KR101829860B1

KR101829860B1 - 응고인자 ⅸ와 같은 비타민 ｋ 의존성 단백질을 정제하는 방법

Info

Publication number: KR101829860B1
Application number: KR1020127025752A
Authority: KR
Inventors: 구스타브 길리암; 스테판 빈게
Original assignee: 옥타파마 아게
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2018-02-19
Also published as: RU2016122883A3; EP2553095A1; EP2553095B1; CN102858971B; RU2012146084A; IL221609A; CA2793136A1; ZA201207227B; IL248549B; IL248549A0; KR20130010474A; RU2590726C2; CN102858971A; ES2740825T3; JP2013523689A; US20130079498A1; JP5876868B2; DK2553095T3; BR112012024550A2; ES2610529T3

Abstract

프리온-불포함 비타민 K 의존성 단백질을 크로마토그래피를 이용한 정제 순서 (purification sequence)로 제조하는 방법으로서,
- 하나 이상의 크로마토그래피가 다중 모드 수지 (multimodal resin)를 이용하여 수행되고;
- 수용액 중에 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는 분획을 수용액에 제공하며;
- 6 내지 9의 pH에서 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는 분획을 다중 모드 수지와 접촉시키고;
- 선택적으로, 비타민 K 의존성 단백질이 용출되기 전에, 오염물을 제거하고 비타민 K 의존성 단백질을 유지시키기 위하여 흡착된 비타민 K 의존성 단백질을 갖는 다중 모드 수지를 선택적으로 수용성 세척 버퍼로 세척하며;
- pH 6 내지 9에서 아르기닌을 포함하는 버퍼로 다중 모드 수지로부터 비타민 K 의존성 단백질을 용출시키고; 및
- 선택적으로 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는 분획을 정제 또는 농축 (enrich)된 형태로 수집하는; 것을 특징으로 하는 방법.

Description

응고인자 Ⅸ와 같은 비타민 Ｋ 의존성 단백질을 정제하는 방법{A Process for Purifying Vitamin K dependent Proteins such as Coagulation Factor Ⅸ}

본 발명은 응고인자 Ⅸ (coagulation factor IX , FIX로 약칭됨)와 같은 비타민 K 의존성 단백질을 정제하는 방법 및 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는 분획에 관한 것이다.

혈우병은 혈액응고 또는 응혈을 조절하는 신체 능력을 손상시키는 유전성 유전 질환군이다. 그의 일 형태인 혈우병 B는, 응고인자 Ⅸ가 결핍이고 출생되는 남아 25,000명 중에 약 1명의 비율로 발생한다. 인자 Ⅸ (또는 크리스마스 인자)는 혈액응고계의 세린 프로테아제 (serine protease) 중 하나이다. 인자 IX는 비타민 K 의존성 혈장 단백질로, Ca² ⁺ 이온, 인지질 및 인자 Ⅷa가 존재하는 조건에서 인자 Ⅹ를 활성화형태로 전환시키는 것에 의해 혈액응고 고유의 경로에 관여한다. FIX 단백질은 다기능적인 특징을 가진 혈액응고에서 필수적인 요소이다.

인자 Ⅸ (Factor Ⅸ, FⅨ)는 461개의 아미노산을 포함하는 단쇄 (single chain)인 당단백질이다. 인자 IX는 주로 간에서 합성되며, 혈장으로 분비된다. 인자 Ⅸ 분자는 신호 펩타이드, 프로펩타이드 (propeptide), Gla 도메인, 2개의 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)-유사 도메인, 활성화 펩타이드 (activation peptide) 및 촉매성, 트립신-유사 도메인 (세린 프로테아제 도메인)을 포함한 수개의 개별적인 기능적 도메인으로 이루어진다.

프로펩타이드는 415개의 아미노산으로 이루어진 성숙한 FIX 분자를 형성하기 위하여 분비 전에 절단된다. 이 단백질은 이황화 결합 (disulfide bond)로 결합된 경쇄 (light chain) 및 중쇄 (heavy chain)로 이루어진 헤테로다이머 (heterodimer)인 활성화형 형태로 더 가공된다.

FⅨ의 결핍은 혈장 유래 FⅨ 농축물 또는 재조합 FⅨ에 의해 치료될 수 있다. FⅨ 농축물의 처리에 의한 치료는 혈우병 환자의 정상적인 삶을 가져왔다. 역사적으로, 혈우병 B는 인간의 혈장으로부터 유래한 FIX에 의해 치료되어 왔다. 정상적인 조건하에 혈장에서는 FⅨ분자가 본래 (native)의 형태로 순환되고 있는 반면, 혈액 응고 효소의 케스케이드 (cascade)에서 개시되는 복잡한 과정을 통하여 활성화된다.

혈장 유래 FⅨ 제품은 적용된 정제 방법에 따라 다양한 순도로 시판된다. FⅨ 정제에 이용되는 방법은 일반적으로 상이한 다른 크로마토그래피 단계의 조합이었다 (주로 정제를 위한 이온 교환 및 친화성 단계 및 생산물의 농축/탈염을 위한 초미세여과 (ultra filtration)단계).

Harrison 등 (S. Harrison et al. Sem Hematol 35 (Suppl 2): 4-10 (1998))은 CHO 세포에서 생산되는 재조합 FⅨ (Benefix®)의 제조 방법을 기술한다. 상기 세포는 정밀여과 (microfiltration)로 회수된 뒤, 초미세여과/정용여과 (ultrafiltration/diafiltration)로 농축되었으며, 버퍼가 제1 크로마토그래피 컬럼으로의 로딩을 위한 일괄적 버퍼와 일치하는 버퍼 (consistent buffer)를 제공하기 위하여 트리스 (Tris) 버퍼로 교환되었다. rFⅨ의 정제를 위하여 4개의 독립적인 크로마토그래피 단계를 이용하였고, 첫 번째는 유사 친화성 모드 (pseudoaffinity mode)로 수행되는 음이온 교환 단계 (Q Sepharose FF)이다. 컬럼은 pH 8.0의 10 mM의 염화칼륨으로 용출된다. 염화칼륨은 FⅨ 분자의 입체 구조적 변화를 유도하여 컬럼으로부터의 분리를 유발한다.

큐 세파로스 (Q Sepharos) 단계는 메트렉스 셀루파인 (Matrex cellufine) 설페이트 (sulfate) 컬럼에서의 정제로 이어지고, 이는 헤파린-결합 (heparin-binding) 도메인을 갖는 단백질의 친화성 정제를 위해 이용된 헤파린 유사체 (heparin analog)이다. 이는 또한 음전화를 띤 설페이트 기에 의해 양이온 교환 수지로도 작용한다. 셀루파인 (cellufine) 정제 단계는 낮은 수준의 HCP를 제거한다.

셀루파인 용출액을 인산 칼슘의 합성형인 세라믹-하이드록시에퍼타이트 (Ceramic-Hydroxyapatite) 컬럼에 로딩한다. 이는 다양한 전하의 단백질을 각각의 분리하기 위해 이용되며, 보다 낮은 비활성 (specific activity) rFⅨ를 제거할 가능성을 제공한다. 이 컬럼을 인산염 농도를 최종적으로 0.5 M까지 증가시키는 계단적 용출 (stepwise elution)로 용출시킨다.

Benefix®의 제조 과정에서의 최종 정제 단계는 Chelate EMD-Cu(II)이다. 단백질은 수지에 의해 유지된 고정화된 금속과 상호작용을 한다. 결합된 rFⅨ는 디스플레이서 (displacer)인 이미다졸 (imidazole)에 의하여 용출되며, 미세 오염물질 (trace contaminants)이 이 정제 단계에서 제거되고, 그 뒤 바이러스 여과 (virus filtration) 단계 (Viresolve-70) 및 최종적으로 rFIX가 농축되고 버퍼는 제제화버퍼 (formulation buffer)로 교환되는 것인 초미세여과/정용여과 (ultrafiltration/diafiltration) 단계가 이어진다.

전술된 rFⅨ 제조 방법은 일관성이 있고, 65개의 배치 (batch)가 분석되었으며 비활성이 276±23 IU/mg으로 밝혀졌다. Gla 함량은 11.4±0.1 mol Gla/mol rFⅨ 이었으며, 총 불순물은 각각 RP-HPLC 및 HCP-ELISA로 결정된 0.01±0.01% 및 0.03±0.01%로 밝혀졌다.

Lindsay 등 (J Chrom A 1026: 149-157 (2004))은 형질전환 돼지의 젖에서 rFIX를 정제하는 방법을 기술한다. 헤파린 세파로오스 FF (Heparin Sepharose FF)가 정제 계획의 최초 단계으로 이용되고, 뒤이어 음이온 교환 단계가 수행되었다.

인자 Ⅸ의 헤파린 결합 도메인은 분자의 C-말단에 위치한다. 이 부분은 PTM을 갖지 않으며, 이에 따라서 헤파린 크로마토크래피 단계는 rFⅨ의 전체 집단이 분리 될 수 있게 한다. 용출액의 비활성은 30-35 IU/mg이며, 이는 큰 분획이 비활성이라는 것을 나타낸다. 활성 rFIX의 부분집단은 AIEX 컬럼의 구배 용출 (gradient elution) 동안 비활성 rFⅨ 부분집단으로부터 분리되었다.

