CN102858971B - 纯化维生素k依赖性蛋白如凝血因子ix的方法 - Google Patents

纯化维生素k依赖性蛋白如凝血因子ix的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102858971B
CN102858971B CN201180017406.5A CN201180017406A CN102858971B CN 102858971 B CN102858971 B CN 102858971B CN 201180017406 A CN201180017406 A CN 201180017406A CN 102858971 B CN102858971 B CN 102858971B
Authority
CN
China
Prior art keywords
vitamin
resin
dependent protein
buffer
fix
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201180017406.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102858971A (zh
Inventor
古斯塔夫·吉尔加姆
斯特凡·温厄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Octapharma AG
Original Assignee
Octapharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Octapharma AG filed Critical Octapharma AG
Publication of CN102858971A publication Critical patent/CN102858971A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102858971B publication Critical patent/CN102858971B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

一种在采用层析的纯化序列中制备无朊病毒的维生素K依赖性蛋白的方法，其特征在于：-使用多峰树脂进行至少一种层析步骤；-以水性溶液提供含维生素K依赖性蛋白的部分；-使含维生素K依赖性蛋白的部分与多峰树脂在pH为6-9下接触；-在洗脱维生素K依赖性蛋白之前，任选用水性洗涤缓冲液洗涤具有所吸附的维生素K依赖性蛋白的多峰树脂，以洗去污染物并保留维生素K依赖性蛋白；-在含精氨酸的缓冲液中pH为6-9下从多峰树脂上洗脱维生素K依赖性蛋白；以及-任选收集纯化或富集形式的含维生素K依赖性蛋白的部分。

