JPH053480B2 - - Google Patents

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JPH053480B2
JPH053480B2 JP59101637A JP10163784A JPH053480B2 JP H053480 B2 JPH053480 B2 JP H053480B2 JP 59101637 A JP59101637 A JP 59101637A JP 10163784 A JP10163784 A JP 10163784A JP H053480 B2 JPH053480 B2 JP H053480B2
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heparin
heparinoid
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Iipuru Yohan
Hetsuru Erunsuto
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Immuno AG
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、抗トロンビン・ヘパリン濃縮物
または抗トロンビン・ヘパリノイド濃縮物の製
造法に関するものである。
［従来の技術およびその問題点］ 抗トロンビンがヘパリンまたはヘパリノイド
と錯体を形成し、その錯体が製薬上有用な性質を
有し、特にこのような錯体が高活性の凝結因子お
よび他の生物活性を有する血漿蛋白の濃縮物の製
造および貯蔵中に存在すると、患者に望ましくな
い副作用を招き得る酵素誘発蛋白変性を低下させ
ることが知られている。抗トロンビンの濃縮物
もまた同様な作用を有する。これらの製品の別の
製薬上有用な性質は、先天性抗トロンビン欠乏
症およびヘパリン療法で抗トロンビン低下症が
起つた危険患者における凝血に関連する効果であ
る。
米国特許4388232号には、抗トロンビン・ヘ
パリン錯体の生成が開示されているが、そこでは
ヘパリンをくえん酸添加ひと血漿または精製抗ト
ロンビンに加えている。この混合物は、安定化
の目的で第Ｖ因子含有フラクシヨンに加えられ
ている。錯体の単離は行なわれていない。
ヨーロツパ特許公開0048898号には、抗トロン
ビン・ヘパリン錯体の製造が開示されている
が、そこでは予じめ精製した抗トロンビンとヘ
パリンを固定化レクチンに吸着させ、過剰のヘパ
リンを洗い去り、錯体炭水化物溶液で溶離してい
る。この場合、レクチンはミトゲン作用を有する
ので、リガンド漏洩の問題を生ずる。したがつ
て、こうして得た製品を治療に用いるのは危険で
ある。
ローゼンベルク等の「ザ・ケミストリー・アン
ド・フイジオロジー・オブ・ザ・ヒユーマン・プ
ラズマ・プロテインズ」と題する本（パーガモン
プレス、1979年）の353頁には、ローゼンベルク
が精製抗トロンビンとペハリンの錯体の製造を
記載しているが、そこでは錯体をゲル濾過により
過剰のヘパリンから分離し、単離している。さら
にローゼンベルクによると、錯体は3M−Nac1溶
液の存在下のゲル濾過によりその構成成分に分離
することができる。
抗トロンビン・ヘパリン錯体がそれ自体すな
わち精製品として製造されて来たのは、主として
分析用に供するためであつた。レクチンのような
毒性リガンドを用いるゲル濾過またはアフイニテ
イクロマトグラフイーは、治療上有用な製品に対
しては適当な製造法ではない。
［問題点の解決および発明の構成］ この発明は、上記の不利益および欠点を回避す
るためになされたものであつて、治療に用いるに
好適な製品を得るために、生産的規模における抗
トロンビン・ヘパリン錯体または抗トロンビン
・ヘパリノイド錯体の提供を可能にしようとす
るものである。
この発明は、ひと血漿またはトロンビン含有
血漿フラクシヨンをヘパリンまたはヘパリノイド
と混合して抗トロンビン・ヘパリン錯体または
抗トロンビン・ヘパリノイド錯体を生成させる
ことを含む抗トロンビン・ヘパリン濃縮物また
は抗トロンビン・ヘパリノイド濃縮物の製造法
を基とし抗トロンビン・ヘパリン錯体または抗
トロンビン・ヘパリノイド錯体をアニオン交換
体上に吸着させ、吸着体を塩溶液で溶離し、抗ト
ロンビン・ヘパリン錯体または抗トロンビン
・ヘパリノイド錯体を挟雑する塩類および望ま
