DK168062B1

DK168062B1 - Fremgangsmaade til fremstilling af et antithrombin iii-koncentrat

Info

Publication number: DK168062B1
Application number: DK292090A
Authority: DK
Inventors: Johann Eibl; Yendra Linnau; Ernst Hetzl
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1983-05-20
Filing date: 1990-12-07
Publication date: 1994-01-31
Also published as: EP0307002A1; EP0307002B1; DE3479503D1; ATE45747T1; JPH05320198A; DK241684D0; ES532641A0; AT379310B; EP0129534B1; ES8602414A1; ATE69552T1; DK292090D0; JPH07116235B2; JPH053480B2; EP0129534A2; DK167271B1; DE3485288D1; US4510084A; ATA185983A; EP0129534A3

Description

i DK 168062 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et antithrombin Ill-koncentrat ved spaltning af et antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoid-kompleks med protamin.

5

Det er kendt, at antithrombin III udviser farmaceutisk værdifulde egenskaber. Især undertrykkes enzymatisk betingede pro-teinforandringer, der kan have uønskede sidereaktioner hos patienter til følge, ved hjælp af tilstedeværelsen af antithrom-10 bin III ved fremstillingen og lagringen af koncentrater af højvirksomme koagulationsfaktorer og andre plasmaproteiner med biologisk virkning. Yderligere farmaceutiske værdifulde egenskaber ved antithrombin III er virkningen overfor thrombo-embolismus i tilfælde af medført mangel på antithrombin III 15 samt hos risikopatienter, hos hvilke antithrombin III-formind-skelse indtræder under hepari nbehandling.

I US patentskrift nr. 4.087.415 samt i R.D. Rosenberg et al., J. Biol. Chem. 248, 6490 (1973) beskrives en fremgangsmåde til 20 udvinding af antithrombin III, som omfatter en adsorption til A1(0H)3, eluering med phosphat/EDTA, yderligere rensning ved hjælp af fraktionering med "Pluronic" eller polyethylenglycol eller ved hjælp af gelf i 1 trering, ionbytningskromatografi samt isoelektrisk fokusering.

25

Endvidere er der M. Miller-Andersson et al. i Thromb. Res. 5, 439 (1974) beskrevet en metode til udvinding af antithrombin III ved hjælp af affinitetskromatografi, hvorved antithrombin III adsorberes til heparin-agarose, og der sker en yderligere 30 rensning ved hjælp af ionbytningskromatografi og gelfiltrering.

Fra T. Kitani et al., Thromb. Res. 17, 367-374 (1980) kendes yderligere analytiske undersøgelser vedrørende veksel virknin-35 gen mellem protamin, antithrombin III og heparin, idet hepa-riniseret plasma med eller uden protaminti Isætning blev underkastet en gelfiltrering, og fraktionerne blev undersøgt for DK 168062 B1 2 deres indhold af protein, radioaktivt mærket heparin og anti-thrombin III eller af anti thrombin ΙΙΙ-heparinkompleks. En isolering eller ren fremstilling af de enkelte bestanddele blev ikke foretaget.

5

Den foreliggende opfindelse tager sigte på at kunne fremstil-1 e ant i thrombi n Ill-koncentrater med høj renhed og i højt udbytte, og fremgangsmåden er ejendommelig ved, at en opløsning af antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-hepara-10 noidkomplekset behandles med immobi1iseret protamin, hvorved komplekset spaltes, og heparinet bindes til det immobiliserede protamin, hvorpå antithrombin III udvindes fra den ovenstående væske og bringes på holdbar form ved hjælp af lyofi 1isering.

15 Antithrombin III-hepari n- eller antithrombin III-heparinoid komplekset bliver før behandlingen med det immobiliserede protamin fordelagtigt renset for uønskede proteiner ved adsorption til en ionbytter og eluering med en saltopløsning.

20 Den beskrevne udvinding af antithrombin III fra komplekset, hvorved heparin forbliver bundet, er den hidtil kendte fremgangsmåde til isolering af antithrombin III overlegen, da komplekset kan opnås på enkel måde og i ren form. En leakage af liganden spiller ingen rolle, da protamin anvendes klinisk til 25 heparin-neutralisering og således er ufarlig.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de følgende eksempler.