Description

纯化维生素K依赖性蛋白如凝血因子IX的方法
技术领域
本发明涉及一种纯化维生素K依赖性蛋白如凝血因子IX（简称为FIX）的方法以及可通过本发明方法获得的包含维生素K依赖性蛋白如FIX的部分。
背景技术
血友病是一类损害人体控制血液凝固或血凝能力的遗传失调。在其一种形式血友病B中，凝血因子IX（简称为FIX）缺乏，血友病B在每25000名男性中出现约1例。因子IX（或Christmas因子）是凝血系统的一种丝氨酸蛋白酶。它是维生素K依赖性血浆蛋白，通过在Ca2+离子、磷脂和因子VIIIa的存在下将因子X转化为其活性形式而参与血凝的。FIX蛋白是具有多功能性质的血凝必要因子。
因子IX（FIX）是包含461个氨基酸的单链糖蛋白。它主要在肝脏中合成并分泌在血浆中。因子IX分子由多个分开的功能域构成，包括信号肽、前肽、Gla域、两个类表皮生长因子（EGF）域、激活肽和催化的类胰蛋白酶域（丝氨酸蛋白酶域）（前肽在分泌产生成熟的415aaFIX分子之前裂解）。该蛋白进一步加工成其活性形式，由通过二硫键连接的轻链和重链构成的异质二聚体。
FIX缺乏可以用FIX血源浓缩物或用重组生成的FIX治疗。用FIX浓缩物治疗已导致血友病患者的正常生活。历史上已用源自人血血浆的FIX治疗血友病B。在正常条件下FIX分子在血浆中以其自然状态循环，而通过在流血阶段凝血酶引起的复杂过程它被激活。
血源FIX制品以不同纯度出现在市场上，这些纯度依赖于所施用的纯化方法。用于纯化FIX的方法通常是用于纯化的不同层析步骤（主要是离子交换和亲和步骤）和用于产品浓缩/脱盐的超滤步骤的组合。
Harrison等人(S.Harrison等人，SemHematol35(Suppl2):4-10(1998))描述了CHO细胞中产生的重组的制备方法。细胞通过微滤收获，随后在超滤/渗滤步骤中浓缩，其中缓冲液交换成Tris缓冲液以提供稠缓冲液用于负载到第一色谱柱上。4个独立的层析步骤用于纯化rFIX，第一个是阴离子交换步骤(Q琼脂糖凝胶FF)，以假亲和模式进行。该柱用pH为8.0的10mM氯化钙洗脱。氯化钙诱导FIX分子的构象变化，而这引起它脱离柱。
Q琼脂糖凝胶步骤后是在Matrexcellufine硫酸盐柱上纯化，该柱是用于亲和纯化具有肝素结合域的蛋白的肝素类似物。由于带负电的硫酸根基团，它也相当于阳离子交换树脂。Cellufine纯化步骤除去低水平的HCP。
Cellufine洗脱液负载到是磷酸钙合成形式的陶瓷羟基磷灰石（Ceramic-Hydroxyapatite）柱上。它用于分离具有不同电荷的蛋白，并提供除去较低比活形式的rFIX的可能性。通过将磷酸盐浓度增加到最终浓度0.5M的分级洗脱来洗脱该柱。
制备方法的最后纯化步骤是螯合物-EMD-Cu(II)。蛋白与被树脂截留的固定化金属相互作用。在该纯化步骤中结合的rFIX被作为置换剂的咪唑洗脱，并且痕量的污染物被除去，之后是病毒过滤步骤(Viresolve-70)，最后是超滤/渗滤步骤，其中rFIX被浓缩并且缓冲液交换成制剂缓冲液。
上述rFIX制备方法是连续的，已分析65批，发现比活为276±23IU/mg。Gla含量为11.4±0.1molGla/molrFIX，杂质总量通过RP-HPLC和HCP-ELISA测定分别为0.01±0.01%和0.03±0.01%。
Lindsay等人(JChromA1026:149-157(2004))描述了从转基因猪奶中提纯rFIX的方法。在该纯化方案中肝素琼脂糖凝胶FF用作第一步骤，之后是阴离子交换步骤。
因子IX的肝素结合域位于分子的C-末端。该区域缺少PTM，因此肝素层析步骤允许整个种群的rFIX分离出。洗脱液的比活为30-35IU/mg，这表明大部分无活性。活性rFIX亚群在AIEX柱的梯度洗脱过程中与无活性的亚群分离。
Kaufman等人(JBC261:9622-9628(1986))描述了rFIX在CHO细胞中的表达和该蛋白的纯化。在施加到具有构象特异性抗体(抗FIX:Ca(II)抗体)的免疫亲和柱之前，含rFIX的细胞培养基通过超滤浓缩，并从包含3mMCaCl2、0.05MTris-HCl和0.5MNaCl的缓冲液中渗析。该柱随后用10mMEDTA、0.05MTris-HCl和0.15MNaCl洗脱。
施加到该柱之前原料中存在3mMCaCl2导致活性与非活性FIX物质分离。非活性物质不能结合到柱上，而活性FIX被EDTA洗脱出柱。
WO-A-2009/007451公开了使用混合模式或多峰树脂纯化FVIII的方法。该纯化方法基于使FVIII蛋白与含配体（包括疏水部分和带负电部分）的多峰或混合模式的树脂接触，并用洗脱缓冲液洗脱所述FVIII蛋白，所述洗脱缓冲液包含至少1.5M盐和至少40%(w/v)乙二醇、丙二醇或其混合物，以及钙离子。
EP-A-1707634公开了通过各种方法分离重组生成的蛋白的方法，例如免疫亲和层析、亲和层析、蛋白沉淀、缓冲液交换、离子交换层析、疏水相互作用层析、混合模式的疏水/离子交换层析介质、螯合层析、碳水化合物亲和如外源凝集素或肝素亲和层析、尺寸排阻层析、电泳、渗析、不同沉淀剂如聚乙二醇、硫酸铵、乙醇、羟基磷灰石吸附、滤膜吸附、偶合磁性颗粒的配体等。但是，它认为没有特定的层析纯化步骤。
WO-A-2005-082483公开了从液体中的一种或多种杂质纯化抗体的方法，该方法包括使所述液体与包括载体（该载体上固定化有多峰配体以将抗体吸附到树脂上）的第一色谱树脂接触，其中每一多峰配体包含至少一种阳离子交换基团和至少一种芳环或杂芳环体系。加入洗脱剂以使抗体从树脂上释放，并且洗出液与第二色谱树脂接触。
WO-A-2005/121163公开了从蛋白溶液中分离一种或多种蛋白的方法。该方法包括如下步骤：提供包含一种或多种特定蛋白且具有预设pH和预设离子强度或电导率的蛋白溶液，将该蛋白溶液施加到包括具有被多孔材料包围的至少一个高密无孔芯的颗粒的吸附柱上，该吸附剂的颗粒密度为至少1.5g/ml，平均体积颗粒直径为至多150μm。在从吸附剂上洗脱蛋白之前任选洗涤柱。
WO-A-2009/156430A1公开了使用混合模式或多峰树脂纯化FVIII的方法。该纯化方法基于使具有高离子强度的溶液中的FVIII蛋白与含配体（包括疏水部分和带负电部分）的多峰或混合模式的树脂接触，并用包含至少一种pH为6-8时带正电的氨基酸的洗脱缓冲液洗脱所述FVIII蛋白。
为改进含FIX的产品，采用针对FIX分子的特异性亲和层析，这有效地除去污染物至高水平的FIX纯度。常用免疫亲和层析的缺点是它相对昂贵，并使用动物源的单克隆抗体作为亲和配体。
二十世纪八十年代中期存在一些与血源FIX产品有关的病毒传播。即使该问题通过实施特异性病毒减少步骤得以解决，但这是重组FIX产品(rFIX)的发展起点。二十世纪九十年代，第一种rFIX产品市场化，并且迄今也是唯一一种。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种通过它避免现有技术中维生素K依赖性蛋白，尤其是FIX的纯化方法的缺陷的方法。从现有技术中已知传统离子交换色谱树脂(例如SP-、CM-、Q-或DEAE琼脂糖凝胶FF离子交换色谱树脂)的一个缺点是蛋白结合到树脂上仅可以在相对低的盐浓度（电导率）和pH内进行，通常在0.01-0.15M盐(NaCl等)浓度范围内。最佳的pH范围依赖于是否使用阳离子交换剂或阴离子交换剂以及待结合到树脂上的目标产品的等电点。一般而言，目标产品结合到离子交换树脂上的pH范围通常为比目标产品的等电点大致高或低1个pH。
在某些应用中，需要能够采用相对温和的纯化条件，离子交换层析步骤在稍许增加的离子强度和正常范围外的pH下针对蛋白实施，也直接(没有进一步的稀释)针对层析树脂施加，而这不能用于常规的离子交换层析。
多峰(或混合模式)色谱是用于纯化蛋白的工具，例如描述在制造商数据表GEHealthcare(11-0035-45AA)CaptoAdhere、制造商数据表GEHealthcare(28-9078-88AA)CaptoMMC和WO-A-2009/024620“Aprocessfortheisolationandpurificationofatargetprotein,freeofprionproteins”中。不足之处在于洗脱往往包括相对严苛的条件如中性pH以下或以上的pH，或这种pH还组合有其它洗脱参数如乙二醇以及如WO-A-2009/007451中描述的。
