MX2012011066A - Proceso para purificar proteinas dependientes de vitamina k tal como el factor ix de coagulacion. - Google Patents

Abstract

Se describe un procedimiento de fabricación de proteína dependiente de vitamina K libre de priones en una secuencia de purificación que utiliza cromatografía caracterizada porque - por lo menos una etapa de cromatografía se realiza utilizando resina multimodal - proporcionar una fracción que contiene proteína dependiente de vitamina K en una solución acuosa; - poner en contacto la fracción que contiene la proteína dependiente de vitamina K con una resina multimodal a un pH entre 6-9; - opcionalmente lavar la resina multimodal que tiene la proteína dependiente de vitamina K adsorbida con un amortiguador de lavado acuoso para eliminar por lavado contaminantes y retener la proteína dependiente de vitamina K antes de que se eluya la proteína dependiente de vitamina K; - la proteína dependiente de vitamina K eluye de la resina multimodal un pH entre 6 a 9 en un amortiguador que comprende arginina; y - opcionalmente recolectar fracciones que contienen proteína dependiente de vitamina K en forma purificada o enriquecida.

Description

PROCESO PARA PURIFICAR PROTEINAS DEPENDIENTES DE VITAMINA K TAL COMO EL FACTOR IX DE COAGULACION DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un proceso de purificación de proteínas dependientes de vitamina K tal como factor IX de coagulación (abreviado como FIX) y una fracción que contiene una proteína dependiente de vitamina K tal como FIX que se puede obtener por el procedimiento de la invención.

La hemofilia es un grupo de trastornos genéticos hereditarios que deterioran la capacidad del cuerpo para controlar la formación de trombos o coagulación de la sangre. En una de sus formas, la hemofilia B, se presenta en la deficiencia del factor de coagulación IX (FIX) , la hemofilia B se presenta en aproximadamente 1 de 25,000 nacimientos del género masculino. El factor IX (o factor Christmas) es una de la serina proteasas del sistema de coagulación. Es una proteína plasmática dependiente de vitamina K que participa en la vía intrínseca de coagulación sanguínea al convertir factor X a su forma activa en presencia de iones Ca2+, fosfolípidos y factor Villa. La proteína FIX es un factor esencial en la coagulación sanguínea con propiedades multifuncionales .

El factor IX (FIX) es una glucoproteína de cadena Ref . : 234496 sencilla que contiene 461 aminoácidos. Es sintetizada principalmente en el hígado y secretada en plasma. La molécula de factor IX consiste de varios dominios funcionales separados que incluyen un péptido señal, propéptido, un dominio Gla, dos dominios similares a factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) , un péptido de activación y un dominio catalítico similar a tripsina (dominio de serina proteasa) (el propéptido se separa antes de la secreción para generar la molécula madura FIX de 415 aminoácidos) . La proteína es procesada adicionalmente a su forma activa, a un heterodímero que consiste de una cadena ligera y una cadena pesada unida por un enlace disulfuro.

La deficiencia de FIX se puede tratar con concentrados de FIX derivados de plasma o por FIX producido de manera recombinante . El tratamiento con concentrados de FIX ha llevado a una vida normalizada de pacientes con hemofilia. Históricamente, la hemofilia B ha sido tratada con FIX que se origina de plasma de sangre humana. En el plasma sanguíneo, bajo condiciones normales, la molécula FIX circula en su forma nativa mientras que se activa a través de un proceso complicado que se inicia en la cascada sanguínea de enzimas de coagulación.

Los productos de FIX derivados de plasma se encuentran en el mercado con purezas diferentes que dependen del método de purificación que se haya aplicado. Los métodos utilizados para purificar FIX normalmente son una combinación de diferentes etapas de cromatografía (principalmente etapas de intercambio iónico y afinidad, para purificación y una o varias etapas de ultrafiltración para concentrar/desalar el producto .

Harrison et al. (S. Harrison et al. Sem Hematol 35 (Suppl 2) : 4-10 (1998) describe el procedimiento de elaboración de FIX recombinante (BenefixMR) producido en células CHO. Las células se cosechan por microfiltración y posteriormente se concentran en una etapa de ultrafiltración/diafiltración en donde se intercambia amortiguador a un amortiguador Tris para proporcionar un amortiguador consistente para cargado sobre una primera columna de cromatografía. Se utilizan cuatro etapas de cromatografía independientes para la purificación de rFIX, la primera es una etapa de intercambio aniónico (Q Sepharose FF) la cual se realiza en un modo de pseudoafinidad. La columna se eluye con cloruro de calcio 10 mM a pH 8.0. El cloruro de calcio induce un cambio conformacional en la molécula FIX lo que provoca que se separe de la columna.

La etapa de Q Sepharose es seguida por purificación en una columna de sulfato de celufina Matrex, la cual es un análogo de heparina utilizado en purificación por afinidad de proteínas con dominios que se unen a heparina. También se comporta como una resina de intercambio catiónico debido a los grupos sulfato cargados negativamente. La etapa de purificación en celufina elimina las concentraciones bajas de HCP.

El eluato de celufina se carga sobre una columna de cerámica-hidroxiapatita la cual es una forma sintética de fosfato de calcio. Se utiliza para separar proteínas de cargas variables y proporciona la posibilidad de eliminar formas de actividad específica inferior de rFIX. Esta columna se eluye con una elusión paulatina al incrementar la concentración de fosfato a una concentración final de 0.5 M.

La etapa de purificación final en el procedimiento de manufactura de Benefix1411 es un quelato de EMD-Cu(II) . Las proteínas interactúan con los metales inmovilizados retenidos por la resina. El rFIX unido se eluye con imidazol como un desplazador y se eliminan contaminantes en trazas en esta etapa de purificación, lo cual es seguido por una etapa de filtración de virus (Viresolve-70) y finalmente por una etapa de ultrafiltración/diafiltración en donde se concentra rFIX y se intercambia el amortiguador al amortiguador de formulación.

El procedimiento de manufactura de rFIX descrito es consistente, se han analizado 65 lotes y se ha encontrado la actividad específica la cual es de 276 ± 23 Ul/mg. El contenido de Gla es de 11.4 ± 0.1 moles de Gla/mol de rFIX y las impurezas totales se encontró que son de 0.01 ± 0.01% y de 0.03 ± 0.01%, determinado por RP-CLAP y HCP-ELISA, respectivamente .

Lindsay et al. (J Chrom A 1026: 149-157 (2004)) describe un método para purificar rFIX a partir de leche de cerdo transgénica. Se ha utilizado heparina Sepharose FF como la primera etapa en el esquema de purificación, seguido por una etapa de intercambio aniónico.

El unión de dominio heparina del factor IX se localiza en el extremo C terminal de la molécula. Esta región carece de PTM y por lo tanto la etapa de cromatografía en heparina permite que la población completa de rFIX pueda aislarse. La actividad específica del eluato es de 30-35 Ul/mg, lo cual indica que una fracción grande es inactiva. Las subpoblaciones activas de rFIX se separan de las subpoblaciones inactivas durante un gradiente de elusión de la columna AIE .

Kaufman et al. (JBC 261: 9622-9628 (1986)) describe la expresión de rFIX en células CHO y la purificación de la proteína. El medio de cultivo celular que contiene rFIX se concentra por ultrafiltración y se dializa contra un amortiguador que contiene CaCl2 3 mM, Tris-HCl 0.05 M y NaCl 0.5 M antes de la aplicación a una columna de inmunoafinidad con anticuerpos específicos de conformación (anticuerpos anti-FIX: Ca(II)). La columna se eluye subsecuentemente con EDTA 10 m , Tris-HCl 0.05 M y NaCl 0.15 M.

La presencia de CaCl2 3 mM en el material inicial antes de la aplicación a la columna resulta en la separación entre las especies activa e inactiva de FIX. Las especies inactivas no se unen a la columna y FIX activo se puede eluir de la columna con EDTA.

