CN107460182B - 一种制备活化猪血浆凝血因子x的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体公开了一种制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法，猪血浆用复合层析填料进行柱层析，缓冲液阶段洗脱，收集pH为3.2‑2.8的缓冲液的洗脱液；加入激活剂激活凝血因子Ⅹ；苯甲脒亲和柱层析纯化活化的凝血因子Ⅹ。与现有技术相比，本发明的制备方法通过采用复合层析填料，从猪血浆中纯化制备得到FⅩa，制备方便，减少了分离步骤，提高分离效率，降低成本，且消耗低、收率和纯度高，一定程度上解决血浆来源受限的问题，适合大规模产业化。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法。
背景技术
凝血因子Ⅹ(FⅩ)是一种维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶原，也是一种血浆蛋白，它由两条肽链组成，肽链之间以二硫键相连接。在凝血瀑布反应中，活化的凝血因子Ⅹ(FⅩa)处于内源、外源和共同途径的衔接部位，故在血液凝固的连锁反应中起关键性作用。在正常人的血浆中，凝血因子Ⅹ的含量通常为10μg/ml。
有多种合适的途径可以激活凝血因子Ⅹ，除内源性、外源性凝血途径中的血液成分能够激活凝血因子Ⅹ外，蝰蛇毒中的RVV-X、胰蛋白酶、25％的柠檬酸钠等也可以激活凝血因子Ⅹ。凝血因子Ⅹ的重链上有三个位点可以发生蛋白水解，分别命名为α-位点、β-位点、γ-位点，其中在N末端的为α-位点，在C末端的为β-位点(Mertens,K.and R.M.Bertina,Pathways in the activation of human coagulation factor X[J].Biochem J,1980.185(3):647-658)，因此凝血因子Ⅹ可以水解形成多个活化或者非活化的凝血因子Ⅹ，内源性、外源性凝血途径以及RVV-X等均能将FⅩ活化成为FⅩa。
目前大部分情况下FⅩ和FⅩa主要作为实验试剂被广泛使用，如市面上现有的肝素测定试剂盒(发色底物法)绝大多数采用FⅩa检测肝素。同时，凝血瀑布反应各步骤是一个逐级放大的过程，前一个步骤的反应会对后一个步骤的反应产生影响。因此作为凝血通道上的关键酶，FⅩa是一个很好的抗凝血和抗血栓药物的设计靶标。此外，FⅩa因其具有更高的选择性和更好的稳定性，也常作为限制性内切酶而被应用。如Pharmacia推出的GST系列目的DNA片段的载体，都是将活化的凝血因子Ⅹ设计成内切蛋白酶。因此，高效制备FⅩ及FⅩa是非常意义的。
国外对于FⅩ及FⅩ的活化状态(FⅩa)的制备方法研究进行的比较早，现在国内外已经有多种从血液中纯化FⅩ及FⅩa的方法且多以研究为目的，步骤繁琐，并主要从牛血浆和人血浆中提取。Bajaj S P等人采用先经柠檬酸钡吸附，解吸附，硫酸铵分级沉淀，所得FⅩ粗提物再采用两步离子交换层析可得电泳纯的牛FⅩ(Bajaj S P,Mann KG.Simultaneous purification of bovine prothrombin and factor X.Activation ofprothrombin by trypsin-activated factor X[J].Journal of Biological Chemistry,1973,248(22):7729-7741)。而人FⅩ的制备相对困难些，通过特异性亲和层析方法，或是常规离子交换层析、非特异性亲和层析和疏水层析中任意两种相结合的方法(Church W R,Mann K G.A simple purification of human Factor X using a high affinitymonoclonal antibody immunoadsorbant[J].Thrombosis Research,1985,38(4):417-424；Bajaj S P,Rapaport S I,Prodanos C.A simplified procedure for purificationof human prothrombin,factor IX and factor X.[J].Preparative Biochemistry,1981,11(4):397-412；Husi H,Walkinshaw M D.Purification of factor X byhydrophobic interaction chromatography[J].Journal of Chromatography BBiomedical Sciences&Applications,2001,755(1–2):367-371)是普遍认可的较为有效的从人血中制备得到电泳纯的人FⅩ的方法。