增加的离子强度可明显有利于蛋白溶液的蛋白稳定性，尤其是在粗蛋白的制备中如收获重组蛋白或在血源产品（潜在的蛋白酶存在于溶液中，这可以不利地影响目标蛋白）中。
由于蛋白酶往往在生理条件下(如在大多数细胞体系中的情况)作用最佳，即pH大致为7和大约0.15M的盐浓度，因此可以有利的是改变这些条件以使蛋白酶的影响最小。这种改变通常可以通过添加盐和/或改变pH来进行。这些参数对于常规离子交换色谱步骤的性能都是关键的，因此往往不可能实现。由此本发明的另一目的是提供其中该问题已解决并使得在包含潜在蛋白水解因子如蛋白酶（使目标蛋白劣化）的粗蛋白样品中添加盐和/或改变pH成为可能的方法。该方法应还能尽可能少地需要其它措施来处理蛋白溶液并能使目标蛋白结合到色谱树脂上。这提供了从粗样品中浓缩和纯化目标蛋白或下游利用例如其它层析步骤如亲和层析进一步纯化的优化步骤。
这种需要特别重要，因为要阻止或至少减少目标蛋白在纯化过程中降解。
这使得可以在洗脱目标蛋白之前除去蛋白酶和其它污染物，这些物质可能存在于粗的收获物中。
本发明的另一目的是提供一种尤其从重组FIX的细胞培养基收获物中纯化维生素K依赖性蛋白如FIX的方法。
根据本发明，该目的通过在采用层析的纯化序列中纯化维生素K依赖性蛋白如FIX的方法来完成，其中：
-使用多峰树脂进行至少一种层析；
-维生素K依赖性蛋白如FIX结合到多峰树脂上；以及
-以含精氨酸的缓冲液在pH为6-9下从多峰树脂上洗脱维生素K依赖性蛋白如FIX。
已知7种血浆糖蛋白的生物合成依赖维生素K。它们是凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C、蛋白S和蛋白Z。Gla域是所有这些维生素K依赖性蛋白的共同结构特征，并且直接在Gla域后，每种蛋白(除了凝血酶原)都具有一种或多种类EGF域。维生素K依赖性蛋白需要Ca2+离子以表达其生理功能，并且钙结合位包括至少Gla域和类EGF域。钙结合使得这些蛋白能够结合到磷脂/细胞膜上，由此表达它们的全生物活性。
本发明使用多峰树脂作为捕集纯化步骤提供了将盐浓度和pH调节到使蛋白溶液中的活性蛋白酶在目标蛋白结合到多峰色谱步骤过程中的风险最小的值的可能性。
本发明方法的优点是在目标蛋白结合到多峰树脂上（例如用作重组过程的捕集步骤）之后在洗脱目标蛋白之前还施用洗涤步骤的可能性。这通过使用多峰树脂来实现，在洗脱目标蛋白之前通过选择合适的洗涤缓冲液洗涤树脂以除去蛋白酶和粘附到多峰树脂上的其它污染物。合适的洗涤缓冲液优选包含盐或氨基酸或缓冲组分，或在适合仍抑制蛋白酶在洗涤除去步骤过程中的活性的pH下的其混合物。
本发明的方法使得在具有独特洗脱性质(即以尽可能小的体积)的温和洗脱环境中洗脱结合到多峰树脂上的目标蛋白成为可能。这通过使用增加的pH或增加的盐浓度或添加氨基酸或其组合来实现。本发明的方法提供诸如抑制团聚体、保持天然分子结构和为进一步的下游处理提供小体积之类的优点。
本发明还有助于在不加入人或动物源的稳定添加剂和不使用整体工艺(基于单克隆抗体的免疫亲和树脂)的纯化方法。使用多峰树脂尤其作为捕集步骤相比常规离子交换剂还有助于更高的结合能力，这样的结果是从柱上获得更浓的产物洗出液，这对产物稳定性是有利的。
根据本发明的一种实施方案，多峰层析可以在色谱柱中进行。这可以视为第一捕集步骤。本发明的方法还可以间歇进行。
在本发明的一种实施方案中，多峰树脂上的层析与在具有酵母源亲和配体的树脂上的层析组合，维生素K依赖性蛋白如FIX蛋白洗脱后的纯度>90%。
在本发明的另一其它实施方案中，多峰树脂步骤和酵母源亲和配体层析步骤与其它层析纯化步骤组合，以在最终的维生素K依赖性产品如FIX蛋白中获得大于99%的纯度。
因此物质组合物也是本发明的主题，该物质组合物包含可根据本发明方法(不加入或使用任何人或动物添加剂如白蛋白或基于单克隆抗体的免疫亲和配体)获得的经纯化的维生素K依赖性蛋白如FIX。
在本发明的另一实施方案中，多峰树脂包含结合到基质上的部分，该部分能够与混合物中的维生素K依赖性蛋白通过离子相互作用和其它类型的相互作用如氢键、疏水和亲硫相互作用而相互作用。
在本发明的另一实施方案中，亲和配体是针对维生素K依赖性蛋白如FIX的酵母源Fab片段。
在本发明的另一实施方案中，进行多峰树脂步骤以从粗蛋白溶液中捕集维生素K依赖性蛋白如FIX，处理后所得多峰层析树脂洗出液在酵母源的亲和配体层析步骤，并且在从所述亲和层析步骤洗脱维生素K依赖性蛋白如FIX之后，相关蛋白和DNA的纯度大于90%。
在本发明的另一其它实施方案中，特征在于如果进行多峰树脂步骤以从粗蛋白溶液中捕集维生素K依赖性蛋白如FIX，处理后所得多峰层析树脂洗出液在选自尺寸排阻、阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用和固定化金属亲和层析和酵母源的亲和配体的其它层析步骤中进一步处理，最终产品的纯度大于99%。
在本发明的另一实施方案中，包含维生素K依赖性蛋白如FIX的混合物以溶液存在。
在本发明的另一实施方案中，维生素K依赖性蛋白如FIX在包括可以使产品劣化的潜在蛋白酶的粗蛋白溶液中。
可以有利的是向多峰树脂施加洗涤缓冲液，以洗除污染物（蛋白酶、DNA等）并在其释放前截留维生素K依赖性蛋白如FIX。
在本发明的另一实施方案中，在洗脱维生素K依赖性蛋白如FIX之前用pH为6-9的洗涤缓冲液洗涤多峰树脂。
在本发明的另一实施方案中，用精氨酸作为洗脱剂进行洗脱。根据本发明，洗脱剂可以与增加的盐浓度组合，其中盐选自Hofmeister系列。根据本发明，洗脱可以用精氨酸单独或与增加的盐浓度组合或仅增加盐浓度来进行，所有这些在pH范围为6-9，优选pH为7.0下进行。
根据本发明，有关包括在Hofmeister系列的盐（例如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐、钡盐、乙酸盐、磷酸盐和硫酸盐）中优选NaCl和KCl。
根据本发明，精氨酸的浓度尤其为约0.1M至约2M，根据Hofmeister系列的盐为0.1M至4M；精氨酸尤其为约0.4M至约1.5M，根据Hofmeister系列的盐为0.6M至2M；或精氨酸为约0.3M至约0.7M，根据Hofmeister系列的盐为0.8M至1.2M。
根据本发明的另一实施方案，维生素K依赖性蛋白如FIX在pH为6-9，优选pH为7.0下结合到多峰树脂上。
在本发明的另一实施方案中，使用pH尤其为约6至约9包含优选选自下列物质的至少之一的缓冲物质：柠檬酸钠、组氨酸、2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、Tris碱和乙酸钠。
在本发明的方法中，非离子型清净剂可以存在于任何所用缓冲液中，该非离子型清净剂尤其选自Polysorbates(Polysorbate20、40、60、80)和PluronicF68。
在pH为6-9，优选pH为7.0的洗脱缓冲液中，精氨酸的量通常为0.1至2M，尤其是0.5M。
在pH为6-9，优选pH为7.0的洗脱缓冲液中，所含氯化钠为0.1至4M，尤其为0.05至0.3M。
在pH为6-9，优选pH为7.0的洗脱缓冲液中，所含精氨酸和氯化钠为0.1至0.5M，尤其为0.3M至0.7M。
在pH为6-9，优选pH为7.0的洗涤缓冲液中，所含氯化钠为0.01至0.3M，尤其为0.05至0.15M。
非离子型清净剂的量通常为0.001至1%，在多峰层析的缓冲液中尤其为0.02%。
根据本发明可用的多峰层析树脂可以包含下列部分的至少一种：
a.带正电的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体；
b.带负电的2-(苯甲酰氨基)丁酸配体；
c.苯丙基配体；
d.N-己基配体；
e.4-巯基-乙基-吡啶配体；
f.3-((3-甲基-5–((四氢呋喃-2-基甲基)-氨基)-苯基)-氨基)-苯甲酸配体或其组合。
特别地，根据本发明可用的多峰层析树脂选自下列可商购树脂：HEPHypercelTM、PPAHypercelTM、CaptoAdhereTM、CaptoMMCTM、MEPHypercelTM。
在本发明方法的另一实施方案中，多峰层析树脂与维生素K依赖性蛋白如FIX亲和层析步骤组合，其中通过蛋白配体如抗体片段（例如在酵母中表达）提供亲和性。
