FI114969B - Tekijä IX:n valmistus - Google Patents
Tekijä IX:n valmistus Download PDFInfo
- Publication number
- FI114969B FI114969B FI933814A FI933814A FI114969B FI 114969 B FI114969 B FI 114969B FI 933814 A FI933814 A FI 933814A FI 933814 A FI933814 A FI 933814A FI 114969 B FI114969 B FI 114969B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- factor
- salt
- solution
- concentration
- process according
- Prior art date
Links
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 title claims abstract description 368
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 title claims abstract description 362
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 title claims abstract description 356
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 114
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 113
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 45
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 180
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 130
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 69
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 54
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 40
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 37
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 29
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 29
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 29
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 24
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 22
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 21
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 20
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 20
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 16
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 16
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 15
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 claims description 15
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 14
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 13
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 12
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 11
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 230000002411 adverse Effects 0.000 claims description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 10
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 9
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 9
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 9
- -1 alkaline earth metal thiocyanates Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 8
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 claims description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 8
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims description 7
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 7
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims description 7
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims description 7
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims description 7
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 6
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 6
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Chemical class 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical class NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 4
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 4
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- 229910001508 alkali metal halide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910001615 alkaline earth metal halide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 claims description 3
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052936 alkali metal sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 claims description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 159000000009 barium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 claims 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 2
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 37
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 51
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 48
- 239000000047 product Substances 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 23
- MELCWEWUZODSIS-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(diethylamino)ethoxy]-n,n-diethylethanamine Chemical compound CCN(CC)CCOCCN(CC)CC MELCWEWUZODSIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 16
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 15
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 13
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 12
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 12
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 12
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 11
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 11
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 10
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 10
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 10
- 239000000306 component Substances 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 description 10
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 9
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 9
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 7
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 7
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 6
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 5
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 5
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 4
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 3
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 229940006612 barium citrate Drugs 0.000 description 3
- PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H barium(2+);2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Ba+2].[Ba+2].[Ba+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 3
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 3
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 2
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 2
- 229960000027 human factor ix Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MJQHZNBUODTQTK-WKGBVCLCSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[[(1s,3s,4s,5s,8r)-3-[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[[(1s,3r,4s,5s,8r)-3,4-dihydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]oxy]-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-4-hydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5- Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H]2OC[C@@H]1O[C@@H](O[C@@H]1[C@H]([C@H](O[C@H]3[C@H]4OC[C@@H]3O[C@@H](O)[C@H]4O)O[C@H](CO)[C@@H]1O)O)[C@H]2O MJQHZNBUODTQTK-WKGBVCLCSA-N 0.000 description 1
- JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-3-ium;chloride Chemical class [Cl-].[NH2+]1C=CN=C1 JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZFFMLCVRJBZUDZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbutane Chemical group CC(C)C(C)C ZFFMLCVRJBZUDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 1
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 101000823435 Homo sapiens Coagulation factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003575 carbonaceous material Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003028 elevating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000000025 haemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940052349 human coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 210000001724 microfibril Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000001453 nonthrombogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000009751 slip forming Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
Description
114969
Tekijä IX:n valmistus - Framställning av faktor IX Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee tekijä IX:n puhdistusta ja stabilointia, joka tekijä IX on yksi proteiineista, jotka ovat välttämättömiä reaktioiden kaskadeja, jotka toteuttavat veren hyydyttämisen haavakohdassa.
Tämä keksintö koskee myös menetelmää hemofilia B:n hoidossa käyttökelpoisen 10 terapeuttisen koostumuksen valmistamiseksi.
Tekijä IX on pallomainen proteiini, jonka molekyylimassa on noin 70 000 Da ja jota, normaalissa yksilössä, muodostuu jatkuvasti maksassa ja kulkee verenkierrossa normaalilla veriplasmakonsentraatiolla noin 5 pg/ml.
15
Hemofilia B (tunnetaan myös nimellä "Christmas disease") on hyvin vakava sairaus, josta on seurauksena alentunut in vivo ja in vitro hyytymisaktiivisuus ja vaatii pitkällistä lääketieteellistä seuraamista koko sairaan henkilön elämän ajan. Tällaisilla henkilöillä nähdään normaaleja hyytymisaikoja vain, kun heille toimitetaan ulkoista teki-20 jä IX:ää, joka on uutettu normaalien yksilöiden veriplasmasta. Ilman tällaista hoitoa sairauden vaivaamilla henkilöillä voi olla spontaaneja verenvuotoja nivelissä, jotka , : vuodot tuottavat voimakasta kipua ja heikentävää immobiliteettia, verenvuotoja ... lihaksiin antaen tulokseksi kudokseen kertyvän veren suuret tilavuudet, spontaanit : -. . verenvuodot kurkussa ja niskassa, jotka voivat aiheuttaa tukehtumisen ellei niitä ; v. 25 hoideta välittömästi, verenvuotoa virtsaan, ja vakavaa verenvuotoa kirurgian tai , *: *. vähäisempien onnettomuustapaturmien tai hampaanpoistojen jälkeen.