我国对血液的管理比较严格，人血来源受限，且我国是养殖大国，特别是养猪业，相比牛血来源，猪血资源更为丰富。然而，国内外极少关于从猪血浆中制备FⅩ及FⅩa的报道。张强等人以及何欢参照牛FⅩ制备方法从猪血将中提取纯化制备猪FⅩ，但报道中猪FⅩ的纯度不高且损耗大(何欢.猪血液中三种凝血因子的提取及凝血因子X的蛋白分析研究[D].湖南农业大学,2009；张强,高学军,钱珊珊,等.猪凝血因子Ⅹ及凝血因子Ⅹa的制备工艺研究[J].中国生化药物杂志,2005,26(1):24-26)，难以放大。采用目前FⅩ纯化普遍认可的有效方法，通过传统的离子交换层析填料、疏水层析填料及肝素亲和层析填料等纯化猪血浆FⅩ及FⅩa，所得猪FⅩa同样纯度不高且损耗较大。
发明内容
有鉴于此，针对目前猪FⅩa制备技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法，通过采用复合层析填料，从猪血浆中获得具有较高纯度和稳定性的活化的凝血因子Ⅹ(FⅩa)。
为实现本发明的目的本发明公开了如下技术方案：
一种制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法，包括：
步骤1：猪血浆用复合层析填料进行柱层析，缓冲液阶段洗脱，收集pH为3.2-2.8的缓冲液的洗脱液；
步骤2：加入激活剂激活凝血因子Ⅹ；
步骤3：柱层析纯化活化的凝血因子Ⅹ。
本发明所述复合层析填料为Capto Adhere填料、HEA HyperCel填料或PPAHyperCel填料，是既具有蛋白和配体的静电相互作用又具有疏水作用的层析材料。本发明所述制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法采用复合层析填料将猪血浆直接进行柱层析，复合层析填料的独特选择性可以对凝血因子Ⅹ进行有效的分离纯化，操作简单，即降低成本，又能提高凝血因子Ⅹ的得率。
进一步的，本发明所述方法步骤1中所述猪血浆还可以先进行粗提取再用复合层析填料进行分离纯化。
在一些实施方案中，所述猪血浆粗提取为猪血浆加入氯化钡溶液混匀后离心收集沉淀。
在一些实施例中，所述氯化钡溶液的加入量为每升猪血浆中加入80mL1M氯化钡溶液，所述混匀为缓慢搅拌10-30分钟。
本发明所述制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法通过阶段洗脱降低和调节缓冲液pH来推动洗脱的进行，首先用缓冲液洗去杂蛋白，再用缓冲液洗脱凝血因子Ⅹ。
所述阶段洗脱的缓冲液可以为柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液或Tris缓冲液，所述缓冲液浓度可以为0.01-0.05M。在一些实施例中，所述缓冲液为0.025M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
优选的，在上样结束后先用pH7.4缓冲液洗脱至基线平稳的步骤，以洗脱未结合的杂蛋白。
本发明所述方法所述阶段洗脱具体为用含0-0.2M NaCl的pH6.7-6.4的缓冲液、pH6.0-5.6的缓冲液、pH 3.2-2.8的缓冲液依次洗脱。即先用含0-0.2M NaCl的pH6.7-6.4的缓冲液洗脱至基线平稳后，用含0-0.2M NaCl的pH6.0-5.6的缓冲液洗脱至基线平稳，最后再用含0-0.2M NaCl的pH 3.2-2.8的缓冲液洗脱至基线平稳。