在本发明方法的另一实施方案中，纯化序列还可包括病原体除去/失活步骤，包括基于化学的失活步骤、基于尺寸的除去步骤、层析步骤或其组合，这些步骤基于涉及待除去的病原体的不同生理性质。文献中充分描述的病原体失活步骤的例子是基于化学的溶剂清净剂方法，例如EP-A-131740中公开的基于磷酸三正丁酯和TritonX-100，它们破坏所有脂质包封的病毒。基于尺寸的病原体除去步骤的例子是例如平均孔尺寸大约20nm的纳滤，如Planova20过滤器。病原体除去的另一例子基于层析。例如，已知亲和层析一般利用病原体除去性质，例如酵母源维生素K依赖性蛋白如FIX亲和配体层析树脂。
在本发明方法的特定实施方案中，纯化序列还包括下列步骤：
1.阳离子多峰树脂如CaptoMMC；
2.用于脂质包封病毒的基于化学的失活步骤，特别是如EP-A-131740中公开的使用磷酸三正丁酯和TritonX-100a的溶剂/清净剂失活；
3.基于在酵母中表达的配体的亲和树脂；
4.阳离子交换剂如SP琼脂糖凝胶或ResourceS；
5.平均孔尺寸大约20nm的病原体过滤除去步骤，如Planova20N；
6.缓冲液交换和/或浓缩步骤如大致10kDa截留分子量的超滤；
7.尺寸排阻层析树脂如Superdex200。
在特定实施方案中，本发明方法包括下列步骤：
-将CaptoMMCTM多峰树脂填充在柱中并用pH为7.0包含20mM柠檬酸钠、0.1MNaCl、0.02%Polysorbate80的缓冲液平衡；
-施加包含维生素K依赖性蛋白如FIX的粗样品，包括与以上平衡缓冲液大致相同的条件，目标蛋白和一些其它杂质蛋白结合到柱上；
-根据本发明将使用平衡缓冲液的洗涤步骤施用到柱上，以抑制蛋白水解活性并除去蛋白酶、DNA和其它污染物，而维生素K依赖性蛋白如FIX仍结合在柱上；
-根据本发明使用其中添加0.5M精氨酸并调节至pH为7.0的平衡缓冲液洗脱维生素K依赖性蛋白如FIX，以获得低体积的稳定非团聚的维生素K依赖性蛋白如FIX部分。
多峰(或混合模式)色谱是用于纯化蛋白的工具，例如描述在制造商数据表GEHealthcare(11-0035-45AA)CaptoAdhere、制造商数据表GEHealthcare(28-9078-88AA)CaptoMMC和WO-A-2009/024620“Aprocessfortheisolationandpurificationofatargetprotein,freeofprionproteins”中。
多峰色谱的上述缺点被在中性附近的pH范围的温和洗脱条件所避免，该范围保持维生素K依赖性蛋白如FIX分子的活性并有利于采用多峰色谱结合增加盐浓度的稳定效果，例如在EP-A-1707634中所述的。
根据本发明的一种实施方案，多峰层析可以在色谱柱中进行。这可视为是第一捕集步骤。本发明方法还可间歇进行。本发明还有助于在不加入人或动物源的稳定添加剂和不使用(基于单克隆抗体的免疫亲和树脂)的纯化方法。使用多峰树脂尤其作为捕集步骤相比常规离子交换剂还有助于更高的结合能力，这样的结果是从该步骤获得更浓的产物洗出液，这对产物稳定性是有利的。
本发明的方法通常与重组维生素K依赖性蛋白如FIX(rFIX)的纯化有关。
在本发明的另一实施方案中，多峰层析步骤与维生素K依赖性蛋白如FIX亲和层析步骤组合，其中亲和性由蛋白配体如在酵母中表达的抗体片段提供。
因此物质组合物也是本发明的主题，该物质组合物包含可根据本发明方法(不加入或使用任何人或动物添加剂如白蛋白或基于单克隆抗体的免疫亲和配体)获得的经纯化的重组维生素K依赖性蛋白如FIX。
通过下面非限制性实施例进一步描述本发明。
具体实施方式
实施例
分析方法的描述
生物活性分析—因子IX(一级凝血测试)
用一级凝血测试测量因子IX的生物活性，并且以当前WHO因子IX浓缩物标准规定的国际单位(IU)表示因子IX的单位。
一级凝血测试是EuropeanPharmacopoeia规定的方法。该测试的原理基于含因子IX样品在磷脂、接触性激动剂和钙离子的存在下校正因子IX缺乏血浆的凝血时间。一步测量纤维蛋白凝块的出现时间。因子IX的活度与凝血时间成反比。该方法在SiemensBCSXP仪器上进行。
SDSPage(分子量分布)
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)包括基于它们的尺寸分离蛋白。该方法描述蛋白的SDS-PAGE，其在还原条件下进行。通过在变性和还原条件下加热样品，蛋白变得展开并覆有阴离子型清净剂十二烷基硫酸钠(SDS)，获得与多肽链长度成比例且高的净负电荷。在负载到聚丙烯酰胺凝胶基质上并置于电场时，带负电的蛋白分子向带正电的电极迁移，并被分子筛分效应即被它们的分子量分开。聚丙烯酰胺凝胶限制较大分子与较小分子一样快地迁移。由于SDS变性多肽中电荷与质量之比近似相同，因此蛋白的最终分离几乎完全取决于多肽相对分子量的差异。在均一密度的凝胶中，蛋白(Rf)的相对迁移距离与其质量的对数成反比。如果已知质量的蛋白与未知的同时运行，则可以绘制Rf与质量的关系图，并估计未知蛋白的质量。电泳分离的蛋白带通过银染色来视觉化。视觉判断标准、参比（空白样品）和分析样品的出现，完成估测。
血源因子IX
这些实验所用的材料源自可商购产品它是高纯SD处理的纳滤因子IX浓缩物。
重组因子IX
含FIX细胞悬浮液的制备
细胞
所用细胞线是适于无血清生长的人胚肾细胞293(HEK293)。用携有用于人FIX和人弗林蛋白酶（furin）的cDNA编码序列的表达盒稳定转染该宿主HEK293F(PACE)。相同强的启动子用于这两个盒。该通用方法在EP-A-1739179(等人)中也有描述。
培养方法
在通用设备并按照本领域公知的一般方法在无血清的培养基中培养细胞，例如在t烧瓶中摇动或搅拌的培养基，作为分批式、分批补料式、灌注或连续恒化器培养基运行的振荡摇床烧瓶和生物反应器(一次性系统和常规搅拌釜)(Freshney,RI(2000),Cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique,第4版,Wiley-Liss;Spier,REed(2000),Encyclopediaofcelltechnology,Wiley,NewYork;Enfors,S-O和L(2000),Bioprocesstechnology:fundamentalsandapplications,RoyalInstituteofTechnology,Stockholm;Vinci,VA和Parekh,SR(2003),Handbookofindustrialcellculture:mammalian,microbial,andplantcells,HumanaPress,USA)。通常利用培养基灌注来超过标准分批培养基水平增加细胞数和产物效价。产物收率和宿主细胞蛋白的量根据培养模式而不同：
·产物效价通常随细胞数增加；
·蛋白总含量和DNA含量通常随细胞数增加；
·蛋白总含量和DNA含量还可随培养长度（longetivity）增加；
·分批培养基增长蛋白和DNA，没有外部添加，也不移除任何物质；
·灌注工艺从代谢物、蛋白、DNA和其它杂质上冲洗下细胞培养基；过滤器或细胞离心通常用于细胞保留。
从细胞释放重组产物，并且细胞悬浮液或细胞悬浮液的上清液是收获物。该收获物的性质(如上述产物效价和杂质)根据所用培养模式而不同。
细胞悬浮液已用在一些下述FIX实施例中。
使用CaptoMMC树脂作为捕集步骤纯化FIX
实施例1
原料
使用血源FIX(pdFIX，)。在负载到CaptoMMC柱上之前溶解冻干的Nanotiv并将其稀释在平衡缓冲液中。
色谱树脂和柱
GEHealthcare的混合模式树脂CaptoMMC(cat号17-5317)用作FIX分子的捕集步骤。CaptoMMC是具有疏水和亲硫相互作用以及氢键的弱阳离子树脂。用CaptoMMC树脂装填Tricorn5/150柱至15.7cm的床高。柱体积(CV)为3.1ml。
缓冲液
平衡缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.1MNaCl、0.02%Polysorbate80，pH为7.0
低盐洗涤缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.2MNaCl、0.02%Polysorbate80，pH为6.5