Kaufman 등 (JBC 261 :9622-9628 (1986))은 CHO 세포에서의 rFⅨ의 발현 및 단백질의 정제에 대하여 기술한다. rFⅨ 함유 세포 배양 배지를 초미세여과 (ultrafiltration)에 의하여 농축하고 3 mM CaCl₂, 0.05 M Tris-HCl 및 0.5 M NaCl를 포함하는 버퍼로 투석한 뒤 형태 (conformation) 특이적인 항체 (anti-FIX:Ca(II) 항체)를 갖는 면역친화성 컬럼에 적용시켰다. 그 뒤, 컬럼을 10 mM EDTA, 0.05 M Tris-HCI 및 0.15 M NaCl로 용출시켰다.

컬럼으로의 적용 전 출발 물질 중 3 mM CaCl₂존재는 FIX의 활성종과 비활성종간의 분리를 가져왔다. 비활성종은 컬럼에 결합하지 못하고 활성형 FIX는 EDTA에 의해 컬럼으로부터 용출될 수 있었다.

WO-A-2009/007451는 혼합 모드 (mixedmode) 또는 다중 모드 (multimodal) 수지를 이용한 FVIII의 정제 방법을 개시한다. 이 정제 방법은 소수성 부분 및 음전화를 띤 부분으로 이루어져 있는 리간드 (ligand)들을 포함하는 혼합 모드 (mixedmode) 또는 다중 모드 (multimodal) 수지와 FVII 단백질을 접촉시키는 단계 및, FVIII 단백질은 1.5 M 이상의 염 및 40 % (w/v) 이상의 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol), 프로필렌 글리콜 (propylene glycol), 또는 이들의 혼합물 및 칼슘 이온을 포함하는 용출 버퍼로 용출시키는 단계에 기반한다.

EP-A-1 707 634는 재조합적으로 생산된 단백질을 다양한 방법, 예를 들면, 면역-친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 단백질 침전, 버퍼 교환, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드 소수성/이온교환 크로마토그래피 미디어 (mixed-mode hydrophobic/ion exchange chromatography media), 킬레이팅 크로마토그래피 (chelating chromatography), 렉틴 (lectin) 또는 헤파린 (heparin) 친화성 크로마토그래피와 같은 탄수화물 친화성 (carbohydrate affinity), 크기 배제 크로마토그래피, 전기영동, 투석, 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol), 암모늄 설페이트 (ammonium sulphate), 에탄올과 같은 다양한 침전제, 하이드록시아파테이트 흡착 (hydroxyapatite adsorption), 여과 막흡착 (filter membrane adsorption), 자성 입자 (magnetic particle)에 결합된 리간드 등으로 단리하는 방법을 개시한다. 그러나 특정 크로마토그래피 여과 단계를 개시하고 있지 않다.

WO-A-2005-082483은 액체 중 하나 또는 그 이상의 불순물로부터 항체를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 액체와 접촉으로 이루어진다. 항체를 수지에 흡착시키기 위하여 다중 모드 리간드 (multimodal ligand)가 고정되어 있는 지지체 (support)로 이루어진 제1 크로마토그래피 수지를 접촉시키는 단계를 포함하고, 각각의 다중 모드 리간드 (multimodal ligand)는 하나 이상의 양이온-교환기 및 하나 이상의 방향족 (aromatic) 또는 헤테로방향족 (hetero aromatic) 고리 시스템을 포함하는 것인 방법을 개시한다. 용출물 (eluant)을 수지에서 항체를 방출시키기 위하여 첨가하고, 용출액을 제2 크로마토그래피 수지와 접촉시킨다.

WO-A-2005/121163은 단백질 용액에서 하나 또는 그 이상의 단백질을 단리하는 방법을 개시한다. 본 방법은 하나 이상의 특정 단백질을 포함하며 미리 조정된 pH 및 미리 조정된 이온 강도 또는 전기전도도를 갖는 단백질 용액을 제공하는 단계, 상기 단백질 용액을 다공성 물질로 둘러싸인 고밀도 비-다공성 코어를 갖는 입자를 포함하는 흡착 컬럼에 적용시키는 단계를 포함하며, 흡착제는 1.5 g/ml 이상의 입자 밀도 및 입자 부피의 평균 지름은 최대 150㎛의 평균 부피 입자 직경 (volume particle diameter)를 갖는다. 컬럼은 흡착제로부터 단백질을 용출시키기 전에 선택적으로 세척된다.

WO-A-2009/156430 A1은 혼합 모드 (mixed-mode) 또는 다중 모드 (multimodal) 수지를 이용한 FVIII 정제 방법을 개시한다. 이 정제 방법은 높은 이온 강도를 갖는 용액 중 FVIII 단백질과 소수성 부분 및 음전하를 띤 부분을 포함하는 다중 모드 또는 혼합 모드 수지와 접촉시키는 단계 및, 상기 FVIII 단백질을 pH 6-8에서 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산을 포함하는 용출 버퍼로 용출시키는 단계에 기반한다.

FⅨ 함유 생산물을 개선시키기 위하여, FIX 분자에 대한 특이적 친화성 크로마토그래피가 적용되었으며, 이는 높은 정도의 FⅨ 순도까지 오염물질을 효과적으로 제거했다. 종종 사용되는 면역 친화성 크로마토그래피의 단점은 상대적으로 비용이 높으며, 동물 유래 모노클로날 항체가 친화성 리간드로 사용된다는 것이다.

80년대 중반에는 혈장 유래 FⅨ 제품과 관련한 일부 바이러스 전파 (virus transmission)가 있었다. 이 문제가 특이적 바이러스 감소 단계의 구현을 통해 해결되었음에도 불구하고, 이것은 재조합 FⅨ 제품 (recombinant FIX (rFIX)) 개발의 시발점이 되었다. 90년대에 최초의 rFⅨ 제품이 판매되었으며 이는 현재까지 유일하다.

본 발명의 일 목적은 종래 기술에서 비타민 K 의존성 단백질, 특히 FⅨ의 정제 방법의 단점을 회피할 수 있는 방법을 제공하는 것이었다. 전통적인 이온 교환 크로마토그래피 수지 (예를 들어 SP-, CM-, Q- 또는 DEAE Sepharose FF 이온교환 크로마토그래피 수지)의 한가지 단점은 단백질의 수지로의 결합이 상대적으로 낮은 염 농도 (전도성)와 pH, 일반적으로 0.01-0.l5 M의 염 (NaCl 등)농도에서만 수행될 수 있다는 것은 선행기술에서 이미 알려진 사실이다. 최적의 pH 범위는 양이온 교환체 또는 음이온 교환체가 사용되는지 여부 및 수지에 결합될 표적 산물의 등전점 (iso-electric point)에 따라서 좌우된다. 일반적으로 표적 단백질이 이온교환 수지에 결합하는 pH 범위는 통상적으로 표적 산물의 등전점으로부터 약 1 pH 단위 위 또는 아래이다.

일부 적용에서, 다소 증가된 이온 강도와 통상적인 이온교환 크로마토그래피에서는 사용될 수 없는, 정상적인 범위를 넘어선 pH에서 직접적으로 (추가적 희석 없이) 크로마토그래피 수지에 적용되며, 이온 크로마토그래피 단계가 단백질에 적용하는 상대적으로 온화한 (mild) 정제 조건의 이용에 대한 요구가 있다.

다중 모드 (또는 혼합 모드) 크로마토그래피는 단백질의 정제를 위한 도구이다. 이는 예를 들어 제조사 데이터 쉬트 GE Healthcare.(11-0035-20 4SAA) Capto Adhere, 제조사 데이터 쉬트 GE Healthcare (28-9078-88AA) Capto MMC 및 WO-A-2009/024620 "A process for the isolation and purification of a target protein, free of prion proteins"에 개시된다. 단점은 용출이 상대적으로 가혹한 조건, 예를 들면, 중성 pH 미만 혹은 초과 pH, 단독, 또는 예를 들면, 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol), WO-A-2009/0074Sl에서 기재된 것과 조합된 것과 같은 조건을 종종 포함한다는 것이다.

증가된 이온 강도는 단백질 용액, 특히 표적 단백질에 부정적으로 작용할 수 있는 잠재적 프로테아제 (protease)가 용액 내에 존재하는 것인 재조합 단백질 회수물 과 같은 조 단백질 제제 또는 혈장 유래 제품 중 단백질 안정성을 위한 유의성 있는 장점이 될 수 있다.

프로테아제 (protease)는 생리적 조건 (대부분의 세포 시스템의 경우와 동일) 즉 약 pH 7, 약 0.15 M의 염 농도에서 최적으로 작용하므로, 프로테아제 효과를 최소화하기 위해 이 조건을 변경하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 변경은 일반적으로 염의 첨가 및/또는 pH의 변경에 의해 수행될 수 있다. 이 파라미터 두 가지 모두 종래의 이온-교환 크로마토그래피 단계의 성능에 결정적이며, 따라서 달성하는 것은 종종 불가능하다. 따라서 본 발명의 또 다른 목적은 이러한 문제점을 해결하고 표적 단백질을 분해할 수 있는 프로테아제와 같은 잠재적 단백질 가수분해 요소를 포함하는 조 (crude) 단백질 샘플에 염을 첨가하고 및/또는 pH를 변경 할 수 있게 하는 방법을 제공하는 것이었다. 이 방법은 또한 단백질 용액을 추가 처리하는 것을 가능한한 최소화고 크로마토그래피 수지에 표적 단백질을 결합시킬 수 있다. 이는 조 (crude) 단백질 샘플로부터 목적 단백질을 농축 및 정제하는 최적화된 단계 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 기타의 크로마토그래피 등을 이용한 추가적인 하류 정제 (purification downstream)를 제공한다.