; v. Funktionaalisen tekijä IX:n puutteet voivat syntyä eri tavoilla. Tekijä IX:ää kooditta- , * · *. va geeni sijaitsee X-kromosomissa. Tämä selittää, miksi hemofilia B on paljon ylei- 30 sempää miehillä kuin naisilla. Joidenkin sairauden vaivaamien henkilöiden tiedetään ' ; perineen X-kromosomin, jossa on täydellinen tekijä IX-geenin deleetio. Nämä vaka- M t I i > · vasti sairaat henkilöt voivat jopa tuottaa vasta-aineita terapeuttisesti injisoidulle tekijä IX:lle. Useiden hemofilia B-potilaiden tiedetään tuottavan tekijä IX-molekyyliä, * : jonka aminohapposekvenssi on muuttunut, mistä on tuloksena molekyylejä, joilla on 114969 2 osittaista tai ei lainkaan hyytymisaktiivisuutta. Jotkut hemofilia B-potilaat tuottavat normaalia tekijä IX:ää, mutta riittämättömiä määriä hyytymisen aikaansaamiseksi normaalin ajan sisällä vamman jälkeen.
5 Kuten edellä mainittiin, tekijä IX-aktiivisuus voidaan palauttaa potilaassa normaalin ihmisplasman injektiolla. Olisi kuitenkin annettava vähintään useita litroja potilaiden verenkierrossa kiertävien tekijä IX-tasojen kohottamiseksi tehokkaalle alueelle. Niinpä terapian painotus hemofilia B-potilailla on ollut toimittaa plasmakonsentraatti-injektioita, jotka ovat pitkälle rikastettuja tekijä IX:n suhteen. Tällaisen konsentraa-10 tin aikaansaaminen ei ole helppo tehtävä, kuten seuraavasta esityksestä käy ilmi.
Mekanismit, joissa verenkierrossa olevan veren hyytyminen on yleensä estetty, mutta jotka on suunnattu veren hyydyttämiseen haavakohdassa, ovat hyvin monimutkaisia ja niihin osallistuu lukuisia proteiineja, muita makromolekyylejä, soluja ja ra-15 kenteita. Tässä hemostaattisessa mekanismissa hyödynnetään myös lukuisia "feedback" -tai monistusreittejä hyytymisen edelleen säätämiseksi. Johtuen suuresta lukumäärästä yksittäisiä proteiinilajeja, jotka muodostavat hyytymisreitin ja muiden veriplasmassa olevien makromolekyylien lukumäärästä on yleensä vaikeaa eristää käyttökelpoisia määriä mitään yksittäistä komponenttia, mukaan lukien tekijää IX, 20 hyvin puhtaassa muodossa. Lisäksi veri sisältää lukuisia proteaaseja (entsyymejä, jotka sulattavat tai vaurioittavat muita proteiineja), jotka voivat vaikuttaa haitallises-: ti eristykseen valittuun proteiiniin, kuten tekijä IX:ään, ennen kuin se voidaan erot- ‘, : taa muista verikomponenteista.
: ’ * : 25 Koska veren hyytymiskykyä pidetään kontrolloidussa tasapainossa, tekijä IX ja muut : Ί ‘: hyytymiseen liittyvät komponentit on pidettävä inaktiivisina suurimman osan ajasta tarpeettoman hyytymisen välttämiseksi. Silti proteiinien on aina oltava läsnä koko ;! · verenkiertojärjestelmässä - valmiina reagoimaan välittömästi tarvittaessa.
* » .. 1: 30 Sen vuoksi on välttämätöntä, että veri sisältää hyvin monimutkaisen mekanismin ____: estämään hyytymistä tapahtumasta kun sitä ei tarvita, puhdistamaan ei-toivotun » # hyytymisen, ja pysäyttämään nopeasti veren menetyksen vaurioituneessa kohdassa.
' ’ Tämän monimutkaisen säätelymekanismin selvityksestä käy ilmi, miksi kliinisesti 114969 3 vaarallisista kontaminoivista aineista vapaan terapeuttisen tekijä IX:n eristäminen on niin vaikeaa.
Tehokkaan hyytymän muodostumiseen liittyy useiden verisuonijärjestelmän kompo-5 nenttien monimutkainen vuorovaikutus, mukaan lukien verihiutaleiden, kollageenin ja mikrofibrillien, jotka paljastuvat vauriossa verisuonen epiteelille, fosfolipidit, ja verenkierrossa olevat proteiinit. Proteiineja, jotka kiertävät veressä inertteinä pro-entsyymeinä ja jotka osallistuvat hyytymiseen, kutsutaan tyypillisesti "hyytymistekijöiksi". Aktivoitaessa ne toimivat yleensä kuten hyvin spesifiset entsyymit, jotka telo kevät spesifisiä muutoksia muihin hyytymistekijäproentsyymeihin. Siten aktivoituu puolestaan jokainen peräkkäinen tekijä. Jotkin proentsyymit, kuten tekijä XII, voivat aktivoitua myös kontaktilla vaurioituneen pinnan kanssa tai kompleksoitumalla muiden makromolekyylien kanssa.
15 Hyytymisprosessin mekanismi tunnetaan huomattavan yksityiskohtaisesti. Hyytymistekijän aktiivista muotoa merkitään indeksillä "a" ja muodostuu tyypillisesti inaktiivisesta proentsyymistä jonkin muun tekijäspesifisen proteaasin vaikutuksesta. Teoriassa aktivoitujen hyytymistekijöiden antoon hemofiliapotilaille liittyy vaara hyytymän muodostumiselle useassa paikassa vauriokohdan ohella.
20
Hemostaattista mekanismia voidaan karakterisoida hyvin herkäksi tasapainoksi koa-: guloitumista estävien ja lisäävien materiaalien tai tapahtumien välillä. Yhden tai . . usean aineen, erityisesti aktivoitujen hyytymistekijöiden liiallinen toimitus voi johtaa : . . ei-toivottuun hyytymiseen. Aktivoidut hyytymistekijät voivat sen vuoksi olla vaaralli- . ·. 25 siä kontaminoivia aineita hyytymisproentsyymien terapeuttisissa valmisteissa kuten tekijä IX-valmisteissa.