高盐洗涤缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.7MNaCl、0.02%Polysorbate80，pH为6.5
洗脱缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.2MNaCl、0.5M精氨酸盐酸盐、0.02%Polysorbate80，pH为6.5
实验设置
用平衡缓冲液平衡该柱，随后以1毫升/分的流量负载原料。在这些缓冲条件过程中pdFIX结合到CaptoMMC树脂上。如表1所示，流出物中没有pdFIX。该树脂随后经历如表1所述的不同洗涤条件，并且在任何经测试的洗涤缓冲液中都没有检测到pdFIX。通过向缓冲液中添加0.5M精氨酸，FIX从树脂上释放，得到85%的收率。
表1
结论
血源FIX(pdFIX，Nanotiv)在pH为7下结合到CaptoMMC上，并可以在不从树脂上洗脱的情况下用至少0.7MNaCl缓冲液洗涤。
通过向缓冲液中添加0.5M精氨酸盐酸盐，pdFIX从柱上洗脱出。
实施例2
原料
在HEK293细胞中产生重组人FIX(rhFIX)。移除细胞，而无细胞的上清液是负载到CaptoMMC柱上的原料。
色谱树脂和柱
GEHealthcare的混合模式树脂CaptoMMC(cat号17-5317)用作FIX分子的捕集步骤。CaptoMMC是具有疏水和亲硫相互作用以及氢键的弱阳离子树脂。用CaptoMMC树脂装填XK26柱至15cm的床高。柱体积(CV)为80ml。
缓冲液
平衡缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.1MNaCl、0.02%Polysorbate80，pH为7.0
高盐洗涤缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.7MNaCl、0.02%Polysorbate80，pH为6.5
洗脱缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.2MNaCl、0.5M精氨酸盐酸盐、0.02%Polysorbate80，pH为6.5
实验设置
用平衡缓冲液平衡该柱，随后以26毫升/分的流量负载原料。在这些缓冲条件过程中rhFIX结合到CaptoMMC树脂上。如表2所示，流出物中没有rhFIX。高盐洗涤没有从柱上洗脱出任何rhFIX。通过向缓冲液中添加0.5M精氨酸，rhFIX从树脂上洗脱，得到92%的收率。
表2
结论
重组人FIX(rhFIX)在pH为7下结合到CaptoMMC上，并可以在不从树脂上洗脱的情况下用至少0.7MNaCl缓冲液洗涤。
通过向缓冲液中添加0.5M精氨酸盐酸盐，rhFIX从柱上洗脱出。
所用缓冲液包含0.02%Polysorbate80(非离子型清净剂)，其没有导致任何负面影响。相比没有向所用缓冲液中加入Polysorbate80的以下实验(实施例3)所得的结果，可能有利的是在缓冲液中使用Polysorbate80。
实施例3
原料
在HEK293细胞中产生重组人FIX(rhFIX)。移除细胞，而无细胞的上清液是负载到CaptoMMC柱上的原料。
色谱树脂和柱
GEHealthcare的混合模式树脂CaptoMMC(cat号17-5317)用作FIX分子的捕集步骤。CaptoMMC是具有疏水和亲硫相互作用以及氢键的弱阳离子树脂。用CaptoMMC树脂装填XK26柱至15cm的床高。柱体积(CV)为80ml。
缓冲液
平衡缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.1MNaCl，pH为7.0
高盐洗涤缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.7MNaCl，pH为6.5
洗脱缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.2MNaCl、0.8M精氨酸盐酸盐，pH为6.5实验设置和结果
用平衡缓冲液平衡该柱，随后以26毫升/分的流量负载原料。在这些缓冲条件过程中rhFIX结合到CaptoMMC树脂上。如表3所示，流出物中存在少量负载到柱上的rhFIX。随后用相对高NaCl浓度0.7M的缓冲液洗涤树脂。如表3所示，在该洗涤中检测到低于1％的rhFIX。通过向缓冲液中添加0.8M精氨酸，rhFIX从树脂上洗脱，得到84%的收率。相比实验2和实验5，该实验所用缓冲液不包含任何Polysorbate80。
表3
结论
重组人FIX(rhFIX)在pH为7下结合到CaptoMMC上，并可以在不从树脂上洗脱的情况下用至少0.7MNaCl缓冲液洗涤。
通过向缓冲液中添加0.8M精氨酸盐酸盐，rhFIX从柱上洗脱出。
没有向缓冲液中加入清净剂，这可表现在洗脱部分中略微低的rhFIX回收率。
实施例4（实施例4A和实施例4B）
原料
使用血源FIX(pdFIX，)。在负载到CaptoMMC柱上之前溶解冻干的Nanotiv并将其稀释在平衡缓冲液中。
色谱树脂和柱
GEHealthcare的混合模式树脂CaptoMMC(cat号17-5317)用作FIX分子的捕集步骤。CaptoMMC是具有疏水和亲硫相互作用以及氢键的弱阳离子树脂。用CaptoMMC树脂装填Tricorn5/150柱至15cm的床高。柱体积(CV)为3ml。
缓冲液
实验实施例4A：
平衡缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.1MNaCl，pH为7.0
洗脱缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.1MNaCl、0.5M精氨酸盐酸盐，pH为7.0
实验实施例4B：
平衡缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.1MNaCl、0.02%Polysorbate80，pH为7.0
洗脱缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.1MNaCl、0.5M精氨酸盐酸盐、0.02%Polysorbate80，pH为7.0
实验设置
比较在CaptoMMC柱上用含或不含Polysorbate80的缓冲液在pH设定为7.0下纯化pdFIX。用平衡缓冲液平衡该柱，随后以1毫升/分的流量负载原料。在这些缓冲条件过程中pdFIX结合到CaptoMMC树脂上。如表4所示，流出物和平衡洗涤部分中没有pdFIX。
表4
结论
相比缓冲液中不含Polysorbate80，缓冲液中包含Polysorbate80时所洗脱的血源FIX增加5％。该差别小，但结果表明在缓冲液中使用Polysorbate80的益处。这两个实验的pdFIX收率都高。这也表明所用缓冲液的pH为7.0无论在结合到CaptoMMC树脂上还是从树脂上洗脱pdFIX都获得好的数据。
实施例5（实施例5A和实施例5B）
原料
使用血源FIX(Nanotiv)。在负载到CaptoMMC柱上之前溶解冻干的Nanotiv并将其稀释在平衡缓冲液中。
色谱树脂和柱
GEHealthcare的混合模式树脂CaptoMMC(cat号17-5317)用作FIX分子的捕集步骤。CaptoMMC是具有疏水和亲硫相互作用以及氢键的弱阳离子树脂。用CaptoMMC树脂装填Tricorn5/150柱至15cm的床高。柱体积(CV)为3ml。
缓冲液
实验实施例5A：
平衡缓冲液:20mMHEPES、0.1MNaCl，pH为8.0
洗脱缓冲液:20mMHEPES、0.1MNaCl、0.5M精氨酸盐酸盐，pH为8.0
实验实施例5B：
平衡缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.1MNaCl，pH为6.0
洗脱缓冲液:20mM柠檬酸钠、0.1MNaCl、0.5M精氨酸盐酸盐，pH为6.0
实验设置
比较在CaptoMMC柱上用具有不同pH（8.0和6.0，在结合和洗脱缓冲液中都用）的缓冲液纯化pdFIX。用平衡缓冲液平衡该柱，随后以1毫升/分的流量负载原料。在这些缓冲条件过程中pdFIX结合到CaptoMMC树脂上。如表5所示，流出物中没有pdFIX。
对于这2个测试的pH，洗脱部分中pdFIX收率相同，都较高。