El documento WO-A-2009/007451 describe un método de purificación de FVIII utilizando una resina de modo mixto o multimodal. El método de purificación se basa en poner en contacto la proteína FVIII con una resina multimodal o de modo mixto que contiene ligandos los cuales comprenden una parte hidrofóbica y una parte cargada negativamente y eluir la proteína FVIII con un amortiguador de elusión que contiene por lo menos 1.5 M de sal y por lo menos 40% (p/v) de etilenglicol, propilenglicol y una mezcla de los mismos, e iones calcio.

El documento EP-A-1 707 634 describe un método para el aislamiento de proteínas producidas recombinantemente, por ejemplo, por diversos métodos tales como cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad, precipitación de proteína, intercambios de amortiguador, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, medio de cromatografía de modo mixto hidrofóbico/intercambio iónico, cromatografía quelante, cromatografía de afinidad de carbohidratos similares a lectina o afinidad a heparina, cromatografía de exclusión de tamaño, electroforesis, diálisis, diferentes agentes de precipitación tales como polietilenglicol , sulfatos de amonio, etanol, adsorción con hidroxi apatita, adsorción de membrana de filtro, ligandos acoplados a partículas magnéticas, etc. No obstante, no se identifican etapas de purificación cromatográficas particulares .

El documento WO-A-2005-082483 describe un procedimiento para la purificación de anticuerpos a partir de una o más impurezas en un líquido, procedimiento el cual comprende poner en contacto el líquido con una primera resina de cromatografía constituida de un soporte al cual se han inmovilizado ligandos multimodales para adsorber los anticuerpos de la resina, en donde cada ligando multimodal comprende por lo menos un grupo de intercambio de cationes y por lo menos un sistema de anillo aromático o heteroaromático . Se agrega un eluyente para liberar los anticuerpos de la resina y el eluato se pone en contacto con una segunda resina de cromatografía.

El documento WO-A-2005/121163 describe un procedimiento para el aislamiento de una o más proteínas de una solución de proteína. El procedimiento comprende las etapas de proporcionar una solución de proteína que comprende una o más proteínas específicas y que tienen un pH preestablecido y una fuerza iónica o conductividad preestablecidas, aplicar la solución de proteína a una columna de adsorción que comprende una partícula con por lo menos un núcleo no poroso de alta densidad rodeado por un material poroso, el adsorbente comprende una densidad de partícula de por lo menos 1.5 g/ml y una media en volumen de diámetro de partícula de un máximo de 150 µt?. La columna opcionalmente se lava antes de eluir una o varias de las proteínas del adsorbente.

El documento WO-A-2009/156430A1 describe un método de purificación de FVIII utilizando una resina de modo mixto o multimodal. El método de purificación se basa en poner en contacto la proteína FVIII en una solución que tiene una fuerza iónica alta con una resina multimodal o de modo mixto que contiene ligandos los cuales comprenden una parte hidrofóbica y una parte cargada negativamente y se eluye la proteína FVIII con un amortiguador de elusión que comprende por lo menos un aminioácido el cual está cargado positivamente a pH 6-8.

Con el fin de mejorar los productos que contienen FIX, se utiliza cromatografía de afinidad específica dirigida contra la molécula FIX, la cual elimina eficazmente contaminantes en un alto grado de pureza de FIX. La desventaja con la cromatografía de inmunoafinidad utilizada habitualmente es que es relativamente costosa y que los anticuerpos monoclonales utilizados con ligandos de afinidad son de origen animal.

A mediados de la década de 1980 existieron algunas transmisiones de virus asociadas con productos de FIX derivados de plasma. Incluso si este problema se resuelve mediante la implementación de etapas específicas de reducción de virus, existe aún el punto de inicio del desarrollo de productos FIX recombinantes (rFIX) . En la década de 1990, el primer producto rFIX se comercializó y hasta la fecha es únicamente uno .

Un objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento mediante el cual se puedan evitar los inconvenientes de los procedimientos de purificación de proteínas dependientes de vitamina K, en particular FIX en la técnica anterior. Se conoce de la técnica anterior que una desventaja de las resinas de cromatografía de intercambio iónico tradicionales (tales como por ejemplo resinas de cromatografía de intercambio iónico de SP- , CM- , Q- o DEAE Sepharose FF) es que la unión de la proteína a la resina únicamente se puede realizar dentro de una concentración de sal (conductividad) y pH relativamente bajos, típicamente en el intervalo de una concentración de sal de 0.01-0.15 M (NaCl, etc.). El intervalo de pH óptimo depende de si se utiliza un intercambiador de cationes o un intercambiador aniónico y el punto iso-eléctrico del producto objetivo se debe unir sobre la resina. En general, el intervalo de pH en el cual la proteína objetivo se une a una resina de intercambio iónico típicamente es de aproximadamente una unidad de pH hacia arriba o hacia abajo a partir del punto isoeléctrico del producto objetivo.

En algunas aplicaciones existe la demanda de poder utilizar condiciones de purificación relativamente moderadas que ejerce una etapa de cromatografía de intercambio iónico hacia las proteínas, también directamente (sin dilución adicional) a una resina de cromatografía a una fuerza iónica ligeramente aumentada y un pH fuera del intervalo normal el cual no se puede utilizar para cromatografía de intercambio iónico convencional .

La cromatografía multimodal (o de modo mixto) es una herramienta para purificar proteínas. Descrita, por ejemplo, en Manufacturer data sheet GE Healthcare (11-0035-45AA) , Capto Adhere, manufacturer data sheet GE Healthcare (28-9078-88AA) , Capto MMC y WO-A-2009/024620 "A process for the isolation and purificationof a target protein, free of prion proteins" . Una desventaja es que la elusión con frecuencia incluye condiciones relativamente difíciles como, por ejemplo, un pH inferior o por encima del pH neutro, solo o en combinación con otros parámetros de elusión tales como, por ejemplo, etilenglicol y tales como, por ejemplo los descritos en WO-A-2009/007451.

Una fuerza iónica aumentada puede ser de ventaja significativa para la estabilidad de la proteína en una solución de proteína, especialmente en una preparación de proteína cruda como en la recolección de proteínas recombinantes o en productos derivados de plasma en donde están presentes proteasas potenciales en la solución lo cual puede afectar negativamente la proteína objetivo.

Dado que las proteasas con frecuencia funcionan mejor en condiciones fisiológicas (como es el caso en la mayor parte de los sistemas celulares) , es decir, a pH aproximadamente 7 y una concentración salina de aproximadamente 0.15 M, puede ser ventajoso cambiar estas condiciones para minimizar los efectos de las proteasas. Estos cambios típicamente se realizan por adición de sal y/o cambio del pH. Estos dos parámetros son críticos para el desempeño de una etapa de cromatografía de intercambio iónico convencional y por lo tanto con frecuencia es imposible de conseguirse. Así, otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento el cual resuelve este problema y posibilite agregar sal y/o cambiar el pH en muestras de proteína cruda que comprende factores potencialmente proteolíticos tales como proteasas las cuales pueden degradar la proteína objetivo. El procedimiento debe ser capaz además de procesar la solución de proteína con menos medidas adicionales posibles y unir la proteína objetivo a una resina de cromatografía. Esto puede proporcionar una etapa optimizada de concentración y purificación de la proteína objetivo a partir de una muestra cruda o purificación adicional posterior utilizando, por ejemplo, otras etapas de cromatografía tales como cromatografía de afinidad.

Esta necesidad es de importancia específica, debido a que la degradación de la proteína objetivo durante la purificación se puede evitar o por lo menos minimizar.

Esto posibilita eliminar proteasas y otros contaminantes los cuales pueden estar presentes en una cosecha cruda, antes de la elusión de la proteína objetivo.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento de purificación de proteína dependiente de vitamina K tal como FIX, en particular partiendo de una cosecha de cultivo celular de FIX recombinante .

