抗体が還元したバンド（Ｈ鎖、Ｌ鎖）が観察されたが、活性炭処理（Ｂ）では、抗体が還元したバンド（Ｈ鎖、Ｌ鎖）が認められなかった。
以上の結果から、活性炭の添加により還元体の生成が抑制されることが確認された。
実施例１２ Ｍａｂ Ａ精製品、Ｍａｂ Ｂ精製品のＤＮＡ分析
実施例７により得られたＭａｂ Ａ最終精製品、比較例１により得られたＭａｂ Ａ精製品、実施例８により得られたＭａｂ Ｂ最終精製品及び比較例２により得られたＭａｂ Ｂ精製品について、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法によるＤＮＡ分析を行った。
実施例７により得られたＭａｂ Ａ最終精製品、比較例１により得られたＭａｂ Ａ精製品、実施例８により得られたＭａｂ Ｂ最終精製品及び比較例２により得られたＭａｂ Ｂ精製品について、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法によるＤＮＡ分析を行った。
Ｍａｂ Ａ及びＭａｂ Ｂに関する活性炭精製での最終精製品およびＰｒｏｔｅｉｎ Ａ精製での精製品の蛋白質１ｍｇあたりのＤＮＡ含有量を図１７に示す。いずれの最終精製品及び精製品についてもＤＮＡ含有量は同程度であり１０ｐｇ／ｍｇ以下であった。
実施例１３ 活性炭精製におけるｐＨの影響
精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を酸またはアルカリでｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８にそれぞれ調整した。生成した沈殿をフィルターろ過で除去し、各ｐＨ調整清澄化液を得た。
精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を酸またはアルカリでｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８にそれぞれ調整した。生成した沈殿をフィルターろ過で除去し、各ｐＨ調整清澄化液を得た。
次いで、得られた各ｐＨ調整清澄化液約１０ｍＬに活性炭（日本エンバイロケミカル社製、白鷺Ｐ）を添加し、混合した。その後、混合した各溶液を遠心分離し、各活性炭溶出液を得た。各ｐＨ調整清澄化液で活性炭を添加していないものを各ｐＨコントロールとした。
得られた各ｐＨ活性炭溶出液および各ｐＨコントロールの蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量をＥＬＩＳＡ法により分析した。得られた蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量より以下の計算式にて宿主細胞蛋白質の低減率（ＨＣＰ ＬＲＶ）を算出した。
（計算式） 宿主細胞蛋白質の低減率（ＨＣＰ ＬＲＶ）＝−ｌｏｇ１０（活性炭溶出液の蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量／コントロールの蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量）
活性炭処理による各ｐＨにおける宿主細胞蛋白質の低減率（ＨＣＰ ＬＲＶ）を図１８に示す。ｐＨ４および５でＨＣＰ ＬＲＶは２以上であった。ｐＨ６、ｐＨ７およびｐＨ８ではＨＣＰ ＬＲＶは１〜２の範囲であった。従って、ｐＨ６、ｐＨ７及びｐＨ８に比べて、ｐＨ４及びｐＨ５の方が活性炭処理による宿主細胞蛋白質低減の効果が高いことが確認された。
得られた各ｐＨ活性炭溶出液の抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析した。ｐＨ７の活性炭溶出液での抗体濃度を１００とした場合の各ｐＨでの相対抗体濃度（％）を図１９に示す。
ｐＨ４での抗体濃度は、他のｐＨの抗体濃度より低く、ｐＨ７の約７０％となった。その他のｐＨでは、ｐＨ７の±１０％の範囲内であり、ｐＨ４に比べて、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７及びｐＨ８の方が活性炭処理における相対抗体濃度が高く、抗体回収率が高いことが確認された。
以上の各ｐＨにおける宿主細胞由来蛋白質の低減率及び相対抗体濃度の結果から、活性炭処理はｐＨ４〜８のいずれのｐＨでも実施可能であり、特にｐＨ４〜６が好ましいと考えられた。実施例１４ 活性炭精製における活性炭原材料の影響
精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を酢酸でｐＨ４．６に調整した。生成した沈殿を遠心分離及び、フィルターろ過で除去し、清澄化液Ｂを得た。
次いで、得られた清澄化液Ｂ約１０ｍＬに表１に示す活性炭をそれぞれ添加し、混合した。その後、混合した溶液を遠心分離及びフィルターろ過し、活性炭溶出液を得た。
各活性炭溶出液の重合体含有率及び分解物含有率はゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて、宿主細胞蛋白質含有量はＥＬＩＳＡ法を用いて分析した。各活性炭溶出液の分析結果を図２０、図２１及び図２２に示す。
白鷺Ｐ、白鷺ＤＯ−２及び白鷺ＤＯ−５を用いた活性炭溶出液はともに、重合体含有率、分解物含有率及び宿主細胞蛋白質含量が培養上清より低下した。特に原材料が木質である白鷺Ｐを用いた活性炭溶出液は、他の活性炭に比べて分解物含有率及び宿主細胞蛋白質含有量がより低下した。
比較例１ Ｍａｂ Ａ精製（プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを含む精製）
実施例７で得た清澄化液Ａをトリス溶液でｐＨ６．４に調整した。この溶液約６０ｍＬを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化したプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）及び平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量の１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン緩衝液（ｐＨ３．２）により溶出した。カラム溶出画分をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ溶出液としてプールした。
実施例７で得た清澄化液Ａをトリス溶液でｐＨ６．４に調整した。この溶液約６０ｍＬを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化したプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）及び平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量の１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン緩衝液（ｐＨ３．２）により溶出した。カラム溶出画分をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ溶出液としてプールした。
得られたＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ液をトリス溶液でｐＨ８．０に調整した。この溶液を１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。
得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を、酢酸溶液でｐＨ５．０に調整した。この溶液を１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（アプライドバイオシステムズ社製、ＰＯＲＯＳ ＸＳ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。次に０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）から塩濃度を徐々に増加させる塩濃度勾配（１０カラム容量）にて溶出した。カラム溶出画分の一部をＰＯＲＯＳ ＸＳ溶出液としてプールした。ＰＯＲＯＳ ＸＳ溶出液をＭａｂ Ａ精製品とした。
比較例２ Ｍａｂ Ｂ精製（プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを含む精製）
実施例８で得た清澄化液Ｂをトリス溶液でｐＨ６．４に調整した。この溶液約６０ｍＬを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化したプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）及び平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量の１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン緩衝液（ｐＨ３．２）により溶出した。カラム溶出画分をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ溶出液としてプールした。
実施例８で得た清澄化液Ｂをトリス溶液でｐＨ６．４に調整した。この溶液約６０ｍＬを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化したプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）及び平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量の１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン緩衝液（ｐＨ３．２）により溶出した。カラム溶出画分をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ溶出液としてプールした。
得られたＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ液をトリス溶液でｐＨ８．０に調整した。この溶液を１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液としてプールした。
得られたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を、酢酸溶液でｐＨ５．０に調整した。この溶液を１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（アプライドバイオシステムズ社製、ＰＯＲＯＳ ＸＳ、５ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。次に０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）から塩濃度を徐々に増加させる塩濃度勾配（１０カラム容量）にて溶出した。カラム溶出画分の一部をＰＯＲＯＳ ＸＳ溶出液としてプールした。ＰＯＲＯＳ ＸＳ溶出液をＭａｂ Ｂ精製品とした。
本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。
Claims (10)
- 活性炭を用いて、抗体由来の還元体の生成を抑制すると同時に抗体と不純物とを分離し、不純物含量が低下した抗体を取得する、抗体の精製方法であって、
活性炭が木質系活性炭であり、且つ平均細孔直径が０．５〜５ｎｍである、精製方法。 - 抗体の分子量が３００００以上である、請求項１に記載の精製方法。
- 抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項１または２に記載の精製方法。
- 不純物が宿主細胞蛋白質、抗体由来の重合体、抗体由来の分解物、抗体由来の還元体およびＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の精製方法。
- 非吸着モードで分離を行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の精製方法。
- ｐＨが３〜８で分離を行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の精製方法。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の精製方法を含む、抗体の製造方法。
- プロテインＡクロマトグラフィーを使用しない、請求項７に記載の製造方法。
- 陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィーまたは混合モードクロマトグラフィーの何れか１のクロマトグラフィーを含む、請求項７または８に記載の製造方法。
- 少なくとも１つの吸着モードのクロマトグラフィーを含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
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| US7390403B2 (en) * | 2004-03-19 | 2008-06-24 | Millipore Corporation | Prefilter system for biological systems |
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