JPH0664B2

JPH0664B2 - 化学的プロセス

Info

Publication number: JPH0664B2
Application number: JP1501523A
Authority: JP
Inventors: アントニーフェルドマン，ピーター
Original assignee: SENTORARU BURATSUDO LAB OOSORITEII
Current assignee: SENTORARU BURATSUDO LAB OOSORITEII
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2009-01-05
Also published as: WO1989005650A3; EP0391974B1; DK175514B1; AU627446B2; ATE90567T1; AU3032989A; JPH03501085A; DE3881895D1; DK153490D0; WO1989005650A2; NO178882B; DK153490A; NO902757L; GB8729822D0; DE3881895T2; NO902757D0; EP0391974A1; NO178882C

Description

【発明の詳細な説明】本発明はビタミンＫ依存性血液凝固因子を含有した分画
中におけるかかる因子の精製又は豊富化のために改良さ
れた方法に関する。

ヒト又は動物起源の血液から得られる血漿はいくつかの
有益な生理学的活性物質、特に様々な血液凝固因子を含
有しており、それらの一部はかかる物質の１以上を欠く
個体の治療用医薬として用いられる。血液凝固因子、即
ちいわゆる血液凝固カスケードの構成因子は下記様式で
関連した不活性及び活性タンパク質分解酵素及び修正タ
ンパク質の群からなっている：付随文字“ａ”は酵素が活性形であることを意味する。

血液凝固因子の一般的カテゴリー内に属するとみなされ
る更に重要な血漿タンパク質としてはプロテインＣ及び
プロテインＳがある。プロテインＣはタンパク質分解酵
素活性プロテインＣ（ＡＰＣ，ＰＣａ）の不活性チモー
ゲンである。上記凝固因子とは異なり、ＡＰＣはこのよ
うに不活性であるＶ因子及びVIII因子のタンパク質分解
を介して機能する抗凝固効果を有している。プロテイン
Ｃの活性化は双方とも凝固プロセスで機能するトロンビ
ン及び内皮結合タンパク質のトロンボモジュリンを要す
るフィードバックプロセスによるらしい。その際にＡＰ
Ｃの活性は補因子として作用するらしいプロテインＳの
存在によって高められる。

上記因子のいくつか、即ちII、VII、IX及びＸ因子更に
プロテインＣ及びプロテインＳはビタミンＫ依存性であ
ることが示された。活性及び不活性形双方のこれら因子
（活性化II因子を除く）は末端γ−カルボキシグルタミ
ン酸残基を有するが、これはビタミンＫで媒介される酵
素プロセスによって導入される。加えて、プロテイン
Ｃ、プロテインＳ、Ｘ及びIX因子は、但しプロトロンビ
ン（II因子）を除くが、修正されたアスパラギン酸残
基、即ちβ-ヒドロキシアスパラギン酸残基を有するこ
とが判明した。

このようにビタミンＫ依存性血液凝固因子とは、密接に
類似した物理化学的性質を有する関連酸性タンパク質群
を表す。これら物質の酸性性質はそれらを一群として単
離することを既に可能としたが、但しそれらの構造的及
び化学的類似性は陰イオン交換クロマトグラフィーのよ
うな常法で個々のタンパク質を分離することを困難にし
た。

プロトロンビン複合体の一部ではないVIII因子は別とし
て、最も頻繁に投与される血液凝固因子はIX因子であ
る。伝統的には、IX因子はプロトロンビン複合体のすべ
ての因子II、VII、IX及びＸの濃縮物として提供される
が、但しVII因子は時々IX、II及びＸとは別に提供され
る。

このようなIX因子濃縮物の注入後、静脈血栓症及び散在
性血管内凝固（ＤＩＣ）に関していくつか報告されたケ
ースがあった。これらの望ましくない応答は、IX因子と
共に注入された高レベルの不必要な凝固因子及び／又は
濃縮物中の望ましくないトロンボゲン成分によって助長
される高凝固状態のせいであろう。IX因子の強度なかつ
長期の投与でII因子のレベルを正常よりも非常に高くし
てしまい、II因子は等量で注入されて血漿中で長い半減
時間を有する。インビトロ研究又は動物モデルに基づく
一部の仮説でも、諸因子の組合せがIX因子単独よりも高
いトロンボゲン性であることを示唆している。当然なが
らIX因子の現投与量レベルは、II因子の過剰レベルを避
ける必要性から一部制限されている。

更にVIII因子濃縮物による治療後、一部の血友病Ａ患者
では非ウイルス性免疫抑制の徴候を示す。IX因子濃縮物
による治療後の血友病Ｂ患者における同様の免疫抑制か
らみても、双方のケースの応答が濃縮物中における望ま
しくない汚染物質のせいらしいことを示唆している。

凝固因子濃縮物が製造されるドナー血漿プールは非Ａ非
Ｂ型肝炎の原因物質（おそらくウイルス）を含有してお
り、ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎及びＨＩＶ）汚染リス
クを有すると仮定しなければならない。製品を安全に改
善するためには、濃縮物は殺ウイルス処理をうけねばな
らないが、これは汚染タンパク質の存在で複雑化される
であろう。例えば、この殺ウイルス処理は不必要なタン
パク質による干渉が最少に抑制される高度に精製された
濃縮物で考えることが容易であろう。

一般に、他の因子又は更に望ましくない生理学的効果を
示すいかなる汚染物質のレベルも同時に高めることなく
ヒト患者の特定凝固因子に代わる又はそれを補充するよ
うに考えられた血液凝固因子を投与することが原則とし
て好ましい。

このため上記問題の一部を緩和又は更に解決するためビ
タミンＫ依存性凝固因子を少なくとも部分的に分離する
改良法に関して必要性がある。ビタミンＫ依存性血液凝
固因子は金属キレートクロマトグラフィーで少なくとも
部分的に互いに分離されうることがここに発見されたの
である。

本発明によれば、ビタミンＫ依存性血液凝固因子を少な
くとも１種のかかる因子を含有した混合物から少なくと
も部分的に分離する方法が提供され、その方法は上記混
合物が不活性支持体に固定化された多価金属のキレート
に吸着されしかる後上記因子の１種に関して富む１以上
の分画を得るため溶出されることで特徴付けられる。

一般に、上記混合物は少なくとの２種のビタミンＫ依存
性血液凝固因子を含有している。このため本発明では組
換えＤＮＡ技術を用いて微生物培養物から得られる十分
に機能化された凝固因子の精製及び豊富化を伴うが、凝
固因子源は通常血漿、特にヒト血漿である。