しくない蛋白質から精製するために溶離液を処理
し、得られる生成物を凍結乾燥により安定な形態
にすることを特徴とするものである。
最初に述べた方法と異なつて、この発明による
方法は極めて簡単でしかも高収率で実施できる。
この発明によると、抗トロンビンの部分変性も
回避される。抗トロンビンは極めて良好なヘパ
リン結合能をもち、ヘパリンは抗トロンビンに
高い親和性をもつが、これら２成分は何れも予じ
め精製する必要がない。アニオン交換体として
は、架橋デキストランゲルに基づくもの（例えば
DEAE−セフアデツクス、QAE−セフアデツク
ス）またはDEAE−セルロースを用いることがで
きる。吸着体は、溶離前に洗浄するのが適当であ
る。
有利な実施態様では、溶離液を、抗トロンビン
・ヘパリン錯体または抗トロンビン・ヘパリ
ノイド錯体を沈澱させるに足る濃度の、硫酸アン
モニウムのような蛋白沈澱剤で処理し、その後沈
澱を溶離し、溶液を熱不活化し、次いで生成物を
凍結乾燥する。存在し得る病原微生物を不活化す
るための熱処理は、60℃で10時間加熱することに
より行なわれる。
この操作法において、抗トロンビン・ヘパリ
ン錯体または抗トロンビン・ヘパリノイド錯体
を含む溶液は、熱不活化後、さらに、望ましくな
い蛋白質を除くが錯体自体は溶液中に残すに足る
濃度の蛋白沈澱剤で処理することができる。
この発明によつて、上記の方法で製造した錯体
濃縮物からの抗トロンビン濃縮物の製造によつ
て、精製錯体の濃度を高めた溶液、特に凍結乾燥
に付する前の溶液を、固定化（immobilized）プ
ロタミンで処理して錯体を解裂させると共にヘパ
リンを固定化プロタミンに結合させ、抗トロンビ
ンを含有する上清を凍結乾燥により安定な形態
にすることを特徴とする方法が可能である。
［効果］ ヘパリンを結合させたままで錯体から抗トロン
ビンを回収する上記方法は、錯体が簡単かつ高
収率に得られるので、従来公知の抗トロンビン
単離法よりすぐれている。この方法では、プロタ
ミンがヘパリンの中和に臨床使用されている程で
あつて無害であるため、リガンドの漏洩は問題と
するに当らない。従来公知の抗トロンビン単離
法（例えばローゼンベルク等、J.Biol.Chem.248
巻6490頁、1973年参照）では、A1（OH）3への吸
着、燐酸アンモニウムによる溶離、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフイーおよび等電点電気泳
動による精製を推奨している。
米国特許4087415号には、抗トロンビンの製
造法において、A1（OH）3への吸着、ホスフエー
ト／EDTAによる溶離、プルロニツク
（Pluronic）またはポリエチレングリコールを用
いたフラクシヨン化による精製が記載されてい
る。
またThromb.Res.5巻439頁（1974年）には、
ミラー・アンダーソン等によりアフイニテイーク
ロマトグラフフイーによる抗トロンビンの製造
法が記載され、そこでは抗トロンビンをヘパリ
ンアガロースに吸着させ、イオン交換クロマトグ
ラフイーおよびゲル濾過により精製している。
［実施例］ 以下、この発明を実施例により詳細に説明す
る。
実施例 １ 血漿から抗トロンビン・ヘパリン錯体の製
造。
血漿100に、低温沈澱を除いた後ヘパリン
８・106単位を加え、30分間＋４℃で攪拌した。
DEAE−セフアデツクスA50を100g混ぜ込んだ
後、＋４℃でさらに２時間攪拌を続けた。負荷ゲ
ルをブフナー漏斗で分離し、PH7.5の燐酸・くえ
ん酸緩衝等張食塩水２リツトルで洗浄して随伴す
る蛋白質を除いた。洗浄した負荷ゲルを上記緩衝
液2.2リツトルにけんだくし、固体NaC1を加えて
導電率を42ms／cmに調節した。＋４℃で１時間攪
拌後、ブフナー漏斗で濾過し、導電率42ms／cm
の燐酸、くえん酸緩衝食塩水0.7リツトルで洗浄
した。
溶離液を合わせ、硫酸アンモニウム1.4Kgを加
え、PHを5.5に調節して抗トロンビン・ヘパリ
ン錯体を沈澱させた。ここで用いた硫酸アンモニ
ウムは、430g／リツトルの濃度であり、溶液に
対して80％飽和に相当するものであつた。＋４℃
で１時間攪拌後、沈澱を濾別し、NaCl13.5ｇお
よびくえん酸３ナトリウム２水化物221gと共に
蒸留水1.5リツトルに溶解した。
PHを7.5に調節し、60℃で10時間加熱して存在
し得る肝炎ウイルスを不活化した。
低温殺菌した生成物を等張食塩水50リツトルで