表5
结论
这些实验表明血源FIX在pH为8.0和6.0的缓冲液中能结合到CaptoMMC树脂上，并且这两个pH都可用在洗脱缓冲液中。
实施例6（实施例6A-6K）
目的
这些实验的目的是研究在3种不同pH：6.0、7.0和8.0下重组人FIX(rhFIX)在CaptoMMC树脂上的捕集和洗脱。还研究了rhFIX结合和洗脱中所用的这些缓冲液中的0.02%Polysorbate80的益处。
原料
在HEK293细胞中产生重组人FIX(rhFIX)。移除细胞，而无细胞的上清液是负载到CaptoMMC柱上的原料。
色谱树脂和柱
GEHealthcare的混合模式树脂CaptoMMC(cat号17-5317)用作FIX分子的捕集步骤。CaptoMMC是具有疏水和亲硫相互作用以及氢键的弱阳离子树脂。用CaptoMMC树脂装填XK26柱至13.5cm的床高。柱体积(CV)为27ml。
缓冲液
实施例6A
平衡缓冲液 0.1M NaCl、20mM柠檬酸钠，pH 7.0
洗涤缓冲液 0.1M NaCl、20mM柠檬酸钠，pH 7.0
洗脱缓冲液 0.1M NaCl、20mM柠檬酸钠、0.5M精氨酸盐酸盐，pH 7.0
CIP 1%Triton X-100/0.5M NaCl、1M NaOH、WFI、20%乙醇
储存缓冲液 20%乙醇
WFI:用于注入的水
实施例6B
平衡缓冲液 0.1M NaCl、20mM柠檬酸钠，pH 6.0
洗涤缓冲液 0.1M NaCl、20mM柠檬酸钠，pH 6.0
洗脱缓冲液 0.1M NaCl、20mM柠檬酸钠、0.5M精氨酸盐酸盐，pH 6.0
CIP 1%Triton X-100/0.5M NaCl、1M NaOH、WFI、20%乙醇
储存缓冲液 20%乙醇
实施例6C
平衡缓冲液 0.1M NaCl、20mM HEPES，pH 8.0
洗涤缓冲液 0.1M NaCl、20mM HEPES，pH 8.0
洗脱缓冲液 0.1M NaCl、20mM HEPES、0.5M精氨酸盐酸盐，pH 8.0
CIP 1%Triton X-100/0.5M NaCl、1M NaOH、WFI、20%乙醇
储存缓冲液 20%乙醇
实施例6D
实施例6E
实施例6F
平衡缓冲液 0.1M NaCl、20mM HEPES，pH 8.0
洗涤缓冲液 0.1M NaCl、20mM HEPES，pH 8.0
洗脱缓冲液 0.1M NaCl、20mM HEPES、0.5M精氨酸盐酸盐，pH 8.0
CIP 1%Triton X-100/0.5M NaCl、1M NaOH、WFI、20%乙醇
储存缓冲液 20%乙醇
实验设置
用平衡缓冲液平衡该柱，随后以9毫升/分的流量负载原料。接着用平衡缓冲液洗涤柱，随后从CaptoMMC柱上洗脱结合的rhFIX。结果示于表6。
表6
表6所示数据表明在pH为6、7和8下rhFIX结合到CaptoMMC上。流出物中没有rhFIX。所结合的rhFIX在这些pH下也能从CaptoMMC树脂上洗脱，回收率大于75％。最佳的回收率在pH为7的洗脱缓冲液中获得。在采用6或7的pH时，平衡和洗脱缓冲液中加入Polysorbate80导致至少5％的增加。在使用pH为8的缓冲液时，Polysorbate80没有带来益处。
这些数据和实验5中得到的数据表明Polysorbate80对于回收CaptoMMC树脂上的rhFIX和pdFIX具有有益影响。
结论
重组人FIX在至少6-8的pH下能结合到CaptoMMC上。通过向缓冲液加入0.5M精氨酸盐酸盐，rhFIX分子从CaptoMMC树脂上洗脱，并且这与所用的3种测试pH无关。
但是所得结果表明pH为7导致更高的rhFIX收率。
加入清净剂Polysorbate80表明在采用6或7的pH时导致rhFIX回收率增加。
实施例7
目的
该工作的目的是从培养基中纯化重组人FIX成纯产品。这包括3个步骤：捕集步骤、亲和步骤以及浓缩和缓冲液交换步骤。CaptoMMC树脂用作捕集步骤，非动物源FIX亲和配体步骤用作主纯化步骤。作为最后步骤，10kDa截留分子量的超滤系统首先用于浓缩分子，接着用于将缓冲液交换成生理缓冲液环境。
捕集步骤的原料
在HEK293细胞中产生重组人FIX。移除细胞，而无细胞的上清液是负载到CaptoMMC柱上的原料。
捕集步骤（实施例7A-C）
GEHealthcare的混合模式树脂CaptoMMC(cat号17-5317)用作FIX分子的捕集步骤。CaptoMMC是具有疏水和亲硫相互作用以及氢键的弱阳离子树脂。用CaptoMMC树脂装填XK50柱至16.5cm的床高。柱体积(CV)为324ml。
平衡缓冲液 0.1M NaCl、20mM柠檬酸钠，pH 7.0
洗涤缓冲液 0.1M NaCl、20mM柠檬酸钠，pH 7.0
洗脱缓冲液 0.1M NaCl、20mM柠檬酸钠、0.5M精氨酸盐酸盐，pH 7.0
CIP 1%Triton X-100/0.5M NaCl、1M NaOH、WFI、20%乙醇
储存缓冲液 20%乙醇
实验设置和结果
用平衡缓冲液平衡该柱，随后以75毫升/分的流量负载原料。接着用平衡缓冲液洗涤柱，随后从CaptoMMC柱上洗脱结合的rhFIX。结果示于表7。使用相同的实验设置和相同类型的缓冲液，在3个分开的步骤中进行rhFIX的纯化。这些捕集纯化在pH为7.0下进行。
表7
表7所示数据表明在pH为7下rhFIX结合到CaptoMMC上。流出物中没有或有非常少的rhFIX。通过加入精氨酸-HCl至最终浓度0.5M，所结合的rhFIX在7.0的pH下也能从CaptoMMC树脂上洗脱。这3个rhFIX捕集的平均回收率是92％。
FIX亲和步骤（实施例7D-E）
作为亲和步骤，使用在酵母中生成的非动物源FIX亲和配体（Fab片段）(与BACBV，theBioAffinityCompany合作开发)。该配体根据标准偶合技术偶合到CaptoMP树脂上(GEHealthcare)，并称为“FIX亲和树脂”。
用FIX亲和树脂装填XK26柱至7.5cm的床高。柱体积(CV)为40ml。
平衡缓冲液 0.15M NaCl、10mM柠檬酸钠，pH 7.0
洗涤缓冲液 0.15M NaCl、10mM柠檬酸钠，pH 7.0
洗脱缓冲液 2M MgCl2、20mM Tris碱，pH 7.4
CIP 0.01M Hac、2M NaCl和20%乙醇
储存缓冲液 20%乙醇
实验设置和结果
将这3个捕集步骤的洗脱液集中并用作亲和柱的原料。通过以10毫升/分的流量负载原料，用平衡缓冲液平衡该柱。接着用平衡缓冲液洗涤柱，随后从亲和柱上洗脱结合的rhFIX。结果示于表8。使用相同的实验设置和相同类型的缓冲液，在2个分开的步骤中进行rhFIX的纯化。
表8
表8所示数据表明在pH为7下rhFIX结合到FIX亲和树脂上。所得流出物是所用树脂量的结合能力的结果。这两个实验中所用的大约100％rhFIX可检测。通过使用含2MMgCl2的缓冲液，所结合的rhFIX从FIX亲和树脂上洗脱。
浓缩和缓冲液交换步骤（实施例7F）
通过使用UF系统，浓缩亲和柱的洗脱液中的rhFIX，接着使用相同的UF过滤器通过渗滤交换缓冲液。
UF过滤器
使用安装在Pellicon2中的10kDa截留分子量的Pellicon3过滤器。
实验设置和结果
通过以正切流泵送样品并允许小部分体积连续通过Pellicon3过滤器，体积下降。由于过滤器所用的孔尺寸，rhFIX分子包含在再循环的部分中。当使用孔尺寸10kDa的过滤器时，rhFIX的分子量大约55kDa并保持。
将310ml体积的亲和洗脱液浓缩至约60ml。通过连续加入渗滤缓冲液，以与过滤通过Pellicon3过滤器相同的速度对该体积进行渗滤。该60ml浓缩液中的缓冲液交换约18次。该浓缩液25°C的电导率从123mS/cm变为18.6mS/cm。
该浓缩和缓冲液交换步骤的rhFIX回收率为86％。进行用渗滤缓冲液的UF过滤器的洗涤步骤，以回收尽可能多的rhFIX。
图1表示FIX亲和树脂纯化后的SDSPage纯度图案。泳道1是可商购的分子标记，泳道2是可商购的高纯血源FIX产品，泳道3是可商购的高纯重组FIX产品，泳道4和5是如实施例7D和7E所述本发明FIX亲和纯化之后的样品，泳道6和7是如实施例7F所述FIX亲和纯化和超滤浓缩/脱盐之后的样品。相比泳道2或3，如可从泳道4-7可见的，根据本发明产生的产品的FIX纯度没有表现出更低或更高分子量的杂质。

