ES2610529T3

ES2610529T3 - Un procedimiento de purificación de proteínas dependientes de vitamina K, tales como el factor de coagulación IX

Info

Publication number: ES2610529T3
Application number: ES11713216.7T
Authority: ES
Inventors: Gustav Gilljam; Stefan Winge
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2017-04-28
Anticipated expiration: 2031-03-30
Also published as: US20130079498A1; ES2740825T3; RU2016122883A3; IL221609A; JP2013523689A; AU2015203388B2; IL248549B; AU2011234521A1; DK2553095T3; IL248549A0; CA2793136A1; RU2016122883A; AU2011234521B2; BR112012024550A2; CA2793136C; EP2553095A1; RU2590726C2; DK3133157T3; AU2015203388A1; KR20130010474A

Abstract

Un procedimiento de fabricación de una proteína dependiente de vitamina K exenta de priones en una secuencia de purificación que emplea cromatografía, caracterizado porque: - al menos una etapa de cromatografía se realiza empleando una resina multimodal; - se proporciona una fracción que contiene una proteína dependiente de vitamina K en una disolución acuosa; - se pone en contacto la fracción que contiene la proteína dependiente de vitamina K con una resina multimodal a un pH entre 6-9; - opcionalmente se lava la resina multimodal que tiene la proteína dependiente de vitamina K adsorbida con un tampón de lavado acuoso para lavar los contaminantes y retener a la proteína dependiente de vitamina K, antes de eluir la proteína dependiente de vitamina K; - la proteína dependiente de vitamina K se eluye de la resina multimodal a un pH entre 6 a 9 en un tampón que comprende arginina; y - opcionalmente se recogen las fracciones que contienen la proteína dependiente de vitamina K en forma purificada o enriquecida; en el que la proteína dependiente de vitamina K es FIX derivado de plasma o FIX producido de modo recombinante.

Description

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c.: un ligando de fenilpropilo,

d.: un ligando de N-hexilo,

e.: un ligando de 4-mercaptoetilpiridina,

f.: un ligando de ácido 3-((3-metil-5-((tetrahidrofuran-2-ilmetil)amino)fenil)amino)benzoico, o sus combinaciones.

En particular, una resina de cromatografía multimodal para su uso según la presente invención se selecciona de las siguientes resinas disponibles comercialmente: HEP Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; MEP Hypercel™.

En otra realización del procedimiento de la invención, la etapa de cromatografía multimodal se combina con una etapa cromatográfica de afinidad de FIX, en la que la afinidad es proporcionada por un ligando de proteína, tal como un fragmento de anticuerpo que se expresa, por ejemplo, en levaduras.

En otra realización de la presente invención, la secuencia de purificación puede comprender además etapas de eliminación/inactivación de patógenos que comprenden una etapa de inactivación con base química, una etapa de eliminación basada en el tamaño, etapas de cromatografía o sus combinaciones, y estas etapas se basan en diferentes propiedades fisiológicas dirigidas al patógeno que se va a eliminar. Un ejemplo de una etapa de inactivación de patógenos muy bien descrita en la bibliografía es el procedimiento de detergente disolvente con base química, por ejemplo, con una base de fosfato de tri-n-butilo y Triton X-100, que desestabiliza a todos los virus con una envuelta de lípidos, divulgado en el documento EP-A-131 740. Un ejemplo de una etapa de eliminación de patógenos basada en el tamaño es, por ejemplo, un nanofiltro con un promedio de tamaño de poro de aproximadamente 20 nm, tal como un filtro Planova 20. Otro ejemplo de eliminación de patógenos se basa en una cromatografía. Por ejemplo, se sabe que la cromatografía de afinidad ejerce unas propiedades de eliminación de patógenos en general, por ejemplo, una resina de cromatografía de ligandos de afinidad de FIX derivados de levadura.

En una realización particular del procedimiento según la presente invención, la secuencia de purificación comprende además las siguientes etapas:

1.: una resina multimodal catiónica, tal como Capto MMC;

2.: una etapa de inactivación con base química para virus con envuelta de lípidos, en particular la inactivación con disolvente/detergente que emplea el fosfato de tri-n-butilo y Triton X-100, según se divulga en el documento EP-A131 740;

3.: una resina de afinidad basada en un ligando expresado en levaduras;

4.: un intercambiador catiónico, tal como SP Sepharose o Resource S;

5.: una etapa de eliminación de patógenos con filtración con un promedio de tamaño de poro de aproximadamente 20 nm, tal como Planova 20N;

6.: una etapa de intercambio de tampón y/o de concentración, tal como una ultrafiltración con un límite de exclusión aproximado de 10 kDa;

7.: una resina de cromatografía de exclusión por tamaño, tal como Superdex 200.