透析し、さらに精製するため硫酸アンモニウム
303g／１リツトルをPH7.0で加えた。ここで用い
た硫酸アンモニウムは、270g／リツトルの濃度
であり、溶液に対して50％飽和に相当するもので
あつた。＋４℃で45分間攪拌後、沈殿を遠心分離
して捨てた。
上清をくえん酸緩衝等張食塩水100リツトルで
透析し、限外濾過で抗トロンビン濃度50単位／
mlまで濃縮した。
くえん酸緩衝等張食塩水での透析後、無菌濾過
し、びんに充填し凍結乾燥した。
抗トロンビンとヘパリンの酵素活性は、次の
ようにして測定した。
（抗トロンビンの酵素活性） この活性は、ひと血漿抗トロンビン
（1.1ntR.P.72／１）について検定した標品に基づ
いて定めた。この標品を用いて、検体の値を得る
ための検量曲線を作成した。
試料溶液と活性0.0125ないし0.0625単位／mlの
標品溶液を下記組成の緩衝液で希釈した。
トリス 3.03g NaC1 10.8g EDTA.Na塩 1.4g ヘパリン 3000単位 （１リツトル当たり。
PH＝8.4） 操作法： ａ 試料0.1mlを37℃に加熱する。
ｂ トロンビン（12国際単位／ml）0.1mlを加え
37℃で３分間インキユベートする。
ｃ TH−１（2AcOH・Ｈ−Ｄ−CHG−Ala−
Arg−pNA）1.2mM溶液0.1mlを加える。
ｄ 37℃で正確に１分間、20％酢酸1.0mlを加え
て反応を停止させる。
ｅ 405nmで吸光度を測定する。
（ヘパリンの酵素活性） この活性は、3.Int.Stand.heparin 65／69につ
いて検定した標品に基づいて定めた。この標品を
用いて、検体の値を得るための検量曲線を作成し
た。
試料溶液と活性0.001ないし0.5国際単位／mlの
標品を下記組成の緩衝液で希釈した。
トリス 6.06g NaC1 18.12g EDTA・Na塩 2.79g （１リツトル当たり。PH＝8.3） ａ 試料0.2mlとヘパリン不含の抗トロンビン
（３単位／ml）0.2mlを室温で20分間および37℃
で３ないし５分間インキユベートする。
ｂ トロンビン（20国際単位／ml）0.2mlを加え、
37℃で1.5分間インキユベートする。
ｃ TH−１の1.2mM溶液0.2mlを加える。
ｄ 37℃で正確に１分後、50％氷酢酸0.2mlを加
えて反応を停止させる。
ｅ 405nmで吸光度を測定する。
実施例１で得た最終製品については、ヘパリン
単位５ないし７／抗トロンビン単位のヘパリン
濃度が得られた。
実施例 ２ 抗トロンビン・ヘパリノイド錯体の製造。
血漿１リツトルに、ヘパリノイド・ペントサン
ポリスルフエート・ナトリウム塩（ポリアニオン
SP54）3gを加え、次いで＋４℃で30分間攪拌し
た。DEAE−セフアデツクスA50を2.5g混ぜ込ん
だ後、＋４℃でさらに２時間攪拌を続けた。負荷
ゲルをブフナー漏斗で分離し、燐酸およびくえん
酸緩衝等張食塩水各200mlで２回洗浄して随伴す
る蛋白質を除いた。洗浄した負荷ゲルを上記緩衝
液100mlにけんだくし、固体NaC1を加えて導電
率60ms／cmに調節した。＋４℃で１時間攪拌後、
ブフナー漏斗で分離し、抗トロンビン・SP54
錯体を得た。
濾液から最終製品への処理は実施例１と同様に
行なつた。
酸素分析の結果、抗トロンビン１単位当りへ
パリン２ないし３単位の活性に対応するヘパリノ
イド濃度が得られた。
参考例 抗トロンビン・ヘパリン錯体から抗トロンビ
ンの製造。
この方法には、固定化プロタミン、いわゆるプ
ロタミンゲルが必要である。このようなゲルは、
種々の方法で製造することができるが、以下に２
個の方法を示す。
（方法１：プロタミン・セフアロース） 架橋６％アガロースゲル（セフアロースC1−
6B）１リツトルを1MNa2CO3溶液２リツトルに
けんだくし、BrCN100gのアセトニトリル100ml
溶液を用いてPH11.0ないし11.5、温度５ないし10
℃で活性化する。
次いで、0.2MNaHCO3溶液各３リツトルで４
回洗浄し、最後にPH9.5のほう酸緩衝食塩水３リ
ツトルで洗浄する。BrCNで活性化したゲルを、
プロタミン硫酸塩20gを加えた上記ほう酸緩衝食
塩水１リツトルと、PH9.5、温度＋４℃で一夜攪
拌する。
残留活性基を1Mエタノールアミン溶液１リツ
トルで（室温、２時間）ブロツクした後、PH8.5
のNaHCO3緩衝食塩水およびPH4.0の酢酸緩衝食
塩水各３リツトルで交互に３回洗浄する。