Claims (18)

1.一种在采用层析的纯化序列中制备无朊病毒的维生素K依赖性蛋白的方法，其特征在于：
-使用多峰树脂进行至少一种层析步骤；
-以水性溶液提供含维生素K依赖性蛋白的部分；
-使含维生素K依赖性蛋白的部分与多峰树脂在pH为6-9下接触；
-在洗脱维生素K依赖性蛋白之前，用水性洗涤缓冲液洗涤具有所吸附的维生素K依赖性蛋白的多峰树脂，以洗去污染物并保留维生素K依赖性蛋白；
-以含精氨酸的洗脱缓冲液在pH为6-9下从多峰树脂上洗脱维生素K依赖性蛋白；以及
-任选收集纯化或富集形式的含维生素K依赖性蛋白的部分，
其中维生素K依赖性蛋白是血源FIX或重组生成的FIX。
2.如权利要求1的方法，其中多峰树脂包括结合到基质上的部分，所述部分能够与水性环境中的维生素K依赖性蛋白通过离子相互作用和其它类型的相互作用而相互作用，所述其它类型的相互作用选自氢键、疏水和亲硫相互作用。
3.如权利要求1-2中任一项的方法，其特征在于水性溶液包含维生素K依赖性蛋白，在盐溶液中对应的电导率为25℃下5至200mS/cm，和/或在洗脱缓冲液中对应的电导率为25℃下5至200mS/cm。
4.如权利要求1-2中任一项的方法，其特征在于精氨酸以0.3-0.7M的浓度存在。
5.如权利要求4的方法，其特征在于用pH为6至9的缓冲液洗脱维生素K依赖性蛋白。
6.如权利要求1-2中任一项的方法，其特征在于洗脱缓冲液还包含选自醇、氨基酸、无机盐、至少一种非离子型清洁剂、至少一种用于将pH从6调节至9的缓冲物质、或其组合的试剂；所述无机盐为氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、氯化镁、氯化钙、氯化钡或硫酸铵。
7.如权利要求6的方法，其特征在于所述醇选自甲醇、丙醇、乙二醇和丙二醇；所述无机盐选自KCl和NaCl；所述非离子型清洁剂选自Tween20、Tween80和PluronicF68；所述缓冲物质选自pH为6-9的柠檬酸钠、组氨酸、HEPES、MES、Tris碱和乙酸钠，柠檬酸钠用于调节6-7.5的pH，Tris碱用于调节7.5-9的pH。
8.如权利要求1-2中任一项的方法，其中用精氨酸/NaCl的组合、或精氨酸/乙二醇的组合洗脱维生素K依赖性蛋白。
9.如权利要求1-2中任一项的方法，其特征在于多峰层析树脂包含下列部分的至少一种：
a.带正电的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体；
b.带负电的2-(苯甲酰氨基)丁酸配体；
c.苯丙基配体；
d.N-己基配体；
e.4-巯基-乙基-吡啶配体；
f.3-((3-甲基-5–((四氢呋喃-2-基甲基)-氨基)-苯基)-氨基)-苯甲酸配体。
10.如权利要求1-2中任一项的方法，其特征在于多峰层析树脂选自下列可商购树脂：HEPHypercelTM、PPAHypercelTM、CaptoAdhereTM、CaptoMMCTM、MEPHypercelTM。
11.如权利要求1-2中任一项的方法，其特征在于多峰层析步骤与维生素K依赖性蛋白亲和层析步骤组合，其中通过基于在酵母中表达的蛋白配体提供亲和性，并且所得洗脱液的纯度大于90％。
12.如权利要求1-2中任一项的方法，其特征在于纯化序列还包括病原体除去/失活步骤，包括基于化学的失活步骤、超滤和/或层析步骤，这些步骤基于涉及待除去的病原体的不同生理性质。
13.如权利要求1-2中任一项的方法，其特征在于纯化序列还包括下列步骤：
i.阳离子多峰树脂；
ii.用于脂质包封病毒的基于化学的失活步骤；
iii.基于蛋白配体的亲和树脂；
iv.平均孔尺寸20nm的病原体过滤除去步骤；
v.阴离子交换树脂；
vi.超滤步骤。
14.如权利要求13的方法，其特征在于多峰层析步骤与亲和层析步骤组合，其中亲和性由基于在酵母中表达的蛋白的配体提供，并且亲和层析树脂所得产物的纯度大于95％。
15.如权利要求14的方法，其特征在于进行其它层析步骤，它们选自尺寸排阻、阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用和固定化金属亲和层析，最终产品的纯度大于99％。
16.如权利要求5的方法，其特征在于用pH为6至8的缓冲液洗脱维生素K依赖性蛋白。
17.如权利要求5的方法，其特征在于用pH为7的缓冲液洗脱维生素K依赖性蛋白。
18.如权利要求13的方法，其特征在于，
i.阳离子多峰树脂是CaptoMMC；
ii.用于脂质包封病毒的基于化学的失活步骤是使用磷酸三正丁酯和TritonX-100的
溶剂/清洁剂失活；
iii.基于蛋白配体的亲和树脂采用由在酵母中表达的维生素K依赖性蛋白抗体片段
组成的配体；
iv.平均孔尺寸20nm的病原体过滤除去步骤采用Planova20N；
v.阴离子交换树脂是Q琼脂糖凝胶FF或CaptoQ；
vi.超滤步骤采用具有10kDa截留分子量的Pellicon3。
CN201180017406.5A 2010-03-30 2011-03-30 纯化维生素k依赖性蛋白如凝血因子ix的方法 Expired - Fee Related CN102858971B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10158511.5 2010-03-30
EP10158511 2010-03-30
US28289510P 2010-04-16 2010-04-16
US61/282,895 2010-04-16
PCT/EP2011/054906 WO2011121020A1 (en) 2010-03-30 2011-03-30 A process for purifying vitamin k dependent proteins such as coagulation factor ix