本発明に従い処理される因子の混合物は、最も普通には
一部の血漿因子が既に除去された血漿分画濃縮物であ
る。

血漿から混合因子を得る場合、望ましい成分を含有した
典型的初期分画としては凍結沈澱上澄（上澄はVIII因子
濃縮物の凍結沈澱後に残留する）、フラクションＩ上澄
及び様々なアフィニティ試薬、例えばヘパリンセファロ
ース（Sepharose）で血漿の吸着後に得られる分画があ
る。一般に、因子はプロトロンビン複合体濃縮物を得る
ためジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース、Ｄ
ＥＡＥセファデックス（Sephadex）又はＤＥＡＥセファ
ロースのような陰イオン交換樹脂への吸着によって更に
濃縮されるであろう。

IX因子製造用に最適の条件下でＤＥＡＥセルロースはVI
I因子と結合しないが、高能力イオン交換剤（例えば、
ＤＥＡＥセファデックス及びＤＥＡＥセファロース）は
容認された工業処理条件下で更に効率的にVII因子と結
合することに注目すべきである。このためＤＥＡＥセフ
ァロースからのプロトロンビン複合体濃縮物はVII因子
を含有していない。挙動上のこの差異に基づき主にVII
因子を含有した濃縮物を得ることができるが、これは本
発明による精製及び豊富化からでも効果的である。陰イ
オン交換樹脂濃縮物は本発明に従い有利に処理される
が、他の組合せの因子であっても望ましい因子の濃度を
高めるため有利に処理される。特に、本発明に従い得ら
れ２種のみの因子を含有した豊富化分画は更に豊富化さ
せるため第二の処理に付してもよい。

現在の精製系はいくつかの本質的欠点を有している。ヘ
パリン−セファロースは工業規模で用いられた場合に分
離及び凝固因子活性に乏しい。硫酸デキストランは非常
に短いＮＡＰＴＴ（後記参照）でIX因子を生成して臨床
的使用で血栓症状を発現することがあり、しかも硫酸デ
キストランは細胞毒性があって、このようなアフィニテ
ィマトリックスからの漏出で生成物をひどく汚染するこ
とがある。本処理法はこれらすべての面に関してかかる
精製系以上の利点を有する。

何らかの効果は初期混合物を固定化された金属キレート
でバッチ様式により処理ししかる最後も容易に溶出する
因子を除去するため単に洗浄することで得られるが、最
も好ましい操作方式はカラムクロマトグラフィーであ
る。このため因子の混合物はカラムの最上部に適用さ
れ、分離された及び部分的に分離された因子を含有した
分画を得るため溶出液が通される。一方、初期混合物は
カラムに担持させる前固定化された金属キレートにバッ
チ様式で適用してもよい。

本発明のプロセスでの使用のためのキレート化多価金属
は通常二価状態であり、Ｃｕ²⁺が特に好ましい。

固定化されたキレート化剤は多価金属をキレート化しう
る基を有した慣用的主鎖又は骨格支持体（例えば、セル
ロース、ポリスチレン、アクリルアミド、シリカ、フッ
化炭素類、架橋デキストラン又は架橋アガロースに基づ
く支持体）である。このような基は周知であって、マー
テル（Martell）及びカルビン（Calvin），金属キレー
ト化合物の化学，プレンティス・ホール社（Prentice H
all,Inc.），ニューヨーク，１９５２年のようなテキス
トブックでみられる。

イミノ二酢酸基-Ｎ（ＣＨ₂ＣＯＯＨ）₂が特に好ましい
キレート化基である。

キレート化基は通常キレート化基及び支持体間で有利に
は８〜１６の原子、例えば約１２原子を有する場合によ
り置換された炭化水素又は炭化化物鎖のような直鎖“ス
ペーサー”基で支持体の主鎖又は骨格から隔たってい
る。このようなスペーサー基は望ましい鎖長の二価試薬
との反応で適切な基質中に導入される。好ましい金属結
合マトリックスは下記鎖：でセファロースに結合されたイミノ二酢酸基を有するフ
ァルマシア社（Pharmacia AB）市販ビーズ化６％アガロ
ース製品のキレート化セファロースである。

キレート化支持体に対するタンパク質の結合性は下記の
少なくとも４つの考慮事項：（１）イオン強度（高イオ
ン強度は見掛上非特異的結合を最小に抑制する）；
（２）担持されるサンプル及び平衡化金属キレートゲル
の双方中における緩衝イオンの存在；（３）マトリック
スの担持能（これは弱く結合するタンパク質を犠牲にし
て更に強く結合するタンパク質で十分に飽和されうる有
限量である。このため具体的タンパク質に関するマトリ
ックス能はそれが担持及び吸着接触時間中に適用される
タンパク質混合物の組成及び濃度に依存している）；
（４）結合性及び溶出の双方、に依存しているが、pHが
認識されたエフェクターである。

比較的高いイオン強度下においてプロトロンビン（II因
子）及びトロンビンのキレートに対する結合性は低下す
るが、一方IX、Ｘ因子及びプロテインＣの場合は増加す
ることが発見された。一般に、トロンビン形成の可能性
を回避する上で他の血液凝固因子の濃縮物中におけるプ
ロトロンビンレベルを低下させることが望ましいため、
この発見は特に有用である。このため例えば０．４〜
１．０Ｍ、好ましくは０．４〜０．６Ｍ、最も好ましく
は約０．５Ｍの塩化ナトリウム及び／又は等イオン強度
の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有した比較的
高イオン強度の水溶液に金属キレートを加えることが好
ましい。

異なるビタミンＫ依存性凝固因子はキレート化ゲルとの
結合性に関して異なるpH適性を有しており、したがって
添加される緩衝液のpHの選定は１種以上のビタミンＫ依
存性凝固因子のキレート化ゲルに対してもう１つのかか
る因子よりも優先的な結合を促進させるための手段を更
に提供することになる。このため例えばＣｕ²⁺プライム
化キレート化セファロースの場合、II、IX、Ｘ因子の至
適結合は各々pH６．０〜７．０、pH７．０以上及びpH
６．５〜７．５で起きる。したがって例えばプロトロン
ビン以上のIX因子のかかるゲルに対する示差的な結合性
を高めるためには、適用pHはpH７．０以上であることが
望ましい。

更に１種以上の他のビタミンＫ依存性凝固因子からプロ
トロンビンを除去することが望まれる場合、他の血液凝
固因子、例えばIX因子に適したプロトロンビンの低結合
性は吸着接触時間及び担持量チャレンジの適切な選定に
よって促進される。このためプロトロンビン複合体濃縮
物から出発する場合Ｃｕ²⁺プライム化キレート化セファ
ロースによるII因子からIX因子の分離を最適化するため
には、吸着接触時間は有利には２０分間以上、更に好ま
しくは約４０分間以上であり、１００〜４５０Ｆ．IX：
Ａｇ単位／mlゲルのIX因子担持が達せられるような担持
量チャレンジが望ましい。

