JP2013523689A - 第ｉｘ凝固因子などのビタミンｋ依存性タンパク質の精製方法 - Google Patents
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Abstract
クロマトグラフィーを用いる一連の精製においてプリオンを含まないビタミンＫ依存性タンパク質を製造する方法であって、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程がマルチモーダル樹脂を用いて行われ、ビタミンＫ依存性タンパク質を水性溶液に含む画分を提供すること、前記ビタミンＫ依存性タンパク質を含む前記画分を６〜９のｐＨでマルチモーダル樹脂と接触させること、前記ビタミンＫ依存性タンパク質を溶出する前に夾雑物を洗い流し、かつ、前記ビタミンＫ依存性タンパク質を保持するために、所望により、前記ビタミンＫ依存性タンパク質を吸着させた前記マルチモーダル樹脂を水性洗浄緩衝液で洗浄すること、前記ビタミンＫ依存性タンパク質がアルギニンを含む緩衝液において６から９のｐＨでマルチモーダル樹脂より溶出していること、ならびに、所望により、精製された、または、濃縮された状態のビタミンＫ依存性タンパク質含有画分を所望により回収すること、を特徴とする方法。
Description
本発明は第ＩＸ凝固因子（ＦＩＸと略記される）などのビタミンＫ依存性タンパク質、および、本発明の方法により得られうるＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質を含む画分を精製する方法に関する。
血友病は、凝血、または、凝固を制御する身体能力が欠損する遺伝性遺伝子疾患の１グループである。その形態の１つである血友病Ｂでは、第ＩＸ凝固因子（ＦＩＸ）が欠損しており、血友病Ｂは２５，０００人の男児出生のうち約１人の割合で起きる。第ＩＸ因子（または、クリスマス因子）は、凝固システムのセリンプロテアーゼの１つである。ビタミンＫ依存性血漿タンパク質こそ、Ｃａ２＋イオン、リン脂質、および、第ＶＩＩＩａ因子の存在下、第Ｘ因子をその活性化型に変換することで血液凝固の内因性経路に関与する。ＦＩＸタンパク質は多機能特性を有する血液凝固における必須因子である。
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は４６１アミノ酸を含む一本鎖糖タンパク質である。それは主に肝臓で合成され、血漿中に分泌される。第ＩＸ因子分子はいくつかに分かれた機能ドメインから構成され、シグナルペプチド、プロペプチド、Ｇｌａドメイン、２つの上皮成長因子様（ＥＧＦ）ドメイン、活性化ペプチド、および、触媒性トリプシン様ドメイン（セリンプロテアーゼドメイン）（前記プロペプチドは分泌前に切断され、４１５アミノ酸の成熟型ＦＩＸ分子が生じる。）を含む。そのタンパク質はさらにプロセッシングを受けて活性型であるジスルフィド結合で連結された軽鎖および重鎖からなるヘテロ二量体を生じる。
ＦＩＸの欠損は、血漿由来のＦＩＸ濃縮物、または、組換え技術により製造されたＦＩＸで治療されることができる。ＦＩＸ濃縮物での治療は血友病の患者に通常の生活をもたらしてきた。歴史的に、血友病Ｂはヒト血漿起源のＦＩＸで治療されてきた。通常の条件下では、ＦＩＸ分子は血漿中においてその本来の形態で循環しているが、凝固酵素の血液カスケードにおいて始まる複雑な過程を通してＦＩＸ分子は活性化される。
使用する精製方法に応じて様々な純度の血漿由来ＦＩＸ製品が市場に存在する。ＦＩＸを精製するために用いられる方法は通常、精製のためのクロマトグラフィー工程（主に、イオン交換工程、および、親和性工程）と製品の濃縮／脱塩のための限外濾過工程の組合せであった。
Ｈａｒｒｉｓｏｎら（Ｓ．ハリソンら著、血液学セミナー誌（Ｓｅｍ Ｈｅｍａｔｏｌ）第３５巻（増刊第２号）：ｐ４−１０（１９９８年）(S. Harrison et al. Sem Hematol 35 (Suppl 2): 4-10 (1998)）によりＣＨＯ細胞で生産される組換えＦＩＸ（ベネフィックス（登録商標））の製造法が説明される。細胞は精密濾過により回収され、引き続いて限外濾過／透析濾過工程で濃縮され、その工程で緩衝液がトリス緩衝液に交換されて最初のクロマトグラフィーカラムへの負荷に適した緩衝液がもたらされる。４工程の独立したクロマトグラフィー工程がｒＦＩＸの精製のために用いられ、第１工程は陰イオン交換工程（ＱセファロースＦＦ）であり、その工程は擬似親和性モードで行われる。ｐＨ８．０で１０ｍＭ塩化カルシウムによりそのカラムを溶出する。塩化カルシウムはＦＩＸ分子の立体構造変化を誘導し、その立体構造変化は、ＦＩＸ分子のカラムからの解離を引き起こす。
Ｑセファロース工程は、ヘパリン結合ドメインを有するタンパク質の親和性精製に用いられるヘパリン類似体であるマトレックス・セルファイン（Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）硫酸カラムでの精製に引き継がれる。それはまた、負に荷電した硫酸基のため、陽イオン交換樹脂としても挙動する。セルファイン精製工程は低レベルのＨＣＰを除去する。
セルファイン溶出液は、リン酸カルシウムの合成物であるセラミックハイドロキシアパタイトのカラムに負荷される。それは、様々な電荷を持つタンパク質を分離するために使用され、そして、それにより特異的活性が比較的低いｒＦＩＸを除去することができる。リン酸濃度を０．５Ｍの最終濃度にまで上昇させる段階溶出により、このカラムを溶出する。
ベネフィックス（登録商標）の製造方法の最終精製工程はキレート−ＥＭＤ−銅（ＩＩ）の工程である。樹脂により保持される固定化金属とタンパク質が相互作用する。結合したｒＦＩＸを置換剤であるイミダゾールにより溶出し、微量の夾雑物はこの精製工程で除去され、ウィルス濾過工程（ビレソルブ（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ）−７０）が引き続いて行われ、最終的に限外濾過／透析濾過工程が行われてｒＦＩＸが濃縮され、そして、緩衝液が製剤用緩衝液に交換される。
上述のｒＦＩＸ製造法は一貫していて、６５処理単位が分析されてきて、特異活性は２７６±２３ＩＵ／ｍｇであることがわかった。Ｇｌａ含有量は１モルのｒＦＩＸ当たり１１．４±０．１モルのＧｌａであり、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＨＣＰ−ＥＬＩＳＡで判定すると不純物の総計は、それぞれ、０．０１±０．０１％および０．０３±０．０１％であった。
Ｌｉｎｄｓａｙら（クロマトグラフィーＡ誌（Ｊ Ｃｈｒｏｍ Ａ）第１０２６巻：ｐ１４９−１５７（２００４年）（J Chrom A 1026: 149-157 (2004)））により形質導入ブタの乳からｒＦＩＸを精製する方法が説明される。ヘパリンセファロースＦＦは精製スキームの第１工程として用いられ、引き続いて陰イオン交換工程が用いられる。
第ＩＸ因子のヘパリン結合ドメインはその分子のＣ末端に位置する。この領域はＰＴＭを欠き、したがって、ヘパリンクロマトグラフィー工程によりｒＦＩＸの全集団が単離されることが可能になる。溶出液の特異的活性は３０−３５ＩＵ／ｍｇであった。このことは、大きな画分は不活性であることを示す。ｒＦＩＸの活性がある亜集団は陰イオン交換カラムの濃度勾配溶出の間に活性の無い亜集団と分離された。
Ｋａｕｆｍａｎら（生化学誌（ＪＢＣ）第２６１巻：ｐ９６２２−９６２８（１９８６年）（JBC 261:9622-9628 (1986)））によりＣＨＯ細胞におけるｒＦＩＸの発現とそのタンパク質の精製が説明される。ｒＦＩＸを含む細胞培養液は、立体構造特異的抗体（抗ＦＩＸ：カルシウム（ＩＩ）抗体）を用いる免疫親和性カラムへのアプライの前に、限外濾過により濃縮され、そして、３ｍＭ塩化カルシウム、０．０５Ｍトリス塩酸、および、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液に対して透析された。その後、そのカラムは１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５Ｍトリス塩酸、および、０．１５Ｍ塩化ナトリウムで溶出された。
前記カラムへのアプライ前の出発物質中の３ｍＭ塩化カルシウムの存在により、ＦＩＸの活性型と非活性型の間で分離が行われた。非活性型はそのカラムに結合できず、活性型ＦＩＸをＥＤＴＡでそのカラムから溶出することができた。
国際公開第ＷＯ−Ａ−２００９／００７４５１号（ＷＯ−Ａ−２００９／００７４５１）号は混合モード樹脂、または、マルチモーダル樹脂を用いる第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の精製方法を開示する。その精製方法は、疎水性部分と負荷電部分を含むリガンドを包含するマルチモーダル樹脂、または、混合モード樹脂と、ＦＶＩＩＩタンパク質と、を接触させること、および、前記ＦＶＩＩＩタンパク質を少なくとも１．５Ｍの塩と少なくとも４０％（重量／体積）のエチレングリコール、プロピレングリコール、または、その混合物、および、カルシウムイオンを含む溶出緩衝液で溶出することに基づく。
欧州特許出願公開第１ ７０７ ６３４号（ＥＰ−Ａ−１ ７０７ ６３４）は、免疫親和性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、タンパク質沈殿、緩衝液交換、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モード疎水性／イオン交換クロマトグラフィー媒体、キレートクロマトグラフィー、炭水化物親和性様レクチン親和性クロマトグラフィー、もしくは、ヘパリン親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、透析、ポリエチレングリコール、硫酸アンモニウム、エタノールなどの様々な沈殿剤、ハイドロキシアパタイト吸着、濾過膜吸着、磁性粒子に結合したリガンド等などの様々な方法により、中でも組換え技術により生産されたタンパク質を単離する方法を開示する。しかしながら、それは特定のクロマトグラフィー精製工程を特定するものではない。
国際公開第２００５−０８２４８３号（ＷＯ−Ａ−２００５−０８２４８３）は液体中の１つ以上の不純物から分けて抗体を精製する方法を開示する。その方法は、抗体を樹脂に吸着するために、マルチモーダルリガンドが固定化された支持体からなる第１クロマトグラフィー樹脂に前記の液体を接触させることを含み、各マルチモーダルリガンドは少なくとも１つの陽イオン交換基と少なくとも１つの芳香環系、または、ヘテロ芳香環系を含む。前記抗体を前記樹脂から解離するために溶離液が加えられ、その溶出液は第２クロマトグラフィー樹脂と接触させられる。
国際公開第２００５／１２１１６３号（ＷＯ−Ａ−２００５／１２１１６３）はタンパク質溶液から１つ以上のタンパク質を単離する方法を開示する。その方法は、１つ以上の特定のタンパク質を含み、前もって調整されたｐＨと前もって調整されたイオン強度、もしくは、電気伝導率を有するタンパク質溶液を提供し、少なくとも高密度で非多孔質の核が多孔質の素材で覆われた粒子を含む吸着カラムにそのタンパク質溶液をアプライする工程を含む。その吸着材は少なくとも１．５ｇ／ｍｌの粒子密度と大きくとも１５０μｍの平均体積粒径を含む。前記吸着材から前記タンパク質を溶出する前にそのカラムは所望により洗浄されてよい。
国際公開第２００９／１５６４３０号（ＷＯ−Ａ−２００９／１５６４３０Ａ１）は混合モード樹脂、または、マルチモーダル樹脂を用いるＦＶＩＩＩの精製方法を開示する。その精製方法は、疎水性部分と負荷電部分を含むリガンドを包含するマルチモーダル樹脂、または、混合モード樹脂に高イオン強度を有する溶液中のＦＶＩＩＩタンパク質を接触させること、および、ｐＨ６〜８で正に荷電する少なくとも１つのアミノ酸を含む溶出緩衝液で前記のＦＶＩＩＩタンパク質を溶出することに基づく。