De acuerdo con la invención, el objetivo se lleva a cabo por un procedimiento de purificación de una proteína dependiente de vitamina K tal como FIX en una secuencia de purificación que utiliza cromatografía, en donde se realiza por lo menos una cromatografía utilizando una resina multimodal; la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX se une a la resina multimodal, y la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX se eluye de la resina multimodal a un pH entre 6 a 9 en un amortiguador que comprende arginina.

Se conocen siete glucoproteínas plasmáticas que son dependientes de vitamina K para su biosíntesis. Estas son protrombina (factor II) , factor VII, Factor IX, factor X, proteína C, proteína S y proteína Z. El dominio Gla es una característica estructural común en todas las proteínas dependientes de vitamina K y está inmediatamente después del dominio Gla, cada una de las proteínas (excepto protrombina) tiene uno o más dominios similares a EGF. Las proteínas dependiente de vitamina K requieren iones Ca2+ para expresar su función fisiológica y los sitios de unión de calcio involucran por lo menos el dominio Gla y los dominios similares a EGF. La unión de calcio permite que estas proteínas se unan a fosfolípidos/membrana celulares y por lo tanto expresan su actividad biológica completa.

La presente invención utiliza una resina multimodal como una etapa de purificación de captación proporciona la posibilidad de ajustar la concentración de sal y pH a valores los cuales minimizan el riesgo de activar proteasas en la solución de proteína durante la unión de la proteína objetivo a la etapa de cromatografía multimodal.

Una ventaja del procedimiento de la invención es la posibilidad de aplicar adicionalmente una etapa de lavado antes de la elusión de la proteína objetivo después de unión de la proteína objetivo a la resina multimodal, por ejemplo utilizada como una etapa de captación en un procedimiento recombinante . Esto se obtiene al utilizar la resina multimodal es para lavado de la resina al seleccionar un amortiguador de lavado adecuado para eliminar proteasas y otros contaminantes los cuales se adhieren a la resina multimodal, antes de eluir la proteína objetivo. El amortiguador de lavado adecuado preferiblemente contiene una sal o un aminoácido o un componente de amortiguador o mezclas de los mismos a un pH adecuado para aún inhibir la actividad de proteasa durante la etapa de separación por lavado.

El procedimiento de la invención vuelve posible eluir la proteína objetivo, unida a la resina multimodal, en un ambiente de elusión moderado con propiedades de elusión distintas (es decir, en un volumen tan pequeño como se pueda) . Esto se obtiene al utilizar un pH aumentado o una concentración de sal aumentada o la adición de un aminoácido o una combinación de los mismos. El procedimiento de la invención proporciona ventajas tales como inhibición de agregados, conservación de estructura de molécula nativa y suministro de un volumen bajo para un procesamiento de corriente abajo adicional.

La presente invención también facilita un procedimiento de purificación sin la adición de aditivos estabilizantes derivados de humano o de animal y el uso de un procedimiento completo el cual está ausente de los mismos (resinas de inmunoafinidad basadas en anticuerpo monoclonal) .

El uso de la resina multimodal, en particular como etapa de captación, facilita también una mayor capacidad de unión en comparación con los intercambiadores de iones convencionales lo que resulta en un eluato de producto más concentrado de la columna lo cual puede ser ventajoso para la estabilidad del producto.

De acuerdo con una modalidad de la invención, la cromatografía multimodal se puede llevar a cabo en una columna cromatográfica. Esto se puede considerar como la primera etapa de captación. El procedimiento de la invención también se puede llevar a cabo en un modo por lotes.

En una modalidad de la invención, la cromatografía sobre resinas multimodales se combina con una cromatografía sobre una resina que tiene un ligando de afinidad derivado de levadura, utilizando una pureza de > 90% después de la elusión de la proteína dependiente de vitamina K tal como la proteína FIX.

En otra modalidad adicional de la invención, la etapa de resina multimodal y la etapa de cromatografía de ligando de afinidad derivado de levadura se combinan con otra etapa de purificación por cromatografía para presentar una pureza de 99% en el producto dependiente de vitamina K final tal como una proteína FIX.

Por lo tanto, también una composición de materia es objeto de la invención, composición de materia la cual comprende una proteína dependiente de vitamina K purificada tal como FIX que se puede obtener por el procedimiento de acuerdo con la invención (sin la adición o uso de cualquier aditivo humano o animal como albúmina o ligados de inmunoafinidad basados en anticuerpo monoclonal) .

En otra modalidad de la invención, la resina multimodal comprende porciones unidas a una matriz y las porciones son capaces de interactuar con proteína dependiente de vitamina K tal como FIX en una mezcla por interacciones iónicas y otros tipos de interacciones tales como unión de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y tiofílicas.

En una modalidad adicional de la invención, el ligando de afinidad es una levadura derivada de un fragmento. Fab dirigido hacia proteína dependiente de vitamina K tal como FIX.

En una modalidad adicional de la invención, la etapa de resina multimodal se realiza para captar la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX a partir de una solución de proteína cruda en donde, después de procesamiento del eluato de resina de cromatografía multimodal resultante sobre una etapa de cromatografía de ligando de afinidad derivada de levadura y después de elusión de la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX a partir de la etapa de cromatografía de afinidad, ejerce una pureza de más de 90% en relación a las proteínas y ADN.

En otra modalidad adicional de la invención se caracteriza porque la pureza del producto final es mayor de 99% si la etapa de resina multimodal realizada para captar la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX a partir de una solución de proteína cruda en donde, después del procesamiento del eluato de resina de cromatografía multimodal resultante es procesada adicionalmente sobre una o varias etapas de cromatografía adicional seleccionadas de exclusión de tamaño, intercambio aniónico, intercambio catiónico, interacción hidrofóbica y cromatografía de afinidad de metal inmovilizado y un ligando de afinidad derivado de levadura.

En otra modalidad adicional de la invención, la mezcla que comprende proteína dependiente de vitamina K tal como FIX está presente en una solución.

En otra modalidad adicional de la invención, la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX está en una solución de proteína cruda que incluye potencialmente proteasas las cuales pueden degradar el producto.

Puede ser ventajoso aplicar el amortiguador de lavado a la resina multimodal, para eliminar por lavado contaminantes (proteasas, ADN, etc.) y retener la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX antes de que sea liberada.

En una modalidad adicional de la invención, la resina multimodal se lava con un amortiguador de lavado a un pH entre 6-9 antes de eluir la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX.

En una modalidad adicional de la invención la elusión se realiza con arginina como el agente de elusión. De acuerdo con la invención, el agente de elusión se puede combinar con una concentración de sal aumentada en la cual la sal se selecciona de la serie Hofmeister. de acuerdo con la invención, la elusión puede tomar parte ya sea con arginina únicamente o en combinación con concentración de sal aumentada o únicamente con concentración de sal aumentada, la totalidad está dentro del intervalo de pH entre 6-9, preferiblemente a pH 7.0.

De acuerdo con la invención, se prefieren NaCl y KCl respecto a la sal comprendida en las series de Hofmeister las cuales, por ejemplo, son sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, bario, acetato, fosfato y sulfato.

De acuerdo con la invención, la concentración de arginina en particular está en el intervalo desde aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 2 M y 0.1 a 4 M para la sal de acuerdo con la serie Hofmeister; en particular en el intervalo de aproximadamente 0.4 M a aproximadamente 1.5 M para arginina y 0.6 M a 2 M para la sal de acuerdo con la serie Hofmeister o en el intervalo desde aproximadamente 0.3 M a aproximadamente 0.7 M para arginina y 0.8 M a 1.2 M para la sal de acuerdo con la serie de Hofmeister.

De acuerdo con otra modalidad de la invención, la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX se une a la resina multimodal a un pH entre 6-9, preferiblemente a pH 7.0.

En una modalidad adicional de la invención, se utiliza una sustancia amortiguadora que comprende preferiblemente por lo menos una de las sustancias que se seleccionan del grupo que consiste de citrato de sodio, histidina, ácido 2- (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil) -etansulfónico (HEPES) , ácido 2 - (N-morfolino) etansulfónico (MES) , base Tris y acetato de sodio, en particular en un intervalo de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 9.

En el procedimiento de la invención, un detergente no iónico puede estar presente en cualquiera de los amortiguadores usados, detergente no iónico el cual en particular se selecciona del grupo que consiste de polisorbatos (polisorbato 20, 40, 60 y 80) y Pluronic F68.

En el amortiguador de elusión con un pH 6-9, preferiblemente a pH 7.0, la cantidad de arginina típicamente está en el intervalo de 0.1 a 2 M, en particular 0.5 M.

En el amortiguador de elusión con un pH 6-9, preferiblemente 7.0, el cloruro de sodio se incluye en un intervalo de 0.1-4 M, en particular en un intervalo de 0.05 a 0.3 M.

En el amortiguador de elusión con un pH 6-9, preferiblemente a pH 7.0, la arginina y el cloruro de sodio se incluyen en un intervalo de 0.1-0.5 M, en particular en un intervalo de 0.3 a 0.7 M.

En el amortiguador de lavado con un pH 6-9, preferiblemente pH 7.0, se incluye cloruro de sodio en un intervalo de 0.01-0.3 M, en particular en un intervalo de 0.05 a 0.15 M.

La cantidad de detergente no iónico típicamente está en el intervalo de 0.001 a 1%, en particular en los amortiguadores para cromatografía multimodal 0.02%.

La resina de cromatografía multimodal la cual se puede utilizar de acuerdo con la invención puede contener por lo menos uno de las siguientes porciones: a. un ligando N-bencil-N-metiletanolamina cargado positivamente b. un ligando de ácido 2- (benzoilamino) butanoico cargado negativamente, c. un ligando de fenilpropilo, d. un ligando de N-hexilo, e. un ligando de 4-mercapto-etil-piridina, f. un ligando de ácido 3- ( (3-metil-5- ( (tetrahidrofuran-2-ilmetil) -amino) -fenil) -amino) -benzoico o combinaciones de los mismos .

En particular, una resina de cromatografía multimodal para uso de acuerdo con la presente invención se selecciona de las siguientes resinas disponibles comercialmente HEP HypercelMR; PPA Hypercel"*; Capto AdhereMR; Capto MMCMR; MEP Hypercel"*.

En otra modalidad del procedimiento de la invención, la etapa de cromatografía multimodal se combina con una etapa cromatográfica de afinidad por proteína dependiente de vitamina K tal como FIX en donde la afinidad se proporciona por un ligando de proteína tal como un fragmento de anticuerpo el cual se expresa, por ejemplo, en levadura .

En otra modalidad de la presente invención, la secuencia de purificación puede comprender además etapas de eliminación/inactivación de patógenos que comprende una etapa de inactivación basada químicamente, una etapa de eliminación basada en tamaño, etapas de cromatografía o combinaciones de las mismas etapas las cuales se basan en diferentes propiedades fisiológicas dirigidas al patógeno que va a ser eliminado. Un ejemplo de una etapa de inactivación de patógeno bien descrita en la literatura es el método de detergente de solvente basado químicamente, por ejemplo basado en fosfato de tri-n-butilo y tritón X-100, el cual rompe todos los virus envueltos en lípidos, descrito en el documento EP-A-131 740. Un ejemplo de una etapa de eliminación de patógenos basada en tamaño es, por ejemplo, un nanofiltro con una media de tamaño de poro de app. 20 nm, tal como un filtro Planova 20. Otro ejemplo de eliminación de patógeno se basa en la cromatografía, Por ejemplo, se sabe que la cromatografía de afinidad ejerce propiedades de eliminación de patógenos en general, por ejemplo una resina de cromatografía de ligando de afinidad de una proteína dependiente de vitamina K tal como FIX derivada de levadura.

En una modalidad particular del procedimiento de la invención, la secuencia de purificación comprende además las siguientes etapas: 1. una resina multimodal catiónica tal como Capto MMC; 2. una etapa de inactivación basada químicamente para virus envueltos en lípidos, en particular la inactivación por solvente/detergente utilizando fosfato de tri-n-butilo y tritón X-100 como se describe en el documento EP-A-131 740; 3. una resina de afinidad basada en un ligando expresado en levadura; 4. un intercambiador catiónico tal como SP Sepharose o Resource S; 5. una etapa de separación de filtración de patógenos con una media de poro en un tamaño de aproximadamente 20 nm tal como Planova 20N; 6. una etapa de intercambio de amortiguador y/o de concentración tal como ultrafiltración con un límite aproximado de 10 kDa; 7. una resina de cromatografía por exclusión de tamaño tal como superdex 200.

En una modalidad particular, el procedimiento de la invención puede comprender las siguientes etapas; Una resina multimodal Capto MMC1 se empaca en una columna y se equilibra con un amortiguador que comprende citrato de sodio 20 nm, NaCl 0.1 M, polisorbato 80 0.02% a pH 7.0.

Se aplica una muestra que contiene proteína dependiente de vitamina K tal como FIX cruda que comprende aproximadamente las mismas condiciones que en el amortiguador de equilibrio anterior y la proteína objetivo y algunas proteínas de impurezas adicionales se unirán a la columna.

Una etapa de lavado, de acuerdo con la invención, utilizando el amortiguador de equilibrio se aplica a la columna para inhibir la actividad proteolítica y para eliminar proteasas, ADN y otros contaminantes mientras que la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX aún se encuentra unida a la columna.

Se eluye la proteína dependiente de vitamina K tal como FIX, de acuerdo con la invención, utilizando el amortiguador de equilibrio en el cual se agrega arginina 0.5 M y se ajusta a pH 7.0 para obtener una proteína dependiente de vitamina K no agregada, estable, tal como la fracción FIX en un volumen bajo.

La cromatografía multimodal (o de modo mixto) es una herramienta para purificar proteínas. Se describe, por ejemplo, en hoja de datos del fabricante GE Health Care (11-0035-45AA) Capto Adhere, hoja de datos del fabricante GE Health Care (28-9078-88AA) Capto MMC y solicitud de patente WO-A-2009/024620 "A process for the isolation and purification of a target protein, free of prion proteins" .

La desventaja mencionada antes de la cromatografía multimodal se evita por condiciones de elusión moderadas en el intervalo de pH aproximadamente neutro el cual retiene la actividad de la proteína dependiente de vitamina K tal como la molécula FIX y facilita el uso de cromatografía multimodal en combinación con los efectos de estabilización de la concentración de sal aumentada, descrita, en el documento EP-A-1 707 634.

De acuerdo con una modalidad de la invención, la cromatografía multimodal se puede llevar a cabo en una columna cromatográfica . Esto se puede considerar como la primera etapa de captación. El procedimiento de la invención también se puede llevar a cabo en un modo por lotes. La presente invención también facilita un procedimiento de purificación sin la adición de aditivos estabilizantes derivados de humano o de animal y el uso de u procedimiento completo el cual está ausente de los mismos (resinas de inmunoafinidad basadas en anticuerpos monoclonales) . El uso de la resina multimodal, en particular como etapa de captación, facilita también una mayor capacidad de unión en comparación con intercambiadores iónicos convencionales lo que resulta en un eluato de producto más concentrado de la etapa, lo cual es ventajoso para la estabilidad del producto.

El procedimiento de la invención típicamente se relaciona con la purificación de proteína dependiente de vitamina K recombinante tal como FIX (rFIX) .