. *. Hemofilia B-potilaiden suhteen tekniikan tasoon liittyy kuitenkin tyypillisesti heidän hoitaminen "protrombiinikompleksikonsentraatilla", joka on plasmauutetta, joka on 30 konsentroitu tekijän IX suhteen, mutta sisältää myös merkittävät määrät muita ! plasmaproteiinit, mukaan lukien tekijöitä II, VII, X, niiden aktiivisia muotoja, ja lu kuisia muita kontaminoivia proteaaseja. Tällaiset valmisteet voivat tavallisesti olla ' ..: kontaminoituneita myös olla tekijä IXa:lla.
114969 4
Kirjallisuudessa on useita raportteja tekijä IXa:lla ja/tai muiden hyytymistekijöiden aktiivisilla tai hajonneilla muodoilla kontaminoidun protrombiinikompleksikonsentraa-tin (tai muiden tekijä IX-konsentraattien) annon kliinisistä seurauksista. Vakavin vaara on hyytymiskaskadin ei-tarkoitettu aktivoituminen. On kuvattu kuolemantapa-5 uksia.
Epäpuhtaiden tekijä IX-konsentraattien käyttöön liittyvien ongelmien ratkaisuja ovat vaikeuttaneet täsmällisen tietämyksen puute siitä, kuinka ja miksi tällaiset konsent-raatit indusoivat ei-toivottua hyytymistä. On ehdotettu, etteivät tekijä IX-konsent-10 raatit voi indusoida koaguloitumista ainoastaan läsnä olevista tekijöiden IXa määristä johtuen, vaan myös koska ne ovat merkittävästi kontaminoituneet muilla hyytymistekijöillä, ladaten siten verenkiertoon liian korkeat yhden tai usean hyytymistekijän tai niiden aktivoitujen muotojen tasot.
15 Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesia (SDS-PAGE) käyttäen suoritettujen määritysten perusteella tekijä IXa:n likimääräinen molekyylimassa on 54 000. Muilla peptidilajeilla, jotka ovat tulosta tekijä IX:n proteolyyttisestä hajotuksesta, on kuitenkin hyvin samanlaiset molekyylimassat, esimerkiksi noin 40 000 -noin 65 000. Nykyisin ei tiedetä, ovatko tekijä IX-aktivaatiotuotteet tai hajoamistuot-20 teet pääasiallisesti vastuussa haitallisista kliinisistä seurauksista, jotka on havaittu :. annettaessa protrombiinikompleksikonsentraattia tai muita epäpuhtaita tekijä IX:ää ; · j sisältäviä konsentraatteja. Näin ollen on farmaseuttiselta kannalta kiinnostavaa val- '; mistaa tekijä IX:n terapeuttisia formulaatioita, joilla vältetään epäpuhtaiden valmis- teiden vaarat.
;v. 25 :' j': Tekniikan tasolla kuvataan erilaiset strategiat tekijä IX:n puhdistukseen, mukaan lukien monoklonaalisen vasta-aineaffiniteettiteknologian käyttö tekijä IX:n erottami-V; seen muista hyytymistekijöistä. On kuitenkin tärkeää, että tällaisissa tekijä IX- :: puhdistuksissa yritetään minimoida tekijä IXa- tai hajonneiden tekijä IX-peptidien .' . 30 muodostuminen. Koska tekijä IX (proentsyymi) ja aktivoitu tekijä IX (IXa) ovat ra- ! kenteeltaan samanlaiset, näitä tekijä IX:n kahta muotoa on vaikea erottaa millään puhdistusstrategialla. Erotuksen saavuttaminen on epätodennäköistä jopa vasta- I t aineaffiniteettiteknologialla, koska molemmissa molekyyleissä ovat niiden mahdolli-‘ * set determinantit yhteisiä, ja tekijä IXa-kontaminantilla (ja mahdollisesti tekijä IX:n 114969 5 hajoamispeptideillä) olisi taipumus kulkeutua eteenpäin lopputuotetta kohden. Uskotaan, että nykyisin ei tunneta vasta-ainetta, jolla olisi riittävästi eroava herkkyys.
Tämä keksintö koskee parannettua menetelmää estää tekijä IX:n proteolyyttinen 5 konversio tekijä IXa:ksi tai hajonneiksi tekijä IX-peptideiksi tekijää IX puhdistettaessa, ja estää proteolyyttistä vaikutusta puhdistettuun tekijä IX:ään sen varastoinnin aikana.
Kuvatut kehitykset 10
Tekijä IX:n puhdistus vaatii sen erottamista lukuisista muista veriplasmaproteiineista ja muista plasman makromolekyyleistä. Tyypillisesti tekijä IX:ää tuotetaan kryosa-kattomasta plasmasta. Tätä plasmafraktiota valmistetaan jäädyttämällä kokoplas-maa nopeasti, antaen sen sulaa hitaasti, ja keräämällä eronneen supernatantin.
15 Katso julkaisua Pool, J.G., et ai. Nature. 203 (1964) 312. Useat proteiinit, mukaan lukien tekijä VIII, saostuvat ulos hitaasti sulavasta plasmasta ja voidaan poistaa sentrifugoimalla.
Tekniikan tason käytännössä tekijä IX:ää sisältävä kryosakaton supernatanttiplasma 20 sekoitetaan tyypillisesti anioninvaihtohartsin tai -geelin kuten DEAE SephadexR:n, DEAE-selluloosan tai DEAE SepharoseR:n kanssa, (erä- tai kolonnimuodossa) tai vaihtoehtoisesti AI(OH)3-geelin kanssa, johtaen tekijä IX:n adsorptioon yhdessä , v. muiden samanlaiset sitoutumisominaisuudet omaavien hyytymistekijöiden kanssa, ja ; ·. ·. myös muiden kontaminoivien proteiinien vähäisempien määrien adsorption kanssa.