ＦＩＸ含有製品を改善するために、高純度のＦＩＸになるまで夾雑物を効果的に除去するＦＩＸ分子に対する特異的な親和性クロマトグラフィーが用いられた。よく用いられる免疫親和性クロマトグラフィーに関する欠点は、それは比較的に高価であり、動物起源のモノクローナル抗体が親和性リガンドとして使用されることであった。８０年代中期には血漿由来ＦＩＸ製品に関連するウィルスの伝播もあった。たとえ、この問題が特定のウィルス低減工程により解決されたとしても、このことが組換えＦＩＸ製品（ｒＦＩＸ）開発の出発点であった。９０年代に最初のｒＦＩＸ製品が市場に出され、それは現在まで唯一の製品である。
本発明は、先行技術におけるビタミンＫ依存性タンパク質、特にＦＩＸの精製方法の欠点を避けることができる方法を提供することを１つの目的とする。タンパク質の樹脂への結合が比較的低い塩濃度（電気伝導率）とｐＨの範囲で、典型的には０．０１〜０．１５Ｍの塩（塩化ナトリウムなど）の濃度の範囲で行われることができるだけあるということが伝統的なイオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、ＳＰ−、ＣＭ−、Ｑ−、または、ＤＥＡＥセファロースＦＦイオン交換クロマトグラフィー樹脂）の１つの欠点であると先行技術から知られている。最適なｐＨの範囲は陽イオン交換体が用いられるか、または、陰イオン交換体が用いられるかということ、そして、その樹脂に結合する目的産物の等電点に依存する。一般的に、イオン交換樹脂に目的タンパク質が結合するｐＨの範囲は、その目的産物の等電点から約１ｐＨ単位上、または、下であるのが典型的である。
ある用途では、あるイオン交換クロマトグラフィー工程により前記タンパク質に対して用いられる比較的穏やかな精製条件を従来のイオン交換クロマトグラフィーには用いることができないやや強いイオン強度と通常の範囲から外れたｐＨで直接的に（さらに希釈することなく）クロマトグラフィー樹脂に対してもまた用いることができるようにする必要があるであろう。
マルチモーダル（または、混合モード）クロマトグラフィーはタンパク質を精製するための手段である。例えば、ＧＥヘルスケアの製造業者データシート（１１−００３５−４５ＡＡ）カプト・アドヒア、ＧＥヘルスケアの製造業者データシート（２８−９０７８−８８ＡＡ）カプトＭＭＣ、および、国際公開第２００９／０２４６２０号（ＷＯ−Ａ−２００９／０２４６２０）「プリオンプロテインを含まない目的タンパク質の単離と精製の方法」に記載される。例えば、中性より下の、もしくは、上のｐＨなどの比較的厳しい条件が単独で、または、例えばエチレングリコールなどの、そして、例えば、国際公開第２００９／００７４５１号（ＷＯ−Ａ−２００９／００７４５１）に記載されるようなその他の溶出パラメータと組み合わせてその溶出にしばしば含まれることが欠点である。
タンパク質溶液、特に、目的タンパク質に悪影響を与えることができる潜在的なプロテアーゼが溶液中に存在する組換えタンパク質の回収物や血漿由来産物などの粗タンパク質調製物において、強いイオン強度は前記タンパク質の安定性にとってかなり有利である可能性がある。
プロテアーゼはしばしば生理的条件で（ほとんどの細胞系の場合と同様に）、すなわち、約ｐＨ７と約０．１５Ｍの塩濃度で最もよく機能するので、プロテアーゼの作用を最小化するためにこれらの条件を変えることは有利である可能性がある。そなどの変化は、典型的には、塩を加える、および／または、ｐＨを変化させることにより実行されることができる。これらのパラメータの両方が従来のイオン交換クロマトグラフィー工程の実行に重要であり、したがって、しばしば達成することが不可能である。したがって、本発明は、この問題が解決された方法であり、そして、前記目的タンパク質を分解することが可能であろうプロテアーゼなどの潜在的タンパク質分解性因子を含む粗タンパク質試料に塩を加えること、および／または、ｐＨを変えることを可能するその方法を提供することをもう１つの目的とした。その方法により、その他のできるだけ少ない手段でそのタンパク質溶液を加工し、前記目的タンパク質をクロマトグラフィー樹脂に結合させることがさらにできるはずである。これにより、粗試料からの前記目的タンパク質の濃縮と精製の、または、例えば、親和性クロマトグラフィーなどのその他のクロマトグラフィー工程を用いるさらなる下流精製の最適な工程が提供されるであろう。
プロテアーゼはしばしば生理的条件で（ほとんどの細胞系の場合と同様に）、すなわち、約ｐＨ７と約０．１５Ｍの塩濃度で最もよく機能するので、プロテアーゼの作用を最小化するためにこれらの条件を変えることは有利である可能性がある。そなどの変化は、典型的には、塩を加える、および／または、ｐＨを変化させることにより実行されることができる。これらのパラメータの両方が従来のイオン交換クロマトグラフィー工程の実行に重要であり、したがって、しばしば達成することが不可能である。したがって、本発明は、この問題が解決された方法であり、そして、前記目的タンパク質を分解することが可能であろうプロテアーゼなどの潜在的タンパク質分解性因子を含む粗タンパク質試料に塩を加えること、および／または、ｐＨを変えることを可能するその方法を提供することをもう１つの目的とした。その方法により、その他のできるだけ少ない手段でそのタンパク質溶液を加工し、前記目的タンパク質をクロマトグラフィー樹脂に結合させることがさらにできるはずである。これにより、粗試料からの前記目的タンパク質の濃縮と精製の、または、例えば、親和性クロマトグラフィーなどのその他のクロマトグラフィー工程を用いるさらなる下流精製の最適な工程が提供されるであろう。
精製中の前記目的タンパク質の分解が防がれる、または、少なくとも低減されるので、この要求は特に重要である。
これにより、粗回収物に存在する可能性があるプロテアーゼとその他の夾雑物を前記目的タンパク質の溶出の前に除去することが可能になる。
本発明は、特に組換えＦＩＸの細胞培養回収物から開始してＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質を精製する方法を提供することをもう１つ別の目的とする。
本発明によれば、前記目的は、クロマトグラフィーを用いる一連の精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）でＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質を精製する方法で達せられ、ここで、
少なくとも１つのクロマトグラフィーがマルチモーダル樹脂を用いて行われ、
ＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質は前記マルチモーダル樹脂に結合し、そして、
ＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質は、アルギニンを含む緩衝液中、６〜９のｐＨで、前記マルチモーダル樹脂から溶出する。
少なくとも１つのクロマトグラフィーがマルチモーダル樹脂を用いて行われ、
ＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質は前記マルチモーダル樹脂に結合し、そして、
ＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質は、アルギニンを含む緩衝液中、６〜９のｐＨで、前記マルチモーダル樹脂から溶出する。
７種の血漿糖タンパク質はその生合成についてビタミンＫ依存的であることが知られている。それらは、プロトロンビン（第ＩＩ因子）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、および、プロテインＺである。Ｇｌａドメインはこれら全てのビタミンＫ依存性タンパク質における共通の構造上の特徴であり、Ｇｌａドメインの直後に前記タンパク質の各々（プロトロンビンを除く）は１つ以上のＥＧＦ様ドメインを有する。前記ビタミンＫ依存性タンパク質はその生理学的機能を発現するためにカルシウムイオンを必要とし、そして、カルシウム結合部位は少なくともＧｌａドメインとＥＧＦ様ドメインに関係する。カルシウムの結合により、これらのタンパク質はリン脂質／細胞膜に結合し、したがって、それらの完全な生物学的活性を発現することができる。
捕捉精製工程としてマルチモーダル樹脂を用いる本発明は、前記マルチモーダルクロマトグラフィー工程に前記目的タンパク質を結合させる間に前記タンパク質溶液中の活性型プロテアーゼの危険性を最小化させる値に塩濃度とｐＨを調節する可能性を提供する。
本発明の方法の利点は、例えば、組換え方法で捕捉工程として用いられるマルチモーダル樹脂への前記目的タンパク質の結合の後、前記目的タンパク質の溶出の前に洗浄工程をさらに用いる可能性があることである。これは、前記目的タンパク質を溶出する前に前記マルチモーダル樹脂に付着するプロテアーゼとその他の夾雑物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ）を除去するために適切な洗浄緩衝液を選択することで前記樹脂を洗浄するマルチモーダル樹脂洗浄工程を用いて達成される。適切な洗浄緩衝液は、好ましくは、洗浄除去工程の間にプロテアーゼ活性をさらに抑えるために適切なｐＨで塩、または、アミノ酸、または、緩衝液成分、または、それらの混合物を含む。
本発明の方法は、明瞭な溶出特性を有する穏やかな溶出環境で（すなわち、できるだけ小さい体積に）前記マルチモーダル樹脂に結合した前記目的タンパク質を溶出することを可能にする。これは、ｐＨを上昇させること、または、塩濃度を上昇させること、または、アミノ酸の添加、または、それらの組合せにより達成された。本発明の方法は、凝集物の抑制、本来の分子構造を保存すること、および、さらなる下流処理のために小容量をもたらすことなどの利点を提供する。
本発明はまた、ヒト、または、動物由来の安定化添加剤を加えることがない精製方法、および、それ（モノクローナル抗体ベースの免疫親和性樹脂）を含まない方法全体の使用を促進する。前記マルチモーダル樹脂の使用、特に捕捉工程としての使用はまた従来のイオン交換体と比較して高い結合能を促進し、それはカラムからのより高濃度の産物溶出液をもたらすことになり、産物の安定性にとって有利である可能性がある。
本発明のある実施形態によれば、前記マルチモーダルクロマトグラフィーはクロマトグラフィーカラムで行われることができる。これは第１捕捉工程としてみなされることができる。本発明の方法はまたバッチモードでも実行されることができる。
本発明のある実施形態において、マルチモーダル樹脂に基づく前記クロマトグラフィーは、酵母由来の親和性リガンドを有する樹脂に基づくクロマトグラフィーと併用され、ＦＩＸタンパク質などの前記ビタミンＫ依存性タンパク質の溶出の後に９０％超の純度を得る。
本発明のさらなる別の実施形態において、前記マルチモーダル樹脂工程と前記酵母由来親和性リガンドクロマトグラフィー工程は、ＦＩＸタンパク質などのビタミンＫ依存性タンパク質の最終産物において９９％より高い純度を得るために、その他のクロマトグラフィー精製工程と併用される。
それ故、また、（アルブミン、または、モノクローナル抗体ベースの免疫親和性リガンドなどのヒト、または、動物由来の添加剤を添加しない、または、使用しない）本発明による方法で得られるＦＩＸなどの精製されたビタミンＫ依存性タンパク質を含む組成物は本発明の対象である。
本発明の別の実施形態において、前記マルチモーダル樹脂はマトリックスに結合する部分を含み、その部分はイオン性相互作用、ならびに、水素結合、疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用などのその他のタイプの相互作用により混合物中でＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質と相互作用することができる。
本発明のさらなる実施形態において、前記親和性リガンドはＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質に対する酵母由来Ｆａｂ断片である。