カラムクロマトグラフィーが好ましい。因子の初期混合
物はカラムの最上部に適用されることが好ましいが、固
定化されたキレートにバッチ様式で初期混合物を担持さ
せてもよい。洗浄後、高イオン強度の場合にはほとん
ど、残留因子はバッチ溶出か又はクロマトグラフィー溶
出用カラムにゲルを移すかのいずれかで分離することが
できる。

担持は、存在するかもしれないプロトロンビン及びトロ
ンビンを除去するため同一又は同様のイオン強度及びpH
の水溶液で直ちに洗浄することが望ましい。有利には、
酸性pH洗浄ステップがキレート化ゲルからインター-α-
トリプシンインヒビターを除去するため更に行われる。
このタンパク質は従来技術で製造されたIX因子濃縮物の
望ましくない主汚染物質として認識されており、一部の
場合には全タンパク質の３０％もの多くを占めている。
しかしながら、インター-α-トリプシンインヒビターは
ゲルからIX因子の明白な損失なしにpH約４．５〜５．５
でＣｕ²⁺プライム化キレート化セファロースから溶出さ
せることができることが見出された。最終製品中の電解
質レベルを減少させるためには、例えば１００〜２００
mMＮａＣｌに相当する低イオン強度で少なくとも１回最
終洗浄ステップを加えることが都合よい。

洗浄操作ではタンパク質が固定された状態における追加
洗浄ステップでウイルスを若干除去する。更に固定化因
子はこの段階で界面活性剤のような殺ウイルス剤により
処理され、しかる後殺ウイルス剤は溶出ステップ前に更
に洗浄することで除去される。金属キレート物質は本発
明による初期吸着前に殺ウイルス剤として用いられる界
面活性剤及び／又は溶媒の存在下で目的のタンパク質因
子と容易に結合し、しかも殺ウイルス剤が洗浄で除去さ
れる場合又は更に殺ウイルス剤の界面活性剤洗浄が因子
の溶出前に適用される場合にこれらの因子を残留させる
ことに注目すべきである。これはかかるタンパク質を吸
着させるために用いられた多くの従来のアフィニティカ
ラムと対照をなし、その場合には界面活性剤がタンパク
質を溶出させてしまう。

II因子の除去後にカラムに残留する凝固因子又は更にII
因子の実質的不存在下でカラムに適用されるこのような
因子は、得られる豊富分画から塩を除去する必要性を緩
和又は回避するために、望ましくは添加緩衝液よりも有
意に低いイオン強度下においてpHの変化及び／又はイミ
ダゾール及びアミノ酸から選択される置換剤の使用によ
り溶出される。このような溶出に適した好ましいイオン
強度は１００〜２００mMの範囲内である。

望ましい血液凝固因子の溶出がpH勾配に依存している場
合、これは増加pH勾配でも又は減少pH勾配であってもよ
いが、いずれの場合でもインター-α-トリプシンイヒビ
ターはIX因子に富む分画の回収前にキレート化剤から除
去されることが望ましい。このため溶出に増加pH勾配適
用の場合、出発pHはインター-α-トリプシンインヒビタ
ーを除去させるためpH約４．５〜５．５の低さであって
もよいが、但し通常望ましい血液凝固因子の溶出のため
pHの実質的な段階的増加をこれに続けることは明らかで
あろう。特に、例えばIX因子及びＸ因子に富む分画は例
えば１００mMＮａＣｌの比較的低イオン強度下、非アミ
ノ酸又はイミダゾール含有緩衝系の存在下でpH約７．０
からpH約８．０までpHを直線的に変化させてＣｕ²⁺プラ
イム化キレート化セファロースから溶出させることが望
ましいことが発見された。例えばプロトロンビン複合体
濃縮物の同タイプのゲル血液凝固因子から溶出させるた
め減少pH勾配を適用する場合、II因子を除去するためpH
７．０以上で例えば５００mMＮａＣｌの高イオン強化下
ゲルの洗浄後、実質上インター-α-トリプシンを含有し
ないＸ因子及びIX因子に富む分画の溶出がpH約４．０ま
での酸性pH範囲内で溶出緩衝液のｐＨの段階的減少によ
り例えば１００mMＮａＣｌの比較的低イオン強度下で行
われることが望ましい。この場合、下記順序でタンパク
質溶出が観察される：Ｘ因子／Ｖ因子（ｐＨ約５〜５．
６）、インター-α-トリプシンインヒビター／プロテイ
ンＣ（ｐＨ約４．６）、IX（ｐＨ約４．１）。

精製された又は豊富なII因子を製造することが望まれる
場合、これはアミノ酸の非存在下低イオン強度で金属キ
レートカラムが溶出されることも好ましい。

置換剤が用いられる場合、溶出液中におけるイミダゾー
ル又はアミノ酸（特に、グリシン、メチオニン又はグル
タミン酸）の濃度は５〜７０mMの範囲内であることが好
ましい。このような溶出における使用に適したアミノ酸
としては例えばアラニン、フエニルアラニン、バリン、
リジン、グリシン、メチオニン及びグルタミン酸があ
る。最後に３つ挙げられたアミノ酸がこの目的にとつて
特に好ましい。

置換剤含有溶出液は好ましくは４〜９の範囲内、更に好
ましくは６〜８、例えば約７のｐＨに緩衝化される。適
切な緩衝系としてはトリスのようなアミノアルコール緩
衝液及びクエン酸−リン酸緩衝液がある。トリスは低濃
度の置換剤、即ちイミダゾール又はアミノ酸の存在下で
すべての因子を溶出させうることがわかつている。

一般に、いずれの溶出系が用いられても、結合親和性を
反映した溶出順序はII／IIａ因子、Ｘ因子、IX／IXａ因
子／プロテインＣのようである。

一般に、溶出は溶出タンパク質比活性（純度及び／又は
効力）が最大化されるような方法で行われることが好ま
しい。一般に目的とする主因子、例えばIX因子の濃度は
少なくとも３０IU／mlであることが好ましい。

溶出後、溶液は凍結乾燥してもよい。ウイルス感染の不
活性化のため凍結乾燥濃縮物は例えば８０℃で加熱され
る。本発明者らは、本発明による精製濃縮物が実質上か
かる加熱に耐えて以前の濃縮物よりもかなり各因子の有
意の活性化を回避しうることを発見した。

本発明の方法を用いて、初めて：（ａ）II因子及びインター-α-トリプシンインヒビター
を実質上含まないIX因子；（ｂ）II、IX及びＸ因子を実質上含まないプロテイン
Ｃ；（ｃ）II因子を実質上含まずかつ少なくとも１３IU／mg
タンパク質のＸ因子比活性を有するＸ因子；及び（ｄ）II因子を実質上含まずかつ１単位／mgタンパク質
以上のVII因子比活性を有するVII因子；を製造することが可能なことを立証した。