: ·. *. 25 Alkufraktioinnissa anioninvaihtohartsipartikkeleilla hyödynnetään sitä seikkaa, että . ·: ·. määrätyt hyytymistekijät (kuten tekijät II, VII, IX ja X) adsorboituvat selektiivisesti < t · tällaisten hartsien pinnalle johtuen niiden negatiivisesti varautuneista gamma-kar- . ·. boksiglutamaattitähteistä. Näitä proteiineja kutsutaan myös "K-vitamiinista riippuvik- . · · ·. si hyytymistekijöiksi" koska translaation jälkeinen K-vitamiinikofaktorista riippuva 30 prosessi kiinnittää gamma-karboksiryhmät, tällaisten ryhmien ollessa välttämättömiä * »· »* ; hyytymistekijöiden oikealle kiinnittymiselle Ca :een, lipidipinnoille ja verihiutaleisiin.
‘: Tyypillisesti sitoutunut tekijä IX pestään ja eluoidaan sitten anioninvaihtohartsista ‘ * käyttämällä suuren molaarisuuden omaavaa puskuroitua suolaliuosta. Koska tällaista 114969 6 korkean molaarisuuden omaavaa suolaliuosta pidetään osmoottisesti yhteensopivat-tomana ihmiskudosten kanssa, tekniikan tason toteuttajat altistavat tekijä IX-uut-teensa poikkeuksetta dialyysille ja suodatukselle (tai vuorotellen ultrasuodatukselle ja diasuodatukselle), jotka saattavat tekijä IX-uutteen konsentroituun muotoon, 5 mutta korvaavat korkean molaarisuuden omaavan suolaliuoksen fysiologisesti yhteensopivalla alhaisen molaarisuuden omaavalla suolaliuoksella.
Tekijä IX:llä rikastettu hartsieluaatti (kontaminoitunut merkittävillä määrillä muita proteiineja, mukaan lukien hyytymistekijöitä II, VII ja X) tunnetaan nimellä protrom-10 biinikompleksikonsentraatti. Tekijä II (protrombiini) ja muut K-vitamiinista riippuvat hyytymistekijät tunnetaan nimellä "protrombiinikompleksi" johtuen edellä mainituista samanlaisista sitoutumisominaisuuksista. Hemofilia B-potilaita on tyypillisesti hoidettu tällaisilla konsentraateilla.
15 Tekniikan tason toteutuksessa edellä mainittua anioninvaihtokromatografiaa voivat myös edeltää muut vaiheet, tai se voidaan korvata muilla vaiheilla. Esimerkiksi kryo-sakaton plasma, johon on lisätty sitraattia, voidaan käsitellä bariumkloridilla, minkä seurauksena saostuu bariumsitraattia, jolle tekijä IX ja määrätyt muut hyytymistekijät ovat sitoutuneet. Proteiinit eristetään sakasta ja altistetaan sitten anioninvaihto-20 kromatografialle. Katso esimerkiksi Miletich, J.P. et ai., J. Biol. Chem.. 253(19) (1978) 6908-6916. Tekijä IX voidaan myös adsorboida AI(OH)3-geeliin.
Vaihtoehtoisesti voidaan lisätä toinen ioninvaihtohartsivaihe. Kuten US-patenttijul- I · : .·. kaisussa 4447416 (tämän jälkeen '416-patentti) kuvataan, tekijä IX-fraktio altiste- : ·. ·. 25 taan anioninvaihtokromatografian jälkeen ultrasuodatukselle ja diasuodatukselle :·. 0,15 M NaCI:ta vastaan, joka on puskuroitu 20 mM sitraatilla, pH 6, ja altistetaan toiselle ioninvaihtokromatografian vaiheelle sulfatoitua dekstraanihartsia käyttäen.
.·. Tekijä IX eluoidaan tästä toisesta hartsista kun suolakonsentraatio saavuttaa 0,8 M.
, ·*·. Tekijä IX, joka sisältyy korkean suolamolaarisuuden omaavaan liuokseen, altistetaan 30 sitten jälleen ultrasuodatukselle ja diasuodatukselle fysiologisesti hyväksyttävää I · * ; 0,11 M NaCI:ää vastaan, 20 mM sitraatti, pH 6,8, ja varastoidaan sitten lyofilisoidus- sa muodossa. Kuvattu menetelmä johtaa kuitenkin tekijä IX-tuotteeseen, jossa alle 10 % proteiinista on tekijä IX:ää, jolloin yli 90 % materiaalista koostuu kontaminoi- ‘' ‘ vista proteiinilajeista. '416-patentissa ei kuvata tekijä IXa-määrityksiä, eikä kuvata 114969 7 kokeita, jotka määrittäisivät jatkavatko kontaminoivat proteaasit tekijä IXa:n tai tekijä IX:n hajotettujen muotojen muodostamista, jos tuotetta olisi varastoitava muussa kuin lyofilisoidussa muodossa.
5 Menache, D. et ai., julkaisussa Blood 64(6) (1984) 1220-1227, käyttäen teknologiaa, joka heijastaa '416-patenttia, kuvaa tekijä IX-valmisteen, jonka mainitaan olevan vapaa aktivoidusta tekijä IXa:sta ja jonka spesifinen aktiivisuus on noin 5 yksikköä tekijä IX-aktiivisuutta/mg kokonaisproteiinia. Koska puhtaan tekijä IX:n spesifinen aktiivisuus on noin 200 yksikköä/mg proteiinia, lopputuotteen katsotaan olevan 10 huomattavan kontaminoitunutta muilla proteiineilla, ja proteaasiaktiivisuuden mahdollisuudesta johtuen sen pitkäaikainen ei-trombogeeninen tila on kyseenalainen.