本発明のさらなる実施形態において、前記マルチモーダル樹脂工程は、粗タンパク質溶液からＦＩＸなどの前記ビタミンＫ依存性タンパク質を捕捉するために行われ、その結果得られるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂溶出液の酵母由来親和性リガンドクロマトグラフィー工程での処理の後に、そして、ＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質の前記親和性クロマトグラフィー工程からの溶出の後にタンパク質とＤＮＡに関して９０％より高い純度が得られる。
本発明のさらに別の実施形態において、前記マルチモーダル樹脂工程がＦＩＸなどの前記ビタミンＫ依存性タンパク質を粗タンパク質溶液から捕捉するために行われ、処理後にその結果生じるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂溶出液がサイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および、固定化金属親和性クロマトグラフィーから選択されるその他のクロマトグラフィー工程、ならびに、酵母由来親和性リガンドでさらに処理されるとき、最終産物の純度が９９％より高いということを特徴とする。
本発明のさらに別の実施形態において、ＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質を含む混合物は溶液中に存在する。
本発明のさらに別の実施形態において、ＦＩＸなどの前記ビタミンＫ依存性タンパク質は前記産物を分解できるプロテアーゼを含む可能性のある粗タンパク質溶液中に存在する。
夾雑物（プロテアーゼ、ＤＮＡ等）を洗い流し、そして、ＦＩＸなどの前記ビタミンＫ依存性タンパク質を保持するために、それをマルチモーダル樹脂から解離する前に前記洗浄緩衝液を前記マルチモーダル樹脂にアプライすることは有利である可能性がある。
本発明の別の実施形態において、ＦＩＸなどの前記ビタミンＫ依存性タンパク質を溶出する前に前記マルチモーダル樹脂はｐＨ６〜９の洗浄緩衝液で洗浄される。
本発明のさらなる実施形態において、前記溶出剤としてアルギニンを用いて溶出が行われる。本発明によれば、前記溶出剤は、ホフマイスターシリーズから選択される塩の濃度の上昇と組み合わされることができる。本発明によれば、その溶出はアルギニン単独、もしくは、塩濃度の上昇との組合せ、または、塩濃度の上昇のみのどちらかで行われることができ、これらはすべて、ｐＨ６〜９の範囲内、好ましくは、ｐＨ７．０である。
本発明によれば、ホフマイスターシリーズに含まれる塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、酢酸塩、リン酸塩、および、硫酸塩に関しては塩化ナトリウムと塩化カリウムが好ましい。
本発明によれば、アルギニンの濃度は、特に、約０．１Ｍから約２Ｍまでの範囲であり、ホフマイスターシリーズによる塩については０．１Ｍから４Ｍまでであり、特に、アルギニンについては約０．４Ｍから約１．５Ｍまでの範囲であり、ホフマイスターシリーズによる塩については０．６Ｍから２Ｍであり、または、アルギニンについては約０．３Ｍから約０．７Ｍまでの範囲であり、ホフマイスターシリーズによる塩については０．８Ｍから１．２Ｍである。
本発明の別の実施形態によれば、ＦＩＸなどの前記ビタミンＫ依存性タンパク質は、６〜９の間のｐＨで、好ましくは、ｐＨ７．０で前記マルチモーダル樹脂に結合する。
本発明のさらなる実施形態において、クエン酸ナトリウム、ヒスチジン、２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル）−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、トリス塩基、および、酢酸ナトリウムからなる群より選択される物質のうちの少なくとも１つを特に約ｐＨ６から約ｐＨ９の範囲で好ましく含む緩衝物質が使用される。
本発明の方法において、非イオン性界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）は使用される前記緩衝液のいずれの中にも存在することができ、その非イオン性界面活性剤は、特に、ポリソルベート類（ポリソルベート２０、４０、６０、８０）およびプルロニックＦ６８からなる群より選択される。
ｐＨ６〜９の、好ましくはｐＨ７．０の前記溶出緩衝液において、アルギニンの量は、典型的には、０．１から２Ｍの範囲、特に０．５Ｍである。
ｐＨ６〜９の、好ましくはｐＨ７．０の前記溶出緩衝液において、塩化ナトリウムは０．１〜４Ｍの範囲で、特に０．０５から０．３Ｍまでの範囲で含まれる。
ｐＨ６〜９の、好ましくはｐＨ７．０の前記溶出緩衝液において、アルギニンと塩化ナトリウムは０．１〜０．５Ｍの範囲で、特に０．３から０．７Ｍまでの範囲で含まれる。
ｐＨ６〜９の、好ましくはｐＨ７．０の前記洗浄緩衝液において、塩化ナトリウムは０．０１〜０．３Ｍの範囲で、特に０．０５から０．１５Ｍまでの範囲で含まれる。
非イオン性界面活性剤の量は典型的には、０．００１から１％の範囲、特にマルチモーダルクロマトグラフィーのための前記緩衝液では０．０２％である。
本発明に従って使用されることができる前記マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は次の部分のうちの少なくとも１つを含むことができる：
ａ．正に荷電したＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンリガンド、
ｂ．負に荷電した２−（ベンゾイルアミノ）ブタン酸リガンド、
ｃ．フェニルプロピルリガンド、
ｄ．Ｎ−ヘキシルリガンド、
ｅ．４−メルカプト−エチル−ピリジンリガンド、
ｆ．３−（（３−メチル−５−（（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−アミノ）−フェニル）−アミノ）−安息香酸リガンド、または、それらの組合せ。
ａ．正に荷電したＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンリガンド、
ｂ．負に荷電した２−（ベンゾイルアミノ）ブタン酸リガンド、
ｃ．フェニルプロピルリガンド、
ｄ．Ｎ−ヘキシルリガンド、
ｅ．４−メルカプト−エチル−ピリジンリガンド、
ｆ．３−（（３−メチル−５−（（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−アミノ）−フェニル）−アミノ）−安息香酸リガンド、または、それらの組合せ。
特に、本発明に従って使用されるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は次の市販の樹脂であるＨＥＰハイパーセル（商標）、ＰＰＡハイパーセル（商標）、カプト・アドヒア（商標）、カプトＭＭＣ（商標）、ＭＥＰハイパーセル（商標）から選択される。
本発明の方法の別の実施形態において、前記マルチモーダルクロマトグラフィー工程はＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質の親和性クロマトグラフィー工程と組み合わされ、そしてその親和性は、例えば、酵母で発現される抗体断片などのタンパク質性リガンドによってもたらされる。
本発明の別の実施形態において、前記の一連の精製は、病原体除去／不活化工程をさらに含むことができる。病原体除去／不活化工程は、化学作用に基づく不活化工程、サイズに基づく除去工程、クロマトグラフィー工程、または、それらの組合せを含み、除去される前記病原体に向けられた様々な生理的特性に基づく。文献によく記載される病原体不活化工程の一例は化学作用に基づく溶媒界面活性剤法であり、例えば、脂質膜で覆われるあらゆるウィルスを破壊するトリ−ｎ−ブチルリン酸とトライトンＸ−１００に基づく欧州特許第ＥＰ−Ａ−１３１ ７４０号に開示される方法である。サイズに基づく病原体除去工程の一例は、例えば、プラノバ２０フィルターなどの約２０ｎｍの平均孔径を有するナノフィルターである。病原体除去の別の一例はクロマトグラフィーに基づく。例えば、親和性クロマトグラフィーは一般に病原体除去特性を発揮することが知られており、例えばＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質の酵母由来親和性リガンドのクロマトグラフィー樹脂はそうである。
本発明の方法の特定の実施形態において、前記の一連の精製はさらに次の工程を含む：
１．カプトＭＭＣなどの陽イオンマルチモーダル樹脂、
２．脂質で覆われたウィルスの化学作用に基づく不活化工程、特に欧州特許ＥＰ−Ａ−１３１ ７４０にて開示されるトリ−ｎ−ブチルリン酸とトライトンＸ−１００を用いる溶媒／界面活性剤−不活化工程、
３．酵母で発現されるリガンドに基づく親和性樹脂、
４．ＳＰセファロース、または、リソースＳなどの陽イオン交換体、
５．プラノバ２０Ｎなどのサイズが約２０ｎｍの平均的な孔での病原体濾過除去工程、
６．約１０ｋＤａの分子量カットオフの特性を有する限外濾過などの緩衝液交換工程、および／または、濃縮工程、
７．スーパーデックス２００などのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂。
１．カプトＭＭＣなどの陽イオンマルチモーダル樹脂、
２．脂質で覆われたウィルスの化学作用に基づく不活化工程、特に欧州特許ＥＰ−Ａ−１３１ ７４０にて開示されるトリ−ｎ−ブチルリン酸とトライトンＸ−１００を用いる溶媒／界面活性剤−不活化工程、
３．酵母で発現されるリガンドに基づく親和性樹脂、
４．ＳＰセファロース、または、リソースＳなどの陽イオン交換体、
５．プラノバ２０Ｎなどのサイズが約２０ｎｍの平均的な孔での病原体濾過除去工程、
６．約１０ｋＤａの分子量カットオフの特性を有する限外濾過などの緩衝液交換工程、および／または、濃縮工程、
７．スーパーデックス２００などのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂。
特定の実施形態において、本発明の方法は次の工程を含むことができた。
−カプトＭＭＣ（商標）マルチモーダル樹脂はカラムに充填され、ｐＨ７．０で２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０を含む緩衝液で平衡化された。
−上述の平衡化緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）とほぼ同じ条件のＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質を含む粗試料がアプライされ、目的タンパク質とその他の不純物タンパク質がカラムに結合した。
−平衡化緩衝液を用いる洗浄工程が、本発明に従い、タンパク質分解性活性を抑制し、プロテアーゼ、ＤＮＡ、および、その他の夾雑物を除去するために前記カラムに適用されたが、ＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質はそれでもそのカラムに結合した。
−本発明に従い、０．５Ｍアルギニンが加えられｐＨ７．０に調整された平衡化緩衝液を用いてＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質を溶出し、安定した凝集していないＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質の画分を少ない体積で得た。
−カプトＭＭＣ（商標）マルチモーダル樹脂はカラムに充填され、ｐＨ７．０で２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０を含む緩衝液で平衡化された。
−上述の平衡化緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）とほぼ同じ条件のＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質を含む粗試料がアプライされ、目的タンパク質とその他の不純物タンパク質がカラムに結合した。