이러한 요구는 특히 중요하며, 이는 정제동안 표적 단백질의 분해를 방지하거나 최소한 감소시킬 수 있기 때문이다.

이것은 표적 단백질의 용출 전에 조 회수물 (crude harvest)에 존재할 수 있는 프로테아제 또는 기타 오염물질을 제거할 수 있게 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 FⅨ와 같은 비타민 K 의존적 단백질의 정제 방법, 특히 재조합 FⅨ의 세포 배양 회수물로부터 출발하여 FⅨ를 정제하는 방법을 제공하는 것이었다.

본 발명에 따르면 발명의 목적은 크로마토그래피를 이용한 정제 순서 (purification sequence)로 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질을 정제하는 방법으로서,

- 하나 이상의 크로마토그래피가 다중모드 수지를 이용하여 수행되고,

- FⅨ와 같은 비타민 K 의존성 단백질이 다중 모드 수지에 결합하며, 및

- FⅨ와 같은 비타민 K 의존성 단백질이 pH 6 내지 9 에서 아르기닌을 포함하는 버퍼로 다중 모드 수지로부터 용출되는 것인 방법에 의해 달성된다.

7개의 혈장 당단백질이 그들의 생합성에 있어서 비타민 K에 의존적이라는 것이 알려져 있다. 그들은 프로트롬빈 (prothrombin, 인자 II), 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C, 단백질 S 및 단백질 Z이다. Gla 도메인은 이 비타민 K 의존성 단백질 모두의 공통적인 구조적 특징이며, 각각의 단백질 (프로트롬빈은 제외)은 Gla 도메인 바로 다음에 하나 또는 하나 이상의 EGF-유사 도메인을 갖는다. 비타민 K 의존성 단백질은 그의 생리적 기능을 발현하기 위해서는 Ca² ⁺ 이온을 필요로 하며, 칼슘 결합 부위에는 최소한 Gla 도메인과 EGF-유사 도메인을 수반한다. 칼슘 결합은 이들 단백질이 인지질/세포막에 결합하여 그들의 최대 생체 활성을 발현시킬수 있게 한다.

다중 모드 수지 (multimodal resin)을 포획 (capture) 정제 단계로 사용하는 본 발명은 표적 단백질이 다중모드 크로마토그래피 단계에서 결합하는 동안, 단백질 용액 중의 활성 프로테아제 위험을 최소화시키는 값으로 염 농도 및 pH를 조정 할 가능성을 제공한다.

본 발명의 방법의 장점은 예를 들면 재조합 방법에서 포획 단계로 사용된, 다중 모드 수지 (multimodal resin)로의 표적단백질의 결합 후, 표적 단백질의 용출 전에 세척 (wash) 단계를 추가 적용할 수 있는 가능성이다. 이것은 표적 단백질 용출 전에, 다중 모드 단계를 수지에 부착된 프로테아제 및 기타 오염물을 제거하기 위해 적합한 세척 버퍼를 선택하는 것에 의해 수지를 세척하는 것으로써 달성된다. 적합한 세척 버퍼는 세척 제거 단계동안 프로테아제의 활성을 억제시키기에 적합한 pH에서 바람직하게는 염 또는 아미노산 또는 버퍼 성분 또는 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 방법은 온화한 용출 환경에서 개별적인 용출 특성 (즉, 가능한 최소 1 부피)으로 다중 모드 수지에 결합된 표적 단백질의 용출을 가능하게 한다. 이는 증가된 pH 또는 증가된 염 농도 또는 아미노산의 첨가 또는 이들의 조합을 이용하여 달성되었다. 본 발명의 방법은 응집 (aggregate)의 억제, 본래 분자 구조의 보존 및 추가적인 하류 가공 (downstream processing)을 위한 작은 용량의 제공 등의 장점을 제공한다.

또한 본 발명은 인간 또는 동물로부터 유래한 안정화 첨가제의 첨가 없는 정제 방법 및 이들(단일클론 항체에 기초한 면역 친화성 수지)이 부재한 전체 과정의 이용을 가능하게 한다. 특히 포획 단계에서의 다중 모드 수지의 이용은 종래의 이온 교환체와 비교하여 더 높은 결합능을 가능하게 하며, 이는 컬럼으로부터 보다 농축된 산물 용출물을 가져올 수 있고 이는 산물의 안정성을 위해 유리할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 다중 모드 크로마토그래피는 크로마토그래피 컬럼에서 수행될 수 있다. 이는 제1 포획 단계일 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 배치 모드 (batch mode)도 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 다중 모드 수지에서의 크로마토그래피는 효모에서 유래된 친화성 리간드를 갖는 수지에서의 크로마토그래피와 조합되고, FIX 단백질과 같은 비타민 K 의존성 단백질 용출 후, 90 %보다 높은 순도를 가져온다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, FIX와 같은 비타민 K 의존성 최종 산물에서 99 % 보다 높은 순도를 얻기 위해서 다중 모드 수지 단계와 효모 유래 친화성 리간드 크로마토그래피 단계는 또 다른 크로마토그래피 정제 단계와 조합된다.

따라서, 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 알부민과 같은 인간 또는 동물 첨가제의 첨가 없이 모노클로날 항체 기초 면역 친화성 리간드를 사용한 정제된 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는 조성물은 본 발명의 대상이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 다중 모드 수지는 매트릭스에 결합된 모이어티 (moiety)를 포함하며, 이 모이어티는 혼합물 중 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질과 이온성 상호작용, 및 수소결합, 소수성 또는 호황성(thiophilic) 상호작용과 같은 다른 종류의 상호작용에 의하여 상호작용할 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 친화성 리간드는 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질에 대한 F_ab 효모 유래 단편이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 다중 모드 수지 단계는 조 (crude) 단백질 용액으로부터 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질을 포획하기 위하여 수행되고, 결과적으로 수득된 다중 모드 크로마토그래피 수지 용출액을 효모 유래 친화성 리간드 크로마토그래피 단계에 처리하고, 상기 친화성 크로마토그래피 단계로부터 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질의 용출 후에, 단백질 및 DNA에 대해 90% 보다 높은 순도를 얻는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 다중모드 수지 단계가 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질을 조 (crude) 단백질 용액으로부터 포획하기 위해 수행되며, 결과적으로 수득된 다중 모드 크로마토그래피 수지 용출액을 크기 배제, 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용 및 고정 금속 친화성 크로마토그래피 (immobilized metal affinity chromatography) 및 효모 유래 친화성 리간드로부터 선택된 추가적인 크로마토그래피 단계에서 더 처리하는 경우, 최종 산물의 순도는 99%보다 높은 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 또 다른 구체예에서, FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는 혼합물은 용액으로 존재한다.

본 발명의 또다른 구체예에서, FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질은 산물을 분해할 수 있는 프로테아제를 포함하는 조 단백질 용액으로 존재한다.

FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질이 방출되기 전에 이를 유지시키고 오염물 (프로테아제, DNA 등)을 제거하기 위하여 다중모드 수지에 세척 버퍼를 적용하는 것이 유리할 수 있다.

본 발명의 추가적인 구체예에서, 다중 모드 수지는 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질의 용출 전에 pH 6 내지 9에서 세척 버퍼를 이용하여 세척된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 아르기닌을 용출제 (elution agent)로 이용하여 용출이 수행된다. 본 발명에 따르면 상기 용출제는 증가된 염 농도와 조합될 수 있으며, 상기 염은 호프마이스터 계열 (Hofmeister series)로부터 선택된다. 본 발명에 따르면 용출은 pH 범위가 6 내지 9, 바람직하게는 pH 7에서 아르기닌 단독 또는 증가된 염분 농도와의 조합 또는 증가된 염 농도 단독에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 바륨, 아세테이트, 인산염, 황산염과 같은 호프마이스터 계열 (Hofmeister series)에 포함되어 있는 염 중에서 NaCl와 KCl이 선호된다.

본 발명에 따르면, 아르기닌의 농도는 특히 약 0.1M 내지 약 2M 이며, 호프마이스터 계열 (Hofmeister series)에 따른 염의 농도는 0.1 M 내지 4M 범위내; 특히 아르기닌의 농도는 약 0.4M 내지 약 1.5M, 호프마이스터 계열 (Hofmeister series)에 따른 염의 농도는 0.6 M 내지 2M 범위 내 또는 아르기닌의 농도는 약 0.3M 내지 약 0.7M의 범위 및, 호프마이스터 계열 (Hofmeister series)에 따른 염의 농도는 0.8 M 내지 1.2M 범위 내이다.