Michalski et. ai., Vox Sana 55 (1988) 202-210, kuvaa tekijä IX:lle puhdistusstrategi-an, jossa tekniikan tason standardianioninvaihtokromatografiaa seuraa kromatogra-15 fia hartsilla, joka on päällystetty hepariinilla, negatiivisesti varautuneella mukopoly-sakkaridilla. Tuotteen mainitaan olevan tekijä IXa-vapaata antitrombiini III-neutra-lointimäärityksellä mitattuna, mutta sisältää vain 5 paino-% tekijä IX:ää, lopun ollessa proteiinikontaminantteja. On kliinisesti ei-toivottavaa antaa tällaisia epäpuhtaita valmisteita johtuen tekijä IX:n aktivoitumismahdollisuudesta yhdellä siinä läsnä 20 olevista kontaminoivista proteiineista. Ilman tällaisen konsentraatin arviointia eläin-malleissa, jotka ovat herkkiä tässä patenttihakemuksessa kuvatuille trombogeenisille ____: komponenteille, trombogeenisen vaaran puuttumista ei ole varmistettu.
: ·.·. Koska veriplasma sisältää useita proteiineja, joilla on samanlaiset fysikaaliset omi- : ·. ·. 25 naisuudet ja joiden erottaminen tekijä IX:stä on hyvin vaikeaa, ja koska useimmat . ·: ·. puhdistusmenettelyt antavat tulokseksi tekijä IX:n huomattavan proteolyyttisen ak tivaation ja/tai hajoamisen, ammatinharjoittajat ovat yrittäneet kehittää uusia toi-. ·. mintasuunnitelmia terapeuttisten tekijä IX-valmisteiden saamiseksi, joilla on hyvä . * · ·. spesifinen aktiivisuus (hyvä puhtaus) ja jotka ovat vapaita muista proteiinikonta- 30 minanteista.
Huomattava paino on pantu ihmisen tekijä IX-geenin kloonaamiselle tekijä IX-:: valmisteiden tuottamiseksi, jotka ovat vapaita muista hyytymistekijöistä ja veriplas- ’:‘: man proteaaseista, jotka pyrkivät hajottamaan tekijä IX:ää. Epäonneksi ei tähän 114969 s mennessä ole ollut mahdollista eristää tekijä IX:ää tällaisista valmisteista riittävän puhtaassa muodossa. Lisäksi estettä toistaa, yhdistelmä-DNA-tuotteessa, erityisten glutamiinihappotähteiden spesifinen, in vivo translaation jälkeinen modifiointi tekijän IX kriittisten gammakarboksiglutamiinihappotähteiden tuottamiseksi ei ole vielä rat-5 kaistu.
Yksittäisille proteiineille spesifiset vasta-aineet ovat olleet arvokas työkalu pyrittäessä eristämään hyytymistekijöitä puhtaassa muodossa. Tekniikan mukaan, jonka Koehler, G. ja Milstein, C. fNature 256 (1975) 495-497) ovat kuvanneet, Goodall, 10 A.H. et ai. tunnistivat monoklonaaliset vasta-aineet tekijälle IX ja käyttivät niitä pre-paratiivisessa immunoaffiniteettikromatografissa suuren spesifisen aktiivisuuden tekijä IX:n luomiseksi. Blood 59(3) (1982) 664-670. Goodall'in menettely ei kuitenkaan ratkaise ratkaisevaa kliinistä vaikeutta, että natiivissa plasmassa esiintyy tekijä IXa:ta ja muodostuu edelleen proteolyyttisellä aktiivisuudella menettelyn alustavien 15 vaiheiden aikana (tavanomainen kromatografia kuten anioninvaihto) ennen immu-noaffiniteettikromatografiaa. Ei ole kuvattu määrityksiä tekijä IXa:lle tai hajotetuille tekijä IX-peptideille. Ei kuvattu strategiaa trombogeenisyyden kontrolloimiseksi ennen immunoaffiniteettikromatografiaa, eikä testituloksia eläinmalleissa, jotka ovat herkkiä kuvatuille trombogeenisille komponenteille.
20 . Monoklonaalinen vasta-aine-affiniteettitekniikat ovat hyvin tehokkaita tekijä IX:n . .erottamisessa muista hyytymistekijöistä, ja niistä on tullut useiden tutkijoiden suo- , v. sima puhdistusmenetelmä. Tekniikan tasolla immunoaffiniteettikromatografialla saa- • * · : ·. ·. tu tekijä IX on kuitenkin johdonmukaisesti kontaminoitunut yhdessä puhdistuvalla 25 tekijä IXa:lla ja/tai tekijä IX:n muilla kliinisesti ei-hyväksyttävillä hajotetuilla muodoil-. ’: ·. la, jotka ristireagoivat tekijä IX-vasta-aineiden kanssa.