−平衡化緩衝液を用いる洗浄工程が、本発明に従い、タンパク質分解性活性を抑制し、プロテアーゼ、ＤＮＡ、および、その他の夾雑物を除去するために前記カラムに適用されたが、ＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質はそれでもそのカラムに結合した。
−本発明に従い、０．５Ｍアルギニンが加えられｐＨ７．０に調整された平衡化緩衝液を用いてＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質を溶出し、安定した凝集していないＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質の画分を少ない体積で得た。
マルチモーダル（または、混合モード）クロマトグラフィーはタンパク質を精製するための手段である。例えば、ＧＥヘルスケアの製造業者データシート（１１−００３５−４５ＡＡ）カプト・アドヒア、ＧＥヘルスケアの製造業者データシート（２８−９０７８−８８ＡＡ）カプトＭＭＣ、および、特許出願国際公開第２００９／０２４６２０号（ＷＯ−Ａ−２００９／０２４６２０）「プリオンタンパク質を含まない目的タンパク質の単離と精製の方法」に記載される。
ＦＩＸ分子などのビタミンＫ依存性タンパク質の活性を保持し、そして、例えば、欧州特許第ＥＰ−Ａ−１ ７０７ ６３４号に記載される塩濃度上昇の安定化作用との併用でマルチモーダルクロマトグラフィーの使用を容易にするほぼ中性のｐＨの範囲にある穏やかな溶出条件によりマルチモーダルクロマトグラフィーの前述の欠点が避けられる。
本発明のある実施形態によれば、前記マルチモーダルクロマトグラフィーはクロマトグラフィーカラムで実行されることができる。これは第１捕捉工程としてみなされることができる。本発明の方法はまた、バッチモードで実行されることができる。本発明はまた、ヒト、または、動物由来の安定化添加剤を加えない精製工程、および、それ（モノクローナル抗体ベースの免疫親和性樹脂）を含まない全工程の使用を容易にする。前記マルチモーダル樹脂の使用、特に捕捉工程としての使用はまた従来のイオン交換体と比較して高い結合能を促進し、それはその工程からのより高濃度の産物溶出液をもたらすことになり、産物の安定性にとって有利である。
本発明の方法は、典型的には、ＦＩＸなどの組換えビタミンＫ依存性タンパク質（ｒＦＩＸ）の精製に関する。
別の実施形態において、本発明の方法である前記マルチモーダルクロマトグラフィー工程はＦＩＸなどのビタミンＫ依存性タンパク質の親和性クロマトグラフィー工程と組み合わされ、そしてその親和性は、例えば、酵母で発現される抗体断片などのタンパク質性リガンドによってもたらされる。
それ故、また、本発明による（アルブミン、または、モノクローナル抗体ベースの免疫親和性リガンドなどのヒト、または、動物由来の添加剤を添加することがない、または、使用することがない）方法で得られうるＦＩＸタンパク質などの精製された組換えビタミンＫ依存性タンパク質を含む組成物は本発明の対象である。
本発明は次の非限定的な実施例によってさらに説明される。
分析方法の説明
＜生物学的活性の分析―第ＩＸ因子＞（１段階凝血アッセイ）
第ＩＸ因子の生物学的活性が１段階凝血アッセイで測定され、第ＩＸ因子の単位が現行の世界保健機関（ＷＨＯ）第ＩＸ因子濃縮物基準により定められる国際単位（ＩＵ）で表された。
＜生物学的活性の分析―第ＩＸ因子＞（１段階凝血アッセイ）
第ＩＸ因子の生物学的活性が１段階凝血アッセイで測定され、第ＩＸ因子の単位が現行の世界保健機関（ＷＨＯ）第ＩＸ因子濃縮物基準により定められる国際単位（ＩＵ）で表された。
前記１段階凝血アッセイはヨーロッパ薬局方で規定される方法である。そのアッセイの原理は、リン脂質、接触活性化因子（ｃｏｎｔａｃｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、カルシウムイオンの存在下、第ＩＸ因子欠損血漿の凝固時間を補正する第ＩＸ因子含有試料の能力に基づく。フィブリン凝塊が出現する時間が一工程で測定される。第ＩＸ因子の前記活性は凝固時間に反比例する。本方法はシーメンスＢＣＳ ＸＰ計器で実行された。
＜ＳＤＳ Ｐａｇｅ＞（分子量分布）
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）はサイズに基づくタンパク質の分離に関係する。この方法は還元的条件で行われるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥについて説明する。変性条件、および、還元条件で前記試料を加熱することでタンパク質は高次構造が解け、および、陰イオン性界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で覆われ、ポリペプチド鎖の長さに正比例する高純負電荷を帯びる。ポリアクリルアミドゲルマトリックスに負荷され、電場に置かれると、前記の負に荷電したタンパク質分子は陽極へと移動し、分子ふるい作用によって、すなわち、その分子量によって分離される。ポリアクリルアミドゲルはより大きな分子がより小さい分子と同じ速度で移動することを妨げる。電荷対質量の比はＳＤＳで変性されたポリペプチドの間でほぼ同じであるので、タンパク質の最終的な分離はほぼ全くポリペプチドの相対的な分子量の差に依存する。均一な密度のゲルでは、タンパク質の相対移動距離（Ｒｆ）はその質量の対数に対して負に比例する。質量既知のタンパク質が質量未知のタンパク質と同時に泳動されるとき、Ｒｆと質量の間の関係がグラフにプロットされることができ、未知のタンパク質の質量が推定される。電気泳動により分離されたタンパク質のバンドは銀染色により可視化される。出現した標準物質、基準物質（対照試料）、および、分析試料を判断して質量の評価が視覚的に行われる。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）はサイズに基づくタンパク質の分離に関係する。この方法は還元的条件で行われるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥについて説明する。変性条件、および、還元条件で前記試料を加熱することでタンパク質は高次構造が解け、および、陰イオン性界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で覆われ、ポリペプチド鎖の長さに正比例する高純負電荷を帯びる。ポリアクリルアミドゲルマトリックスに負荷され、電場に置かれると、前記の負に荷電したタンパク質分子は陽極へと移動し、分子ふるい作用によって、すなわち、その分子量によって分離される。ポリアクリルアミドゲルはより大きな分子がより小さい分子と同じ速度で移動することを妨げる。電荷対質量の比はＳＤＳで変性されたポリペプチドの間でほぼ同じであるので、タンパク質の最終的な分離はほぼ全くポリペプチドの相対的な分子量の差に依存する。均一な密度のゲルでは、タンパク質の相対移動距離（Ｒｆ）はその質量の対数に対して負に比例する。質量既知のタンパク質が質量未知のタンパク質と同時に泳動されるとき、Ｒｆと質量の間の関係がグラフにプロットされることができ、未知のタンパク質の質量が推定される。電気泳動により分離されたタンパク質のバンドは銀染色により可視化される。出現した標準物質、基準物質（対照試料）、および、分析試料を判断して質量の評価が視覚的に行われる。
＜血漿由来第ＩＸ因子＞
これらの実験で用いられる物質は市販の製品であるナノティブ（登録商標）に起源を持ち、ナノティブは溶媒／界面活性剤法で処理され、ナノフィルターで濾過された高純度の第ＩＸ因子濃縮物である。
これらの実験で用いられる物質は市販の製品であるナノティブ（登録商標）に起源を持ち、ナノティブは溶媒／界面活性剤法で処理され、ナノフィルターで濾過された高純度の第ＩＸ因子濃縮物である。
＜組換え第ＩＸ因子＞
ＦＩＸ含有細胞懸濁液の製造
細胞
使用された細胞株は無血清成長に順化したヒト胚性腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）株由来物である。この宿主であるＨＥＫ２９３ＦはヒトＦＩＸとヒトのフーリン（ＰＡＣＥ）のｃＤＮＡコーディング配列を持つ発現カセットで安定的に形質移入された。同じ強力なプロモーターが両方のカセットに用いられた。一般的な方法はまた、欧州特許出願公開公報第１ ７３９ １７９号（ＥＰ−Ａ−１ ７３９ １７９）（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら）に記載される。
ＦＩＸ含有細胞懸濁液の製造
細胞
使用された細胞株は無血清成長に順化したヒト胚性腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）株由来物である。この宿主であるＨＥＫ２９３ＦはヒトＦＩＸとヒトのフーリン（ＰＡＣＥ）のｃＤＮＡコーディング配列を持つ発現カセットで安定的に形質移入された。同じ強力なプロモーターが両方のカセットに用いられた。一般的な方法はまた、欧州特許出願公開公報第１ ７３９ １７９号（ＥＰ−Ａ−１ ７３９ １７９）（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら）に記載される。
培養方法
前記細胞は無血清培地中で一般設備を用い、当該技術分野で周知の一般的な方法に従って培養された。例えば、Ｔ型フラスコ、振盪用フラスコ、および、バイオリアクター（使い捨てのシステムおよび従来の撹拌タンク）内での振盪培養、または、撹拌培養で回分培養、半回分培養、灌流培養、または、連続ケモスタット培養として実行される（フレシュニー，ＲＩ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＲＩ）著（２０００年）動物細胞の培養：基礎技術の手引き 第４版、ワイリー‐リス社（Freshney, R I (2000), Culture of animal cells: a manual of basic technique, 4th ed, Wiley- Liss）；シュパイアー，ＲＥ（Ｓｐｉｅｒ，ＲＥ）編（２０００年）細胞工学百科事典、ワイリー社、ニューヨーク（Spier, R E ed (2000), Encyclopedia of cell technology, Wiley, New York）；エンフォース，Ｓ−Ｏ（Ｅｎｆｏｒｓ，Ｓ−Ｏ）およびヘッグストレーム，Ｌ（Ｈaｇｇｓｔｒoｍ，Ｌ）著（２０００年）バイオプロセス技術：原理と応用、大学出版会（Ｈoｇｓｋｏｌｅｔｒｙｃｋｅｒｉｅｔ），王立工科大学，ストックホルム（Enfors, S-O and Haggstrom, L (2000), Bioprocess technology: fundamentals and applications, Hogskoletryckeriet, Royal Institute of Technology, Stockholm）；ビンチ，ＶＡ（Ｖｉｎｃｉ，ＶＡ）およびパレク，ＳＲ（Ｐａｒｅｋｈ，ＳＲ）（２００３年），工業細胞培養ハンドブック：哺乳類細胞、微生物細胞、および、植物細胞、ヒューマナプレス社、米国（Vinci, V A and Parekh, S R (2003), Handbook of industrial cell culture: mammalian, microbial, and plant cells, Humana Press, USA））。典型的には、標準的な回分培養の水準を超えて細胞数と産物の力価（ｔｉｔｅｒ）を増加させるために培地の灌流が用いられた。産物収量と宿主細胞タンパク質の量は培養モードに応じて異なる：
・産物の力価は典型的には細胞数と共に増加するであろう。
・総タンパク質量と総ＤＮＡ量は典型的には細胞数と共に増加するであろう。
・総タンパク質量と総ＤＮＡ量はまた培養物の持続時間と共に増加することができる。