본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질은 pH 6 내지 9, 바람직하게는 pH 7.0에서 다중 모드 수지에 결합한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 바람직하게는 구연산 나트륨 (sodium citrate), 히스티딘 (histidine), 2-(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐)-에탄 설폰산 (HEPES), 2-(N-모노폴리노)에탄 설폰산 (MES), 트리스 염기 (Tris base) 및 특히 약 pH 6 내지 9 범위의 아세트산 나트륨 (sodium acetate)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 물질을 포함한 버퍼 물질이 사용한다.

본 발명의 방법에서, 비이온성 디터전트 (non-ionic detergent)가 사용되는 버퍼에 존재할 수 있으며, 비이온성 디터전트는 특히 폴리소르베이트 (폴리소르베이트 20, 40, 60, 80) 및 플루로닉 (Pluronic) F68로 이루어진 군에서 선택된다.

pH 6 내지 9, 바람직하게는 pH 7의 용출 버퍼에서, 아르기닌의 양은 일반적으로 0.1 내지 2M 범위 내 특히 0.5M이다.

pH 6 내지 9, 바람직하게는 pH 7의 용출 버퍼에서, 염화나트륨은 0.1 내지 4M 범위 내, 특히 0.05 내지 0.3M 범위로 포함된다.

pH 6 내지 9, 바람직하게는 pH 7의 용출 버퍼에서, 아르기닌 및 염화 나트륨은 0.1 내지 0.5M, 특히 0.3 내지 0.7M 의 범위로 포함된다.

pH 6 내지 9, 바람직하게는 pH7 의 세척 버퍼에서, 염화나트륨은 0.01 내지 0.3M 범위 내, 특히 0.05 내지 0.15M 범위로 포함된다.

비이온성 디터전트의 양은 일반적으로 0.001 내지 1%의 범위 내, 특히 다중 모드 크로마토그래피의 버퍼에서는 0.02%이다.

본 발명에 따라 적용될 수 있는 다중모드 크로마토그래피 수지는 하나 이상의 하기의 모이어티를 포함할 수 있다.

a. 양전하를 띤 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 (N-Benzyl-N-methyl ethanolamine) 리간드,

b. 음전하를 띤 2-(벤조일아미노) 부탄산 (2-(benzoylamino) butanoic acid) 리간드,

c. 페닐프로필 (phenylpropyl) 리간드,

d. N-헥실 (N-hexyl) 리간드,

e. 4-머캅토-에틸-피리딘 (4-Mercapto-Ethyl-Pyridine) 리간드,

f. 3-((3-메틸-5-((테트라히드로퓨란-2-일메틸)-아미노)-페닐)-아미노)-벤조산 (3-((3-methyl-5-((tetrahydrofuran-2-ylmethyl)-amino)-phenyl)-amino)-benzoic acid) 리간드 또는 이들의 조합.

특히, 본 발명에 따라 이용되는 다중 모드 크로마토그래피 수지는 하기 상업적으로 입수 가능한 수지 HEP Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; MEP Hypercel™부터 선택된다.

본 발명의 방법의 일 구체예에서, 다중 모드 크로마토그래피 단계는 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질 친화성 크로마토그래피 단계와 조합되며, 상기 친화성은 효모에서 발현한 항체 조각과 같은 단백질 리간드에 의해 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 정제 순서는 화학적 불활성화 (chemically based inactivation) 단계, 크기 기반 제거 단계, 크로마토그래피 단계 또는 이들의 조합으로 이루어진 병원체 제거/불활성화 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 단계들은 제거 대상 병원체의 상이한 생리학적 특성에 기초한다. 문헌에 상술된 잘 알려진 병원체 불활성화 단계의 일 예는 화학적 기반 용매 디터전트 방법으로, 예를 들어 EP-A-131 740에 개시된 바와 같이, 모든 지질외피 바이러스를 방해하는 트리-n-부틸 포스페이트 (tri-n- butyl phosphate) 및 트리톤 X-100 (Triton X-100)에 기초한 방법이다. 크기를 기초로 한 병원체 제거 단계의 일 예로는 플라노바 20 (Planova 20) 필터와 같이 평균 공극 크기가 대략적으로 20 nm인 나노필터가 있다. 병원체 제거의 또다른 예는 크로마토그래피에 기초한다. 예를 들어 친화성 크로마토그래피는 일반적으로 병원체 제거특성이 있다고 알려졌으며, 예를 들어 FIX와 같은 비타민 K 단백질에 대한 효모 유래 친화성 리간드 크로마토그래피 수지가 있다.

본 발명의 방법의 특정한 구체예에서 정제 순서 (purification sequence)는 하기의 단계를 추가적으로 포함한다:

1. Capto MMC와 같은 양이온 다중모드 수지;

2. 지질 외막(lipid enveloped) 바이러스를 위한 화학적 불활성화 단계, 특히, EP-A-131　740에서 개시된 바와 같이 트리-n-부틸 포스페이트 (tri-n- butyl phosphate) 및 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 이용한 용매/디터전트-불활성화 단계;

3. 효모에서 발현되는 리간드에 기초한 친화성 수지;

4. SP Sepharose 또는 Resource S와 같은 양이온 교환기;

5. 플라노바 20N (Planova 20N)과 같은 약 20nm의 평균 공극 크기를 이용한 병원체 여과 제거 단계;

6. 약 10 kDa 컷오프 (cut off)를 갖는 초미세여과 (ultra filtration) 와 같은 버퍼 교환 및/또는 농축 단계;

7. Superdex 200와 같은 크기 배제 크로마토그래피.

일 구체예에서 본 발명의 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

- Capto MMC™ 다중 모드 수지를 컬럼에 채우고, pH 7.0에서 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80을 포함하는 버퍼로 평형화시켰다

- 동일한 조건을 포함하는 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질 함유 조 (crude) 샘플을 전술된 평형화 버퍼와 거의 동일한 조건을 적용하여, 표적 단백질과 추가적인 불순물 단백질이 컬럼에 부착했다.

- 본 발명에 따라, FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질은 컬럼에 계속 부착되어 있는 반면 단백질 가수분해 활성 저해 및 프로테아제, DNA 및 기타 불순물을 제거하기 위하여, 평형화 버퍼를 이용한 세척 단계가 컬럼에 적용된다.

- 본 발명에 따르면, FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질을 0.5 M의 아르기닌이 첨가되며 pH가 7.0로 조정된 평형화 버퍼를 이용하여 용출시켜, 낮은 부피에서 응집 (aggregate)되지 않은 안정적인 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질을 얻었다

다중 모드(또는 혼합 모드) 크로마토그래피는 단백질을 정제하기 위한 도구이다. 예를 들면, 제조사 데이터 쉬트 GE Health Care (11-0035-45AA) Capto Adhere, 제조사 데이터 쉬트 GE Health Care (28-9078-88AA) Capto MMC 및 특허출원 EP 07114856.3 "A process for the isolation and purification of a target protein, free of prion proteins"에 개시된다.

전술한 다중 모드 크로마토그래피의 단점은 FIX 분자와 같은 비타민 K 의존성 단백질의 활성을 유지시키고 예를 들어 EP-A-1 707 634에서 개시하고 있는 바와 같이 증가된 염 농도의 안정화 효과와 조합된 다중 모드 크로마토그래피의 이용을 촉진하는 대략 중성인 pH 범위의 온화한 용출 조건으로 피할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 다중 모드 크로마토그래피는 크로마토그래피 컬럼 에서 수행될 수 있다. 이는 제1 포획 단계로 간주될 수 있다. 본 발명의 방법은 배치 모드 (batch mode)로 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 인간 또는 동물 유래 안정화 첨가제의 첨가 없는 정제 방법 및 상기 첨가제가 부재한 방법 (모노클로날 항체 기초 친화성 수지)의 이용을 가능하게 한다. 다중 모드 수지의 이용은, 특히 포획 단계로서의 이용은 전통적인 이온 교환기에 비하여 더 높은 결합능을 촉진하여 본 단계에서 더욱 농축된 용출 산물을 수득하게 하며 이는 산물의 안정성에 유리하다.

본 발명의 방법은 일반적으로 재조합 FIX (rFIX)와 같은 재조합 비타민 K 의존성 단백질 (rFIX)의 정제와 관련된다.

본 발명의 방법의 또다른 구체예에서, 다중 모드 크로마토그래피 단계는 FIX와 같은 비타민 K 의존성 단백질 친화성 크로마토그래피와 조합되며, 상기 친화성은 효모에서 발현되는 항체 단편과 같은 단백질 리간드에 의해 제공된다.

이에 따라, 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 알부민과 같은 인간 또는 동물 첨가제의 첨가 없이 모노클로날 항체 기초 면역 친화성 리간드를 사용한 정제된 FIX와 같은 정제된 재조합 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는 조성물도 본 발명의 대상이다.

본 발명은 하기의 비한정적인 실시예에 의해 더 설명된다.

실시예

분석방법의 설명

생물학적 활성 분석 - 인자 IX (1-단계 혈전 분석법, the one - stage clotting assay )

인자 IX의 생물학적 활성을 1-단계 혈전 분석법 (one-stage clotting assay)로 측정하였으며, 인자 IX의 단위를 통용 WHO 인자 IX 농축물 표준에 의하여 정의된 (IU, International Units)로 표현하였다.