30 Eksempel

Fremstilling af antithrombin ΙΙΙ-heparinkompleks ud fra plasma

Til 100 liter plasma sattes 8 x 106 E heparin efter fjernelse af kryopræcipi tatet, og der blev omrørt i 30 minutter ved 35 + 4°C. Efter indrøring af 100 g "DEAE"-Sephadex A 50" blev der omrørt i yderligere 2 timer ved +4°C. Den fyldte gel fraskiltes ved hjælp af B'dchner-tragt og blev til fjernelse af led- DK 168062 B1 3 sageproteiner vasket med 2 liter af en phosphat-citratpufret isotonisk kogsaltopløsning med en pH-værdi på 7,5. Den fyldte, vaskede gel blev suspenderet i 2,2 liter af den ovenfor nævnte puffer, og ved tilsætning af fast NaCl indstilledes en led-5 ningsevne på 42 mS/cm. Efter 1 times omrøring ved +4*C blev der fraskilt ved hjælp af BUchner-tragt og eftervasket med 0,7 liter af en phosphat- og citratpufret kogsaltopløsning med en ledningsevne på 42 mS/cm.

10 Fra de forenede eluater blev antithrombin III-heparinkomplek-set udfældet ved tilsætning af 1,4 kg ammoniumsulfat og indstilling af pH-værdien til 5,5. Den herved benyttede ammoniumsul fatkoncentration på 430 g/liter svarer til en 80% mætning af opløsningen. Efter 1 times omrøring ved +4°C blev bundfal-15 det fraskilt ved hjælp af filtrering og sammen med 13,5 NaCl og 221 g Na3~citrat · 2 H2O opløst i 1,5 liter desti lieret vand.

pH-værdien blev indstillet til 7,5, og til inaktivering af 20 eventuelt tilstedeværende vira blev der opvarmet til 60°C i 10 timer.

Det pasteuriserede produkt blev dialyseret mod 50 liter isotonisk kogsaltopløsning, og til yderligere rensning blev 303 g 25 ammoniumsulfat per liter indrørt ved en pH-værdi på 7,0. Den herved benyttede ammoniumsulfatkoncentration på 270 g/liter svarer til en 50% mætning af opløsningen. Efter 45 minutters omrøringstid ved +4°C blev bundfaldet fjernet ved centrifugering og bortkastet.

30

Den ovenstående væske blev dialyseret mod 100 liter af en citratpufret, isotonisk kogsaltopløsning og ved hjælp af ultrafiltrering koncentreret til et antithrombin III-indhold på 50 E/ml.

Efter dialyse mod en citratpufret, isotonisk kogsaltopløsning blev der steri 1fi 1 treret, fyldt på flasker og frysetørret.

35 DK 168062 B1 4

De enzymatiske aktiviteter af antithrombin III og heparin blev afprøvet på følgende måde:

Enzymatisk aktivitet af antithrombin III: 5 Aktiviteten blev regnet i forhold til et standardpræparat, der var indstillet mod humant antithrombin Ill-plasma (1. Int. R.P. 72/1). Med dette standardpræparat opnåedes en justeringskurve, på hvilken de til afprøvning bestemte prøver blev aflæst.

10

Fortyndingen af prøverne og af standarden til aktiviteter mellem 0,0125 og 0,0625 E/ml skete med en pufferopløsning med følgende sammensætning: 15 3,03 g Tris Λ 10,8 g NaCl 1,4 g Na-EDTA Γ Per liter' PH 8'4 3000 E heparin 20 Pipetteringsskema:

a) 0,1 ml prøve blev opvarmet til 37eC

b) 0,1 ml thrombin (12 IE/ml) blev tilsat, og der inkuberedes i 3 minutter ved 37°C

c) 0,1 ml af en 1,2 mM opløsning af THI (1 AcOH·H-D-CHG-A1a- 25 Arg-pNA) blev tilsat d) efter nøjagtigt 1 minut ved 37°C blev reaktionen standset ved tilsætning af 1,0 ml 20% eddikesyre e) ekstinktionen ved 405 nm blev målt.

30 Enzymatisk aktivitet af heparin:

Aktiviteten blev regnet i forhold til et standardpræparat, der var indstillet mod det 3. Int. Stand. Heparin 65/69. Med dette standardpræparat opnåedes en justeringskurve, på hvilken de til afprøvning bestemte prøver blev aflæst.

Fortyndingen af prøverne og af standarden til aktiviteter fra 0,001 til 0,5 IE/ml skete med en pufferopløsning med følgende sammensætning: 35 DK 168062 B1 5 6,06 g Tris 18,12 g NaCl per liter, pH 8,3

2,79 g Na-EDTA

5 Pipetteringsskema: a) 0,2 ml prøve og 0,2 ml heparinfrit antithrombin III (3 E/ml) blev inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur og i

3-5 minutter ved 37°C

b) 0,2 ml thrombin (20 IE/ml) blev tilsat, og der blev inkube-

10 ret i 1,5 minutter ved 37°C

c) 0,2 ml af en 1,2 mM opløsning af TH-1 blev tilsat d) efter nøjagtigt 1 minut ved 37°C blev reaktionen standset ved tilsætning af 0,2 ml 50% iseddike e) ekstinktionen blev målt ved 405 nm.