在一些具体实施方案中，所述阶段洗脱为含0.1M NaCl的0.025M pH6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、含0.15M NaCl的0.05M pH5.8柠檬酸钠缓冲液、0.05M pH3.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液依次洗脱。
本发明采用发色底物法检测确定具有凝血因子Ⅹ(FⅩ)活性的洗脱峰，收集浓缩备用。
本领域技术人员可以理解，还可以通过复合层析填料进行多次柱层析分离纯化得到更高纯度的猪血浆凝血因子Ⅹ。如先使用Capto Adhere填料进行柱层析后再使用HEAHyperCel填料(或PPA HyperCel填料)进行柱层析。
本发明所述制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法步骤2用激活剂激活凝血因子Ⅹ，获得活化的猪血浆凝血因子Ⅹ。
其中，所述激活剂为RVV-X冻干粉、柠檬酸钠或PEG。
在一些实施方案中，所述激活为RVV-X冻干粉激活，具体为加入RVV-X冻干粉、氯化钙溶液和兔脑磷脂37℃下活化3-8小时。其中RVV-X的终浓度为0.1～1mg/ml,氯化钙溶液的终浓度为0.015～0.025M，兔脑磷脂的终浓度为4.4～5.5ml/L。
在一些实施方案中，所述激活为柠檬酸钠激活，具体为加入柠檬酸钠，室温下活化22-48小时。其中加入柠檬酸钠固体使其终浓度为0.25-0.40g/ml。
在一些实施方案中，所述激活为PEG激活，具体为加入PEG4000、氯化钙溶液和甘油，调pH至6.5-7.5，室温下活化16-20小时。其中PEG4000终浓度为0.14g/ml，氯化钙终浓度为25mM，甘油终浓度为0.1ml/ml。
本领域还可以采用多种方法共同使用进行激活，例如先采用上述加入柠檬酸钠激活或PEG激活的方法激活后采用RVV-X冻干粉激活，37℃下活化1-3小时。
本发明所述方法步骤3采用柱层析纯化活化的凝血因子Ⅹ。其中所述柱层析的层析柱为苯甲脒亲和层析柱。
在一些实施方案中，所述柱层析纯化的方法具体为激活后的活化的凝血因子X直接上样至平衡好的层析柱，依次用含0.5M、0.8M、1.0M、1.3M浓度NaCl的pH6.0的缓冲液进行阶段洗脱。
优选的，所述柱层析纯化的上样结束后先用含0.3M NaCl的0.02M Mes-TrispH6.0缓冲液冲洗直至基线平稳，以洗脱未结合的杂蛋白。
本发明采用发色底物法检测确定具有活化的凝血因子Ⅹ(FⅩa)活性的洗脱峰，收集浓缩备用。
进一步，采用SDS-PAGE电泳方法检测活化的凝血因子Ⅹ(FⅩa)的纯度，显示所得FⅩa达到电泳单一纯。
本发明所述活化猪血浆凝血因子Ⅹ可以通过冷冻干燥制成冷冻干燥试剂。
具体为纯化的活化猪血浆凝血因子Ⅹ加入缓冲剂、赋形剂和冻干保护剂冷冻干燥。所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液中的一种，优选Tris-HCl缓冲液。所述冻干保护剂和赋形剂可以选择本领域技术人员已知的赋形剂和冻干保护剂，所述赋形剂优选为硫酸葡聚糖、右旋糖酐40、甘露醇、BSA、PEG6000及抑肽酶中的任意一种或者几种混合。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法，猪血浆用复合层析填料进行柱层析，缓冲液阶段洗脱，收集pH为3.2-2.8的缓冲液的洗脱液；加入激活剂激活凝血因子Ⅹ；柱层析纯化活化的凝血因子Ⅹ。与现有技术相比，本发明的制备方法通过采用复合层析填料，以及苯甲脒亲和层析从猪血浆中纯化制备得到FⅩa，制备方便，减少了分离步骤，提高分离效率，降低成本，且损耗少、收率和纯度高，一定程度上解决血浆来源受限的问题，适合大规模产业化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为FⅩ在Capto Adhere柱上的层析谱图；
图2为FⅩa在苯甲脒亲和柱上的层析谱图；
图3为猪FⅩ与FⅩa的SDS-PAGE电泳图；其中泳道1为实施例2中PPA HyperCel柱制备所得猪FⅩ；泳道2为实施例1中Capto Adhere柱制备所得猪FⅩ；泳道3为实施例6传统常规层析填料(DEAE Sepharose FF)制备所得猪FⅩ；泳道M为蛋白Marker；泳道4为实施例4用苯甲脒亲和层析所得猪FⅩa；泳道5为实施例6中传统常规层析填料制备所得猪FⅩa。