1-단계 혈전 분석법 (one-stage clotting assay)는 유럽 약전 (European Pharmacopoeia)에 기술된 방법이다. 본 분석법의 원리는 인자 IX를 포함하는 샘플이 인지질, 접촉 활성자 (contact activator) 및 칼슘 이온의 존재 하에 인자 IX가 결여된 혈장의 응고 시간을 정정하는 능력에 기초한다. 피브린 혈전이 나타나는 시간을 단일 단계에서 측정한다. 인자 IX 활성은 응 고시간에 반비례한다. 본 방법은 Siemens BCS XP 기기에서 수행하였다.

SDS Page (분자 질량 분포)

SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)는 단백질을 그들의 크기에 기초하여 분리하는 것을 수반한다. 이 방법은 환원 조건 (reducing condition)하에서 수행된 단백질의 SDS-PAGE을 나타낸다. 샘플을 변성 및 환원 조건 하에서 (denaturing and reducing condition) 가열하는 것에 의해, 단백질이 언폴딩되고 음이온 디터젼트 (anionic detergent)인 SDS (sodium dodecyl sulphate)에 의하여 코팅되며, 폴리펩티드 사슬 길이에 비례하는 높은 순 음전하를 얻는다. 폴리아크릴아미드 겔 매트릭스 (polyacrylamide gel matrix)에 로딩되고 전기장 내에 배치되면, 음전하를 띤 단백질 분자는 양전하를 띤 전극으로 이동하며, 분자량에 따라 분자 분급 효과 (molecular sieving effect)에 의해 분리된다. 폴리아크릴아미드 겔은 큰 분자가 작은 분자보다 빨리 이동하는 것을 저지한다. 전하 대 질량비가 SDS-변성 폴리펩티드와 거의 동일하기 때문에, 최종적 단백질 분리는 폴리펩티드의 상대적인 분자량 차이에 좌우된다. 겔의 균등한 밀도 내에서, 단백질의 상대적인 이동 겨리 (Rf)는 그 질량의 로그 (log)에 반비례한다. 알려진 질량의 단백질이 미지의 단백질과 동시에 움직이게 되면, 질량과 R_f와의 관계를 나타낼 수 있을 것이고, 이에 따라 미지의 단백질 질량을 측정할 수 있다. 전기영동으로 분리된 단백질 밴드는 은 염색 (silver staining)으로 시각화한다. 표준, 기준 (대조군 샘플) 및 분석 샘플의 출현을 판단하여 시각적으로 평가한다.

혈장 유래 인자 IX

본 실험에 사용되는 물질은 고순도의 SD 처리 및 나노 필터된 높은 순도의 인자IX 농축물인 Nanotiv®에서의 상업적으로 이용가능한 제품으로부터 유래된다.

재조합 인자 IX

FIX를 포함하는 새포 현탁액의 생산

세포

사용한 세포주는 무혈청 증식에 적응된, 인간 배아 신장 (human embryonic kidney) 세포 293 (HEK 293)의 파생물이다. 이 숙주세포, HEK 293F는 인간 FIX 및 인간 푸린furin의 cDNA 코딩 서열을 갖는 발현 카세트 (PACE)로 안정적으로 형질감염되었다. 양 카세트에는 동일한 강력한 프로모터를 사용하였다. 일반적인 과정은 EP-A-1　739　179 (Schroder et al)에 기술된다.

배양방법

세포를 해당 기술분야에서 잘 알려진 일반적인 장치에서 일반적인 방법에 따라 무혈청 배지에서 배양하였으며, 예를 들면 회분 (batch), 유가 (fed-batch), 관류 (perfusion), 또는 연속화 성분 배양 (continous chemostat culture)으로서 작동 시킨(run) t-플라스크, 쉐이커 플라스크 및 생물반응기 (일회용 시스템 및 통상적인 교반 탱크)에서 진탕 또는 교반 배양으로 배양하였다 (Freshney, R I (2000), Culture of animal cells: a manual of basic technique, 4th ed, Wiley- Liss; Spier, R E ed (2000), Encyclopedia of cell technology, Wiley, New York; Enfors, S-O and Haggstrom, L (2000), Bioprocess technology: fundamentals and applications, Hogskoletryckeriet, Royal Institute of Technology, Stockholm; Vinci, V A and Parekh, S R (2003), Handbook of industrial cell culture: mammalian, microbial, and plant cells, Humana Press, USA). 일반적으로, 배지의 관류는 세포수 및 생성물 역가 (product titer)를 표준 회분 배양 수준 이상으로 증가시키기 위하여 수행하였다. 생성물 수율과 숙주세포 단백질의 양은 배양 방식에 따라서 상이하다:

- 생산물 역가는 일반적으로 세포 수에 따라서 증가할 것이다.

- 총 단백질 함량과 DNA 함량은 일반적으로 세포 수에 따라서 증가할 것이다.

- 총 단백질 함량과 DNA 함량은 또한 배양 수명 (culture longetivity)에 따라 증가할 수 있다.

- 회분 배양은 단백질과 DNA를 축적한다; 어느것도 외부로부터 첨가되지 않고, 제거되지 않는다.

- 관류 과정은 세포 배양물을 대사산물, 단백질, DNA 및 기타 불순물로부터 세정한다; 필터 또는 세포 원심분리는 세포 유지 (cell retension)을 위하여 일반적으로 사용되었다.

재조합 생산물은 세포로부터 분비되며 세포 현탁액 또는 세포 현탁액의 상청액이 회수물 (harvest)이다. 회수물의 특성 (전술된 바와 같은, 생산물 역가 및 불순물)은 배양방법에 따라서 달라진다.

세포 현탁액은 하기에 기술된 FIX 실시예 중 일부에서 사용했다

수득 단계에서 Capto MMC 수지를 이용한 FIX 의 정제

실시예 1

출발물질

혈장 유래 FIX (pdFIX, Nanotiv®)를 사용했다. 동결건조된 Nanotiv®를 용해시키고 평형화 버퍼로 희석시키고 Capto MMC 컬럼에 로딩시켰다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare사의 혼합 모드 수지 (mixed mode resin)인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 FIX 분자의 포획 단계로 사용했다. Capto MMC는 소수성 및, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. Tricorn 5/150 컬럼을 베드 높이 (bed height)가 15.7cm까지 Capto MMC 수지로 채웠다. 컬럼 부피 (column volume, CV)는 3.1 ml이었다.

버퍼

평형화 버퍼 (Equilibration buffer) : 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80 (Polysorbate 80), pH 7.0

저염 세척 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.2M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80 (Polysorbate 80), pH 6.5

고염 세척 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.7M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80 (Polysorbate 80), pH 6.5

용출 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.2M NaCl, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로 클로라이드 (arginine mono hydrochloride), 0.02% 폴리소르베이트 80 (Polysorbate 80), pH 6.5

실험구성

컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시키고 뒤이어 출발물질을 유속 1ml/분으로 로딩시켰다. 이와 같은 버퍼 조건하에서 pdFIX를 Capto MMC 수지에 결합했다. 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이 본 통과액 (flow through)에서는 pdFIX가 발견되지 않았다. 그 뒤, 수지를 표 1에서 표시된 바와 같이 상이한 세척 조건을 적용했고, 테스트된 어떠한 세척 버퍼에서도 pdFIX는 발견되지 않았다. 0.5M의 아르기닌을 버퍼에 첨가하여 FIX를 수지로부터 용출시켰고, 85%의 수율을 얻었다.

샘플	부피 ml	FIX:C IU/ml	총 FIX:C IU	수율 %
출발물질	10	25.4	254	100
통과액 및 평형화 세척	40	0	0	0
저염 세척	3	0	0	0
고염 세척	3	0	0	0
용출액	6	36	216	85

결론

혈장 유래 FIX (pdFIX, Nanotiv)는 pH7에서 Capto MMC에 결합하며, 적어도 0.7M NaCl 버퍼로 수지로부터의 용출 없이 세척할 수 있다.

버퍼에의 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 버퍼에 첨가하여, pdFIX를 컬럼으로부터 용출시킨다.

실시예 2

출발물질

재조합 인간 FIX (rhFIX)는 HEK 293로부터 생산하였다. 이 세포를 제거하였고 세포 불포함 상청액을 Capto MMC 컬럼에 출발물질로써 로딩하였다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare사의 혼합 모드 수지 (mixed mode resin)인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 FIX 분자의 포획 단계로 사용하였다. Capto MMC는 소수성, 호황성 상호작용 및 수소결합를 갖는 약한 양이온성 수지이다. XK 26 컬럼을 베드 높이 15cm까지 MMC 수지로 채웠다. 컬럼 부피 (CV)는 80ml이었다.

버퍼

평형화 버퍼 : 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0

고염 세척 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.7M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 6.5

용출 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.2M NaCl, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 6.5

실험구성

컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시키고 출발물질을 유속 26ml/min로 로딩시켰다. 이 버퍼 조건에서 rhFIX는 Capto MMC 수지에 결합했다. 표 2에서 볼 수 있는 것과 같이 통과액에서는 rFIX가 발견되지 않았다. 고염세척은 rhFIX을 컬럼으로부터 용출시키지 않았다. 0.5M의 아르기닌을 버퍼에 추가함으로써 FIX를 수지로부터 용출시켰고 92%의 수율을 얻었다.