15

For det opnåede slutprodukt opnåedes et heparinindhold på 5-7 heparinenheder per enhed anti thrombin III.

Fremstilling af antithrombin HI ud fra anti thrombin III-hepa-20 ri nkomplekset

Til denne arbejdsmåde kræves et immobi1 i seret protamin, en såkaldt protamin-gel. Sådanne geler kan fremstilles på forskellig måde. I det følgende er anført to metoder.

25

Metode 1: Protamin-Sepharose 1 liter af en tværbundet 6% agarosegel (Sepharose C1-6B) suspenderes i 2 liter af en 1 M Na2C03-opløsning og aktiveres med en opløsning af 100 g BrCN i 100 ml acetonitril ved en pH-vær-30 di på 11,0-11,5 og en temperatur fra 5-10°C.

Derpå vaskes fire gange, hver gang med 3 liter af en 0,2 M NaHC03-opløsning, og til sidst med 3 liter af en boratpufret kogsaltopløsning med pH-værdi 9,5. Den BrCN-aktiverede gel om-35 røres natten over sammen med 1 liter af den ovennævnte borat-kogsaltopløsning, som er blevet tilsat 20 g protaminsul fat, ved en pH-værdi på 9,5 og en temperatur på +4°C.

DK 168062 B1 6

Efter blokeringen af de resterende aktive grupper med 1 liter af en 1 M ethanol aminopløsning (2 h ved stuetemperatur) vaskes der tre gange, hver gang skiftevis med 3 liter af en NaHCC>3-pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 8,5 og en acetat-pufret 5 kogsaltopløsning med pH-værdi 4,0.

Før anvendelsen til fjernelse af heparin ækvilibreres prota-mingelen med en tris- og citratpufret kogsaltopløsning med pH-værdi 8,0.

10

Metode 2: Protamin-eupergit 5 g oxiran-acrylharpiks (Eupergit C) tilsættes en opløsning af 400 mg protaminsulfat i 20 ml 1 M kaliumphosphat med pH-værdi 9,5 og lades henstå i 16 timer ved stuetemperatur. Efter vask-15 ning med vand, 1 M NaCl-opløsning og 0,01 M phosphatopløsning blokeres de resterende reaktive grupper med 70 ml af en 5% opløsning af jS-mercaptoethanol (16 timer ved stuetemperatur). Endelig vaskes fem gange, hver gang med 80 ml vand. Før anvendelsen til fjernelse af heparin ækvilibreres som ved metode 1.

20

Det som ovenfor beskrevet fremstillede antithrombin III-hepa-rinkompleks blev opløst, eller også anvendtes den opløsning, der blev opnået efter dialyseringen. Per liter af denne dialyserede opløsning tilsattes 1 g tris, pH-værdien indstilledes 25 til 8,0, og der blev tilsat 15 ml af den ifølge metode 1 fremstillede protamin-gel. Efter omrøring natten over blev gelen fraskilt ved hjælp af filtrering. Hovedmængden af det heparin-fri antithrombin III befandt sig i den ovenstående væske fra adsorptionen.

30

Til forøgelse af udbyttet af anti thrombin III blev gelen vasket med tris- og citratpufrede kogsaltopløsninger med stigende ionstyrke. Den ovenstående væske fra adsorptionen og de heparinfri ovenstående vaskevæsker blev forenet til isolering 35 af antithrombin III og lyofiliseret med henblik på koncentration. Det således opnåede pulver blev per g suspenderet i 1 ml destilleret vand og dialyseret mod en citratpufret isotonisk

Claims

5 Den enzymatiske analyse resulterede i et heparinindhold på < 0. 5.E heparin per 1 E antithrombin III. Patentkrav. 10

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et antithrombin III-kon-centrat ved spaltning af et antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoidkompleks med protamin, kendetegnet ved, at en opløsning af antithrombin III-heparin- 15 eller antithrombin III-heparinoidkomplekset behandles med immobil iseret protamin, hvorved komplekset spaltes, og heparinet bindes til det immobi1iserede protamin, hvorpå antithrombin III udvindes fra den ovenstående væske og bringes på holdbar form ved hjælp af lyofilisering. 20

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-hepari-noidkomplekset før behandlingen med det immobi1iserede protamin renses for uønskede proteiner ved adsorption på en ion- 25 bytter og eluering med en saltopløsning. 30 35