試験方法：従来のプロトロンビン複合体濃縮物の注入後における血
栓症状の発現に関して報告された事例は、それらのトロ
ンボケン性作用に関する製品のインビトロ及びインビボ
試験に基づいていた。インビボ試験は注入後に血栓症を
評価するため様々な基準を用いて動物（ウサギ、ブタ及
びイヌ）で行われた。インビトロ試験は基質血漿又はフ
イブリノーゲンの凝固時間を減少させうる濃縮物の能力
に基づいている。これらの試験の有意性は示されなかつ
たが、但し大きなウエイトが製品品質コントロールに関
してそれらにかけられている。

３つの主な試験は以下のとおりである：ＮＡＰＴＴ：任意の下限凝固時間１５０秒間でサンプル
中における活性化凝固因子のレベルについて測定する。
ＮＡＰＴＴは結局いずれの具体的活性化凝固因子の濃度
とも関連していなかつたが、Ｆ．IXａ及びＦ．Ｘａの存
在について示している。

ＦＣＴ：試験物質存在下でフイブリノーゲン溶液が凝固
するのに要する時間を測定する。これはトロンビン（血
液凝固“カスケード”において最後から二番目のタンパ
ク質）の直接的測定である。下限凝固時間は３時間であ
つて、これはトロンビン５×１０^−３IU／ml又は２ng／
mlに相当する。

ＴＧｔ５０：既知量のトロンビンを生成するの要する時
間を測定する。それは本プロセスで早期に機能する凝固
因子の活性化に関する測定である。

下記例は説明のみの目的で示されている。

タンパク質の定量のため例中で用いられる試験機能性生物学的活性及び抗原活性の双方が目的のタンパ
ク質を定量するため利用された。

II、IX及びＸ因子の生物学的活性は確立された凝固アッ
セイで測定された。凝固活性（：Ｃ）の単位数はII、IX
及びＸ因子濃縮物に関する一次国際標準コード８４／６
８１に対して較正されたワーキング標準８７／５３２を
用いて決定された。

XII因子の生物学的活性は確立された凝固アッセイ又は
合成基質を用いた発色原アッセイで測定された。双方の
場合において、単位数はドナー３０例以上のヒト血漿プ
ールに対して較正され１．０Ｆ．XII：CU／mlのVII因子
活性を有するとして規定される自家VII因子濃縮物ワー
キング標準を用いて決定された。

II、Ｘ、IX及びＸ因子、プロテインＣ並びにインター-
α-トリプシンインヒビターに関するものすべての抗原
活性（：Ａｇ）は標準として正常プール血漿を用い免疫
電気泳動〔ローレルのロケツト法(Laurell's Rocket me
thod)〕で測定された。各場合において、標準は１．０
単位／mlの効力に選定されており、サンプル活性は血漿
当量単位／mlとして表された。

本明細書において、凝固活性又は“因子-：Ｃ″は国際
単位／ml又はIU／mlで示される。抗原活性又は“因子
-：Ａｇ”は単位／ml（U/ml）又は血漿当量単位／ml(pe
u/ml)で示される。

凝固及び抗原活性はタンパク質化学の異なる面の測定で
あるため、凝固活性の国際単位は血漿当量単位と同じで
はない。典型的には、部分的精製タンパク質濃縮物中に
おいてII因子、IX因子及びＸ因子に関するIU：peuの比
は各々０．８６、０．６及び０．６３である。

例１プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）からのプロトロ
ンビンの製造キレート化セフアロースをそれに硫酸銅溶液を通すこと
で銅イオンによりプライム化した。次いでゲルをｐＨ
７．０の５００mMＮａＣｌ含有クエン酸-リン酸緩衝液
で洗浄した。５００mMＮａＣｌ含有ＰＣＣをIX因子
１００〜２００IU／mlゲルの担持量でカラムに適用し
た。タンパク質溶出液をモニターし、漏出タンパク質を
回収した。これは５〜２５のIU／mlの効力で比活性５IU
／mgタンパク質を有するプロトロンビンを含有してい
た。この物質は少なくとも７０％のプロトロンビであつ
た。

例２ II、IX、Ｘ因子及びプロテインＣの銅-キレートゲルへ
の結合性に関するイオン強度の効果ＰＣＣを１００、２５０、５００又は１０００mMＮａＣ
ｌ含有pH７．０のクエン酸-リン酸緩衝液に対して透析
した。次いでこれを同一イオン強度緩衝液で洗浄された
Cu²⁺プライム化キレート化セフアロースカラムに担持さ
せた。４３０単位／mlゲルで担持後、カラムを同一緩衝
液で更に洗浄し、溶出未結合タンパク質をII、IX、Ｘ因
子及びプロテインＣに関して分析した。下記第１表はそ
の結果について示している。

II因子と比較したIX因子の最大差結合性は５００mMＮａ
Ｃｌで観察された。

例３ II、IX及びＸ因子の銅-キレートゲルへの結合性に関す
る吸着pHの効果キレート化セフアロースを最初銅イオンでプライム化
し、しかる後下記レベルに調整されたｐＨの５００mMＮ
ａＣｌ含有クエン酸-リン酸緩衝系で洗浄した。５００m
MＮａＣｌ含有ＰＣＣを同一ｐＨまで滴定し、しかる後I
X因子約３００単位／mlゲルでゲルに担持させた。カラ
ムを同一緩衝液で更に洗浄し、漏出／未結合タンパク質
を回収し、II、IX及びＸ因子に関して測定した。下記第
２表はその結果について示している。

II因子の至適結合はｐＨ６．０〜７．０で達せられた。
IX因子の至適結合はｐＨ７．０以上で達せられた。

Ｘ因子の至適結合はｐＨ６．５〜７．５で達せられた。
したがつて、吸着ｐＨはゲルへの好ましい凝固因子の結
合性を最適化させるために用いることができる。

例４低プロトロンビン含有Ｘ因子及びIX因子濃縮物の製造キレート化セフアロースカラムを例１のように調製して
担持させた。ＰＣＣの適用後、カラムをpH７．０の５０
０mMＮａＣｌ含有クエン酸-リン酸緩衝液で洗浄した。
次いでイオン強度を１００mMＮａＣｌ含有クエン酸-酸
緩衝液による洗浄で低下させた。次いでＸ因子分画を１
００mMＮａＣｌ及び５mMグリシン含有クエン酸-リン酸
緩衝液で溶出させた。これはＸ因子１５〜４０IU／ml及
びＸ因子１単位当たりプロトロンビン０．０１単位以下
を含有していた。Ｘ因子比活性は１３IU／mgタンパク質
であり、したがつて純度７％であつた。この分画はほぼ
当モル量（Ｘ因子１単位当たりIX因子１IU）でIX因子も
含有していた。