ヘパリンの除去に使用する前に、プロタミンゲ
ルをPH8.0のトリスおよびくえん酸緩衝食塩水で
平衡させる。
（方法２：プロタミン・ユーペルギツト） オキシランアクリル樹脂（EupergitC）5gにプ
ロタミン硫酸塩400mgの1M燐酸カリウム（PH9.5）
20ml溶液を加え、室温で16時間放置する。水、
1MNaC1溶液および0.01M燐酸塩溶液で洗浄後、
残留活性基を５％ベータメルカプトエタノール溶
液70mlで（室温、16時間）ブロツクする。最後
に、水各80mlで５回洗浄する。ヘパリンの除去に
使用する前に、方法１と同様に平衡化する。
実施例１で得た抗トロンビン・ヘパリン錯体
を溶かすか、または透析後の溶液を用いた。この
透析溶液１リツトルに、トリス1gを加え、PHを
8.0に調節し、方法１で製造したプロタミンゲル
15mlを加えた。一夜攪拌後、ゲルを濾過した。ヘ
パリン不含の抗トロンビンの大部分が吸着上清
に存在した。
抗トロンビンの収率を上げるために、ゲルを
トリスおよびくえん酸緩衝等張食塩水で次第にイ
オン強度を上げて洗浄した。吸着上清とヘパリン
不含の洗浄上清を抗トロンビン採取のために合
わせ、凍結乾燥により濃縮した。得られた粉末を
蒸留水１mlに1gの割合でけんだくし、くえん酸
緩衝等張食塩水で透析した。透析後、希釈して抗
トロンビン含量50単位／mlとし、無菌濾過し、
びんに充填し、凍結乾燥した。
酸素分析法によると、抗トロンビン１単位当
りヘパリン0.5単位未満のヘパリン含量を示した。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ ひと血漿または抗トロンビン含有血漿フラ
    クシヨンにヘパリンまたはヘパリノイドを加えて
    抗トロンビン・ヘパリン錯体または抗トロンビ
    ン・ヘパリノイド錯体を生成させる工程を含む
    抗トロンビン・ヘパリン濃縮物または抗トロン
    ビン・ヘパリノイド濃縮物の製造法において、
    抗トロンビン・ヘパリン錯体または抗トロンビ
    ン・ヘパリノイド錯体をアニオン交換体上に吸
    着させて吸着体を形成させ、上記吸着体を塩溶液
    で溶離して溶離液を生成させ、上記溶離液に含ま
    れる抗トロンビン・ヘパリン錯体または抗トロ
    ンビン・ヘパリノイド錯体を塩類から分離し、
    得られる生成物を凍結乾燥して安定な形態にする
    ことからなる、改良方法。 ２ 吸着体からの溶離前に吸着体を洗浄する工程
    を含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 抗トロンビン・ヘパリン錯体の沈澱または
    抗トロンビン・ヘパリノイド錯体の沈澱を生成
    するに充分な濃度の蛋白沈澱剤で溶離液を処理
    し、沈澱を溶かして溶液を生成し、溶液を熱不活
    化し、次いで凍結乾燥する、特許請求の範囲第１
    項記載の方法。 ４ 蛋白沈澱剤が硫酸アンモニウムからなる、特
    許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 溶液の熱不活化後、抗トロンビン・ヘパリ
    ン錯体または抗トロンビン・ヘパリノイド錯体
    を含有する上記溶液を、さらに、望ましくない蛋
    白質を除き上記抗トロンビン・ヘパリン錯体ま
    たは抗トロンビン・ヘパリノイド錯体を溶液中
    に残すに充分な濃度の蛋白沈澱剤で処理する、特
    許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 抗トロンビン・ヘパリン錯体または抗トロ
    ンビン・ヘパリノイド錯体をさらに処理する蛋
    白沈澱剤が硫酸アンモニウムからなる、特許請求
    の範囲第５項記載の方法。
JP59101637A 1983-05-20 1984-05-19 抗トロンビン３・ヘパリン類濃縮物の製造法 Granted JPS59222421A (ja)

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CA (1) CA1211371A (ja)
DE (2) DE3479503D1 (ja)
DK (2) DK167271B1 (ja)
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