샘플	부피 ml	FIX:C IU/ml	총 FIX:C IU	수율 %
출발물질	1600	1.27	2032	100
통과액 및 평형화 세척	2400	0	0	0
고염 세척	400	0	0	0
용출	60	31.1	1866	92

결론

재조합 FIX (rhFIX)는 pH 7에서 Capto MMC에 결합하며, 적어도 0.7M NaCl 버퍼로 수지로부터의 용출 없이 세척할 수 있었다.

버퍼에 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 첨가하는 것에 의해 rhFIX를 컬럼으로부터 용출하도록 하였다.

사용된 버퍼는 0.02% 폴리소르베이트 80 (비 이온성 디터젼트)를 포함하고 있었으며, 이는 어떠한 부정적 효과도 초래하지 않았다. 버퍼 중에 폴리소르베이트 80을 사용하는 것은 유리하다; 사용하는 버퍼에 폴리소르베이트 80을 첨가하지 않은 하기의 실험 결과 (실시예 3)와 비교하여 본다.

실시예 3

출발물질

재조합 인간 FIX (rhFIX)는 HEK 293로부터 생산하였다. 이 세포를 제거하였으며, 세포 불포함 상청액을 Capto MMC 컬럼에 출발물질로써 로딩시켰다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare사의 혼합 모드 수지 (mixed mode resin)인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 FIX 분자의 포획 단계에서 사용하였다. Capto MMC는 소수성 및, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. XK 26 컬럼을 베드 높이 (bed height)\ 15cm까지 Capto MMC 수지로 채웠다. 컬럼 부피 (CV)는 80ml이었다.

버퍼

평형화 버퍼 : 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, pH 7.0

고염 세척 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.7M NaCl, pH 6.5

용출 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.2M NaCl, 0.8M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, pH 6.5

실험 구성 및 결과

컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시키고, 출발물질을 유속 26ml/분으로 로딩시켰다. rhFIX는 이와 같은 버퍼 조건하에서 Capto MMC 수지에 결합하였다. 표3에서 표시된바와 같이 컬럼에 로딩된 rhFIX의 소량을 통과액에서 발견하였다. 그 뒤 수지를 상당히 높은 NaCl 농도인 0.7M로 세척하였다. 표 3에서 나타난 바와 같이 1% 미만의 rhFIX를 이 세척액에서 검출하였다. 버퍼에 0.8M 아르기닌을 첨가하는 것에 의해 rhFIX를 수지에서 용출시키고 84%의 수율을 얻었다. 이 실험에서 사용된 버퍼는 실험 2 및 실험 5와 대비하여 폴리소르베이트 80을 포함하지 않았다.

샘플	부피 ml	FIX:C IU/ml	총 FIX:C IU	수율 %
출발물질	750	1.27	2032	100
통과액 및 평형화 세척액	1550	0	0	4
고염 세척	400	0	0	0
용출액	60	31.1	1866	84

결론

재조합 FIX (rhFIX)는 pH 7에서 Capto MMC에 결합하며, 수지로부터의 용출 없이 최소 0.7M NaCl 버퍼로 세척할 수 있었다.

버퍼로의 0.8M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드의 첨가는 rhFIX를 컬럼으로부터 용출시킨다.

어떠한 디터전트도 버퍼에 첨가하지 않았고, 이는 용출 분획에서 다소 더 낮은 rhFIX의 회수율 (recovery)를 나타낸다.

실시예 4 (실시예 4A 및 실시예 4B)

출발물질

혈장 유래 FIX (pdFIX, Nanotiv®)를 사용하였다. 동결 건조된 Nanotiv®를 용해시키고 평형화 버퍼로 희석시키고 Capto MMC 컬럼에 로딩시켰다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare 사의 혼합 모드 수지인 Capto MMC를 FIX 분자의 수득 단계에 사용하였다. Capto MMC (cat no. 17-5317)는 소수성 및, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. Tricorn 5/150 컬럼을 베드 높이 15cm까지 Capto MMC 수지로 채웠다. 컬럼 부피 (CV)는 3ml이었다.

버퍼

실시예 4A의 경우:

평형화 버퍼 : 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, pH 7.0

용출 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로 클로라이드, pH 7.0

실시예4B의 경우:

용출 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로 클로라이드, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0

실험구성

폴리소르베이트 80을 포함하거나 또는 포함하지 않고, pH를 7.0로 맞춘 버퍼를 이용한, Capto MMC 컬럼에서의 pdFIX 정제의 비교. 컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시켰고 출발물질을 유속 1ml/분로 로딩시켰다. pdFIX는 이와 같은 버퍼 조건하에서 Capto MMC 수지에 결합했다. 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이 본 통과액 및 평형화 세척 분획에서는 pdFIX를 발견할 수 없었다.

샘플	부피 ml	FIX:C IU/ml	총 FIX:C IU	수율 %
실시예 4A (폴리소르베이트 80 무)
출발물질	18	22.3	401	100
통과액 및 평형화 세척	15	0	0	0
용출	9	42.25	380	95
실시예 4B (폴리소르베이트 80 유)
출발물질	18.45	25.9	478	100
통과액 및 평형화 세척	42	0	0	0
용출	9	52.85	476	99.5

결론

버퍼에 폴리소르베이트 80이 존재하는 경우, 버퍼에 폴리소르베이트 80이 존재하지 않는경우보다 5% 증가한 혈장 유래 FIX가 용출되었다. 그 차이는 작지만, 이러한 결과는 버퍼에서 폴리소르베이트 80을 사용하는 것의 효용을 나타낸다. 양 실험에서 pdFIX의 수율은 모두 높았다. 이것은 또한 버퍼에서의 pH 7.0이 Capto MMC 수지로의 pdFIX의 결합 및 그로부터의 용출 모두에서 우수한 데이터를 가져왔다는 것을 나타낸다.

실시예 5 (실시예 5A 및 실시예 5B)

출발 물질

혈장 유래 FIX (Nanotiv®)를 사용하였다. 동결건조된 Nanotiv®를 용해시키고 평형화 버퍼로 희석시키고 Capto MMC 컬럼에 로딩시켰다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare 사의 혼합 모드 수지 (mixed mode resin)인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 FIX 분자의 포획 단계로 사용하였다. Capto MMC는 소수성 및, 호황성 상호작용 및 수소결합이 존재하는 약한 양이온성 수지이다. Tricorn 5/150 컬럼을 베드 높이 15cm까지 Capto MMC 수지로 채웠다. 컬럼 부피 (CV)는 3ml이었다.

버퍼

실시예5A 실험의 경우:

평형화 버퍼: 20 mM HEPES, 0.1M NaCl, pH 8.0

용출 버퍼: 20mM HEPES, 0.1M NaCl, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, pH 8.0

실시예5B 실험의 경우:

평형화 버퍼 : 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, pH 6.0

용출 버퍼: 20mM 구연산나트륨, 0.1M NaCl, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, pH 6.0

실험구성

결합 및 용출 버퍼 모두에서 사용된, pH가 8.0 또는 6.0인 두개의 상이한 pH를 갖는 버퍼에 의한 Capto MMC 컬럼에서의 pdFIX 정제를 비교하였다. 컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시켰고 출발물질을 유속 1ml/분으로 로딩시켰다. pdFIX을 이와 같은 버퍼 조건하에서 Capto MMC 수지에 부착시켰다. 표5에서 볼 수 있는 것과 같이 본 통과액 및 평형화 세척 분획에서는 pdFIX를 발견할 수 없었다. 용출 분획에서의 pdFIX의 수율은 테스트된 두 가지 pH 모두에서 동일하게 높았다.

샘플	부피 ml	FIX:C IU/ml	총 FIX:C IU	수율 %
실시예 5A (pH 8.0)
출발 물질	18.83	22.9	431	100
통과액 및 평형화 세척액	42	0	0	0
용출액	9	38.8	349	81
실시예 5B (pH 6.0)
출발 물질	17.87	14	250	100
통과액 및 평형화 세척액	42	0	0	0
용출액	15	13.6	204	81

결론

본 실험은 혈장 유래 FIX는 pH가 8.0 및 6.0인 버퍼에서 Capto MMC 수지에 결합할 수 있으며 이 두 pH는 용출 버퍼에도 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 6 (실시예 6A-6K)

목적

본 실험의 목적은 3가지 다른 pH; 6.0, 7.0 및 8.0 에서 Capto MMC 수지에서의 재조합 인간 FIX (rhFIX)의 포획 및 용출을 연구하는 것이었다. 또한 rhFIX의 결합 및 용출에 대해, 이와 같은 사용된 버퍼 중 0.02%의 폴리소르베이트 80의 이점을 조사하였다.

출발 물질

재조합 인간 FIX (rhFIX)를 HEK 293 세포에서 생산하였다. 세포를 제거하고 세포 불포함 상청액을 Capto MMC 컬럼에 출발물질로써 로딩시켰다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare 사의 혼합 모드 수지 (mixed mode resin)인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 FIX 분자의 포획 단계로 사용하였다. Capto MMC는 소수성 및, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. XK 16컬럼을 베드 높이 13.5cm까지 Capto MMC 수지로 채웠다. 컬럼 부피 (CV)는 27ml이었다.