例５低プロトロンビン及びIX因子含有Ｘ因子の製造キレート化セフアロースカラムを例１で記載されたよう
にプライム化して担持させた。サンプルの適用後、カラ
ムをpH７．０の５００mMＮａＣｌ含有クエン酸-リン酸
緩衝液で洗浄した。次いでＸ因子をpH７．０の５００mM
ＮａＣｌ及び５mMグリシン含有クエン酸-リン酸緩衝液
で溶出させた。この物質は比活性１４IU／mgタンパク質
でＸ因子１５〜３０IU／mlを含有していた。この物質は
高プロトロンビ活性及び低IX因子活性を有することから
例４で得られた物質と異なつていた。ここでは０．２５
IU／単位Ｘ因子でプロトロンビン及びIX因子双方に関し
得られた。したがつて、プロトロンビンはなお全タンパ
ク質中約４０〜５０重量％であつた。

例６低プロトロンビン含有IX因子及びＸ因子濃縮物の製造キレート化セフアロースカラムを例１で記載されたよう
にプライム化して担持させた。次いでそれを最初５００
mMしかる後１００mMＮａＣｌを含有したpH７．０のクエ
ン酸-リン酸緩衝液で連続的に洗浄した。次いでIX因子
及びＸ因子双方を３０IU／mlの効力で１００mMＮａＣｌ
含有トリス-グリシン緩衝液により溶出させた。プロト
ロンビンはIX因子及びＸ因子１単位当たり０．０３IUま
で減少した。

例７低プロトロンビン及びＸ因子含有IX因子及びプロテイン
Ｃ濃縮物の製造キレート化セフアロースカラムを例４で記載されたよう
に調製して洗浄した。５mMグリシンでタンパク質溶出
後、トリス-グリシン緩衝液を用いてIX因子を溶出させ
た。トリスは１０〜３０mMの範囲、グリシンは４０〜７
０mMの範囲内であつてかつＮａＣｌは１００mMであるこ
とが適切と判明した。これにより３０〜５０IU／mlの効
力でIX因子を溶出させた。プロトロンビンは検出され
ず、Ｘ因子はIX因子１単位当たり０．０１単位以下
（０．０５重量％以下）であつた。プロテイＣも２５〜
４０血漿当量単位／mlの濃度で溶出した。

例８プロトロビン及びＸ因子からプロテインＣの分離プロテインＣの精製はヘパリン-セフアロース又はデキ
ストラン-サルフエート-セフアロースのような慣用的ク
ラマトグラフイーの場合プロトロンビン及びＸ因子の共
溶出によつて複雑化される。しかしながら、これらの系
では、IX因子汚染はそのタンパク質の強い結合性のせい
で最少である。したがつて、前記金属キレート系もプロ
テインＣの精製に際しては一ステツプとして用いてよ
い。

キレート化セフアロースカラムの調製及び洗浄は例７で
記載されたとおりであつた。タンパク質結合性は濃度依
存性であるため、担持量はＸ因子１６０IU／mlゲル又は
プロトロンビン２４０IU／mlゲル以内で可能なかぎり高
くした。次いでカラムを洗浄し、例７で記載されたよう
に溶出させたところ、プロテインＣは最終トリス-グリ
シン緩衝液溶出液中に溶出して、プロトロンビン及びＸ
因子汚染物から分離された。

例９ Cu²⁺プライム化キレート化セフアロースによるII因子、
IX因子、Ｘ因子及びプロテインＣの結合性及び回収率に
関する吸着接触時間の効果キレート化セフアロースをカラムに充填し、銅イオンで
プライム化し、しかる後pH７．０の５００mMＮａＣｌ含
有クエン酸-リン酸緩衝液で洗浄した。５００mMＮａＣ
ｌ含有ＰＣＣをゲルとの接触時間が異なるカラム毎に変
わるよう制御された流速で各カラムに担持させた。カラ
ムにIX因子４３０単位／mlゲルで担持させ、５００mMＮ
ａＣｌ緩衝液、１００mMＮａＣｌ緩衝液、しかる後ｐＨ
７．０の１０mMトリス、７０mMグリシン、１００mMＮａ
Ｃｌ緩衝液で洗浄した。漏出物及びトリス-グリシン溶
出液をII因子、IX因子、Ｘ因子及びプロテインＣに関し
て測定した。結果は下記第３表で示されている。

したがつてゲルへのタンパク質結合性は接触時間に依存
している。これによりIX、Ｘ因子及びプロテインＣに関
しては４０分間以上の接触時間で最適化させることがで
きる。接続時間が増加するほどゲルへのII因子結合性は
低下している。

例１０ Cu²⁺プライム化キレート化セフアロースによるII因子、
IX因子、Ｘ因子及びプロテインＣの結合性及び回収率に
関する担持量チヤレンジの効果キレート化セフアロースをいくつかのカラムに充填し、
銅イオンでプライム化し、しかる後ｐＨ７．０の５００
mMＮａＣｌ含有クエン酸-リン酸緩衝液で洗浄した。５
００mMＮａＣｌ含有ＰＣＣを異なる量でカラムに担持さ
せ、各カラムに関する接触時間をカラムからの流速を変
えることで４０分間維持した。次いでカラムを例６で記
載されたように緩衝液で洗浄した。結果は下記第４表で
示されている。

担持量が増加するほど優先的にII因子と置き換わる。担
持量チャレンジは他方と比較した場合の１つの特定タン
パク質の結合性及び回収率を高めるために行うことがで
きる。II因子からIX因子の分離改善は２５８〜４３０
Ｆ．IX：Ａｇ単位／mlゲル（約１５０〜２５０Ｆ．IX：
ＣIU／mlゲルに相当）の担持量で達成された。

例１１ Cu²プライム化キレート化セファロースによるII因子、I
X因子、Ｘ因子及びプロテインＣの結合性及び回収率に
関するIX因子濃度の効果キレート化セファロースを前記例で記載されたように銅
イオンでプライム化し、洗浄した。５００mMＮａＣｌ含
有ＰＣＣをpH７．０の５００mMＮａＣｌ含有クエン酸-
リン酸緩衝液で希釈した。カラムに異なる希釈率で担持
させ、例６で記載されたように緩衝液で洗浄した。全担
持量チャレンジ（約２５０単位／mlゲル）及び接触時間
は一定に保たれた。結果は下記第５表まで示されてい
る。