En una realización particular, el procedimiento de la invención puede comprender las siguientes etapas:

-Una resina multimodal Capto MMC™ se carga en una columna y se equilibra con un tampón que comprende citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, polisorbato 80 al 0,02% a pH 7,0.

-La muestra que contiene FIX bruta se aplica y comprende aproximadamente las mismas condiciones que el anterior tampón de equilibrio, y la proteína diana y algunas otras impurezas de proteína se unen a la columna.

-Se aplica una etapa de lavado, según la invención, empleando el tampón de equilibrio, a la columna para inhibir la actividad proteolítica y para eliminar las proteasas, el ADN y otros contaminantes, mientras que el FIX continúa unido a la columna.

-Se eluye el FIX, según la invención, empleando el tampón de equilibrio al que se añade arginina 0,5 M y se ajusta a pH 7,0, para lograr una fracción de FIX no agregado estable en un volumen pequeño.

La cromatografía multimodal (o de modo mixto) es una herramienta para purificar proteínas. Se divulga, por

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Factor IX derivado de plasma

El material utilizado en estos experimentos proviene del producto disponible comercialmente Nanotiv®, que es un concentrado de factor IX nanofiltrado y tratado con SD de alta pureza.

Factor IX recombinante

Producción de una suspensión celular que contiene FIX.

Células

La línea celular utilizada es un derivado de la línea de células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293), que está adaptada para un crecimiento sin suero. Este hospedante, HEK 293F, se transfectó de modo estable con un módulo de expresión que porta la secuencia codificadora de ADNc para el FIX humano y la furina humana (PACE). Se empleó el mismo promotor fuerte para ambos módulos. El procedimiento general también se divulga en el documento EP-A-1 739 179 (Schröder et al.).

Procedimiento de cultivo

Las células se cultivaron en un medio sin suero con un equipo general y según procedimientos generales muy conocidos en la técnica, por ejemplo, cultivos agitados o removidos en matraces t, matraces de agitación y biorreactores (sistemas desechables y tanques de agitación convencionales) que funcionan con cultivos de quimiostato discontinuos, de alimentación discontinua, de perfusión o continuos (Freshney, R. I. (2000), Culture of animal cells: a manual of basic technique, 4ª ed, Wiley-Liss; Spier, R. E. ed. (2000), Encyclopedia of cell technology, Wiley, Nueva York; Enfors, S.-O. y Häggström, L. (2000), Bioprocess technology: fundamentals and applications, Högskoletryckeriet, Royal Institute of Technology, Estocolmo; Vinci, V. A. y Parekh, S. R. (2003), Handbook of industrial cell culture: mammalian, microbial, and plant cells, Humana Press, EEUU). Generalmente, se emplea la perfusión del medio para aumentar el número de células y las titulaciones del producto por encima de los niveles de cultivo discontinuo convencionales. El rendimiento del producto y la cantidad de proteínas de la célula hospedante difieren dependiendo del modo de cultivo:

•: la titulación del producto generalmente aumenta con el número de células,

•: el contenido total en proteínas y en ADN generalmente aumenta con el número de células,

•: el contenido total en proteínas y en ADN también puede aumentar con la longevidad del cultivo,

•: los cultivos discontinuos acumulan proteínas y ADN; nada se añade externamente y nada se retira,

•: los procedimientos de perfusión enjuagan a los cultivos celulares de metabolitos, proteínas, ADN y otras impurezas; los filtros o centrífugas de células se emplean generalmente para la retención de células.

El producto recombinante se libera de las células y la suspensión celular o el sobrenadante de la suspensión celular sería la recolección. Las propiedades de la recolección (titulaciones del producto e impurezas, tal como se mencionó anteriormente) difieren dependiedo del modo de cultivo utilizado.

La suspensión celular se ha utilizado en algunos de los ejemplos de FIX descritos a continuación.