・回分培養はタンパク質とＤＮＡを蓄積する。何も外部から加えられないし、何も取り除かれない。
・灌流方法では代謝物、タンパク質、ＤＮＡ、および、その他の不純物から細胞培養物が洗い落される。フィルターと細胞遠心分離機が細胞の保持のために典型的に使用された。
前記細胞は無血清培地中で一般設備を用い、当該技術分野で周知の一般的な方法に従って培養された。例えば、Ｔ型フラスコ、振盪用フラスコ、および、バイオリアクター（使い捨てのシステムおよび従来の撹拌タンク）内での振盪培養、または、撹拌培養で回分培養、半回分培養、灌流培養、または、連続ケモスタット培養として実行される（フレシュニー，ＲＩ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＲＩ）著（２０００年）動物細胞の培養：基礎技術の手引き 第４版、ワイリー‐リス社（Freshney, R I (2000), Culture of animal cells: a manual of basic technique, 4th ed, Wiley- Liss）；シュパイアー，ＲＥ（Ｓｐｉｅｒ，ＲＥ）編（２０００年）細胞工学百科事典、ワイリー社、ニューヨーク（Spier, R E ed (2000), Encyclopedia of cell technology, Wiley, New York）；エンフォース，Ｓ−Ｏ（Ｅｎｆｏｒｓ，Ｓ−Ｏ）およびヘッグストレーム，Ｌ（Ｈaｇｇｓｔｒoｍ，Ｌ）著（２０００年）バイオプロセス技術：原理と応用、大学出版会（Ｈoｇｓｋｏｌｅｔｒｙｃｋｅｒｉｅｔ），王立工科大学，ストックホルム（Enfors, S-O and Haggstrom, L (2000), Bioprocess technology: fundamentals and applications, Hogskoletryckeriet, Royal Institute of Technology, Stockholm）；ビンチ，ＶＡ（Ｖｉｎｃｉ，ＶＡ）およびパレク，ＳＲ（Ｐａｒｅｋｈ，ＳＲ）（２００３年），工業細胞培養ハンドブック：哺乳類細胞、微生物細胞、および、植物細胞、ヒューマナプレス社、米国（Vinci, V A and Parekh, S R (2003), Handbook of industrial cell culture: mammalian, microbial, and plant cells, Humana Press, USA））。典型的には、標準的な回分培養の水準を超えて細胞数と産物の力価（ｔｉｔｅｒ）を増加させるために培地の灌流が用いられた。産物収量と宿主細胞タンパク質の量は培養モードに応じて異なる：
・産物の力価は典型的には細胞数と共に増加するであろう。
・総タンパク質量と総ＤＮＡ量は典型的には細胞数と共に増加するであろう。
・総タンパク質量と総ＤＮＡ量はまた培養物の持続時間と共に増加することができる。
・回分培養はタンパク質とＤＮＡを蓄積する。何も外部から加えられないし、何も取り除かれない。
・灌流方法では代謝物、タンパク質、ＤＮＡ、および、その他の不純物から細胞培養物が洗い落される。フィルターと細胞遠心分離機が細胞の保持のために典型的に使用された。
前記組換え産物は前記細胞から放出され、前記細胞の懸濁液、または、その細胞懸濁液の上清が回収される。回収物の特性（上述の産物の力価と不純物）は使用される培養モードに応じて異なる。
前記細胞懸濁液は以下に記述されるＦＩＸの実施例のいくつかで使用されてきた。
＜カプトＭＭＣ樹脂を捕捉工程として用いるＦＩＸの精製＞
実施例１
出発物質
血漿由来ＦＩＸ（ｐｄＦＩＸ、ナノティブ（登録商標））が使用された。カプトＭＭＣカラムに負荷される前に、凍結乾燥されたナノティブが平衡化緩衝液に溶解され、希釈された。
実施例１
出発物質
血漿由来ＦＩＸ（ｐｄＦＩＸ、ナノティブ（登録商標））が使用された。カプトＭＭＣカラムに負荷される前に、凍結乾燥されたナノティブが平衡化緩衝液に溶解され、希釈された。
クロマトグラフィー樹脂及びカラム
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。トリコーン５／１５０カラムに１５．７ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は３．１ｍｌであった。
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。トリコーン５／１５０カラムに１５．７ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は３．１ｍｌであった。
緩衝液
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
低塩濃度洗浄緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
高塩濃度洗浄緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩（ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
低塩濃度洗浄緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
高塩濃度洗浄緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩（ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
実験構成
カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて１ｍｌ／分の流速で出発物質の負荷が行われた。これらの緩衝液条件の間にｐｄＦＩＸはカプトＭＭＣ樹脂に結合した。表１に示されるように、通過画分（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）にｐｄＦＩＸは検出されなかった。その後、前記樹脂は表１に記載される様々な洗浄条件で洗浄され、試験された洗浄緩衝液のいずれにもｐｄＦＩＸは検出されなかった。前記緩衝液に０．５Ｍのアルギニンを添加することによりＦＩＸが樹脂より溶出され、８５％の収率が得られた。
カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて１ｍｌ／分の流速で出発物質の負荷が行われた。これらの緩衝液条件の間にｐｄＦＩＸはカプトＭＭＣ樹脂に結合した。表１に示されるように、通過画分（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）にｐｄＦＩＸは検出されなかった。その後、前記樹脂は表１に記載される様々な洗浄条件で洗浄され、試験された洗浄緩衝液のいずれにもｐｄＦＩＸは検出されなかった。前記緩衝液に０．５Ｍのアルギニンを添加することによりＦＩＸが樹脂より溶出され、８５％の収率が得られた。
結論
血漿由来ＦＩＸ（ｐｄＦＩＸ、ナノティブ）はｐＨ７でカプトＭＭＣに結合し、および、少なくとも０．７Ｍの塩化ナトリウムで前記樹脂から溶出されることなく洗浄されることができる。
血漿由来ＦＩＸ（ｐｄＦＩＸ、ナノティブ）はｐＨ７でカプトＭＭＣに結合し、および、少なくとも０．７Ｍの塩化ナトリウムで前記樹脂から溶出されることなく洗浄されることができる。
前記緩衝液に０．５Ｍのアルギニン塩酸塩を添加することでｐｄＦＩＸが前記カラムから溶出する。
実施例２
出発物質
組換えヒトＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）はＨＥＫ２９３細胞で産生した。細胞が取り除かれ、その無細胞上清が出発物質としてカプトＭＭＣカラムに負荷された。
出発物質
組換えヒトＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）はＨＥＫ２９３細胞で産生した。細胞が取り除かれ、その無細胞上清が出発物質としてカプトＭＭＣカラムに負荷された。
クロマトグラフィー樹脂及びカラム
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。ＸＫ２６カラムに１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は８０ｍｌであった。
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。ＸＫ２６カラムに１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は８０ｍｌであった。
緩衝液
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
高塩濃度洗浄緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
高塩濃度洗浄緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
実験構成
カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて２６ｍｌ／分の流速で出発物質の負荷が行われた。これらの緩衝液条件の間にｒｈＦＩＸはカプトＭＭＣ樹脂に結合した。表２に示されるように、通過画分にｒｈＦＩＸは検出されなかった。高塩濃度洗浄液ではｒｈＦＩＸは前記カラムから溶出しなかった。緩衝液に０．５Ｍのアルギニンを添加することによりｒｈＦＩＸが前記樹脂より溶出され、９２％の収率が得られた。
カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて２６ｍｌ／分の流速で出発物質の負荷が行われた。これらの緩衝液条件の間にｒｈＦＩＸはカプトＭＭＣ樹脂に結合した。表２に示されるように、通過画分にｒｈＦＩＸは検出されなかった。高塩濃度洗浄液ではｒｈＦＩＸは前記カラムから溶出しなかった。緩衝液に０．５Ｍのアルギニンを添加することによりｒｈＦＩＸが前記樹脂より溶出され、９２％の収率が得られた。
結論
組換えＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）はｐＨ７でカプトＭＭＣに結合し、および、少なくとも０．７Ｍの塩化ナトリウムで前記樹脂から溶出されることなく洗浄されることができる。
組換えＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）はｐＨ７でカプトＭＭＣに結合し、および、少なくとも０．７Ｍの塩化ナトリウムで前記樹脂から溶出されることなく洗浄されることができる。
前記緩衝液に０．５Ｍのアルギニン塩酸塩を添加することでｒｈＦＩＸが前記カラムから溶出する。
使用された緩衝液は０．０２％ポリソルベート８０（非イオン性界面活性剤）を含み、それは悪影響も生じなかった。おそらく、前記緩衝液にポリソルベート８０を使用したことは利点があった。使用された緩衝液にポリソルベート８０が加えられなかった以下の実験（実施例３）で得られた結果と比較すること。
実施例３
出発物質
組換えヒトＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）はＨＥＫ２９３細胞で生産された。細胞が取り除かれ、その無細胞上清が出発物質としてカプトＭＭＣカラムに負荷された。
出発物質
組換えヒトＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）はＨＥＫ２９３細胞で生産された。細胞が取り除かれ、その無細胞上清が出発物質としてカプトＭＭＣカラムに負荷された。
クロマトグラフィー樹脂及びカラム
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。ＸＫ２６カラムに１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は８０ｍｌであった。