担持される物質の濃度が高いことはキレートとの結合を
生じさせる上で好ましい。

例１２ IX因子結合及び回収率に関するキレート化ゲルの効果等容量の５タイプのキレート化ゲルを５つのカラムに充
填し、Cu²⁺イオンでプライム化し、pH７．０の５００mM
ＮａＣｌ含有クエン酸-リン酸緩衝液で洗浄した。５０
０mMＮａＣｌを含有するように調整されたＰＣＣを各カ
ラムに等容量で担持させ、しかる後１００mMＮａＣｌ含
有の同一緩衝液で連続的に洗浄し、次いでpH７．０の１
０mMトリス、７０mMグリシン緩衝液で溶出させた。漏
出、洗浄及び溶出分画中におけるIX因子を測定した。

用いられたゲルタイプは以下のとおりであった：１．１２原子（１０炭素）スペーサー分子でセファロー
スに結合されたイミノ二酢酸を有するキレート化セファ
ロース〔ファルマシア〕；２．１と同様でおるが、但しファースト・フロー・セフ
ァロース（Fast Flow Sepharose）と更に架橋；３．１２原子（１０炭素）スペーサー分子で結合された
イミノ二酢酸を有するアガロース〔シグマ〕；４．スチレン-ジビニルベンゼン架橋ポリマーに直接結
合されたイミノ二酢酸〔キレックス１００(Chelex100),
バイオラッド(BioRad)〕；５．４と同様であるが、但し粗メッシュ非架橋マトリッ
クスと結合〔キレックス２０，バイオラッド〕；下記第６表はその結果を示している。

Cu²⁺プライム化イミノ二酢酸基に対するIX因子結合量は
マトリックス及びキレート化基間におけるスペーサー分
子の形成並びに非架橋キレート化セファロースの使用に
よって増加される。

例１３バッチ吸着においてCu²⁺プライム化キレート化セファロ
ースを用いるIX因子の製造キレート化セファロースを水洗し、しかる後硫酸銅溶液
（５mg／ml）に懸濁し、２０〜３０分間混合した。Cu²⁺
プライム化ゲルを混合物から遠心で回収し、pH７．０の
５００mMＮａＣｌ含有クエン酸-リン酸緩衝液で徹底洗
浄した。ゲルを上記のように回収し、５００mMＮａＣｌ
含有ＰＣＣの溶液に再懸濁し、２０〜３０分間混合し
た。ＰＣＣ対ゲル比は約５０IX因子：Ｃ単位／mlゲルで
あった。ゲルを遠心又は重力沈降で回収し、上澄を除去
した。

pH７．０の５００mMＮａＣｌ、しかる後１００mMＮａＣ
ｌ含有クエン酸-リン酸緩衝液による連続洗浄で弱結合
タンパク質を除去し、イオン強度を低下させた。次いで
Ｘ因子をpH７．０の１０mMトリス、５mMグリシン、１０
０mMＮａＣｌ洗浄で除去することができた。次いでIX因
子をpH７．０の１０mMトリス、７０mMグリシン、５００
mMＮａＣｌでゲルを洗浄することにより溶出させた。

例１４異なるアミノ酸溶出緩衝液を用ちるCu²⁺プライム化キレ
ート化セファロースからのIX因子回収キレート化セファロースのカラムを前記例で記載された
ようにCu²⁺イオンでプライム化し、洗浄した。ＰＣＣ
（５００mMＮａＣｌ含有）を各カラムに担持させ、しか
る後pH７．０のクエン酸-リン新緩衝液で洗浄した。IX
を（ａ）非極性アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、
フェニルアラニン、メチオニ）、（ｂ）極性非電荷アミ
ノ酸（例えば、グリシン、セリン、チロシン、グルタミ
ン）、（ｃ）極性負電荷アミノ酸（例えば、グルタミン
酸）又は（ｄ）極性正電荷アミノ酸（例えば、リジン、
アルギニン）から選択されるアミノ酸を７０mMで含有し
たpH７．０の１０mMトリスで溶出させることにより回収
した。メチオニン、グリシン及びグルタミン酸が特に有
利とわかったが、これらは８０％以上のIX因子収率及び
５IU／mg以上のIX因子比活性を示す。

例１５メチオニンを用いるキレート化セファロースからのＸ因
子及びIX因子溶出 Cu²⁺プライム化キレート化セファロースのカラムをpH
７．０の５００mMＮａＣｌ含有クエン酸-リン酸緩衝液
で洗浄した。ＰＣＣをカラムに適用し、しかる後同一緩
衝液で洗浄し、次いで１００mMＮａＣｌ含有緩衝液で洗
浄することによりイオン強度を低下させた。次いでＸ因
子をpH７．０の２〜５mMメチオニン含有トリス緩衝液で
溶出させた。Ｘ因子効力は１５U/ml以上であり、比活性
は約３０単位／mgであった。IX因子はＸ因子分画中でIX
因子約０．５単位／単位Ｘ因子まで低下し、プロトロン
ビンは０．１単位／単位Ｘ因子以下で存在していた。

IX因子は１０〜１５mMメチオニン含有トリス緩衝液によ
る洗浄で溶出することがわかった。IX因子効力は１５U/
ml以上であって、それは約２０単位／mgの比活性を有し
ていた。プロトロンビンはIX因子分画中で検出されず、
Ｘ因子はＸ因子０．１単位／IX因子以下で存在してい
た。

例１６グルタミン酸を用いるキレート化セファロースからのＸ
因子及びIX因子溶出 Cu²⁺プライム化キレート化セファロースカラムをメチオ
ニン溶出（例１５）で記載されたように調製し、洗浄
し、ＰＣＣで担持させ、洗浄した。

Ｘ因子を５〜１０mMグルタミン酸含有１０mMトリス緩衝
液で溶出させた。Ｘ因子は１６〜２２単位／mgの比活性
を有していた。

次いで比活性約１５U/mgのIX因子を溶出緩衝液中のグル
タミン酸濃度を４０mMまで高めることにより溶出させ
た。

例１７キレート化セファロースから溶出させるため増加pH勾配
を用いるIX因子及びＸ因子の製造キレート化セファロースのカラムをCu²⁺イオンでプライ
ム化し、pH７．０の５００mMＮａＣｌ含有緩衝液で洗浄
した。５００mMＮａＣｌ含有ＰＣＣをカラムに担持さ
せ、しかる後緩衝液で洗浄した。イオン強度をpH７．０
の低塩緩衝液を用いて１００mMＮａＣｌまで低下させ
た。一部のＸ因子は比活性１０．５U/mgでこの緩衝液に
より溶出した。