具体实施方式
本发明公开了一种制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。本发明所涉及的层析柱在上样前均需要预先用缓冲液进行平衡。所涉及的RVV-X可由本领域技术人员通过已知的分离纯化方法从蝰蛇毒中制备而得。
实施例1从猪血浆中提取纯化制备FⅩ
每升猪血浆中加入80mL 1M氯化钡溶液，缓慢搅拌30分钟，离心得FⅩ粗提物沉淀。所得沉淀溶解于0.2M EDTA pH7.4溶液中，上样前调pH至7.4。样品上样至事先用0.02MTris-HCl缓冲液pH7.4缓冲液平衡好的Capto Adhere柱，随后用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4缓冲液冲洗未结合的杂蛋白，直至基线平稳。含0.1M NaCl的0.025M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.5)、含0.15M NaCl的0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH5.8)、0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)阶段洗脱，洗脱速度1.0mL/min，5min/管，自动收集洗脱液。用核酸蛋白检测仪监测，根据A280nm值绘出洗脱线，如图1所示。采用发色底物法检测各收集部分的活性，确定FⅩ所在的洗脱峰，收集透析浓缩备用。
实施例2血浆直接经层析柱制备FⅩ
往猪血浆中加入适量已经用平衡缓冲液(0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4)平衡好的PPA HyperCel填料，温和搅拌1h。将吸附了蛋白的填料装柱，随后用平衡缓冲液充分冲洗未结合的杂蛋白，大约需要10倍柱床体积的平衡缓冲液。含0.1M NaCl的0.025M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.5)、含0.15M NaCl的0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.8)、0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)阶段洗脱，每个洗脱阶段大约需要3倍柱床体积的洗脱缓冲液，收集洗脱液。采用发色底物法检测各收集部分的活性，确定具有FⅩ活性的洗脱液，收集透析浓缩备用。
实施例3激活FⅩ
收集实施例1或实施例2中具有FⅩ活性的洗脱液加入柠檬酸钠固体，使其终浓度为0.35g/ml，室温下活化23小时。随后往其中加入纯化的RVV-X冻干粉，使其浓度为0.5mg/ml，之后每升洗脱液中再加入100mL 0.2M氯化钙溶液及5mL兔脑磷脂，37℃下活化3小时。激活完成后，透析浓缩样品并立即分离纯化。
实施例4苯甲脒亲和柱纯化制备猪FⅩa
将实施例3激活后的FⅩa经含0.3M NaCl的0.02M Mes-Tris pH6.0缓冲液透析平衡后，直接上样至事先用相同缓冲液平衡好的苯甲脒亲和柱，继续用含0.3M NaCl的0.02MMes-Tris pH6.0缓冲液冲洗未结合的杂蛋白，直至基线平稳。然后用含不同浓度NaCl(依次为0.5M、0.8M、1.0M、1.3M)的0.02M Mes-Tris pH6.0缓冲液阶段洗脱，0.5mL/min，5mL/管，自动收集洗脱液。用核酸蛋白检测仪监测，根据A280nm值绘出洗脱线，如图2所示。采用发色底物法检测各收集部分的活性，含有FXa活性主要分布在0.8M及1.0M NaCl洗脱液中，合并含有FⅩa活性的洗脱液，测定FXa的总酶活为197U。采用SDS-PAGE电泳方法检测FⅩa的纯度，如图3所示，本发明制备方法所得FⅩa达到电泳单一纯(图3泳道4)。
实施例5常规离子柱纯化制备猪FⅩa