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。ＸＫ２６カラムに１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は８０ｍｌであった。
緩衝液
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０
高塩濃度洗浄緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．８Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ６．５
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０
高塩濃度洗浄緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．８Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ６．５
実験構成と結果
カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて２６ｍｌ／分の流速で出発物質の負荷が行われた。これらの緩衝液条件の間にｒｈＦＩＸはカプトＭＭＣ樹脂に結合した。表３に示されるように、カラムに負荷されたｒｈＦＩＸのうちの低量が通過画分に検出された。その後、前記樹脂はかなり高い濃度である０．７Ｍの塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄された。表３に記載されるように、この洗浄では１％未満のｒｈＦＩＸが検出された。前記緩衝液に０．８Ｍのアルギニンを添加することによりｒｈＦＩＸが前記樹脂より溶出され、８４％の収率が得られた。この実験で使用された緩衝液は、実験２および実験５と比較して、少しもポリソルベート８０を含まなかった。
カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて２６ｍｌ／分の流速で出発物質の負荷が行われた。これらの緩衝液条件の間にｒｈＦＩＸはカプトＭＭＣ樹脂に結合した。表３に示されるように、カラムに負荷されたｒｈＦＩＸのうちの低量が通過画分に検出された。その後、前記樹脂はかなり高い濃度である０．７Ｍの塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄された。表３に記載されるように、この洗浄では１％未満のｒｈＦＩＸが検出された。前記緩衝液に０．８Ｍのアルギニンを添加することによりｒｈＦＩＸが前記樹脂より溶出され、８４％の収率が得られた。この実験で使用された緩衝液は、実験２および実験５と比較して、少しもポリソルベート８０を含まなかった。
結論
組換えＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）はｐＨ７でカプトＭＭＣに結合し、および、少なくとも０．７Ｍの塩化ナトリウムで前記樹脂から溶出することなく洗浄されることができる。
組換えＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）はｐＨ７でカプトＭＭＣに結合し、および、少なくとも０．７Ｍの塩化ナトリウムで前記樹脂から溶出することなく洗浄されることができる。
前記緩衝液に０．８Ｍのアルギニン塩酸塩を添加することでｒｈＦＩＸが前記カラムから溶出する。
界面活性剤は前記緩衝液に添加されなかった。そのことで、前記溶出画分でのｒｈＦＩＸの回収率がやや少ないことが示されている可能性がある。
実施例４（実施例４Ａ及び実施例４Ｂ）
出発物質
血漿由来ＦＩＸ（ｐｄＦＩＸ、ナノティブ（登録商標））が使用された。カプトＭＭＣカラムに負荷される前に、凍結乾燥されたナノティブが平衡化緩衝液に溶解され、希釈された。
出発物質
血漿由来ＦＩＸ（ｐｄＦＩＸ、ナノティブ（登録商標））が使用された。カプトＭＭＣカラムに負荷される前に、凍結乾燥されたナノティブが平衡化緩衝液に溶解され、希釈された。
クロマトグラフィー樹脂及びカラム
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。トリコーン５／１５０カラムに１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は３ｍｌであった。
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。トリコーン５／１５０カラムに１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は３ｍｌであった。
緩衝液
実施例４Ａの実験には、
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ７．０
実施例４Ｂの実験には、
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実施例４Ａの実験には、
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ７．０
実施例４Ｂの実験には、
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験構成
ｐＨ７．０でポリソルベート８０を含む緩衝液、または、含まない緩衝液を用いるカプトＭＭＣでのｐｄＦＩＸの精製の比較。カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて１ｍｌ／分の流速で出発物質の負荷が行われた。これらの緩衝液条件の間にｐｄＦＩＸはカプトＭＭＣ樹脂に結合した。表４に示されるように、通過画分と平衡化洗浄画分にｐｄＦＩＸは検出されなかった。
ｐＨ７．０でポリソルベート８０を含む緩衝液、または、含まない緩衝液を用いるカプトＭＭＣでのｐｄＦＩＸの精製の比較。カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて１ｍｌ／分の流速で出発物質の負荷が行われた。これらの緩衝液条件の間にｐｄＦＩＸはカプトＭＭＣ樹脂に結合した。表４に示されるように、通過画分と平衡化洗浄画分にｐｄＦＩＸは検出されなかった。
結論
緩衝液中にポリソルベート８０が無いときと比べて、ポリソルベート８０が緩衝液に含まれるとき、血漿由来のＦＩＸが５％増加して溶出した。その差異は小さいが、その結果はポリソルベート８０を緩衝液に用いることの利点を示す。ｐｄＦＩＸの収率は両方の実験で高かった。このことはまた、使用された緩衝液の７．０のｐＨによってｐｄＦＩＸの結合とカプトＭＭＣ樹脂からのｐｄＦＩＸの溶出の両方に関して良いデータが得られたことを示す。
緩衝液中にポリソルベート８０が無いときと比べて、ポリソルベート８０が緩衝液に含まれるとき、血漿由来のＦＩＸが５％増加して溶出した。その差異は小さいが、その結果はポリソルベート８０を緩衝液に用いることの利点を示す。ｐｄＦＩＸの収率は両方の実験で高かった。このことはまた、使用された緩衝液の７．０のｐＨによってｐｄＦＩＸの結合とカプトＭＭＣ樹脂からのｐｄＦＩＸの溶出の両方に関して良いデータが得られたことを示す。
実施例５（実施例５Ａ及び実施例５Ｂ）
出発物質
血漿由来ＦＩＸ（ナノティブ）が使用された。カプトＭＭＣカラムに負荷される前に、凍結乾燥されたナノティブが平衡化緩衝液に溶解され、希釈された。
出発物質
血漿由来ＦＩＸ（ナノティブ）が使用された。カプトＭＭＣカラムに負荷される前に、凍結乾燥されたナノティブが平衡化緩衝液に溶解され、希釈された。
クロマトグラフィー樹脂及びカラム
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。トリコーン５／１５０カラムに１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は３ｍｌであった。
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。トリコーン５／１５０カラムに１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は３ｍｌであった。
緩衝液
実施例５Ａの実験には、
平衡化緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０
溶出緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ８．０
実施例５Ｂの実験のためには、
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ６．０
実施例５Ａの実験には、
平衡化緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０
溶出緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ８．０
実施例５Ｂの実験のためには、
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ６．０
実験構成
結合緩衝液及び溶出緩衝液の両方で、２つの異なるｐＨであるｐＨ８．０とｐＨ６．０の緩衝液を用いるカプトＭＭＣカラムでのｐｄＦＩＸの精製の比較。カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて１ｍｌ／分の流速で出発物質の負荷が行われた。これらの緩衝液条件の間にｐｄＦＩＸは前記カプトＭＭＣ樹脂に結合した。表５に示されるように、通過画分にｐｄＦＩＸは検出されなかった。ｐｄＦＩＸの収率は試験された両方のｐＨの溶出画分で等しく高かった。
結合緩衝液及び溶出緩衝液の両方で、２つの異なるｐＨであるｐＨ８．０とｐＨ６．０の緩衝液を用いるカプトＭＭＣカラムでのｐｄＦＩＸの精製の比較。カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて１ｍｌ／分の流速で出発物質の負荷が行われた。これらの緩衝液条件の間にｐｄＦＩＸは前記カプトＭＭＣ樹脂に結合した。表５に示されるように、通過画分にｐｄＦＩＸは検出されなかった。ｐｄＦＩＸの収率は試験された両方のｐＨの溶出画分で等しく高かった。
結論
血漿由来のＦＩＸはｐＨ８．０とｐＨ６．０の緩衝液中でカプトＭＭＣ樹脂に結合すること、および、これらの両方のｐＨはまた溶出緩衝液でも用いられ得ることがこれらの実験により示される。
血漿由来のＦＩＸはｐＨ８．０とｐＨ６．０の緩衝液中でカプトＭＭＣ樹脂に結合すること、および、これらの両方のｐＨはまた溶出緩衝液でも用いられ得ることがこれらの実験により示される。
実施例６（実施例６Ａ〜６Ｋ）
目的
これらの実験は３つの異なるｐＨであるｐＨ６．０、ｐＨ７．０、および、ｐＨ８．０における組換えヒトＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）のカプトＭＭＣ樹脂での捕捉と溶出を検討することを目的とした。また、ｒｈＦＩＸの結合と溶出で使用されたこれらの緩衝液の中に存在する０．０２％ポリソルベート８０の利点も検討された。
目的
これらの実験は３つの異なるｐＨであるｐＨ６．０、ｐＨ７．０、および、ｐＨ８．０における組換えヒトＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）のカプトＭＭＣ樹脂での捕捉と溶出を検討することを目的とした。また、ｒｈＦＩＸの結合と溶出で使用されたこれらの緩衝液の中に存在する０．０２％ポリソルベート８０の利点も検討された。
出発物質
組換えヒトＦＩＸはＨＥＫ２９３細胞で生産された。細胞が取り除かれ、その無細胞上清が出発物質としてカプトＭＭＣカラムに負荷された。
組換えヒトＦＩＸはＨＥＫ２９３細胞で生産された。細胞が取り除かれ、その無細胞上清が出発物質としてカプトＭＭＣカラムに負荷された。
クロマトグラフィー樹脂及びカラム
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。ＸＫ１６カラムに１３．５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は２７ｍｌであった。
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。ＸＫ１６カラムに１３．５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は２７ｍｌであった。
緩衝液
実施例６Ａ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ７．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
＊ＷＦＩ：注射用水
実施例６Ｂ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ６．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実施例６Ｃ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ８．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実施例６Ｄ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実施例６Ｅ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実施例６Ｆ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ８．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実施例６Ａ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ７．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
＊ＷＦＩ：注射用水
実施例６Ｂ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ６．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実施例６Ｃ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ８．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実施例６Ｄ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実施例６Ｅ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実施例６Ｆ
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ８．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実験構成及び結果
カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて９ｍｌ／分の流速で前記出発物質の負荷が行われた。カラムは、それから、平衡化緩衝液で洗浄され、引き続いて前記カプトＭＭＣカラムから結合したｒｈＦＩＸが溶出された。結果は表６に示される。
カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて９ｍｌ／分の流速で前記出発物質の負荷が行われた。カラムは、それから、平衡化緩衝液で洗浄され、引き続いて前記カプトＭＭＣカラムから結合したｒｈＦＩＸが溶出された。結果は表６に示される。
ｒｈＦＩＸはｐＨ６、ｐＨ７、および、ｐＨ８でカプトＭＭＣに結合することが表６に示されるデータより明らかにされる。通過画分にｒｈＦＩＸは検出されなかった。結合したｒｈＦＩＸはまたこれらのｐＨでカプトＭＭＣ樹脂から７５％超の回収率で溶出することができる。ｐＨ７の溶出緩衝液で最も良い回収率が得られた。前記平衡化緩衝液と溶出緩衝液の中へのポリソルベート８０の添加により、ｐＨ７またはｐＨ６が用いられたとき、回収率が少なくとも５％増加することになった。ｐＨ８の緩衝液が用いられたとき、ポリソルベート８０について利点は得られなかった。
これらのデータと実験５で得られたデータから、カプトＭＭＣ樹脂でのｒｈＦＩＸとｐｄＦＩＸの回収についてポリソルベート８０の好作用が示される。
結論
組換えヒトＦＩＸは少なくとも６〜８の範囲のｐＨでカプトＭＭＣに結合することができる。試験に用いられた３つのｐＨのいずれであるかに関係なく、０．５Ｍのアルギニン塩酸塩を加えることにより、ｒｈＦＩＸ分子は前記カプトＭＭＣ樹脂から溶出する。
組換えヒトＦＩＸは少なくとも６〜８の範囲のｐＨでカプトＭＭＣに結合することができる。試験に用いられた３つのｐＨのいずれであるかに関係なく、０．５Ｍのアルギニン塩酸塩を加えることにより、ｒｈＦＩＸ分子は前記カプトＭＭＣ樹脂から溶出する。
しかし、得られた結果は、ｒｈＦＩＸの収率がｐＨ７でより大きくなることを示す。
ｐＨ７またはｐＨ６が用いられるとき、界面活性剤であるポリソルベート８０の添加によりｒｈＦＩＸの回収率の上昇することが示される。
実施例７
目的
この研究は培地から純粋な産物にまで組換えヒトＦＩＸを精製することを目的とした。これには捕捉工程、親和性工程、ならびに、濃縮および緩衝液交換工程の３つの工程が含まれた。カプトＭＭＣ樹脂が捕捉工程で用いられ、非動物由来ＦＩＸ親和性リガンドの工程が主要な精製工程として用いられた。最終工程として、１０ｋＤａの分子量カットオフの限外濾過システムが用いられ、まず、分子が濃縮され、それから、緩衝液が生理的緩衝環境へと交換された。
目的
この研究は培地から純粋な産物にまで組換えヒトＦＩＸを精製することを目的とした。これには捕捉工程、親和性工程、ならびに、濃縮および緩衝液交換工程の３つの工程が含まれた。カプトＭＭＣ樹脂が捕捉工程で用いられ、非動物由来ＦＩＸ親和性リガンドの工程が主要な精製工程として用いられた。最終工程として、１０ｋＤａの分子量カットオフの限外濾過システムが用いられ、まず、分子が濃縮され、それから、緩衝液が生理的緩衝環境へと交換された。
捕捉工程のための出発物質
組換えヒトＦＩＸはＨＥＫ２９３細胞で生産された。細胞が取り除かれ、その無細胞上清が出発物質としてカプトＭＭＣカラムに負荷された。
組換えヒトＦＩＸはＨＥＫ２９３細胞で生産された。細胞が取り除かれ、その無細胞上清が出発物質としてカプトＭＭＣカラムに負荷された。
捕捉工程（実施例７Ａ〜Ｃ）
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。ＸＫ５０カラムに１６．５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は３２４ｍｌであった。
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ７．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
ＧＥヘルスケアの混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）がＦＩＸ分子の捕捉工程として用いられた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用、ならびに、水素結合を有する弱陽イオン性樹脂である。ＸＫ５０カラムに１６．５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂が充填された。カラム容積（ＣＶ）は３２４ｍｌであった。
平衡化緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
溶出緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン塩酸塩、ｐＨ７．０
ＣＩＰ １％トライトンＸ−１００／０．５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ水酸化ナトリウム、ＷＦＩ、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実験構成及び結果
カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて７５ｍｌ／分の流速で前記出発物質の負荷が行われた。そして、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、引き続いて前記カプトＭＭＣカラムから結合したｒｈＦＩＸが溶出された。結果は表７に示される。ｒｈＦＩＸの精製は同じ実験構成と同じタイプの緩衝液を用いて３回別々に実行された。これらの捕捉精製はｐＨ７．０で実行された。
カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて７５ｍｌ／分の流速で前記出発物質の負荷が行われた。そして、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、引き続いて前記カプトＭＭＣカラムから結合したｒｈＦＩＸが溶出された。結果は表７に示される。ｒｈＦＩＸの精製は同じ実験構成と同じタイプの緩衝液を用いて３回別々に実行された。これらの捕捉精製はｐＨ７．０で実行された。
表７に示されるデータにより、ｒｈＦＩＸはカプトＭＭＣにｐＨ７で結合するか、または通過画分にｒｈＦＩＸは全く、または、ほとんど検出されなかったことが示される。アルギニン塩酸を０．５Ｍの最終濃度まで加えることで、結合したｒｈＦＩＸを、ｐＨ７．０で前記カプトＭＭＣ樹脂から溶出することができた。ｒｈＦＩＸのこれら３回の捕捉での平均回収率は９２％であった。
ＦＩＸ親和性工程（実施例７Ｄ〜Ｅ）
親和性工程として、（ＢＡＣ ＢＶ、バイオアフィニティー社（ＢＡＣ ＢＶ， Ｔｈｅ Ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）との共同作業で開発された）酵母で生産された非動物由来ＦＩＸ親和性リガンド（Ｆａｂ断片）が使用された。標準的なカップリング技術に従いこのリガンドをカプトＭＰ樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合した。この樹脂は「ＦＩＸ親和性樹脂」と称される。
親和性工程として、（ＢＡＣ ＢＶ、バイオアフィニティー社（ＢＡＣ ＢＶ， Ｔｈｅ Ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）との共同作業で開発された）酵母で生産された非動物由来ＦＩＸ親和性リガンド（Ｆａｂ断片）が使用された。標準的なカップリング技術に従いこのリガンドをカプトＭＰ樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合した。この樹脂は「ＦＩＸ親和性樹脂」と称される。
ＸＫ２６カラムに７．５ｃｍのベッド高まで前記ＦＩＸ親和性樹脂が充填された。カラム容量（ＣＶ）は４０ｍｌであった。
平衡化緩衝液 ０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
洗浄緩衝液 ０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
溶出緩衝液 ２Ｍ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．４
ＣＩＰ ０．１Ｍ酢酸、２Ｍ塩化ナトリウム、および、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
平衡化緩衝液 ０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
洗浄緩衝液 ０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
溶出緩衝液 ２Ｍ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．４
ＣＩＰ ０．１Ｍ酢酸、２Ｍ塩化ナトリウム、および、２０％エタノール
保存緩衝液 ２０％エタノール
実験構成及び結果
前記の３つの捕捉工程からの溶出液が混合され、親和性カラムでの出発物質として用いられた。カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて１０ｍｌ／分の流速で前記出発物質の負荷が行われた。そして、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、引き続いて親和性カラムから結合したｒｈＦＩＸが溶出された。結果は表８に示される。ｒｈＦＩＸの精製は同じ実験構成と同じタイプの緩衝液を用いて２回別々に実行された。
前記の３つの捕捉工程からの溶出液が混合され、親和性カラムでの出発物質として用いられた。カラムを平衡化緩衝液で平衡化し、引き続いて１０ｍｌ／分の流速で前記出発物質の負荷が行われた。そして、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、引き続いて親和性カラムから結合したｒｈＦＩＸが溶出された。結果は表８に示される。ｒｈＦＩＸの精製は同じ実験構成と同じタイプの緩衝液を用いて２回別々に実行された。
表８に示されるデータにより、ｒｈＦＩＸはｐＨ７でＦＩＸ親和性樹脂に結合することが示される。得られた通過画分は使用された量の樹脂の結合能の結果である。両方の実験で用いられた約１００％のｒｈＦＩＸが検出可能である。２Ｍ塩化マグネシウムを含む緩衝液を用いてＦＩＸ親和性樹脂から結合したｒｈＦＩＸを溶出することができた。
濃縮および緩衝液交換工程（実施例７Ｆ）
限外濾過システムを用いることで、前記親和性カラムからの溶出液中のｒｈＦＩＸが濃縮され、それから、同じ限外濾過フィルターを用いる透析濾過により前記緩衝液が交換された。
限外濾過システムを用いることで、前記親和性カラムからの溶出液中のｒｈＦＩＸが濃縮され、それから、同じ限外濾過フィルターを用いる透析濾過により前記緩衝液が交換された。
限外濾過フィルター
ペリコン２システムに設置された１０ｋＤａの分子量カットオフの特性を有するペリコン３フィルターが用いられた。
透析濾過緩衝液 ０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２５℃での電気伝導率 １８．４ｍＳ／ｃｍ
ペリコン２システムに設置された１０ｋＤａの分子量カットオフの特性を有するペリコン３フィルターが用いられた。
透析濾過緩衝液 ０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２５℃での電気伝導率 １８．４ｍＳ／ｃｍ
実験構成及び結果
ポンプで前記試料を接線流の方向（ｔａｎｇｅｎｉｔａｌ ｆｌｏｗ）に注入し、試料の体積の小部分が連続的にペリコン３フィルターを通り抜けることができるようにすることで、体積が減少した。前記フィルターに使用される孔径のため、ｒｈＦＩＸ分子は再循環画分に含まれる。ｒｈＦＩＸの分子量は約５５ｋＤａであり、１０ｋＤａの孔径のフィルターが使用されると保持される。
ポンプで前記試料を接線流の方向（ｔａｎｇｅｎｉｔａｌ ｆｌｏｗ）に注入し、試料の体積の小部分が連続的にペリコン３フィルターを通り抜けることができるようにすることで、体積が減少した。前記フィルターに使用される孔径のため、ｒｈＦＩＸ分子は再循環画分に含まれる。ｒｈＦＩＸの分子量は約５５ｋＤａであり、１０ｋＤａの孔径のフィルターが使用されると保持される。
３１０ｍｌの体積の親和性溶出液が約６０ｍｌにまで濃縮された。この体積の溶出液は、ペリコン３フィルターを通して濾過されるのと同じ速度で透析濾過緩衝液を連続的に加えることにより透析濾過された。この６０ｍｌの濃縮物中の緩衝液は約１８回交換された。この濃縮物の電気伝導率は２５℃で１２３ｍＳ／ｃｍから１８．６ｍＳ／ｃｍまでに変化した。
この濃縮および緩衝液交換工程によるｒｈＦＩＸの回収率は８６％であった。透析緩衝液での限外濾過フィルターの洗浄工程はできるだけ多くのｒｈＦＩＸを回収するために行われた。
Claims (16)
- クロマトグラフィーを用いる一連の精製においてプリオンを含まないビタミンＫ依存性タンパク質を製造する方法であって、
少なくとも１つのクロマトグラフィー工程がマルチモーダル樹脂を用いて行われ、
ビタミンＫ依存性タンパク質を水性溶液に含む画分を提供すること、
前記ビタミンＫ依存性タンパク質を含む前記画分を６〜９のｐＨでマルチモーダル樹脂と接触させること、
前記ビタミンＫ依存性タンパク質を溶出する前に夾雑物を洗い流し、かつ、前記ビタミンＫ依存性タンパク質を保持するために、所望により、前記ビタミンＫ依存性タンパク質を吸着させた前記マルチモーダル樹脂を水性洗浄緩衝液で洗浄すること、
前記ビタミンＫ依存性タンパク質が、アルギニンを含む緩衝液において６から９のｐＨで前記マルチモーダル樹脂から溶出していること、ならびに、
所望により、精製された、または、濃縮された状態のビタミンＫ依存性タンパク質含有画分を回収すること、
を特徴とする、方法。 - 前記ビタミンＫ依存性タンパク質が血漿由来ＦＩＸまたは組換え技術で製造されたＦＩＸである、請求項１に記載の方法。
- 前記マルチモーダル樹脂がマトリックスに結合した部分を含み、前記部分がイオン性相互作用、ならびに、水素結合、疎水性相互作用、および、イオウ親和性相互作用などのその他のタイプの相互作用によって水性環境中で前記ビタミンＫ依存性タンパク質と相互作用可能である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記水溶液が２５℃で約５から約２００ｍＳ／ｃｍまでの電気伝導率に相当する塩溶液、および／または、２５℃で約５から約２００ｍＳ／ｃｍまでの電気伝導率に相当する前記溶出緩衝液に前記ビタミンＫ依存性タンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- ０．１〜０．３Ｍ、および、０．７〜１Ｍ、特に、０．３〜０．７Ｍの濃度でアルギニンが存在することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 約６から約９のｐＨ、特にｐＨ約６から約８、または、ｐＨ７の緩衝液で前記ビタミンＫ依存性タンパク質を溶出することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- アルコールなどの少なくとも１つのヒドロキシル基を含む有機化合物、アミノ酸などの少なくとも１つのアミノ基を含む有機化合物、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化バリウム、硫酸バリウム、硫酸アンモニウムからなる群より選択される無機塩などの前記緩衝液のイオン強度を調整する少なくとも１つの化合物、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤、前記ｐＨを約６から約９までに、特にほぼ中性の値に調整する少なくとも１つの緩衝物質、または、その組合せからなる群より選択される物質を前記溶出緩衝液がさらに含むことを特徴とする、請求項１〜６のうちの少なくとも１項に記載の方法。
- 前記アルコールはメタノール、プロパノール、エチレングリコール、および、プロピレングリコールからなる群より選択され、前記無機塩は塩化カリウムと塩化ナトリウムからなる群より選択され、前記非イオン性界面活性剤はツイーン２０、ツイーン８０、および、プルロニックＦ６８からなる群より選択され、前記緩衝物質は６〜９のｐＨではクエン酸ナトリウム、ヒスチジン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス塩基、および、酢酸ナトリウム、ｐＨ６〜７．５の調整にはクエン酸ナトリウム、および、ｐＨ７．５〜９の調整にはトリス塩基からなる群より選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
- 前記ビタミンＫ依存性タンパク質を塩化ナトリウム／エチレングリコールの組合せ、アルギニン／塩化ナトリウムの組合せ、または、アルギニン／エチレングリコールの組合せで溶出する、請求項１〜８の少なくとも１項に記載の方法。
- 前記「マルチモーダル」クロマトグラフィー樹脂が、下記の部分、
ａ． 正に荷電するＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンリガンド、
ｂ． 負に荷電する２−（ベンゾイルアミノ）ブタン酸リガンド、
ｃ． フェニルプロピルリガンド、
ｄ． Ｎ−ヘキシルリガンド、
ｅ． ４−メルカプト−エチル−ピリジンリガンド、
ｆ． ３−（（３−メチル−５−（（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−アミノ）−フェニル）−アミノ）−安息香酸リガンド、
のうちの少なくとも１つ、または、これらの組合せを含むことを特徴とする、請求項１〜９のうちの少なくとも１項に記載の方法。 - 前記「マルチモーダル」クロマトグラフィー樹脂が、市販の樹脂であるＨＥＰハイパーセル（商標）、ＰＰＡハイパーセル（商標）、カプト・アドヒア（商標）、カプトＭＭＣ（商標）、ＭＥＰハイパーセル（商標）から選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルクロマトグラフィー工程が、ビタミンＫ依存性タンパク質親和性クロマトグラフィー工程と組み合わされ、前記親和性は酵母で発現されるタンパク質に基づくリガンドによってもたらされ、かつ、得られた溶出液の純度は９０％より高いことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記の一連の精製がさらに、化学作用に基づく不活化工程、限外濾過、クロマトグラフィー工程、または、それらの組合せを含み、除去される病原体に関する様々な生理的特性に基づく病原体除去／不活化工程を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記の一連の精製がさらに、下記の工程、
ｉ． カプトＭＭＣなどの陽イオンマルチモーダル樹脂、
ｉｉ． 脂質膜で覆われたウィルスを化学作用に基づき不活化する工程、特にトリ−ｎ−ブチルリン酸とトライトンＸ−１００を用いる溶媒／界面活性剤−不活化工程、
ｉｉｉ． 酵母で発現されるビタミンＫ依存性タンパク質の抗体断片からなるリガンドなどのタンパク質性リガンドに基づく親和性樹脂、
ｉｖ． プラノバ２０Ｎなどの約２０ｎｍの平均孔径のフィルターでの病原体濾過除去工程
ｖ． ＱセファロースＦＦまたはカプトＱなどの陰イオン交換体樹脂、
ｖｉ． １０ｋＤａの分子量カットオフの特性を有するペリコン３などの限外濾過工程
を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。 - 前記マルチモーダルクロマトグラフィー工程が親和性クロマトグラフィー工程と組み合わされ、前記親和性は酵母で発現されるタンパク質に基づくリガンドによってもたらされ、そして、その結果得られる前記親和性クロマトグラフィー樹脂からの産物の純度は９５％より高いことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
- サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および、固定化金属親和性クロマトグラフィーから選択される追加のクロマトグラフィー工程が実行されること、および、最終産物の純度が９９％よりも高いことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
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