Purificación de FIX empleando la resina Capto MMC como etapa de captura

Ejemplo 1

Material de partida

Se empleó FIX derivado de plasma (pdFIX, Nanotiv®). Se disolvió y diluyó Nanotiv liofilizado en tampón de equilibrio antes de ser cargado en una columna Capto MMC. Resina y columna cromatográfica Se empleó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (n.º de catálogo 17-5317), como etapa de

captura para la molécula de FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrófobas y tiofílicas y enlaces de hidrógeno. Una columna Tricorn 5/150 se cargó con la resina Capto MMC hasta una altura del lecho de 15,7 cm. El volumen de la columna (CV) era de 3,1 ml.

Tampones Tampón de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, polisorbato 80 al 0,02%, pH 7,0

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Tampón de lavado de baja salinidad: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,2 M, polisorbato 80 al 0,02%, pH 6,5

Tampón de lavado de alta salinidad: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,7 M, polisorbato 80 al 0,02%, pH 6,5

Tampón de elución: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,2 M, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, polisorbato 80 al 0,02%, pH 6,5

Configuración experimental

La columna se equilibró con tampón de equilibrio, seguido de la carga del material de partida a un caudal de 1 ml/min. El pdFIX se une a la resina Capto MMC durante estas condiciones de tampón. Tal como puede observarse en la tabla 1, no se encontró pdFIX en la corriente. Después la resina se sometió a diferentes condiciones de lavado, tal como se describe en la tabla 1, y no se detectó pdFIX en ninguno de los tampones de lavado ensayados. Mediante la adición de arginina 0,5 M al tampón, el FIX eluye de la resina y se obtiene un rendimiento del 85%.

Tabla 1

Muestra: Volumen, ml FIX:C, IU/ml FIX:C total, IU Rendimiento, %

Material de partida: 10 25,4 254 100

Corriente y lavado de equilibrio: 40 0 0 0

Lavado de baja salinidad: 3 0 0 0

Lavado de alta salinidad: 3 0 0 0

Eluato: 6 36 216 85

Conclusión

El FIX derivado de plasma (pdFIX, Nanotiv) se une a Capto MMC a pH 7 y puede lavarse con tampón NaCl al menos 0,7 M sin que se eluya de la resina. Mediante la adición de monohidrocloruro de arginina 0,5 M al tampón, el pdFIX se eluye de la columna.

Ejemplo 2

Material de partida

FIX humana recombinante (rhFIX) producida en células HEK 293 Las células se retiraron y el sobrenadante sin células constituyó el material de partida cargado en la columna de Capto MMC. Resina y columna cromatográfica Se empleó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (n.º de catálogo 17-5317), como etapa de

captura para la molécula de FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrófobas y tiofílicas y enlaces de hidrógeno. Una columna XK 26 se cargó con la resina Capto MMC hasta una altura del lecho de 15 cm. El volumen de la columna (CV) era de 80 ml.

Tampones Tampón de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, polisorbato 80 al 0,02%, pH 7,0 Tampón de lavado de alta salinidad: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,7 M, polisorbato 80 al 0,02%, pH 6,5 Tampón de elución: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,2 M, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, polisorbato 80 al

0,02%, pH 6,5 Configuración experimental La columna se equilibró con tampón de equilibrio, seguido de la carga del material de partida a un caudal de 26

ml/min. El rhFIX se une a la resina Capto MMC durante estas condiciones de tampón. Tal como puede observarse en la tabla 2, no se encontró rhFIX en la corriente. El lavado de alta salinidad no eluye ninguna cantidad de rhFIX

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de la columna. Mediante la adición de arginina 0,5 M al tampón, el rhFIX eluye de la resina y se obtiene un rendimiento del 92%.

Tabla 2

Muestra: Volumen, ml FIX:C, IU/ml FIX:C total, IU Rendimiento, %

Material de partida: 1600 1,27 2032 100

Corriente y lavado de equilibrio: 2400 0 0 0

Lavado de alta salinidad: 400 0 0 0

Eluato: 60 31,1 1866 92

Conclusión

El FIX recombinante (rhFIX) se une a Capto MMC a pH 7 y puede lavarse con tampón NaCl al menos 0,7 M sin que se eluya de la resina.

Mediante la adición de monohidrocloruro de arginina 0,5 M al tampón, el rhFIX se eluye de la columna.

Los tampones utilizados contenían polisorbato 80 al 0,02% (un detergente no iónico) que no produjo ningún efecto negativo. Probablemente es una ventaja utilizar el polisorbato 80 en los tampones; compárese con los resultados obtenidos en el siguiente experimento (ejemplo 3), en el que no se añadió polisorbato 80 a los tampones utilizados.