En otra modalidad del procedimiento de la invención, la etapa de cromatografía multimodal se combina con una etapa de cromatografía de afinidad de proteína dependiente de vitamina K tal como FIX en donde la afinidad se proporciona por un ligando de proteína tal como un fragmento de anticuerpo el cual se expresa en levadura.

Por lo tanto, también una composición de materia es el objeto de la invención, composición de materia la cual comprende una forma purificada recombinante de proteína dependiente de vitamina K tal como FIX que se puede obtener por el procedimiento de acuerdo con la invención (sin la adición o uso de aditivo humano o animal como albúmina o ligandos de inmunoafinidad basados en anticuerpo monoclonal) .

La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS DESCRIPCION DE METODOS ANALITICOS Análisis de actividad biológica - factor IX (análisis de coagulación de una etapa) Se mide la actividad biológica del factor IX con un análisis de coaugulacion de una etapa y se expresan la unidad de factor IX en unidades internacionales (UI) como se define por la norma de factor IX concentrado de la WHO actual .

El análisis de coagulación de una etapa es el método prescrito en la European Pharmacopoeia. El principio del análisis se basa en la capacidad de una muestra que contiene factor IX para corregir el tiempo de coagulación de un plasma deficiente en factor IX en presencia de fosfolípidos, activador de contacto e iones calcio. El tiempo de aparición del coagulo de fibrina se mide en una etapa. La actividad del factor IX es inversamente proporcional al tiempo de coagulación. El método se lleva a cabo en un instrumento Siemens BCS XP.

SDS-Page (distribución de peso molecular) La electroforesis en SDS y gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) involucra la separación de proteínas basadas en su tamaño. Este método describe la prueba SDS-PAGE de proteínas, la cual se lleva a cabo bajo condiciones reducidas. Al calentar la muestra bajo condiciones desnaturalizantes y reductoras, las proteínas se despliegan y recubren con un detergente aniónico, dodecilsulfato de sodio (SDS) , adquiriendo una carga negativa neta elevada que es proporcional a la longitud de la cadena del polipéptido. Cuando se cargan sobre una matriz de gel de poliacrilamida y se colocan en un campo eléctrico, las moléculas de proteína cargadas negativamente se desplazan hacia el electrodo cargado positivamente y se separan por un efecto de tamizado molecular, es decir, por su peso molecular. Los geles de poliacrilamida limitan a las moléculas más grandes evitando que se desplacen tan rápido como las moléculas más pequeñas . Debido a que la relación carga respecto a masa es casi la misma entre los polipéptidos desnaturalizados por SDS, la separación final de las proteínas depende casi por completo de las diferencias en las masas moleculares relativas de los polipéptidos. En un gel de densidad uniforme, la distancia de desplazamiento relativa de una proteína (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo de su masa. Si las proteínas de masa conocidas se corren simultáneamente con las desconocidas, se puede elaborar una gráfica de la relación entre Rf y la masa y se pueden calcular las masas de proteínas desconocidas. Las bandas proteínicas separadas por electroforesis se visualizan poir tinción con plata. La evaluación se realiza visualmente mediante consideración de las apariencias de las normas, la referencia (muestra control) y las muestras analizadas.

Factor IX derivado de plasma El material utilizado en estos experimentos se origina del producto disponible comercialmente Nanotiv" , el cual es SD de alta pureza tratado y concentrado de factor IX nonofiltrado .

Factor IX recombinante Producción de suspensión celular que contiene FIX Células La línea de células utilizada es un derivado de células de riñón embriónicas humanas 293 (HEK 293) la cual ha sido adaptada a crecimiento libre de suero. Este hospedador, HEK 293F se transfecta de manera estable con un cásete de expresión que presente la secuencia codificante de ADNc para FIX humano y furina humana (PACE) . Se utiliza el mismo promotor fuerte para ambos casetes . El procedimiento general también se describe en el documento EP-A-1 739 179 (Schróder et al) .

Método de cultivo Las células se cultivan en medio libre de suero en equipo general y de acuerdo con los métodos generales bien conocidos en el ámbito, por ejemplo cultivos agitados o sometidos a agitación en matraces t, matraces agitadores y biorreactores (sistemas desechables y tanques de agitación convencionales) que se llevaron a cabo como lotes, alimentación por lotes, perfusión o cultivos quimioestáticos continuos (Freshney, R I (2000) , Culture of animla cells: a manual of basic technique, 4th ed, Wiley- Liss; Spier, R E ed (2000), Encyclopedia of cell technology, wiley, New York; Enfors, S-0 and Hággstróm, L (2000) , Bioprocess technology: fundamentáis and applications , Hogskoletryckeriet, Royal Institute of Technology, Stockholm; Vinci, V A and Parekh, S R (2003) , Handbook of industrial cell culture: mammalian, microbial, and plant cells, Humana Press, USA) . Típicamente, la perfusión del medio se utiliza para incrementar los números de células y los títulos de producto sobrepasando los niveles de cultivo por lote estándar. El rendimiento de producto y la cantidad de proteínas de células hospedadoras dependen en base en el modo de cultivo: • el título de producto típicamente se incrementa con los números de células • el contenido de proteína total y el contenido de ADN típicamente aumentarán con los números de células • el contenido de proteína total y el contenido de ADN también se incrementan con la longevidad del cultivo • los cultivos por lotes acumulan proteína y ADN; no se agregan nada externamente, no se retira nada • los procesos de perfusión enjuagan cultivos celulares a partir de metabolitos, proteína, ADN y otras impurezas; los filtros o centrífugas de células típicamente se utilizan para retención de células.

El producto recombinante se libera de las células y la suspensión celular o el sobrenadante de suspensión celular es lo que se cosecha. Las propiedades de la cosecha (títulos de producto e impurezas como se mencionan en lo anterior) difieren dependiendo del modo de cultivo usado .

La suspensión celular se ha utilizado en parte de los ejemplos FIX descritos más adelante.

PURIFICACION DE FIX UTILIZANDO RESINA CAPTO MMC COMO ETAPA DE CAPTACION EJEMPLO 1 Material inicial Se utiliza FIX derivado de plasma (pdFIX, NanotivMR) . El Nanotiv liofilizado se disuelve y diluye en un amortiguador de equilibrio antes de ser cargado en una columna Capto MMC.

Resina cromatográfica y columna Se utiliza Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (cat no. 17-5317) como etapa de captación para la molécula de FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrofóbica y tiofílica y unión de hidrógeno. Se empaca en una columna Tricorn 5/150 empacada con resina Capto MMC a una altura del lecho de 15.7 cm. El volumen de columna (CV, por sus siglas en inglés) es de 3.1 mi .

Amortiguadores Amortiguador de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.1 M, polisorbato 80 0.02%, pH 7.0.

Amortiguador de lavado bajo en sales: citrato de sodio 20 mM, BaCl 0.2 M, polisorbato 80 0.02%, pH 6.5.

Amortiguador de lavado alto en sales: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.7 M, polisorbato 80 0.02%, pH 6.5.

Amortiguador de elusión: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.2 M, monoclorhidrato de arginina 0.5 M, polisorbato 80 0.02%, pH 6.5.

Instalación experimental La columna se equilibra con amortiguador de equilibrio seguido por cargado del material inicial a un caudal de 1 ml/min. pdFIX se une a la resina Capto MMC durante estas condiciones de amortiguador. Como se observa en la tabla 1, no se encontró pdFIX en el flujo pasante. La resina posteriormente se trata a diferentes condiciones de lavado como se describe en la tabla 1 y no se detectó pdFIX en cualquiera de los amortiguadores de lavado probados. Al agregar arginina 0.5 M al amortiguador se eluye FIX de la resina y se obtiene un rendimiento de 85%.

TABLA 1 CONCLUSION El FIX derivado de plasma (pdFIX, Nanotiv) se une a Capto MMC a pH 7 y se puede lavar con amortiguador de NaCl por lo menos 0.7 sin que eluya de la resina. Por adición de monoclorhidrato de arginina 0.5 M de amortiguador, se eluye pdFIX de la columna.

EJEMPLO 2 Material inicial Se produce FIX humano recombinante (rhFIX) en células HEK 293. Las células se extraen y el sobrenadante libre de células es el material inicial cargado sobre la columna Capto MMC.

Resina cromatográfica y columna Se utiliza Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (cat no. 17-5317) como etapa de captación para la molécula de FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrofóbicas y tiofílicas y unión de hidrógeno. Una columna XK 26 se empaca con resina Capto MMC a una altura de lecho de 15 ctn. El volumen de columna (CV) es de 80 mi.

Amortiguadores Amortiguador de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.1 M, polisorbato 80 0.02%, pH 7.0.

Amortiguador de lavado alto en sal: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.7 M, polisorbato 80 0.02%, pH 6.5.

Amortiguador de elusión: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.2 M, monoclorhidrato de arginina 0.5 M, polisorbato 80 0.02%, pH 6.5.

Instalación experimental La columna se equilibra con amortiguador de equilibrio seguido por cargado del material inicial a un caudal de 26 ml/min. rhFIX se une a la resina Capto MMC durante las condiciones de este amortiguador. Como se observa en la tabla 2, no se encontró rhFIX en el flujo pasante. El lavado alto en sales no eluye rhFIX alguno de la columna. Al agregar arginina 0.5 M al amortiguador, se eluye rhFIX de la resina y se obtiene un rendimiento de 92%.

TABLA 2 CONCLUSION FIX recombinante (rhFIX) se une a Capto MMC a pH 7 y se puede lavar con amortiguador de NaCl por lo menos 0.7 M sin que eluya de la resina.

Mediante la adición de monoclorhidrato de arginina 0.5 al amortiguador, rhFIX se eluye de la columna.

Los amortiguadores utilizados contienen polisorbato 80 0.02% (un detergente no iónico) lo cual no resulta en ningún efecto negativo. Posiblemente es de una ventaja utilizar polisorbato 80 y los amortiguadores; compárense los resultados obtenidos en el experimento siguiente (ejemplo 3) en donde no se agregó polisorbato 80 a los amortiguadores usados.

EJEMPLO 3 Material inicial Se produce FIX humano recombinante (rhFIX) en células HEK 293. Las células se separan y el sobrenadante libre de células es el material inicial cargado sobre la columna Capto MMC.

Resina cromatográfica y columna Se utiliza Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (cat no. 17-5317) como etapa de captación para la molécula FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrofóbica y tiofílica y unión de hidrógeno. Una columna XK 26 se empaca con resina Capto MMC a una altura de lecho de 15 cm. El volumen de columna (CV) es de 80 mi.

Amortiguadores Amortiguador de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.1 M, pH 7.0.

Amortiguador de lavado alto en sales: citrato de sodio 20 mMr NaCl 0.7 M, pH 6.5.

Amortiguador de elusión: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.2 M, monoclorhidrato de arginina 0.8 M, pH 6.5.

Establecimiento del experimento y resultados La columna se equilibra con amortiguador de equilibrio seguido por cargado del material inicial a un caudal de 26 ml/min. rhFIX se une a la resina Capto MMC durante estas condiciones de amortiguador. Como se observa en la tabla 3, una cantidad baja de rhFIX cargada en la columna se encuentra en el flujo pasante. La resina posteriormente se lava con amortiguador con una concentración de NaCl muy alta, 0.7 M. Como se describe en la tabla 3, menos de 1% de rhFIX se detecta en este lavado. Ál agregar arginina 0.8 M al amortiguador se eluye rhFIX de la resina y se obtiene un rendimiento de 84%. El amortiguador utilizado en este experimento no contiene polisorbato 80 alguno en comparación con el experimento 2 y el experimento 5.

TABLA 3 CONCLUSION FIX humano recombinante (rhFIX) se une a Capto MMC a pH 7 y se puede lavar con amortiguador de NaCl por lo menos 0.7 M sin que eluya de la resina.

Por adición de monoclorhidrato de arginina 0.8 M al amortiguador, se eluye rhFIX de la columna.

No se agrega detergente a los amortiguadores, lo cual puede indicar una recuperación un poco menor de rhFIX en la fracción de elusión.

EJEMPLO 4 (EJEMPLO A Y EJEMPLO 4B) Material inicial Se utiliza FIX derivado de plasma (pdFIX, Nanotiv" ) . Se disuelve Nanotiv liofilizado y se diluye en un amortiguador de equilibrio antes de ser cargado en una columna Capto MMC.

Resina cromatográfica y columna Se utiliza Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (cat no. 17-5317) como etapa de captación para la molécula FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrofóbicas y tiofílicas y unión de hidrógeno. Una columna Tricorn 5/150 se empaca con resina Capto MMC a una altura del lecho de 15 cm. El volumen de columna (CV) es de 3 mi .

Amortiguadores Para el experimento del ejemplo 4A: Amortiguador de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.1 M, pH 7.0.

Amortiguador de elusión-. citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.1 M, monoclorhidrato de arginina 0.5 M, pH 7.0.

Para el experimento del ejemplo 4B: Amortiguador de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.1 M, polisorbato 80 0.02%, pH 7.0.

Amortiguador de elusión: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.1 M, monoclorhidrato de arginina 0.5 M, polisorbato 80 0.02%, pH 7.0.

Instalación experimental Una comparación de purificación de pdFIX sobre una columna Capto MMC con amortiguadores con o sin polisorbato 80 y un pH establecido en 7.0. La columna se equilibra con amortiguador de equilibrio seguido por cargado del material inicial a un caudal de 1 ml/min. pdFIX se une a la resina Capto MMC durante estas condiciones de amortiguador. Como se observa en la tabla 4, no se encontró pdFIX en el flujo a través de la fracción de lavado de equilibrio TABLA 4 CONCLUSION Un incremento de 5% en FIX derivado de plasma se eluye con polisorbato 80 se incluye en los amortiguadores en comparación a el caso en donde no hay polisorbato 80 en los amortiguadores . La diferencia es pequeña pero los resultados apuntan hacia un beneficio cuando se utiliza polisorbato 80 en los amortiguadores. El rendimiento de pdFIX es alto en ambos experimentos. También muestra que el pH 7.0 en los amortiguadores utilizados resulta en un buenos datos respecto tanto a la unión como a la elusión de pdFIX de la resina Capto MMC.

EJEMPLO 5 (EJEMPLO 5A Y EJEMPLO 5B) Material inicial Se utiliza FIX derivado de plasma (Nanotiv) . Se disuelve Nanotiv liofilizado y se diluye en un amortiguador de equilibrio antes de ser cargado en una columna Capto MMC.

Resina cromatográfica y columna Capto MMC una resina de modo mixto de GE Healthcare (cat no. 17-5317) se utiliza como etapa de captación para la molécula FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrofóbicas y tiofílicas y unión de hidrógeno. Una columna Tricorn 5/150 se empaca con resina Capto MMC a una altura de lecho de 15 cm. El volumen de la columna (CV) es de 3 mi.

Amortiguadores Para el experimento del ejemplo 5A: Amortiguador de equilibrio: HEPES 20 mM, NaCl 0.1 M, pH 8.0.

Amortiguador de elusión: HEPES 20 mM, NaCl 0.1 M, monoclorhidrato de arginina 0.5 M, pH 8.0.

Para el experimento del ejemplo 5B: Amortiguador de equilibrio: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.1 M, pH 6.0.

Amortiguador de elusión: citrato de sodio 20 mM, NaCl 0.1 M, monoclorhidrato de arginina 0.5 M, pH 6.0.