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102858971A CN102858971A (zh) 2013-01-02
CN102858971B true CN102858971B (zh) 2016-06-01

Family

ID=42154362

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180017406.5A Expired - Fee Related CN102858971B (zh) 2010-03-30 2011-03-30 纯化维生素k依赖性蛋白如凝血因子ix的方法

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20130079498A1 (zh)
EP (2) EP2553095B1 (zh)
JP (1) JP5876868B2 (zh)
KR (1) KR101829860B1 (zh)
CN (1) CN102858971B (zh)
AU (2) AU2011234521B2 (zh)
BR (1) BR112012024550B1 (zh)
CA (1) CA2793136C (zh)
DK (2) DK2553095T3 (zh)
ES (2) ES2740825T3 (zh)
IL (2) IL221609A (zh)
MX (1) MX2012011066A (zh)
RU (2) RU2731720C2 (zh)
TR (1) TR201911082T4 (zh)
WO (1) WO2011121020A1 (zh)
ZA (1) ZA201207227B (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105777862A (zh) 2012-10-24 2016-07-20 建新公司 使用mes和mops作为流动相改性剂从多峰树脂洗脱生物分子
CN105175486A (zh) * 2015-10-20 2015-12-23 上海洲跃生物科技有限公司 一种高纯人凝血因子ix的制备方法
CN105330736A (zh) * 2015-11-06 2016-02-17 上海洲跃生物科技有限公司 一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子ix及vii的方法
CN105326859A (zh) * 2015-11-09 2016-02-17 上海洲跃生物科技有限公司 一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法
WO2018187388A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 Scarab Genomics, Llc Improved purification of crm 197 from bacteria
CN107460182B (zh) * 2017-09-01 2020-12-18 上海太阳生物技术有限公司 一种制备活化猪血浆凝血因子x的方法
CN109444422A (zh) * 2018-12-17 2019-03-08 福建省立医院 一种基于upt-lf定量测定血清pivka-ii的检测卡及其构建方法及应用
CN111378029B (zh) * 2018-12-29 2023-05-05 四川远大蜀阳药业有限责任公司 一种人凝血因子ix的制备方法
CN110257358B (zh) * 2019-06-10 2023-05-19 广东双林生物制药有限公司 一种高纯人凝血因子ix制剂的生产方法
CN111925450B (zh) * 2020-09-21 2020-12-15 迈威(上海)生物科技股份有限公司 一种去除毕赤酵母表达重组蛋白聚集体和/或降解片段的方法
CN113267390B (zh) * 2021-05-11 2023-05-05 北京丹大生物技术有限公司 一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液及其应用
CA3233419A1 (en) * 2021-09-28 2023-04-06 Kashiv Biosciences, Llc An improved process for purification of protein

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2027875A1 (en) * 2007-08-23 2009-02-25 Octapharma AG A Process for Isolation and Purification of a Target Protein free of Prion Protein (PrPSC)
WO2009156430A1 (en) * 2008-06-24 2009-12-30 Octapharma Ag A process of purifying coagulation factor viii

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4540573A (en) 1983-07-14 1985-09-10 New York Blood Center, Inc. Undenatured virus-free biologically active protein derivatives
DK162233C (da) * 1989-11-09 1992-03-16 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii
CA2105282C (en) * 1991-03-01 2002-09-24 Centeon L.L.C. Preparation of factor ix
US5286849A (en) * 1992-07-14 1994-02-15 Alpha Therapeutic Corporation Purification of factor IX
DE19506633A1 (de) * 1995-02-25 1996-08-29 Octapharma Ag Verfahren zur Herstellung von Faktor IX aus biologischen Quellen
US5714583A (en) * 1995-06-07 1998-02-03 Genetics Institute, Inc. Factor IX purification methods
AU766551C (en) * 1998-08-28 2005-02-17 Genentech Inc. Human anti-factor IX/IXa antibodies
RU2321633C2 (ru) * 2001-02-16 2008-04-10 Ново Нордиск Хелт Кэр Аг Способ получения витамин к-зависимых белков
SE0203551D0 (sv) * 2002-12-02 2002-12-02 Biovitrum Ab Prothrombin purification
US20040106779A1 (en) * 2002-12-03 2004-06-03 Bigler Douglas E. Modified factor IX preparation
US7750129B2 (en) 2004-02-27 2010-07-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Process for the purification of antibodies
AU2005252296B2 (en) 2004-06-07 2009-08-20 Evolve Biologics Inc. Isolation of plasma or serum proteins
MXPA06014318A (es) * 2004-06-07 2007-08-02 Avt Plasma Ltd Proceso para aislamiento de proteinas.
WO2006067230A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Novo Nordisk Health Care Ag Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin k-dependent protein of interest
EP1707634A1 (en) * 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
EP1739179A1 (en) 2005-06-30 2007-01-03 Octapharma AG Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines
ES2364118T3 (es) 2007-07-11 2011-08-25 Novo Nordisk A/S Purificación de factor viii usando una resina de modo mixto o multimodal.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2027875A1 (en) * 2007-08-23 2009-02-25 Octapharma AG A Process for Isolation and Purification of a Target Protein free of Prion Protein (PrPSC)
WO2009156430A1 (en) * 2008-06-24 2009-12-30 Octapharma Ag A process of purifying coagulation factor viii

Also Published As

Publication number Publication date
CA2793136C (en) 2019-05-07
MX2012011066A (es) 2012-10-10
RU2731720C2 (ru) 2020-09-08
CN102858971A (zh) 2013-01-02
ES2740825T3 (es) 2020-02-06
JP5876868B2 (ja) 2016-03-02
EP2553095B1 (en) 2016-10-12
IL248549A0 (en) 2016-12-29
AU2015203388A1 (en) 2015-07-09
US20130079498A1 (en) 2013-03-28
DK2553095T3 (en) 2017-01-23
ZA201207227B (en) 2013-06-26
EP3133157A1 (en) 2017-02-22
JP2013523689A (ja) 2013-06-17
AU2011234521A1 (en) 2012-09-13
BR112012024550A2 (pt) 2015-09-22
AU2011234521B2 (en) 2015-04-23
ES2610529T3 (es) 2017-04-28
KR101829860B1 (ko) 2018-02-19
KR20130010474A (ko) 2013-01-28
EP2553095A1 (en) 2013-02-06
IL221609A (en) 2017-01-31
RU2016122883A (ru) 2018-11-29
RU2016122883A3 (zh) 2019-12-03
WO2011121020A1 (en) 2011-10-06
CA2793136A1 (en) 2011-10-06
EP3133157B1 (en) 2019-05-08
TR201911082T4 (tr) 2019-08-21
RU2012146084A (ru) 2014-05-10
AU2015203388B2 (en) 2017-11-16
RU2590726C2 (ru) 2016-07-10
BR112012024550B1 (pt) 2020-12-08
DK3133157T3 (da) 2019-08-12
IL248549B (en) 2020-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102858971B (zh) 纯化维生素k依赖性蛋白如凝血因子ix的方法
JP6216930B2 (ja) 組換えａｄａｍｔｓ１３および他のタンパク質を精製する方法ならびにそれらの組成物
JP5619738B2 (ja) 凝固第ｖｉｉｉ因子の精製方法
JP2017141258A (ja) 陰イオン交換クロマトグラフィによるタンパク質の精製方法
AU2015252061A1 (en) Method for Purifying Recombinant ADAMTS13 and Other Proteins and Compositions Thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160601

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee