JPH05320198A - 抗トロンビンｉｉｉ濃縮物の製造法 - Google Patents

抗トロンビンｉｉｉ濃縮物の製造法

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JPH05320198A
JPH05320198A JP4201213A JP20121392A JPH05320198A JP H05320198 A JPH05320198 A JP H05320198A JP 4201213 A JP4201213 A JP 4201213A JP 20121392 A JP20121392 A JP 20121392A JP H05320198 A JPH05320198 A JP H05320198A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 ひと血漿または抗トロンビンIII含有血漿フ
ラクションにヘパリンまたはヘパリノイドを加えて抗ト
ロンビンIII・ヘパリン錯体または抗トロンビンIII・ヘ
パリノイド錯体を生成させ、アニオン交換体上に吸着さ
せて吸着体を形成させ、上記吸着体を塩溶液で溶離して
溶離液を生成させ、分離し、得られる生成物を凍結乾燥
して安定な形態にすることからなる方法により得られ
た、抗トロンビンIII・ヘパリン錯体または抗トロンビ
ンIII・ヘパリノイド錯体の濃縮物の精製溶液を、固定
化プロタミンで処理して解裂させると共にヘパリンまた
はヘパリノイドを固定化プロタミンに結合させ、抗トロ
ンビンIII含有上清を生成し、上清を凍結乾燥して安定
な形態にすることからなる、抗トロンビンIII濃縮物の
製造法。 【効果】 抗トロンビンIII濃縮物が簡単かつ高収率に
得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、抗トロンビンIII・
ヘパリン濃縮物または抗トロンビンIII・ヘパリノイド
濃縮物から抗トロンビンIII濃縮物の製造法に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】抗ト
ロンビンIIIがヘパリンまたはヘパリノイドと錯体を形
成し、その錯体が製薬上有用な性質を有し、特にこのよ
うな錯体が高活性の凝結因子および他の生物活性を有す
る血漿蛋白の濃縮物の製造および貯蔵中に存在すると、
患者に望ましくない副作用を招き得る酵素誘発蛋白変性
を低下させることが知られている。抗トロンビンIIIの
濃縮物もまた同様な作用を有する。これらの製品の別の
製薬上有用な性質は、先天性抗トロンビンIII欠乏症お
よびヘパリン療法で抗トロンビンIII低下症が起った危
険患者における凝血に関連する効果である。米国特許４
３８８２３２号には、抗トロンビンIII・ヘパリン錯体
の生成が開示されているが、そこではヘパリンをくえん
酸添加ひと血漿または精製抗トロンビンIIIに加えてい
る。この混合物は、安定化の目的で第ＶIII因子含有フ
ラクションに加えられている。錯体の単離は行なわれて
いない。
【０００３】ヨーロッパ特許公開００４８８９８号に
は、抗トロンビンIII・ヘパリン錯体の製造が開示され
ているが、そこでは予じめ精製した抗トロンビンIIIと
ヘパリンを固定化レクチンに吸着させ、過剰のヘパリン
を洗い去り、錯体炭水化物溶液で溶離している。この場
合、レクチンはミトゲン作用を有するので、リガンド漏
洩の問題を生ずる。したがって、こうして得た製品を治
療に用いるのは危険である。ローゼンベルク等の 「ザ・
ケミストリー・アンド・フィジオロジー・オブ・ザ・ヒ
ューマン・プラズマ・プロテインズ」と題する本 (パー
ガモンプレス、１９７９年）の３５３頁には、ローゼン
ベルクが精製抗トロンビンIIIとヘパリンの錯体の製造
を記載しているが、そこでは錯体をゲル濾過により過剰
のヘパリンから分離し、単離している。さらにローゼン
ベルクによると、錯体は３Ｍ−Ｎａｃｌ溶液の存在下の
ゲル濾過によりその構成成分に分離することができる。
抗トロンビンIII・ヘパリン錯体がそれ自体すなわち精
製品として製造されて来たのは、主として分析用に供す
るためであった。レクチンのような毒性リガンドを用い
るゲル濾過またはアフィニティクロマトグラフィーは、
治療上有用な製品に対しては適当な製造法ではない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の不利
益および欠点を回避するためになされたものであって、
治療に用いるに好適な製品を得るために、生産的規模に
おける抗トロンビンIII・ヘパリン錯体または抗トロン
ビンIII・ヘパリノイド錯体からのトロンビンIII濃縮物
の提供を可能にしようとするものである。この発明は、
ひと血漿または抗トロンビンIII含有血漿フラクション
にヘパリンまたはヘパリノイドを加えて抗トロンビンII
I・ヘパリン錯体または抗トロンビンIII・ヘパリノイド
錯体を生成させ、上記抗トロンビンIII・ヘパリン錯体
または抗トロンビンIII・ヘパリノイド錯体をアニオン
交換体上に吸着させて吸着体を形成させ、上記吸着体を
塩溶液で溶離して溶離液を生成させ、上記溶離液に含ま
れる抗トロンビンIII・ヘパリン錯体または抗トロンビ
ンIII・ヘパリノイド錯体を塩類から分離し、得られる
生成物を凍結乾燥して安定な形態にすることからなる方
法により得られた、抗トロンビンIII・ヘパリン錯体ま
たは抗トロンビンIII・ヘパリノイド錯体の濃縮物の精
製溶液を、固定化プロタミンで処理して上記抗トロンビ
ンIII・ヘパリン錯体または上記抗トロンビンIII・ヘパ
リノイド錯体を解裂させると共にヘパリンまたはヘパリ
ノイドを固定化プロタミンに結合させ、抗トロンビンII
I含有上清を生成し、上記抗トロンビンIII含有上清を凍
結乾燥して安定な形態にすることを特徴とするものであ
る。
【０００５】最初に述べた方法と異なって、この発明に
よる方法は極めて簡単でしかも高収率で実施できる。こ
の発明によると、抗トロンビンIIIの部分変性も回避さ
れる。抗トロンビンIIIは極めて良好なヘパリン結合能
をもち、ヘパリンは抗トロンビンIIIに高い親和性をも
つが、これら２成分は何れも予じめ精製する必要がな
い。アニオン交換体としては、架橋デキストランゲルに
基づくもの (例えばＤＥＡＥ−セファデックス、ＱＡＥ
−セファデックス）またはＤＥＡＥ−セルロースを用い
ることができる。吸着体は、溶離前に洗浄するのが適当
である。
【０００６】有利な実施態様では、溶離液を、抗トロン
ビンIII・ヘパリン錯体または抗トロンビンIII・ヘパリ
ノイド錯体を沈澱させるに足る濃度の、硫酸アンモニウ
ムのような蛋白沈澱剤で処理し、その後沈澱を溶離し、
溶液を熱不活化し、次いで生成物を凍結乾燥する。存在
し得る病原微生物を不活化するための熱処理は、６０℃
で１０時間加熱することにより行なわれる。この操作法
において、抗トロンビンIII・ヘパリン錯体または抗ト
ロンビンIII・ヘパリノイド錯体を含む溶液は、熱不活化
後、さらに、望ましくない蛋白質を除くが錯体自体は溶
液中に残すに足る濃度の蛋白沈澱剤で処理することがで
きる。
【０００７】
【発明の効果】ヘパリンを結合させたままで錯体から抗
トロンビンIIIを回収する上記方法は、錯体が簡単かつ
高収率に得られるので、従来公知の抗トロンビンIII単
離法よりすぐれている。この方法では、プロタミンがヘ
パリンの中和に臨床使用されている程であって無害であ
るため、リガンドの漏洩は問題とするに当らない。従来
公知の抗トロンビンIII単離法 (例えばローゼンベルク
等、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２４８巻６４９０頁、１９７３年
参照）では、Ａｌ (ＯＨ）3への吸着、燐酸アンモニウ
ムによる溶離、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ーおよび等電点電気泳動による精製を推奨している。米
国特許４０８７４１５号には、抗トロンビンIIIの製造
法において、Ａｌ (ＯＨ）3への吸着、ホスフェート／
ＥＤＴＡによる溶離、プルロニック (Pluronic）または
ポリエチレングリコールを用いたフラクション化による
精製が記載されている。またＴhromb.Ｒes.5巻４３９頁
(１９７４年）には、ミラー・アンダーソン等によりア
フィニティークロマトグラフフィーによる抗トロンビン
IIIの製造法が記載され、そこでは抗トロンビンIIIをヘ
パリンアガロースに吸着させ、イオン交換クロマトグラ
フィーおよびゲル濾過により精製している。この発明の
方法は上記の従来法とは異なるより優れた抗トロンビン
III濃縮物の製造法である。
【０００８】
【実施例】以下、この発明を実施例により詳細に説明す
る。 実施例１ 血漿から抗トロンビンIII・ヘパリン錯体の製造。 血漿１００lに、低温沈澱を除いた後ヘパリン８・１０6
単位を加え、３０分間＋４℃で撹拌した。ＤＥＡＥ−セ
ファデックスＡ５０を１００g混ぜ込んだ後、＋４℃で
さらに２時間撹拌を続けた。負荷ゲルをブフナー漏斗で
分離し、ＰＨ７．５の燐酸・くえん酸緩衝等張食塩水２
リットルで洗浄して随伴する蛋白質を除いた。洗浄した
負荷ゲルを上記緩衝液２．２リットルにけんだくし、固
体ＮaＣlを加えて導電率を４２ms／cmに調節した。＋４
℃で１時間撹拌後、ブフナー漏斗で濾過し、導電率４２
ms／cmの燐酸、くえん酸緩衝食塩水０．７リットルで洗
浄した。
【０００９】溶離液を合わせ、硫酸アンモニウム１．４
ｋｇを加え、ｐＨを５．５に調節して抗トロンビンIII
・ヘパリン錯体を沈澱させた。ここで用いた硫酸アンモ
ニウムは、４３０ｇ／リットルの濃度であり、溶液に対
して８０％飽和に相当するものであった。＋４℃で１時
間攪拌後、沈澱を濾別し、ＮaＣl１３．５gおよびくえ
ん酸３ナトリウム２水化物２２１gと共に蒸留水１．５
リットルに溶解した。pＨを７．５に調節し、６０℃で
１０時間加熱して存在し得る肝炎ウイルスを不活化し
た。低温殺菌した生成物を等張食塩水５０リットルで透
析し、さらに精製するため硫酸アンモニウム３０３g／
１リットルをpＨ７．０で加えた。ここで用いた硫酸ア
ンモニウムは、２７０g／リットルの濃度であり、溶液
に対して５０％飽和に相当するものであった。＋４℃で
４５分間攪拌後、沈澱を遠心分離して捨てた。上清をく
えん酸緩衝等張食塩水１００リットルで透析し、限外濾
過で抗トロンビンIII濃度５０単位／mlまで濃縮した。
くえん酸緩衝等張食塩水での透析後、無菌濾過し、びんに
充填し凍結乾燥した。
【００１０】抗トロンビンIIIとヘパリンの酵素活性
は、次のようにして測定した。 (抗トロンビンIIIの酵素活性)この活性は、ひと血漿抗
トロンビンIII(１．１ntＲ．Ｐ．７２／１)について検
定した標品に基づいて定めた。この標品を用いて、検体
の値を得るための検量曲線を作成した。試料溶液と活性
０．０１２５ないし０．０６２５単位／mlの標品溶液を
下記組成の緩衝液で希釈した。 トリス ３．０３g ＮaＣl １０．８ g ＥＤＴＡ・Ｎa塩 １．４ g ヘパリン ３０００単位 (１リットル当たり。 pＨ＝８．４) 操作法: a)試料０．１mlを３７℃に加熱する。 b)トロンビン(１２国際単位／ml)０．１mlを加え３７℃
で３分間インキユベートする。 c)ＴＨ−１(２ＡcＯＨ・Ｈ−Ｄ−ＣＨＧ−Ａla−Ａrg−
pＮＡ)１．２mＭ溶液０．１mlを加える。 d)３７℃で正確に１分後、２０％酢酸１．０mlを加えて
反応を停止させる。 e)４０５nm で吸光度を測定する。
【００１１】(ヘパリンの酵素活性）この活性は、３．
Ｉｎｔ．Ｓtand．heparin ６５／６９について検定し
た漂品に基づいて定めた。この標品を用いて、検体の値
を得るための検量曲線を作成した。試料溶液と活性０．
００１ないし０．５国際単位／mlの標品を下記組成の緩
衝液で希釈した。 トリス ６．０６g ＮaＣl １８．１２g ＥＤＴＡ・Ｎa塩 ２．７９g (１リットル当たり。pＨ＝８．３) a)試料０．２mlとヘパリン不含の抗トロンビンIII(３単
位／ml)０．２mlを室温で２０分間および３７℃で３な
いし５分間インキュベートする。 b)トロンビン(２０国際単位／ml)０．２mlを加え、３７
℃で１．５分間インキュベートする。 c)ＴＨ−１の１．２mＭ溶液０．２mlを加える。 d)３７℃で正確に１分後、５０％氷酢酸０．２mlを加え
て反応を停止させる。 e)４０５nmで吸光度を測定する。 実施例１で得た最終製品については、ヘパリン単位５な
いし７／抗トロンビンIII単位のヘパリン濃度が得られ
た。
【００１２】実施例２ 抗トロンビンIII・ヘパリノイド錯体の製造。 血漿１リットルに、ヘパリノイド・ペントサンポリスル
フエート・ナトリウム塩(ポリアニオンＳＰ５４)３gを
加え、次いで＋４℃で３０分間攪拌した。ＤＥＡＥ−セ
ファデックスＡ５０を２．５g混ぜ込んだ後、＋４℃で
さらに２時間攪拌を続けた。負荷ゲルをブフナー漏斗で
分離し、燐酸およびくえん酸緩衝等張食塩水各２００ml
で２回洗浄して随伴する蛋白質を除いた。洗浄した負荷
ゲルを上記緩衝液１００mlにけんだくし、固体ＮaＣlを
加えて導電率６０ms／cmに調節した。＋４℃で１時間攪
拌後、ブフナー漏斗で分離し、抗トロンビンIII・ＳＰ
５４錯体を得た。濾液から最終製品への処理は実施例１
と同様に行なった。酸素分析の結果、抗トロンビンIII
１単位当りへパリン２ないし３単位の活性に対応するヘ
パリノイド濃度が得られた。
【００１３】実施例３ 抗トロンビンIII・ヘパリン錯体から抗トロンビンIIIの
製造。 この方法には、固定化プロタミン、いわゆるプロタミン
ゲルが必要である。このようなゲルは、種々の方法で製
造することができるが、以下に２個の方法を示す。 (方法１:プロタミン・セファロース)架橋６％アガロー
スゲル(セファロースＣ１−６Ｂ)１リットルを１ＭＮa2
ＣＯ3溶液２リットルにけんだくし、ＢrＣＮ１００gの
アセトニトリル１００ml溶液を用いてpＨ１１．０ない
し１１．５、温度５ないし１０℃で活性化する。次い
で、０．２ＭＮaＨＣＯ3溶液各３リットルで４回洗浄
し、最後にpＨ９．５のほう酸緩衝食塩水３リットルで
洗浄する。ＢrＣＮで活性化したゲルを、プロタミン硫
酸塩２０gを加えた上記ほう酸緩衝食塩水１リットル
と、pＨ９．５、温度＋４℃で一夜攪拌する。残留活性
基を１Ｍエタノールアミン溶液１リットルで(室温、２
時間)ブロックした後、pＨ８．５のＮaＨＣＯ3緩衝食塩
水およびpＨ４．０の酢酸緩衝食塩水各３リットルで交
互に３回洗浄する。ヘパリンの除去に使用する前に、プ
ロタミンゲルをpＨ８．０のトリスおよびくえん酸緩衝
食塩水で平衡させる。
【００１４】(方法２:プロタミン・ユーペルギット)オ
キシランアクリル樹脂(EupergitＣ)５gにプロタミン硫
酸塩４００mgの１Ｍ燐酸カリウム(pＨ９．５)２０ml溶
液を加え、室温で１６時間放置する。水、１ＭＮaＣl溶
液および０．０１Ｍ燐酸塩溶液で洗浄後、残留活性基を
５％ベータメルカプトエタノール溶液７０mlで(室温、
１６時間)ブロックする。最後に、水各８０mlで５回洗
浄する。ヘパリンの除去に使用する前に、方法１と同様
に平衡化する。
【００１５】実施例１で得た抗トロンビンIII・ヘパリ
ン錯体を溶かすか、または透析後の溶液を用いた。この
透析溶液１リットルに、トリス１gを加え、pＨを８．０
に調節し、方法１で製造したプロタミンゲル１５mlを加
えた。一夜撹拌後、ゲルを濾去した。ヘパリン不含の抗
トロンビンIIIの大部分が吸着上清に存在した。抗トロ
ンビンIIIの収率を上げるために、ゲルをトリスおよび
くえん酸緩衝等張食塩水で次第にイオン強度を上げて洗
浄した。吸着上清とヘパリン不含の洗浄上清を抗トロン
ビンIII採取のために合わせ、凍結乾燥により濃縮し
た。得られた粉末を蒸留水１mlに１gの割合でけんだく
し、くえん酸緩衝等張食塩水で透析した。透析後、希釈
して抗トロンビンIII含量５０単位／mlとし、無菌濾過
し、びんに充填し、凍結乾燥した。酸素分析法による
と、抗トロンビンIII１単位当りヘパリン０．５単位未
満のヘパリン含量を示した。
フロントページの続き (72)発明者 イエントラ・リナウ オーストリア国ウィーン22、ラーベンデル ベーク24番

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ひと血漿または抗トロンビンIII含有血
    漿フラクションにヘパリンまたはヘパリノイドを加えて
    抗トロンビンIII・ヘパリン錯体または抗トロンビンIII
    ・ヘパリノイド錯体を生成させ、上記抗トロンビンIII
    ・ヘパリン錯体または抗トロンビンIII・ヘパリノイド
    錯体をアニオン交換体上に吸着させて吸着体を形成さ
    せ、上記吸着体を塩溶液で溶離して溶離液を生成させ、
    上記溶離液に含まれる抗トロンビンIII・ヘパリン錯体
    または抗トロンビンIII・ヘパリノイド錯体を塩類から
    分離し、得られる生成物を凍結乾燥して安定な形態にす
    ることからなる方法により得られた、抗トロンビンIII
    ・ヘパリン錯体または抗トロンビンIII・ヘパリノイド
    錯体の濃縮物の精製溶液を、固定化プロタミンで処理し
    て上記抗トロンビンIII・ヘパリン錯体または上記抗ト
    ロンビンIII・ヘパリノイド錯体を解裂させると共にヘ
    パリンまたはヘパリノイドを固定化プロタミンに結合さ
    せ、抗トロンビンIII含有上清を生成し、上記抗トロン
    ビンIII含有上清を凍結乾燥して安定な形態にすること
    からなる、抗トロンビンIII濃縮物の製造法。
  2. 【請求項２】 上記吸着体からの溶離前に上記吸着体を
    洗浄する工程を含む、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 抗トロンビンIII・ヘパリン錯体の沈澱
    または抗トロンビンIII・ヘパリノイド錯体の沈澱を生
    成するに充分な濃度の蛋白沈澱剤で上記溶離液を処理
    し、沈澱を溶かして溶液を生成し、溶液を熱不活化し、
    次いで凍結乾燥する、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 上記蛋白沈澱剤が硫酸アンモニウムから
    なる、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 溶液の熱不活化後、抗トロンビンIII・
    ヘパリン錯体または抗トロンビンIII・ヘパリノイド錯
    体を含有する上記溶液を、さらに、望ましくない蛋白質
    を除き上記抗トロンビンIII・ヘパリン錯体または抗ト
    ロンビンIII・ヘパリノイド錯体を溶液中に残すに充分
    な濃度の蛋白沈澱剤で処理する、請求項３記載の方法。
  6. 【請求項６】 抗トロンビンIII・ヘパリン錯体または
    抗トロンビンIII・ヘパリノイド錯体をさらに処理する
    蛋白沈澱剤が硫酸アンモニウムからなる、請求項５記載
    の方法。
JP4201213A 1983-05-20 1992-07-28 抗トロンビンｉｉｉ濃縮物の製造法 Expired - Lifetime JPH07116235B2 (ja)

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JPH05320198A true JPH05320198A (ja) 1993-12-03
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