Instalación experimental Una comparación de purificación de pdFIX sobre una columna Capto MMC con amortiguadores con dos pH diferentes, 8.0 y 6.0, utilizados ambos en los amortiguadores de unión y de elusión. La columna se equilibra con amortiguador de equilibrio seguido por cargado del material inicial a un caudal de 1 ml/min. pdFIX se une a la resina Capto MMC durante las condiciones de estos amortiguadores. Como se observa en la tabla 5, no se encontró pdFIX en el flujo pasante. El rendimiento de pdFIX es igualmente alto en la fracción de elusión para ambos pH probados.

TABLA 5 CONCLUSION Estos experimentos muestran que FIX derivado de plasma se puede unir a resina Capto MMC en amortiguadores con pH de 8.0 y 6.0 y que ambos pH también se pueden utilizar en el amortiguador de elusión.

EJEMPLO 6 (EJEMPLOS 6? A 6K) Obj etivo El objetivo de estos experimentos es estudiar la captación y elusión de FIX humano recombinante (rhFIX) sobre una resina Capto MMC a tres diferentes pH; 6.0, 7.0 y 8.0. También se investigó el beneficio de polisorbato 80 0.02% en estos amortiguadores utilizados, respecto a la unión y elusión de rhFIX.

Material inicial FIX recombinante humano producido en células HEK 293. Las células se separan y el sobrenadante libre de células es el material inicial cargado en la columna Capto MMC.

Resina cromatográfica y columna Se utilizó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (cat no. 17-5317) como etapa de captación para la molécula FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrofóbicas y tiofílicas y unión de hidrógeno. Se empacó una columna XK 16 con resina Capto MMC a una altura del lecho de 13.5 cm. El volumen de columna (CV) es de 27 mi.

Amortiguadores EJEMPLO 6A Instalación experimental y resultados La columna se equilibra con amortiguador de equilibrio seguido por cargado del material inicial a un caudal de 9 ml/min. La columna después se lava con amortiguador de equilibrio seguido por elusión con rhFIX unido a partir de la columna Capto MMC. Los resultados se presentan en la tabla 6.

TABLA 6 Los datos presentados en la tabla 6 muestran que rhFIX se une a Capto MMC a pH 6 , Ph 7 y pH 8. No se encontró rhFIX en el flujo pasante. rhFIX unido también se eluyó de la resina Capto MMC a estos pH con una recuperación de > 75%. La mejor recuperación se obtiene con un amortiguador de elusión con pH 7. La adición de polisorbato 80 en el amortiguador de equilibrio y de elusión resulta en un incremento de por lo menos 5% cuando se utiliza pH 7 o 6. No se obtuvo beneficio para polisorbato 80 cuando se utilizaron amortiguadores con pH 8.

Estos datos y los datos obtenidos en el experimento 5 indican el efecto positivo de polisorbato 80 para la recuperación de rhFIX y pdFIX en una resina Capto MMC.

CONCLUSION FIX humano recombinante se puede unir a Capto MMC en un intervalo de pH de por lo menos 6-8. Las moléculas de rhFIX se eluyen a partir de la resina Capto MMC por adición de monoclorhidrato de arginina 0.5 M a los amortiguadores independiente de cual de los tres pH probados se utilizan.

No obstante, los resultados obtenidos muestran que los resultados de pH 7 proporcionan el mayor rendimiento de rhFIX.

La adición del detergente polisorbato 80 indica un incremento de recuperación de rhFIX cuando se utiliza pH 7 ó 5.

EJEMPLO 7 Obj etivo El objetivo de esta investigación es purificar FIX humano recombinante de medios de cultivo a un producto puro. Esto incluye tres etapas: una etapa de captación, una etapa de afinidad y una etapa de concentración y amortiguador de intercambio. Se utiliza una resina Capto MMC como una etapa de captación y se utiliza una etapa de ligando de afinidad FIX no derivado de animal como la etapa de purificación principal. Como la etapa final se utiliza un sistema de ultrafiltración con un límite de 10 kDa, primero para concentrar la molécula y después para intercambiar el amortiguador a un ambiente de amortiguador fisiológico.

Material inicial para la etapa de captación FIX humano recombinante producido en células HEK 293. Las células se separan y el sobrenadante libre de células es el material inicial cargado en la columna Capto MMC.

ETAPAS DE CAPTACION (EJEMPLO 7A-7C) Se utiliza Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (cat no. 17-5317) como etapa de captación para la molécula FIX. Capto MMC es una resina catiónica débil con interacciones hidrofóbicas y tiofílicas y unión de hidrógeno. Una columna XK 50 se empaca con resina Capto MMC a una altura de lecho de 16.5 cm. El volumen de columna (CV) es de 324 mi.

Instalación experimental y resultados La columna se equilibra con amortiguador de equilibrio seguido por cargado del material inicial a un caudal de 75 ml/min. La columna después se lava con amortiguador de equilibrio seguido por elusión de rhFIX unido desde la columna Capto MMC. Los resultados se presentan en la tabla 7. La purificación de rhFIX se realiza en tres corridas separadas utilizando el mismo sistema experimental y el mismo tipo de amortiguadores. Estas purificaciones de captación se realizan a pH 7.0.

TABLA 7 Los datos presentados en la tabla 7 muestran que rhFIX se une a Capto MMC a pH 7. Se encontró en el flujo pasante nada o muy poco de rhFIX. El rhFIX unido también se puede eluir de la resina Capto MMC a pH 7.0 al agregar clorhidrato de arginina a la concentración final de 0.5 M. La recuperación promedio de estas tres captaciones de rhFIX es de 92%.

ETAPA DE AFINIDAD DE FIX (EJEMPLO 7D-7E) Como una etapa de afinidad se utilizó ligando de afinidad FIX no derivado de animal (fragmento Fab) producido en levadura (desarrollado en co-operación con BAC BV, de Bio Affinity Company) . Este ligando se acopló a una resina Capto MP (GE Healthcare) de acuerdo con técnicas de acoplamiento estándar y se le denominó como "la resina de afinidad FIX) .

Se empacó una columna XK 26 con la resina de afinidad FIX a una altura de lecho de 7.5 cm. El volumen de la columna (CV) es de 40 mi.

Instalación experimental y resultados Los eluatos se las tres etapas de captación se acumulan y se utilizan como material inicial en la columna de afinidad. La columna se equilibra con amortiguador de equilibrio seguido por cargado del material inicial a un caudal de 10 ml/min. La columna después se lava con amortiguador de equilibrio seguido por elusión de rhFlX unido a partir de la columna de afinidad. Los resultados se presentan en la tabla 8. La purificación de rhFIX se realiza en dos corridas separadas, utilizando la misma instalación experimental y el mismo tipo de amortiguadores.

TABLA 8 Los datos presentados en la tabla 8 muestran que rhFIX se une a resina de afinidad de FIX a pH 7. El flujo pasante obtenido es un efecto de la capacidad de unión de la cantidad de resina usada. Aproximadamente 100% de rhFIX utilizado en ambos experimentos es detectable. El rhFIX unido se puede eluir de la resina de afinidad de FIX mediante la utilización de un amortiguador que contiene MgCl2 2 M.

CONCENTRACION Y ETAPA DE INTERCAMBIO DE AMORTIGUADOR (EJEMPLO 7F) Mediante la utilización de un sistema UF, el rhFIX en el eluato a partir de la columna de afinidad se concentra y después el amortiguador se intercambia por una diafiltración utilizando el mismo filtro UF.

Filtro UF Se utiliza un filtro Pellicon 3 con un límite de 10 kDa montado en un sistema Pellicon 2. amortiguador de NaCl 0.15 M, citrato de sodio 20 mM, pH 7.0 diafiltración Conductividad 18.4 mS/cm a 25°C Instalación experimental y resultados Al bombear la muestra en un flujo tangencial y permitir que una parte pequeña del volumen pase continuamente a través del filtro Pellicon 3, el volumen disminuye. Debido al tamaño de poro utilizado en el filtro, la molécula rhFIX está contenida en la fracción recirculante. El peso molecular de rhFIX es de aproximadamente 55 kDa y es retenido cuando se utiliza un filtro con un tamaño de poro de 10 kDa.