カラムをpH７．０〜８．５のpH勾配で段階的に溶出させ
た。IX因子及びＸ因子は各々比活性２７U/mg及び６U/mg
でpH７．１〜７．９のとき溶出した。

例１８溶出させるためpH及びグリシンを用いるIX、Ｘ因子及び
プロテインＣの製造キレート化セファロースのカラムをCu²⁺イオンでプライ
ム化し、pH７．５のクエン酸-リン酸緩衝液で洗浄し
た。５００mMＮａＣｌ含有ＰＣＣをpH７．５に調整し、
カラムに担持させ、緩衝液で洗浄した。次いでイオン強
度をpH７．５の１００mMＮａＣｌ含有クエン酸-リン酸
緩衝液による洗浄で低下させた。これにより比活性９U/
mgを有するIX因子との混合物として比活性１８U/mgのＸ
因子を溶出させた。次いで混合プロテインＣ（１５U/m
l；６．５単位／mgタンパク質）及びIX因子（１２U/m
l；５単位／mgタンパク質）分画をpH８．０の１０mMト
リス、５mMグリシン、１００mMＮａＣｌ緩衝液による洗
浄で回収した。

例１９減少pH勾配を用いるキレート化セファロースからのタン
パク質成分溶出キレート化セファロースのカラムをCu²⁺イオンでプライ
ム化し、pH７．５の５００mMＮａＣｌ含有クエン酸-リ
ン酸緩衝液で洗浄した。次いでＰＣＣをpH７．５及びＮ
ａＣｌ１５００mMへの調整後適用した。次いでII因子を
除去するため洗浄として上記緩衝液を用いた。出発物質
中のＶ因子３０％もこの洗液で除去された。次いでイオ
ン強度を１００mMＮａＣｌ含有緩衝液による洗浄で低下
させた。これにより約１５単位／mgタンパク質の比活性
でＸ因子も除去した。クエン酸-リン酸緩衝液を用い
て、pH勾配をカラムの洗浄中pH７．５〜４．０に形成し
た。選択されたタンパク質に富む分画は回収しうること
がわかった。このため例えばpH約５．５でＸ因子を更に
除去し、一方pH５〜５．６で更に４０％の結合Ｖ因子を
カラムから約５血漿当量単位／mlで除去した。

このpH範囲内でインター-α-トリプシンインヒビターも
プロテインＣと同時に溶出し始めた。緩衝液pHがpH４．
６に下がると、インター-α-トリプシンインヒビター及
びプロテインＣの溶出が各々３．０及び４．６血漿当量
単位／mgタンパク質の比活性で続いた。ほんの少量のIX
因子が減少pH勾配のこれらセグメントに際して溶出し
た。

pHが例えばpH４．１まで更に低下したとき、IX因子は効
力４０単位／ml以上及び比活性３０単位／mgタンパク質
以上で溶出した。この分画は検出可能なII因子又はＸ因
子を含していなかった。プロテインＣは約０．０１単位
／単位IX因子で存在し、Ｖ因子は０．０６単位／単位IX
因子で存在し、インター-α-トリプシンインヒビターは
０．０３単位／単位IX因子で存在した。IX因子１単位に
おけるそれらの汚染について、これは出発物質（ＰＣ
Ｃ）よりもプロテインＣ、Ｖ因子及びインター-α-トリ
プシンインヒビターに関し各々９５％、６３％及び９０
％の減少を示す。

例２０キレート化セファロースからタンパク質成分を分離する
ためのpH及びアミノ酸使用キレート化セァロースのカラムをCu²⁺イオンでプライム
化し、pH７．５の５００mMＮａＣｌ含有クエン酸-リン
酸緩衝液で洗浄した。５００mMＮａＣｌ含有かつpH７．
５に調整されたＰＣＣをカラムに担持させ、しかる後上
記緩衝液で洗浄した。更にpH７．５の１００mMＮａＣｌ
含有クエン酸-リン酸緩衝液による洗浄でイオン強度を
低下させてＸ因子を除去したが、これは少なくとも６U/
mlの効力及び少なくとも１５単位／mgタンパク質の比活
性で回収することができた。次いでpHを第三の緩衝液、
典型的にはpH４．５の１００mMＮａＣｌ含有クエン酸-
リン酸による洗浄で低下させた。これにより残留結合イ
ンター-α-トリプシンインヒビターの少なくとも５５％
及び残留結合プロテインＣの２４％を除去したが、但し
結合IX因子に関しては５％のみであった。次いでカラム
をIX因子溶出に適したpH及び塩濃度を有する緩衝液、典
型的にはpH７．０の１００mMＮａＣｌで再平衡化した。
次いでIX因子アミノ酸溶出緩衝液、例えば前記例で記載
されたような１００mMＮａＣｌ含有トリス緩衝液中グリ
シンで溶出させた。これにより２００U/mgタンパク質以
上の比活性を有するIX因子を得た。プロテインＣも２０
血漿当量単位／mgタンパク質の比活性で存在していた。

出発ＰＣＣ物質として、IX因子分画は有意に低量の汚染
タンパク質しか含有していなかった。II因子、Ｘ因子、
Ｖ因子及びインター-α-トリプシンインヒビターはIX因
子１単位当り各々０．０００５、０．００５、０．００
２及び０．０４単位のレベルで存在していた。これはＰ
ＣＣ出発物質中各々１．０、１．０、０．２及び０．４
の値に匹敵する。

例２１ Cu²⁺プライム化キレート化セファロースによるVII因子
の製造キレート化セファロースのカラムをCu²⁺イオンで荷電
し、しかる後pH７．０の５００mMＮａＣｌ含有クエン酸
-リン酸緩衝液で洗浄した。凍結上澄又はIX因子消失上
澄で吸着されたＤＥＡＥ−セファロースの溶出により得
られたVII因子濃縮物を５００mMＮａＣｌを含有するよ
うに調整し、５０〜１５０VII因子単位／mlゲルでカラ
ムに担持させた。上記緩衝液で洗浄後、イオン強度をpH
７．０の１００mMＮａＣｌ含有クエン酸-リン酸緩衝液
による洗浄で低下させた。VII因子を１００mMＮａＣｌ
含有pH７．０の１０mMトリス、６０mMグリシンでカラム
を洗浄することにより１単位／mg以上の比活性で回収し
た。

例２２キレート化セファロースに吸着された血漿凝固因子の界
面活性剤処理キレート化セファロースのカラムCu²⁺イオンで電荷し、
しかる後例１で記載されたように担持させた。次いでカ
ラムpH７．０の５００mMＮａＣｌ含有クエン酸-リン酸
緩衝液で洗浄した。次いでカラムを少なくとも４倍層容
量のドデシル硫酸ナトリウム１重量％含有同一緩衝液で
洗浄して、ゲルに結合された脂質成分を可溶化させた。
次いで界面活性剤を１００mMＮａＣｌ含有クエン酸-リ
ン酸緩衝液でゲルから洗い出した。この段階は脱塩でイ
オン強度を低下させるためにも役立つ。次いでIX因子を
例７で記載されたようにトリス緩衝液中グリシンでゲル
から溶出させた。同様の操作を用いるが、ドデシル硫酸
ナトリウムは同重量のコール酸又はポリオキシエチレン
(20)モノオレエート〔ツィーン８０(Tween80)〕で置き
換えてもよい。