. ·. US-patenttijulkaisussa 4786726 (tämän jälkeen 726-patentti) kuvataan erityinen , · · ·. monoklonaalinen vasta-aine, jota siellä kutsutaan nimellä "A-7". Kehitys koostuu sen 30 ymmärtämisestä, että tämän vasta-aineen sitoutuminen tekijä IX:ään on Ca+2-riip- • * · * ! puvaa ja voidaan estää etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) lisäämällä. Tämä . antaa käyttöön käyttökelpoisen tavan kontrolloida tekijä IX:n affiniteettikolonnin stationaarifaasista elUoitumista kontaminoivien proteiinien poistamiseksi suoritetun ' ’ pesun jälkeen. Lopuksi tekijä IX eluoidaan vasta-aine/hartsi-komplekseista kalsium- 114969 9 kelatointia käyttäen. Kehittäminen ei kuitenkaan paranna immunoaffiniteettikolon-niin lisätyn protrombiinikompleksikonsentraatin laatua, eikä anna käyttöön tapaa tekijä IX:n erottamiseksi tekijä IXa:sta.
5 Ei mainita tekijä IX:n aktivaation tai hajoamisen varhaisissa käsittelyvaiheissa kontrolloimisen välttämättömyyttä, eikä tapaa kontrolloinnin suorittamiseksi.
Smith, KJ. et ai., Thrombosis Research 33 (1984) 211-224, julkaisussa, joka heijastaa 726-patenttia, ei onnistunut yrityksessä muodostaa vasta-ainetta, joka tunnis-10 taisi tekijä IX:n eikä tekijä IX^ta (tai kääntäen). Tekniikan tasolla ei kuvata sellaista vasta-ainetta (jonka eristäminen on, itse asiassa, rakenteellisista seikoista johtuen luultavasti hyvin vaikeaa) painottaen tarvetta muille puhdistusvaiheille ja -menetelmille, jotka ratkaisevat tekijä IX:n tekijä IXa:ksi aktivoitumisen tai sen muiksi kliinisesti ei-turvallisiksi peptideiksi hajoamisen ongelman.
15
Kliinisesti hyväksyttävimmän, trombogeenisistä komponenteista vapaan tekijä IX:n tuottamiseksi on välttämätöntä kontrolloida tekijä IX:n hajoamista, tai aktivoitumista kautta valmistusproseduurin ja erityisesti sen varhaisissa vaiheissa. Tämän ongelman ratkaisun puute mainitaan johdonmukaisesti tekniikan tasolla. On esimerkiksi 20 kuvattu, että immunoaffiniteettipuhdistetulla tekijä IX-tuoteella nähtiin alhaisemman , molekyylimassan omaavien komponenttien (mukaan lukien IXa:n) kontaminaatiota, : joka johtuu tekijä IX:n hajoamisesta lähtöainemateriaalissa.
: ·,*. Lisäksi toiseen immunoaffiniteettipuhdistusjärjestelmään viitaten, H.A. Liebman et : , 25 ai. mainitsee myös saman kyvyttömyyden differentioida ja erottaa tekijät IX ja IXa.
! ;·. Blood, 62(5), supp. 1, 288a (1983). Katso myös Liebman, H.A. et ai., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 82 (1985) 3879-3883.
.1 · ·. Immunopuhdistusjärjestelmän, jonka on kuvannut H. Bessos et ai., sanotaan luo- 30 neen suuren spesifisen aktiivisuuden omaavaa tekijä IX:ää, jonka aktiivisuus aleni I « · ’· ; nopeasti puhdistuksen jälkeen kun tuote sijoitettiin alhaisen ionivahvuuden omaa- , vaan varastointiliuokseen. Thrombosis and Haemostasis 56(1) (1986) 86-89. Tämän * I · :: rappeutumisen on aiheuttanut proteaasiaktiivisuus.
• I
10 1 1 4969
Tekniikan tasolla on myös yritetty, vain osittaisella menestyksellä, estää tekijä IX:n aktivoitumista tekijä IXa:ksi käyttämällä erityisiä proteaasi-inhibiittoreita, joista useat ovat orgaanisia yhdisteitä, jotka ovat tyypillisesti hyvin toksisia. Nämä yhdisteet ovat sopivia ainoastaan in vitro-tutkimuskävttöön ja ovat hyvin ei-toivottavia reagenssei-5 na kliinisille tuotteille tarkoitetuissa ohjeissa. Esimerkiksi 726-patentissa mainitaan, että tekijä IX:n immunoaffiniteettikromatografian on tapahduttava bentsamidiinin läsnä ollessa. Tekijä IX:n saamiseksi riittävän puhtaana ja stabiilina spesifisten mo-noklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi Goodall, A.H. et ai. (Blood 59 (3) 664-670 (1982)) kuvaa toksisten orgaanisten bentsamidiini- ja di-isopropyylifluorifosfonaatti-10 yhdisteiden lisäämisen tekijä IX:ää sisältäviin liuoksiin.
Tämä keksintö liittyy tekijä IX:n stabiloimiseen aktivoitumista tai hajoamista vastaan.
15 Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön mukaisesti aikaansaadaan menetelmä tekijä IX:n stabiloimiseksi liuoksessa tekijä IXa:ksi aktivoitumista tai muuttuneen pituuden ja/tai konformaation omaaviksi peptideiksi hajoamista vastaan, johon menetelmään kuuluu vaiheet: 20 (A) lisätään yhtä tai useaa liukoista orgaanista tai epäorgaanista suolaa tekijä IX:ää sisältävään liuokseen konsentraatioon, joka on riittävä estämään tai oleellisesti minimoimaan tekijä IX:n aktivoitumisen tai hajoamisen, mutta konsentraatiossa, joka on , ·. riittämätön aiheuttamaan tekijä IX-molekyylin saostumista, irreversiibeleitä muutoksia : v. tai denaturoitumista; ja 25 (B) pidetään suola(t) liuoksessa mainitussa konsentraatiossa.