Un volumen de 310 mi de eluato de afinidad se concentra a aproximadamente 60 mi. Este volumen después se somete a diafiltración mediante amortiguador de diafiltración agregado continuamente a la misma velocidad a que es filtrado a través del filtro Pellicon 3. El amortiguador en este concentrado de 60 mi se intercambia aproximadamente 18 veces. La conductividad de este concentrado se cambia de 123 mS/cm a 18.6 mS/cm a 25°C .

La recuperación de rhFIX sobre esta etapa de concentración e intercambio de amortiguador de 86%. Una etapa de lavado del filtro UF con amortiguador de diálisis se realiza para recuperar tanto rhFIX como se pueda.

La figura 1 muestra el patrón de pureza de SDS Page después de purificación de resina de afinidad FIX. El carril 1 es un marcador molecular disponible comercialmente, el carril 2 es un producto FIX derivado de plasma de alta pureza disponible comercialmente, el carril 3 es un producto FIX recombinante de alta pureza disponible comercialmente, los carriles 4 y 5 son muestras después de purificación por afinidad FIX de la invención como se describe en el ejemplo 7D y 7E, los carriles 6 y 7 son muestras después de purificación de afinidad FIX y concentración por ultrafiltración/desalación como se describe en el ejemplo 7F. Como se puede observar en los carriles 4-7, la pureza FIX del producto elaborado de acuerdo con la invención no muestra impurezas de peso molecular menor o mayor, en comparación con el carril 2 ó 3.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un procedimiento para elaborar una proteína dependiente de vitamina K libre de priones en una secuencia de purificación utilizando cromatografía, caracterizado porque por lo menos una etapa de cromatografía se realiza utilizando resina multimodal; proporcionar una fracción que contiene proteína dependiente de vitamina K en una solución acuosa; poner en contacto la fracción que contiene proteína dependiente de vitamina K con una resina multimodal a un pH entre 6-9; opcionalmente, lavar la resina multimodal que tiene proteína dependiente de vitamina K adsorbida con un amortiguador de lavado acuoso para eliminar por lavado contaminantes y retener la proteína dependiente de vitamina K, antes de que se eluya la proteína dependiente de vitamina K; la proteína dependiente de vitamina K se eluye a partir de la resina multimodal a un pH entre 6 a 9 en un amortiguador que comprende arginina; y opcionalmente, recolectar fracciones que contienen proteína dependiente de vitamina K en forma purificada o enriquecida.

2. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína dependiente de vitamina K es FIX derivado de plasma o FIX producido de manera recombinante .

3. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 a 2, caracterizado porque la resina multimodal comprende porciones unidas a una matriz y las porciones son capaces de interactuar con la proteína dependiente de vitamina K en un ambiente acuoso por interacciones iónicas y otros tipos de interacciones tales como unión de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y tiofílicas.

4. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la solución acuosa comprende la proteína dependiente de vitamina K en una solución salina que corresponde a una conductividad desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 200 mS/cm a 25 °C y/o el amortiguador de elusión que corresponde a una conductividad desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 200 mS/cm a 25°C.

5. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la arginina está presente en concentraciones de 0.1-0.3 M y 0.7-1 M, particularmente, 0.3-0.7 M .

6. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la proteína dependiente de vitamina K se eluye con un amortiguador que tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, en particular pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, o pH de 7.

7. El procedimiento de conformidad con por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el amortiguador de elusión adicionalmente comprende agentes que se seleccionan del grupo que consiste de por lo menos compuestos orgánicos que contienen un grupo hidroxilo tal como un alcohol, por lo menos un compuesto orgánico que contiene un grupo amino tal como un aminoácido, por lo menos un compuesto para regular la fuerza iónica del amortiguador tal como las sales inorgánicas que se seleccionan del grupo que consiste de cloruro de sodio, fosfato de sodio, sulfato de sodio, cloruro de potasio, fosfato de potasio, sulfato de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, cloruro de bario, sulfato de bario, sulfato de amonio, por lo menos un detergente no iónico, por lo menos una sustancia amortiguadora para regular el pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, en particular a aproximadamente un valor neutro, o combinaciones de los mismos.

8. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el alcohol se selecciona del grupo que consiste de metanol, propanol, etilenglicol y propilenglicol ; la sal inorgánica se selecciona del grupo que consiste de KC1 y NaCl; el detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste de Tween 20, Tween 80 y Pluronic F68; la sustancia amortiguadora se selecciona del grupo que consiste de citrato de sodio, histidina, HEPES, MES, base Tris y acetato de sodio a un pH entre 6-9, citrato de sodio para ajuste de pH 6-7.5 y base Tris para ajuste de pH 7.5-9.

9. El procedimiento de conformidad con por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la proteína dependiente de vitamina K se eluye con una combinación de NaCl/etilenglicol o una combinación de arginina/NaCl o una combinación de arginina/etilenglicol.

10. El procedimiento de conformidad con por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la resina de cromatografía "multimodal" contiene por lo menos una de las siguientes porciones: a. un ligando de N-bencil-N-metiletanolamina cargado positivamente b. un ligando de ácido 2- (benzoilamino) butanoico cargado negativamente, c. un ligando de fenilpropilo, d. un ligando de N-hexilo, e. un ligando de 4 -mercapto-etil-piridina, f. un ligando de ácido 3- ( (3-metil-5-( (tetrahidrofuran-2-ilraetil) -amino) -fenil) -amino) -benzoico o combinaciones de los mismos.

11. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la resina de cromatografía "multimodal" se selecciona de las siguientes resinas disponibles comercialmente HEP HypercelMR; PPA HypercelMR; Capto AdhereMR; Capto M CMR; MEP HypercelMR.

12. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la etapa de cromatografía multimodal se combina con la etapa de cromatografía de afinidad para proteína dependiente de vitamina K en donde la afinidad se proporciona por un ligando el cual se basa en una proteína expresada en levadura y la pureza del eluato resultante es mayor de 90%.

13. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la secuencia de purificación comprende además etapas de eliminación/inactivación de patógenos que comprende una etapa de inactivación basada químicamente, ultrafiltración, etapas de cromatografía o combinaciones de las mismas, etapas las cuales se basan en propiedades fisiológicas diferentes dirigidas a un patógeno que va a ser eliminado. 1 . El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la secuencia de purificación comprende además las siguientes etapas : i. una resina multimodal catiónica tal como Capto

MMC; ii. una etapa de inactivación basada químicamente para virus envueltos en lípidos, en particular la inactivación por solvente/detergente utilizando fosfato de tri-n-butilo y tritón X-100; iii. una resina de afinidad basada en un ligando de proteína tal como un ligando que consiste de un fragmento de anticuerpo para proteína dependiente de vitamina K expresado en levadura; iv. una etapa de separación por filtración de patógeno con una media de tamaño de poro de aproximadamente 20 nm tal como Planova 20N; v. una resina intercambiadora de aniones tal como Q Sepharose FF o Capto Q; vi. una etapa de ultrafiltración tal como Pellicon 3 con un límite de 10 kDa.

15. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la etapa de cromatografía multimodal se combina con una etapa de cromatografía de afinidad en donde la afinidad se proporciona por un ligando el cual se basa en una proteína expresada en levadura y en donde la pureza del producto resultante a partir de la resina de cromatografía de afinidad es mayor de 95% .

16. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la etapa o etapas de cromatografía adicionales se realizan, seleccionadas a partir de cromatografía de exclusión de tamaño, de intercambio aniónico, de intercambio catiónico, de interacción hidrofóbica y de afinidad a metal inmovilizado, caracterizado porque la pureza del producto final es mayor de 99%.