将实施例3激活后的FⅩa经含0.1M NaCl的0.025M柠檬酸-柠檬酸钠pH6.0缓冲液透析平衡后，直接上样至事先用相同缓冲液平衡好的DEAE Sepharose FF柱，继续用含0.1MNaCl的0.025M柠檬酸-柠檬酸钠pH6.0缓冲液冲洗未结合的杂蛋白。然后用含不同浓度NaCl(依次为0.2M、0.3M、0.5M)的0.025M柠檬酸-柠檬酸钠pH6.0缓冲液阶段洗脱，收集洗脱液。采用发色底物法检测各收集部分的活性，合并含有FⅩa活性的洗脱液，测定FXa的总酶活。与实施例4实验结果相比，相同体积下，苯甲脒亲和填料制备得到的猪FⅩa的收率较高(表1)。
表1不同层析柱纯化获得的猪FⅩa活性检测结果
| 苯甲脒亲和柱纯化 | 常规离子柱纯化 | |
| FⅩa总酶活(U) | 197 | 125 |
实施例6传统常规层析填料制备猪FⅩ及猪FⅩa
每升猪血浆中加入80mL 1M氯化钡溶液，缓慢搅拌30分钟，离心得FⅩ粗提物沉淀。所得沉淀溶解于0.2M EDTA pH7.4溶液中，立即于已用0.025M柠檬酸-柠檬酸钠pH6.0缓冲液平衡好的DEAE Sepharose FF柱上进行分离纯化，然后用含不同浓度NaCl(依次为0.1M、0.2M、0.3M、0.5M)的0.010M柠檬酸-柠檬酸钠pH6.0缓冲液阶段洗脱获得猪FⅩ。然后依据实施例3所述方法激活猪FⅩ，透析浓缩后立即于已用含0.1M NaCl的0.025M柠檬酸-柠檬酸钠pH6.0缓冲液平衡好的DEAE Sepharose FF柱上进行分离纯化，然后用含不同浓度NaCl(依次为0.2M、0.3M、0.5M)的0.025M柠檬酸-柠檬酸钠pH6.0缓冲液阶段洗脱获得猪FⅩa。采用SDS-PAGE电泳方法检测FⅩ及FⅩa的纯度，如图3所示，猪FⅩa并未达到电泳单一纯，有杂蛋白存在(图3泳道5)。同时采用发色底物法检测FⅩa的活性，结果如表2所示。
表2 FⅩa活性检测结果
表2的结果显示：以同等体积猪血浆为原料，传统常规层析填料(实施例6)制得的FⅩa总酶活明显所得低于本发明制备方法(实施例4)制得的FⅩa总酶活。相比本发明制备方法，传统常规填料制备得到的猪FⅩa损耗较大，收率较低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种制备活化猪血浆凝血因子X的方法，其特征在于，包括：
步骤1：猪血浆用复合层析填料进行柱层析，用0.02Mtris-Hcl缓冲液pH7.4充分冲洗未结合的杂蛋白，缓冲液阶段洗脱，收集pH为3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的洗脱液；所述复合层析填料为Capto Adhere填料或PPA HyperCel填料；所述阶段洗脱为用含0.1 M NaCl的pH6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、0.15 M NaCl 的pH5.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、0.05M NaCl 的pH 3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液依次洗脱；
步骤2：加入激活剂激活凝血因子X；加入柠檬酸钠固体室温下活化23h，再加入RVV-X冻干粉、氯化钙溶液和兔脑磷脂37℃下活化3小时；
步骤3：柱层析纯化活化的凝血因子X；所述柱层析的层析柱为苯甲脒亲和层析柱；步骤3所述柱层析具体为激活后的活化的凝血因子X直接上样至平衡好的层析柱，依次用含0.5M、0.8M、1.0M、1.3M浓度NaCl的pH6.0的缓冲液进行阶段洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述猪血浆在用复合层析填料进行分离纯化前还包括猪血浆粗提取的步骤；所述猪血浆粗提取为猪血浆加入氯化钡溶液混匀后离心收集沉淀。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述激活步骤中的RVV-X的终浓度为0.5mg/ml, 氯化钙溶液的终浓度为0.02M，兔脑磷脂的终浓度为5 ml/L；柠檬酸钠的终溶度为0.35 g/ml。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3纯化后还包括加入缓冲剂、赋形剂和冻干保护剂冷冻干燥的步骤。
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