Eräässä suhteessa tämä keksintö liittyy tekijä IX:n suojaamiseen tekijä IXa:ksi akti-.·. voitumiselta tai hajoamiselta muuttuneen pituuden ja/tai konformaation omaaviksi peptideiksi monivaiheisen puhdistuksen aikana minimoimalla ajan, jona epäpuhdas-30 ta tekijä IX:ää on läsnä liuoksissa, jotka sisältävät riittämättömän suolakonsentraati- * * · ‘ ; on. Keksinnön mukaisten parannettujen menetelmien havaitaan olevan erityisen • · käyttökelpoisia estämään proteaasien katalyyttisen vaikutuksen tekijä IX:ää koh-taan. Niinpä annetaan keksinnön mukaisesti käyttöön menetelmä tekijä IX:n puhdis 114969 11 tamiseksi liuoksessa, johon puhdistukseen kuuluu kaksi tai useampia peräkkäisiä erotusprosesseja, johon menetelmään kuuluu vaiheet: (A) lisätään erityisen erotusprosessin aikana tai sen jälkeen, yhtä tai useaa liukoista orgaanista tai epäorgaanista suolaa tekijä IX:ää sisältävään liuokseen suolakonsent- 5 raatioon, joka on riittävä estämään tai oleellisesti minimoimaan proteaasien katalyyttisen vaikutuksen tekijä IX:ään, mutta mainitun suolan tai suolojen kokonaiskon-sentraatiossa, joka on riittämätön aiheuttamaan tekijä-IX-molekyylin saostumista, irreversiibeleitä muutoksia, tai denaturoitumista; ja (B) pidetään osaksi puhdistettu proteiini kontaktissa mainitun suolaliuoksen kanssa 10 mainitussa riittävässä suolakonsentraatiossa ajanjakson ainakin kunnes seuraava erotusprosessi aloitetaan.
Kuten tässä alla kuvataan yksityiskohtaisesti, keksinnön toteutuksessa voidaan käyttää laajaa valikoimaa vesiliukoisia orgaanisia ja epäorgaanisia suoloja. Edullisia suo-15 loja ovat vesiliukoiset alkalimetalli- tai maa-alkalimetallisuolat, edullisimmin magnesium-, kalium-, natrium- ja litiumkloridi tai natriumsulfaatti. Odotetaan, että laajimmin käytetty suolakonsentraatio on alueella noin 0,4 - noin 1,4 M.
Keksinnön avulla voidaan muodostaa vesiliuos, joka sisältää osaksi puhdistettua 20 tekijä IX:ää, jolla on ennalta määrätty spesifinen aktiivisuus, ja yhtä tai useaa vesiliukoista orgaanista tai epäorgaanista suolaa konsentraatiossa, joka on riittävä es-, : tämään tai oleellisesti minimoimaan proteaasien katalyyttisen vaikutuksen tekijä . v, IX:ää kohtaan, mutta riittämätön tekijä IX-molekyylin irreversiibelien muutosten, : ·. ·, saostumisen tai denaturoitumisen aiheuttamiseen, jolloin liuoksella on ainakin noin ; ·. ·. 25 12 tunnin ajan lämpötilassa 4°C tai alle varastoitaessa myös tekijä IX-aktiivisuus * » .1 r, noin 80 - noin 100 % ennalta määrätystä aktiivisuudesta.
: , >, Keksinnön avulla voidaan myös aikaansaada tekijä IX-koostumukseen, joka on terä- * > . · · ·. peuttisessa muodossa ja on stabiili siten, että sitä voidaan varastoida pilaamatta 30 vesiliuoksessa pidennettyjä ajanjaksoja, esimerkiksi ainakin noin 2 viikkoa huoneen-‘ ; lämpötilassa. Niinpä keksintö lisäksi koskee, kuten edellä on mainittu, menetelmää . * hemofilia B:n hoidossa käyttökelpoisen terapeuttisen koostumuksen valmistamiseksi, :: jolla koostumuksella on spesifinen aktiivisuus yli noin 50 yksikköä tekijä IX-aktiivi- ‘* ”: suutta/mg proteiinia, ja jota voidaan varastoida liuosmuodossa ajanjakso noin 114969 12 2 viikkoa varastointilämpötilassa jopa 15-30°C pysyen samalla vapaana tekijä IXa:sta, tekijä IX:n denaturoiduista muodoista ja/tai muiden hyytymistekijöiden aktiivisista muodoista konsentraatioissa, joilla olisi taipumus aiheuttaa havaittavia haitallisia kliinisiä vaikutuksia ihmisessä kun mainittua koostumusta annetaan terapeut-5 tinen annos, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että menetelmässä: (A) saatetaan kryosakatonta veriplasmaa kontaktiin anioninvaihtohartsin kanssa, johon tekijä IX ja muut tekijät adsorboituvat; 10 (B) eluoidaan tekijä IX anioninvaihtohartsista saattamalla hartsin kontaktiin suolaliu oksen kanssa, jolla on ainakin riittävä molaarisuus tekijä IX:n eluoimiseksi ja tekijä IX:ää sisältävän eluaatin aikaansaamiseksi; (C) pidetään tekijä IX:ää sisältävässä eluaatissa yhtä tai useaa liukoista orgaanista 15 tai epäorgaanista suolaa konsentraatiossa, joka on riittävä estämään tai oleellisesti minimoimaan proteaasien katalyyttisen vaikutuksen tekijä IX: ään, mutta riittämätön aiheuttamaan tekijä IX:n irreversiibeleitä muutoksia, saostumista tai denaturoitumista; 20 (D) altistetaan tekijä IX:ää sisältävä eluaatti kromatografialle immunoaffiniteettiko- lonnilla tekijä IX:n sitomiseksi siihen; ja . y. (E) poistetaan tekijä IX immunoaffiniteettikolonnista puhdistettua tekijä IX:ää sisäl- : , , tävän liuoksen aikaansaamiseksi.
lv. 25
« I
. v. Lisäksi keksinnön mukaisille edullisille suoritusmuodoille on tunnusomaista se, mikä jäljempänä olevissa epäitsenäisissä patenttivaatimuksissa on esitetty.