例２３例１及び４〜７の最終分画の凍結乾燥及び次の熱処理上記特定例の溶出物を活性の損失なしに凍結乾燥し、し
かる後８０℃で７２時間加熱して潜在的ウイルス感染力
を低下させた。現ＰＣＣとは異なり、トロンビン生成は
加熱時に観察されなかった。II、IX及びＸ因子は異なる
媒体中での加熱に対して異なる安定性を示した。溶出物
をクエン酸及び水で希釈した場合、非加熱活性の６５〜
９０％の加熱収率が得られた。トリスによる希釈では非
常に大きな活性損失を招いたが、これはプロトロンビン
よりもＸ因子に関して大きく、Ｘ因子よりもIX因子に関
して大きかった。この一般的効果は下記例２４及び２５
で記載されるような利点を得る上で用いることができ
る。

例２４Ｘ因子の濃縮物中におけるIX因子活性の低下前記例４及び例６はIX因子が共存したＸ因子濃縮物の製
造について記載している。IX因子活性は凍結乾燥前にpH
７．０の５０mMトリス緩衝液による関連Ｘ因子分画の希
釈で優先的に低下させることができる。一方、溶出Ｘ因
子効力の希釈を避けるため、溶出緩衝液中のトリスはＸ
因子がその処方緩衝液中に溶出されるよう５０mMまで増
加させてもよい。凍結乾燥後、この物質は８０℃で７２
時間加熱することができる。IX因子活性はＸ因子濃縮物
として大きな特異性をもった生成物が用いられるようＸ
因子よりも低下される。

例２５高純度IX因子濃縮物の加熱処理加熱後できるだけ最大のIX因子活性収率を達成するた
め、例７で記載されたIX因子溶出物をクエン酸もしくは
クエン酸-リン酸緩衝液又は水で望ましい最終効力まで
希釈し、凍結乾燥し、しかる後８０℃で７２時間加熱処
理した。溶出緩衝液はトリスを含有していたが、但しこ
の効果は最終緩衝液中のトリス成分を有効に希釈しうる
よう十分に高いIX因子効力をもつ分画の選択によって最
少に抑制した。一方、溶出緩衝液の処方を修正して、未
希釈溶出液を直接凍結乾燥してもよい。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビタミンＫ依存性血液凝固因子を少なくと
も１種のかかる因子を含有した混合物から少なくとも部
分的に分離するための方法であって、上記混合物が不活性支持体に固定化された多価金属のキ
レートに吸着され、しかる後上記因子の１種に関して富
む１以上の分画を得るために溶出されることを特徴とす
る方法。
【請求項２】混合物が少なくとも２種のビタミンＫ依存
性血液凝固因子を含有している、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】混合物がプロトロンビン複合体濃縮物であ
る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】混合物が組換えＤＮＡ技術で産生されるビ
タミンＫ依存性血液凝固因子含有微生物培養物から得ら
れる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】不活性支持体がその上にキレート化された
Ｃｕ²⁺イオンを固定化している、請求項１〜４のいずれ
か一項に記載の方法。
【請求項６】Ｃｕ²⁺イオンがスペーサーを介してアガロ
ース支持体に結合されたイミノ二酢酸基でキレート化さ
れている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】スペーサーが８〜１６の原子を有してい
る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】混合物が、０．４〜１．０ＭＮａＣｌ及
び／又は等イオン強度の溶液を与える１種以上の他の電
解質を含有した水溶液の存在下でキレートに吸着され
る、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】該溶液が０．５ＭＮａＣｌ及び／又は等
イオン強度の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有
している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】混合物が、pH６．０以上の緩衝液の存在
下でキレートに吸着される、請求項１〜９のいずれか一
項に記載の方法。
【請求項１１】プロトロンビン複合体濃縮物が、１００
〜４５０Ｆ．IX：Ａｇ単位／mlゲルのIX因子担持量とす
るため２０分間以上にわたり請求項６に記載されたアガ
ロース支持体に吸着される、請求項８〜１０のいずれか
一項に記載の方法。
【請求項１２】混合物の吸着後に、望ましいビタミンＫ
依存性血液凝固因子に富むいずれかの分画の溶出前に結
合II因子を除去するため支持体の洗浄が行なわれる、請
求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】混合物の吸着後に、少なくとも最終洗浄
ステップが１００〜２００mMＮａＣｌ及び／又は等イオ
ン強度の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有した
緩衝液で行われる洗浄段階が続けられる、請求項１〜１
２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】支持体に吸着された１種以上の望ましい
ビタミンＫ依存性血液凝固因子の溶出がpH勾配によって
行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項１５】支持体に吸着された１種以上の望ましい
ビタミンＫ依存性血液凝固因子の溶出がグリシン、メチ
オニン及びグルタミン酸から選択されるアミノ酸を含有
した緩衝液によって行われる、請求項１〜１４のいずれ
か一項に記載の方法。
【請求項１６】特に支持体から結合インター-α-トリプ
シンインヒビターを除去するため酸性pH緩衝液を用いる
溶出ステップを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項１７】溶出ステップ後に、インヒビター及びII
因子を実質上含有しないIX因子に富む分画の回収が続け
られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】Ｘ因子に富む分画及び／又はVII因子に
富む分画及び／又はプロテインＣに富む分画がII因子を
実質上含有しないで得られる、請求項１〜１７のいずれ
か一項に記載の方法。
【請求項１９】カラムクロマトグラフィーが行われる、
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】IX因子及び少なくとも一種の他の蛋白質
を含む混合物からIX因子を少なくとも部分的に分離す
る、請求項１に記載の方法。。
【請求項２１】キレート化多価金属が銅であり、IX因子
及び少なくとも１種の他の蛋白質を含む混合物からIX因
子を少なくとも部分的に分離する、請求項１に記載の方
法。
【請求項２２】IX因子が固定化されたキレート化銅か
ら、グリシン、メチオニン及びグルタミン酸から選択さ
れるアミノ酸を含有した緩衝液によって溶出される、請
求項２１に記載の方法。
【請求項２３】プロテインＣ及び少なくとも他の一種の
蛋白質を含む混合物からプロテインＣを少なくとも部分
的に分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】Ｘ因子及び少なくとも一種の他の蛋白質
を含む混合物からＸ因子を少なくとも部分的に分離す
る、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】VII因子及び少なくとも一種の他の蛋白
質を含む混合物からVII因子を少なくとも部分的に分離
する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】混合物が、少なくとも一種の他のビタミ
ンＫ依存性血液凝固因子を含む、請求項２０〜２５のい
ずれか一項に記載の方法。