Ejemplo 3

Material de partida

Se produjo FIX humana recombinante (rhFIX) en células HEK 293. Las células se retiraron y el sobrenadante sin células constituyó el material de partida cargado en la columna de Capto MMC.

Resina y columna cromatográfica

Se empleó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (n.º de catálogo 17-5317), como etapa de captura para la molécula de FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrófobas y tiofílicas y enlaces de hidrógeno. Una columna XK 26 se cargó con la resina Capto MMC hasta una altura del lecho de 15 cm. El volumen de la columna (CV) era de 80 ml.

Tampones

Tampón de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,0

Tampón de lavado de alta salinidad: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,7 M, pH 6,5

Tampón de elución: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,2 M, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, pH 6,5

Configuración experimental y resultados

La columna se equilibró con tampón de equilibrio, seguido de la carga del material de partida a un caudal de 26 ml/min. El rhFIX se une a la resina Capto MMC durante estas condiciones de tampón. Tal como puede observarse en la tabla 3, en la corriente se encontró una cantidad baja de rhFIX cargado en la columna. Después, la resina se lavó con un tampón con una concentración de NaCl bastante alta, 0,7 M. Tal como se describe en la tabla 3, se detectó menos del 1% de rhFIX en este lavado. Mediante la adición de arginina 0,8 M al tampón, el rhFIX eluye de la resina y se obtiene un rendimiento del 84%. El tampón utilizado en este experimento no contenía polisorbato 80, comparado con el experimento 2 y el experimento 5.

Tabla 3

Muestra: Volumen, ml FIX:C, IU/ml FIX:C total, IU Rendimiento, %

Material de partida: 750 1,27 2032 100

Corriente y lavado de equilibrio: 1550 0 0 4

Lavado de baja salinidad: 400 0 0 0

Eluato: 60 31,1 1866 84

Conclusión La FIX humana recombinante (rhFIX) se une a Capto MMC a pH 7 y puede lavarse con tampón NaCl al menos 0,7 M sin que se eluya de la resina. 5 Mediante la adición de monohidrocloruro de arginina 0,8 M al tampón, el rhFIX se eluye de la columna. No se añadió detergente a los tampones, lo cual puede indicar una recuperación algo menor del rhFIX en la fracción de elución.

Ejemplo 4 (Ejemplo 4A y Ejemplo 4B)

Material de partida

10 Se empleó FIX derivado de plasma (pdFIX, Nanotiv®). Se disolvió y diluyó Nanotiv liofilizado en tampón de equilibrio antes de ser cargado en una columna Capto MMC. Resina y columna cromatográfica Se empleó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (n.º de catálogo 17-5317), como etapa de

captura para la molécula de FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrófobas y tiofílicas 15 y enlaces de hidrógeno. Una columna Tricorn 5/150 se cargó con la resina Capto MMC hasta una altura del lecho de 15 cm. El volumen de la columna (CV) era de 3 ml. Tampones Para el experimento del ejemplo 4A: Tampón de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,0 20 Tampón de elución: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, pH 7,0 Para el experimento del ejemplo 4B:

Tampón de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, polisorbato 80 al 0,02%, pH 7,0 Tampón de elución: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, polisorbato 80 al 0,02%, pH 7,0

25 Configuración experimental Se compara la purificación de pdFIX en una columna de Capto MMC con tampones con o sin polisorbato 80 y a un pH ajustado a 7,0. La columna se equilibró con tampón de equilibrio, seguido de la carga del material de partida a un caudal de 1 ml/min. El pdFIX se une a la resina Capto MMC durante estas condiciones de tampón. Tal como puede observarse en la tabla 4, no se encontró pdFIX en la corriente ni en la fracción de lavado de equilibrio. 30 Tabla 4

Muestra: Volumen, ml FIX:C, IU/ml FIX:C total, IU Rendimiento, %

Ejemplo 4A (sin polisorbato 80)

Material de partida: 18 22,3 401 100

Corriente y lavado de equilibrio: 15 0 0 0

Eluato: 9 42,25 380 95

Ejemplo 4B (con polisorbato 80)

Material de partida: 18,45 25,9 478 100

Corriente y lavado de equilibrio: 42 0 0 0

Eluato: 9 52,85 476 99,5

Conclusión

Se eluyó un aumento del 5% del FIX derivado de plasma cuando se incluyó polisorbato 80 en los tampones, comparado con el caso en que no se encuentra polisorbato 80 en los tampones. La diferencia es pequeña. pero los

5 resultados apuntan hacia un beneficio en la utilización de polisorbato 80 en los tampones. El rendimiento del pdFIX fue alto en ambos experimentos. Esto demuestra que el pH 7,0 en los tampones utilizados produce unos datos buenos, con relación a la unión y a la elución de pdFIX de la resina MMC.

Ejemplo 5 (Ejemplo 5A y Ejemplo 5B)

Material de partida

10 Se empleó FIX derivado de plasma (Nanotiv). Se disolvió y diluyó Nanotiv liofilizado en tampón de equilibrio antes de ser cargado en una columna Capto MMC. Resina y columna cromatográfica Se empleó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (n.º de catálogo 17-5317), como etapa de

captura para la molécula de FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrófobas y tiofílicas 15 y enlaces de hidrógeno. Una columna Tricorn 5/150 se cargó con la resina Capto MMC hasta una altura del lecho de 15 cm. El volumen de la columna (CV) era de 3 ml. Tampones Para el experimento del ejemplo 5A: Tampón de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, pH 8,0 20 Tampón de elución: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, pH 8,0 Para el experimento del ejemplo 5B: Tampón de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, pH 6,0 Tampón de elución: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, pH 6,0 Configuración experimental

25 Se compara la purificación de pdFIX en una columna de Capto MMC con tampones con dos pH diferentes, 8,0 y 6,0, empleados ambos en los tampones de unión y de elución. La columna se equilibró con tampón de equilibrio, seguido de la carga del material de partida a un caudal de 1 ml/min. El pdFIX se une a la resina Capto MMC durante estas condiciones de tampón. Tal como puede observarse en la tabla 5, no se encontró pdFIX en la corriente. El rendimiento de pdFIX fue igualmente elevado en la fracción de elución para ambos pH ensayados.

30 Tabla 5

Muestra: Volumen, ml FIX:C, IU/ml FIX:C total, IU Rendimiento, %

Ejemplo 5A (pH 8,0)

Material de partida: 18,83 22,9 431 100

Corriente y lavado de equilibrio: 42 0 0 0

Eluato: 9 38,8 349 81

Ejemplo 5B (pH 6,0)

Material de partida: 17,87 14 250 100

Corriente y lavado de equilibrio: 42 0 0 0

Eluato: 15 13,6 204 81

Conclusión Estos experimentos demuestran que el FIX derivado de plasma puede unirse a la resina Capto MMC en tampones con un pH de 8,0 y 6,0, y que ambos pH también pueden utilizarse en el tampón de elución.

5 Ejemplo 6 (Ejemplo 6A-6K) Objetivo El objetivo de estos experimentos es estudiar la captura y elución del FIX humano recombinante (rhFIX) en una

resina Capto MMC a tres pH diferentes: 6,0, 7,0 y 8,0. También se investigó la ventaja de incluir polisorbato 80 al 0,02% en estos tampones con respecto a la unión y la elución de rhFIX.

10 Material de partida FIX humana recombinante producida en células HEK 293 Las células se retiraron y el sobrenadante sin células constituyó el material de partida cargado en la columna de Capto MMC.

Resina y columna cromatográfica Se empleó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (n.º de catálogo 17-5317), como etapa de 15 captura para la molécula de FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrófobas y tiofílicas

y enlaces de hidrógeno. Una columna XK 16 se cargó con la resina Capto MMC hasta una altura del lecho de 13,5 cm. El volumen de la columna (CV) era de 27 ml. Tampones

Ejemplo 6A

Tampón de equilibrio: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, pH 7,0

Tampón de lavado: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, pH 7,0

Tampón de elución: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, pH 7,0

CIP: Triton X-100 al 1%/NaCl 0,5 M, NaOH 1 M, WFI, etanol al 20%

Tampón de conservación: etanol al 20%

WFI: agua para inyección

Ejemplo 6B

Tampón de equilibrio: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, pH 6,0

Tampón de lavado: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, pH 6,0

Tampón de elución: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, pH 6,0

CIP: Triton X-100 al 1%/NaCl 0,5 M, NaOH 1 M, WFI, etanol al 20%

Tampón de conservación: etanol al 20%

Ejemplo 6C

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Tampón de lavado: NaCl 0,1 M, HEPES 20 mM, pH 8,0

Tampón de elución: NaCl 0,1 M, HEPES 20 mM, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, pH 8,0