버퍼

실시예 6A

평형화 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, pH 7.0
세척 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, pH 7.0
용출 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, 0,5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, pH 7.0.
CIP	1% Triton X-100/0.5M NaCl, 1M NaOH, WFI, 20% 에탄올
보관 버퍼	20% 에탄올

WFI: 주사용수 (Water for injection)

실시예 6B

평형화 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, pH 6.0
세척 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, pH 6.0
용출 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, 0,5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, pH 6.0.
CIP	1% Triton X-100/0.5M NaCl, 1M NaOH, WFI, 20% 에탄올
보관 버퍼	20% 에탄올

실시예 6C

평형화 버퍼	0.1M NaCl, 20mM HEPES, pH 8.0
세척 버퍼	0.1M NaCl, 20mM HEPES, pH 8.0
용출 버퍼	0.1M NaCl, 20mM HEPES, 0,5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, pH 8.0.
CIP	1% Triton X-100/0.5M Na, 1M NaOH, WFI, 20% 에탄올
보관 버퍼	20% 에탄올

실시예 6D

평형화 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0
세척 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0
용출 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, 0,5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0.
CIP	1% Triton X-100/0.5M NaCl, 1M NaOH, WFI, 20% 에탄올
보관 버퍼	20% 에탄올

실시예 6E

평형화 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 6.0
세척 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 6.0
용출 버퍼	0.1M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, 0,5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 6.0.
CIP	1% Triton X-100/0.5M NaCl, 1M NaOH, WFI, 20% 에탄올
보관 버퍼	20% 에탄올

실시예 6F

평형화 버퍼	0.1M NaCl, 20mM HEPES, pH 8.0
세척 버퍼	0.1M NaCl, 20mM HEPES, pH 8.0
용출 버퍼	0.1M NaCl, 20mM HEPES, 0,5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, pH 8.0.
CIP	1% Triton X-100/0.5M NaCl, 1M NaOH, WFI, 20% 에탄올
보관 버퍼	20% 에탄올

실험구성 및 결과

컬럼을 평형화 버퍼로 평형화시켰고, 출발 물질을 9ml/분의 유속으로 로딩하였다. 컬럼은 평형화 버퍼로 세척하고, 뒤이어 Capto MMC 컬럼으로부터 결합된 rhFIX을 용출시켰다. 결과는 표 12에 표시된다.

실험 번호 실시예	pH	0.02% P80	통과액 중 FIX %	용출액 중 FIX %
실시예 6A	7.0	No	0	89
실시예 6D	7.0	Yes	0	94
실시예 6B	6.0	No	0	77
실시예 6E	6.0	Yes	0	86
실시예 6C	8.0	No	0	80
실시예 6F	8.0	Yes	0	78

표 12에서 제시된 데이터는 rhFIX가 pH 6, pH 7, 및 pH 8에서 Capto MMC에 결합한다는 것을 보여준다. 통과액에서는 rhFIX를 발견할 수 없었다. 결합된 rhFIX는 또한 pH에서 75% 보다 높은 회수율 (recovery)로 Capto MMC 수지로부터 용출될수 있다. 최상의 회수율은 pH 7의 용출버퍼에서 얻었다. pH 7 또는 6을 사용하였을 때, 평형화 및 용출 버퍼 중 폴리소르베이트 80의 첨가는 최소 5%의 증가를 가져왔다. pH가 8인 버퍼를 사용한 경우 폴리소르베이트 80 에 따른 이점은 나타나지 않았다.

본 데이터 및 실험 5에서 수득된 데이터는 Capto MMC 수지로부터의 rhFIX와 pdFIX의 회수율에 대한 폴리소르베이트 80의 긍정적 효과를 보여준다.

결론

재조합 인간 FIX는 최소한 6-8 pH 범위에서 Capto MMC 에 결합할 수 있다. 0.5 M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드의 버퍼로의 첨가에 의해 rhFIX 분자는 3개의 테스트된 pH 중 사용된 pH에 관계없이 시험된 pH 범위 내에서 Capto MMC 수지로부터 용출된다.

그러나, 수득된 결과는 pH 7이 보다 높은 rhFIX 수율을 가져온다는 것을 보여준다. pH 7 또는 6이 사용된 경우 폴리소르베이트 80 디터전트의 첨가는 rhFIX 회수율 증가를 보여준다.

실시예 7

목적

본 실험의 목적은 재조합 인간 FIX를 배양 배지로부터 순수한 산물로 정제하는 것이었다. 이는 3단계를 포함했다; 포획 단계, 친화성 단계, 및 농축 및 버퍼 교환 단계. Capto MMC 수지를 포획 단계에서 사용하며 비-동물 (non-animal) 유래 FIX 친화성 리간드 단계를 주요 정제 단계로 사용했다. 최종 단계로서, 먼저 우선적으로 분자를 농축시키고 그 후 생리학적 버퍼 환경으로 버퍼를 교환하기 위해 10 kDa 컷오프 (cut off)의 초미세여과 (ultra filtration) 시스템을 사용했다.

포획 단계의 출발 물질

재조합 인간 FIX (rhFIX)을 HEK 293세포에서 생산하였다. 이 세포를 제거하였으며, 세포 불포함 상청액을 Capto MMC 컬럼에 출발물질로 로딩하였다.

포획 단계 (실시예 7A-C)

GE Healthcare 사의 혼합 모드 수지 (mixed mode resin)인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 FIX 분자의 포획단계에 사용하였다. Capto MMC는 소수성, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. XK 50 컬럼을 베드 높이 16.5cm까지 MMC 수지로 채웠다. 컬럼 부피 (CV)는 324 ml이었다.

실험 구성 및 결과

컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시키고 출발물질을 유속 75ml/분로 로딩하였다. 그 뒤, 컬럼을 평형화 버퍼로 세척하였으며 Capto MMC 컬럼으로부터 결합된 rhFIX를 용출하였다. 결과를 표 14에 표시한다. rhFIX의 정제를 동일한 실험구성 및 동일한 종류의 버퍼를 이용하여, 3회 개별적 진행으로 수행하였다. 이 포획 정제는 pH 7.0의 조건에서 수행하였다.

실시예	통과액 중 FIX %	용출액 중 FIX %
실시예 7A	0	84.5
실시예 7B	2	93.5
실시예 7C	0	100

표 14에서 나타난 데이터는 pH 7에서 rhFIX가 Capto MMC에 결합한다는 것을 나타낸다. 통과액에서는 rhFIX가 발견되지 않았거나 아주 미량 발견되었다. 결합된 rhFIX는 pH 7에서 최종 농도 0.5M의 아르기닌-HCl을 최종 농도 0.5M 까지 첨가하는 것에 의해 Capto MMC 수지로부터 용출시킬수 있었다. 이 3회의 rhFIX 포획 평균 회수율은 92%였다.

FIX 친화성 단계 (실시예 7D-E)

친화성 단계에서 효모에서 생산된 비 동물 유래 FIX 친화성 리간드 (F_ab 단편)을 사용하였다 (BAC BV 와 Bio Affinity Company 와 공동 개발). 이 리간드를 표준 커플링 기법 (standard coupling technique)에 따라 Capto MP 수지 (GE Healthcare)에 커플링시키고 "FIX 친화성 수지 (FIX affinity resin)"로 지칭한다.

XK 26 컬럼를 베드 높이 7.5 cm까지 FIX 친화성 수지로 채웠으며, 컬럼 부피 (CV)는 40 ml였다.

평형화 버퍼	0.15M NaCl, 10mM 구연산 나트륨, pH 7.0
세척 버퍼	0.15M NaCl, 10mM 구연산 나트륨, pH 7.0
용출 버퍼	2M MgCl2, 20mM Tris 염기, pH 7.4
CIP	0.1M HAc, 2M NaCl 와 20% 에탄올
보관 버퍼	20% 에탄올

실험 구성 및 결과

3개의 포획 단계로부터의 용출액을 모으고 이를 친화성 컬럼에서 출발물질로 이용하였다. 컬럼을 평형화 버퍼로 평형화시켰으며 10ml/분의 유속으로 출발물질을 로딩시켰다. 컬럼을 평형화 버퍼로 세척하고, 뒤이어 친화성 컬럼으로부터 결합된rhFIX를 용출 시켰다. 결과는 표 16에 표시된다. rhFIX의 정제는 동일한 실험 설계 및 동일한 종류의 버퍼를 이용하여 2개의 개별적인 진행으로 수행하였다.

실시예	통과액 중 FIX %	용출 중 FIX %
실시예 7D	50	47
실시예 7E	15	80

표 16에서 표시하고 있는 데이터는 rhFIX가 pH7에서 FIX 친화성 수지에 결합한다는 것을 보여준다. 수득된 통과액은 사용된 수지 양의 결합능력의 효과였다. 두 실험 모두에서 사용된 rhFIX의 거의 100% 가 검출되었다. 결합된 rhFIX는 2M MgCl2를 포함하는 버퍼를 이용하여 FIX 친화성 수지로부터 용출할 수 있었다.

농축 (concentrating) 및 버퍼교환 (buffer exchange) 단계 (실시예 7F)

UF 시스템을 이용하여 친화성 컬럼으로부터 얻은 용출액 중 rhFIX를 농축하고, 동일한 UF 필터를 이용한 정용여과 (dia-filtration)에 의해 버퍼를 교환하였다.

UF 필터

Pellicon 2 시스템에 장착된 10 kDa 컷오프 (cut off)의 Pellicon 3 필터를 사용하였다.

정용여과 (Diafiltration) 버퍼

0.15M NaCl, 20mM 구연산 나트륨, pH 7.0
25℃에서의 전도도 18.4mS/cm

실험 구성 및 결과

접선 유동 (tangential flow)의 샘플 펌핑 (pumping)과 소량의 용량 (volume)이 pellicon 3 필터를 통해 연속적으로 통과할 수 있게 하여, 용량이 감소되었다. 본 필터에 사용되는 공극 크기 때문에 rhFIX 분자가 재순환 분획 (re-circulating fraction)에 포함되어 있었다. rhFIX의 분자량은 대략적으로 55kDa 이고, 이는 10kDa의 공극을 갖는 필터를 사용할 때에 유지된다.

310ml의 친화성 용출액이 약 60ml까지 농축되었다. 이 용량은 Pellicon 3 필터를 통하여 여과되는 속도와 동일한 속도로 연속적으로 정용 여과 (diafiltration) 버퍼를 첨가하는 것에 의해 정용 여과된 것이다. 이 60ml 농축액 중 버퍼를 약 18회 교환하였다. 이 농축액의 전도도는 25℃에서 123mS/cm 부터 18.6mS/cm까지 변화하였다.

본 농축 및 버퍼 교환 단계를 통한 rhFIX의 회수율은 86%였다. rhFIX를 최대한 회수하기 위하여 투석 버퍼에 의한 UF 필터의 세척 단계를 수행하였다.

도 1은 FIX 친화성 수지 정제 후의 SDS Page 순도 패턴을 보여준다. 레인 1 (lane 1)은 상업적으로 입수 가능한 분자 마커이고, 레인 2는 상업적으로 입수 가능한 고순도의 혈장 유래 FIX이며, 레인 3은 상업적으로 입수 가능한 고순도의 재조합 FIX 제품이고, 레인 4 및 5는 실시예 7D 및 7E에 기재된 본 발명의 FIX 친화성 정제 후의 샘플, 레인 6 및 7은 실시예 7F에 기재된 FIX 친화성 정제 및 초미세 여과 농축 (concentration)/ 탈염 (desalting) 후의 샘플이다. 레인 4 내지 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 산물의 FIX 순도는, 레인 2 또는 3과 비교하여 더 높거나 더 낮은 분자량의 불순물을 보이지 않았다.

Claims

프리온-불포함 비타민 K 의존성 단백질을 크로마토그래피를 이용한 정제 순서 (purification sequence)로 제조하는 방법으로서,
- 하나 이상의 크로마토그래피가 다중 모드 수지 (multimodal resin)를 이용하여 수행되고;
- 수용액 중 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는 분획을 제공하며;
- 6 내지 9의 pH에서 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는 분획을 다중 모드 수지와 접촉시키고; 및
- pH 6 내지 9에서 아르기닌을 포함하는 용출 버퍼로 다중 모드 수지로부터 비타민 K 의존성 단백질을 용출시키는; 것을 특징으로 하고,
상기 비타민 K 의존성 단백질은 혈장 유래 FVII 또는 FIX, 또는 재조합적으로 생산된 FVII 또는 FIX인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다중모드 수지는 매트릭스에 결합된 모이어티를 포함하고 상기 모이어티는 수성 환경에서 상기 비타민 K 의존성 단백질과 이온성 상호작용, 및 수소 결합, 소수성 상호작용 및 호황성 (thiophilic) 상호작용 중 어느 하나의 상호작용에 의해 상호작용할 수 있는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 수용액은 25℃에서 5 내지 200 mS/cm의 전도도를 갖는 염 용액 및 25℃에서 5 내지 200 mS/cm의 전도도를 갖는 용출 버퍼 (elution buffer) 중 어느 하나 이상에 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 아르기닌이 0.1-2 M의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 아르기닌이 0.3-0.7 M의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4 또는 5에 있어서, 상기 비타민 K 의존성 단백질은 pH 6 내지 9를 갖는 버퍼에 의해 용출되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 비타민 K 의존성 단백질은 pH 6 내지 8을 갖는 버퍼 또는 pH 7을 갖는 버퍼에 의해 용출되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 용출 버퍼는 하나 이상의 히드록시기 함유 유기 화합물, 하나 이상의 아미노기 함유 유기 화합물, 버퍼의 이온 강도를 조절하기 위한 하나 이상의 화합물, 하나 이상의 비이온성 디터전트 (detergent), pH를 6 내지 9로 조절하기 위한 하나 이상의 버퍼 물질 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제 (agent)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 8에 있어서,
- 상기 히드록시기 함유 유기 화합물은 메탄올, 프로판올, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- 상기 버퍼의 이온 강도를 조절하기 위한 화합물은 염화칼륨 (KCl) 및 염화나트륨 (NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- 상기 비이온성 디터전트 (detergent)는 트윈 (Tween) 20, 트윈 80 및 플루로닉 (Pluronic) F68로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- 상기 버퍼 물질은 구연산 나트륨 (sodium citrate), 히스티딘 (histidine), HEPES, MES, 트리스 염기 (Tris base) 및 pH 6 내지 9의 아세트산 나트륨 (sodium acetate)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 구연산 나트륨은 pH를 6 내지 7.5로 조정하기 위한 것이고, 트리스 염기는 pH를 7.5 내지 9로 조정하기 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 비타민 K 의존성 단백질은 염화나트륨/에틸렌 글리콜의 조합 또는 아르기닌/염화나트륨의 조합, 또는 아르기닌/에틸렌 글리콜의 조합에 의해 용출되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다중모드 (multimodal) 크로마토그래피 수지는 하기 모이어티 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a. 양전하를 띤 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 (N-Benzyl-N-methyl ethanolamine) 리간드,
b. 음전하를 띤 2-(벤조일아미노) 부탄산 (2-(benzoylamino) butanoic acid) 리간드,
c. 페닐프로필 (phenylpropyl) 리간드,
d. N-헥실 (N-hexyl) 리간드,
e. 4-머캅토-에틸-피리딘 (4-Mercapto-Ethyl-Pyridine) 리간드,
f. 3-((3-메틸-5-((테트라히드로퓨란-2-일메틸)-아미노)-페닐)-아미노)-벤조산 (3-((3-methyl-5-((tetrahydrofuran-2-ylmethyl)-amino)-phenyl)-amino)-benzoic acid) 리간드 또는 이들의 조합.
청구항 1에 있어서, 상기 다중 모드 (multimadal) 크로마토그래피 수지는 하기 상업적으로 입수 가능한 수지 HEP Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; MEP Hypercel™부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계는 비타민 K 의존성 단백질 친화성 크로마토그래피와 조합되고, 상기 친화성은 효모에서 발현되는 단백질에 기초하는 리간드로부터 제공되고, 결과적으로 수득되는 용출액의 순도는 90 %보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 정제 순서 (purification sequence)가 화학적 불활성화 (chemically based inactivation) 단계, 초미세여과 (ultra filtration) 단계, 크로마토그래피 단계 또는 이들의 조합을 포함하는 병원체 제거/불활성화 단계를 추가로 포함하고, 상기 단계들은 제거할 병원체에 대한 상이한 생리학적 특성에 기초하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 정제 순서는 하기 단계들을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
i. 양이온 다중모드 수지에 의한 크로마토그래피 단계;
ii. 지질 외피(lipid enveloped) 바이러스에 대한 화학적 불활성화 단계;
iii. 단백질 리간드에 기초한 친화성 수지에 의한 크로마토그래피 단계;
iv. 20nm의 평균 공극 크기를 갖는 필터를 이용한 병원체 여과 제거 단계;
v. 음이온 교환 수지에 의한 크로마토그래피 단계; 및
vi. 10 kDa 컷오프 (cut off)를 갖는 초미세여과 단계.
청구항 15에 있어서,
- 상기 양이온 다중모드 수지 크로마토그래피 단계에서 사용된 양이온 다중모드 수지는 Capto MMC이고;
- 상기 화학적 불활성화는 트리-n-부틸 포스페이트 (tri-n-butyl phosphate) 및 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 이용한 용매/디터전트-불활성화이고;
- 상기 친화성 수지 크로마토그래피 단계는 효모에서 발현된 비타민 K 의존성 단백질 항체 단편으로 이루어진 단백질 리간드에 기초하고;
- 상기 병원체 제거 단계는 플라노바 20N (Planova 20N)을 사용하여 수행되고;
- 상기 음이온 교환 수지 크로마토그래피 단계에서 사용된 음이온 교환 수지는 Q Sepharose FF 또는 Capto Q이고;
- 상기 초미세여과 단계는 Pellicon 3을 사용하여 수행되는 것인 방법.
청구항 15 또는 16에 있어서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피 단계와 조합되고, 상기 친화성은 효모에서 발현되는 단백질에 기초하는 리간드로부터 제공되고, 친화성 크로마토그래피 수지로부터 얻어진 결과 산물의 순도는 95%보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 17항에 있어서, 크기 배제, 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용 및 고정 금속 친화성 크로마토그래피 (immobilized metal affinity chromatography)로부터 선택된 추가적인 크로마토그래피가 수행되며, 최종 산물의 순도는 99%보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.