CIP: Triton X-100 al 1%/NaCl 0,5 M, NaOH 1 M, WFI, etanol al 20%

Tampón de conservación: etanol al 20%

Ejemplo 6D

Tampón de equilibrio: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, polisorbato 80 al 0,02%, pH 7,0

Tampón de lavado: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, polisorbato 80 al 0,02%, pH 7,0

Tampón de elución: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, polisorbato 80 al 0,02%, pH 7,0

CIP: Triton X-100 al 1%/NaCl 0,5 M, NaOH 1 M, WFI, etanol al 20%

Tampón de conservación: etanol al 20%

Ejemplo 6E

Tampón de equilibrio: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, polisorbato 80 al 0,02%, pH 6,0

Tampón de lavado: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, polisorbato 80 al 0,02%, pH 6,0

Tampón de elución: NaCl 0,1 M, citrato de sodio 20 mM, monohidrocloruro de arginina 0,5 M, polisorbato 80 al 0,02%, pH 6,0

CIP: Triton X-100 al 1%/NaCl 0,5 M, NaOH 1 M, WFI, etanol al 20%

Tampón de conservación: etanol al 20%

Ejemplo 6F

Tampón de equilibrio: NaCl 0,1 M, HEPES 20 mM, pH 8,0

Tampón de lavado: NaCl 0,1 M, HEPES 20 mM, pH 8,0

CIP: Triton X-100 al 1%/NaCl 0,5 M, NaOH 1 M, WFI, etanol al 20%

Tampón de conservación: etanol al 20%

Configuración experimental y resultados

La columna se equilibró con tampón de equilibrio, seguido de la carga del material de partida a un caudal de 9 ml/min. La columna después se lavó con tampón de equilibrio, seguido de la elución del rhFIX unido de la columna de Capto MMC. Los resultados se presentan en la tabla 6.

Tabla 6

Ejemplo n.º de exp.: pH P80 al 0,02% FIX en la corriente, % FIX en el eluato, %

Ejemplo 6A: 7,0 no 0 89

Ejemplo 6D: 7,0 sí 0 94

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Mediante la utilización de un sistema de UF se concentró el rhFIX en el eluato de la columna de afinidad y después el tampón se intercambió mediante una diafiltración empleando el mismo filtro de UF. Filtro de UF Se empleó un filtro Pellicon 3 con un límite de exclusión de 10 kDa montado en un sistema Pellicon 2.

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Configuración experimental y resultados

Mediante el bombeo de la muestra en un flujo tangencial y permitiendo que una pequeña parte del volumen pase continuamente a través del filtro Pellicon 3, el volumen disminuyó. Debido al tamaño de poro empleado en el filtro, la molécula de rhFIX se encuentra contenida en la fracción de recirculación. El peso molecular del rhFIX es de

10 aproximadamente 55 kDa y es retenido cuando se emplea un filtro con un tamaño de poro de 10 kDa.

Se concentró un volumen de 310 ml de eluato de afinidad hasta aproximadamente 60 ml. Este volumen se diafiltró mediante la adición continua de tampón de diafiltración a la misma velocidad a la que se filtra a través del filtro Pellicon 3. El tampón en este concentrado de 60 ml se cambió aproximadamente 18 veces. La conductividad de este concentrado cambió de 123 mS/cm a 18,6 mS/cm a 25 °C.

15 La recuperación del rhFIX en esta etapa de concentración e intercambio de tampón fue del 86%. Se realizó una etapa de lavado del filtro de UF con el tampón de diálisis para recuperar tanto rhFIX como fuera posible.

La figura 1 muestra el patrón de pureza de SDS-PAGE después de la purificación de la resina de afinidad de FIX. El carril 1 es un marcador molecular disponible comercialmente, el carril 2 es un producto de FIX derivado de plasma de alta pureza disponible comercialmente, el carril 3 es un producto de FIX recombinante de alta pureza

20 disponible comercialmente, los carriles 4 y 5 son muestras después de la purificación por afinidad de FIX de la invención según se describe en el ejemplo 7D y 7E, los carriles 6 y 7 son muestras después de la purificación por afinidad y concentración con ultrafiltración/desalación de FIX según se describe en el ejemplo 7F. Como puede observarse a partir de los carriles 4-7, la pureza del producto de FIX producido según la invención no muestra impurezas de peso molecular menor o mayor, comparado con el carril 2 o 3.

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Claims

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