. “ ·. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu terapeuttinen koostumus voidaan 30 antaa käyttöön hemofilia B:n hoitamiseksi potilaassa. Tällaiselle potilaalle voidaan ‘ ; antaa tehokas määrä yhtä tai useaa keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettua terapeuttista koostumusta. Kuten alla olevasta esityksestä nähdään, tällaisten kek-sinnön mukaisesti valmistettavien koostumusten formulointiin voidaan käyttää erilai-‘: : siä epäorgaanisia ja orgaanisia suoloja, jotka ovat ihmisille ei-toksisia.
114969 13
Keksinnön antamia tärkeitä etuja ovat mm.: 1) terapeuttisten tekijä IX-koostumus-ten puhtauden, luotettavuuden ja stabiilisuuden parantaminen; ja 2) joustavuuden ja taloudellisuuden lisääminen kaupallisiin tekijä IX:n tuotantokaavioihin. Edelleen eräs keksinnön antama etu on, että voidaan tuottaa stabiilia hyvin puhdasta tekijä 5 IX:ää käyttämällä terapeuttisesti ei-toivottavia ja hyvin toksisia orgaanisia proteaasi- inhibiittoreita. Lisäksi keksinnön luonne on sellainen, että se on laajalti sovellettavissa usean tyyppisiin prosesseihin, jotka on kehitetty tekijä IX-valmisteiden, mukaan lukien alhaisen, keskinkertaisen tai korkean puhtauden omaavien valmisteiden tuottamiseen.
10
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 on SDS-polyakryyliamidilaattageeli, jossa näkyvät DEAE-konsentraatit ja lopulliset tekijä IX-tuotteet, jotka on valmistettu näistä tyypillisellä tekniikan tason 15 menetelmällä tai keksinnön mukaisella menetelmällä.
Kuvio 2 on "Western blot", jossa näkyvät DEAE-konsentraatit ja lopulliset tekijä IX-tuotteet, jotka on valmistettu näistä tyypillisellä tekniikan tason menetelmällä tai keksinnön mukaisella menetelmällä.
20
Kuvio 3 on "Western blot", jossa esitetään tasot tekijä IX:n proteolyysistä, joka ta-: pahtui 25°C:ssa tekijä IX:ää sisältävän DEAE-konsentraatin näytteissä, joita dialysoi- , ·, *. tiin natriumkloridin eri molaarisuuksia vastaan.
: . *. 25 Kuvio 4 on "Western blot", jossa esitetään tasot tekijä IX:n proteolyysistä, joka ta- . ,'. pahtui 4°C:ssa tekijä IX:ää sisältävän DEAE-konsentraatin näytteissä, joita dialysoi- tiin eri suolojen 0,5 M konsentraatioita vastaan.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus . 30 ' Tämä keksintö perustuu havaintoon, että vesiliukoisia orgaanisia ja epäorgaanisia » » suoloja voidaan käyttää suojaamaan tekijä IX:ää proteolyysiltä, mukaan lukien akti-voitumiselta tekijä IXa:ksi tekijä IX;n puhdistuksen aikana. Eräs tämän keksinnön ‘ : tärkeistä eduista on, että sitä voidaan käyttää tehokkaasti missä hyvänsä useista 114969 14 erilaisista prosesseista, jotka ovat käytettävissä tekijä IX:n puhdistukseen. Seuraa kuvaus perusprosessityypistä puhdistetun konsentroidun tekijä IX:n tuottamiseksi.
Tekijä IX:n tuotanto terapeuttiseen käyttöön hemofilia B:n hoitamiseksi alkaa perin-5 teisesti veriplasmalla, joka altistetaan pakastukselle.
Sitten tämä pakastettu plasma sulatetaan hitaasti, missä pisteessä hyytymistekijä VIII:n ja määrättyjä muita proteiineja voidaan saada talteen kryosakkana. Tekijä IX ja muut proteiinit liikkuvat liukoiseen supernatanttifaasiin.
10
Sitten tämä tekijä IX:ää sisältävä plasmafraktio altistetaan tyypillisesti anioninvaih-tohartsille adsorptiolle. Sen jälkeen kun hartsipartikkelit on pesty perusteellisesti laimealla suolaliuoksella sitoutumattomien tai heikosti sitoutuneiden proteiinien poistamiseksi, käytetään tavallisesti suuren molaarisuuden omaavaa suolaliuosta eluoi-15 maan tekijä IX:ää, joka kerätään fraktiona, joka tunnetaan nimellä "protrombiini-kompleksikonsentraatti" koska se sisältää myös merkittävät määrät muita K-vita-miinista riippuvia tai "protrombiinikompleksi"-hyytymistekijöitä (tekijöitä II, VII ja X, ja myös näiden aktivoituja muotoja).
20 Tyypillisesti tämä tekijä IX:n suhteen rikastunut fraktio altistetaan sitten pitkähkölle suodatuskonsentroinnille ja dialyysimenettelylle, joka voi vaatia jopa 24 tuntia tarkoituksena korvata runsassuolainen väliaine alhaisen suolamolaarisuuden omaavalla, fysiologisesti yhteensopivalla puskurilla. Aikaisemmin tätä tuotemuotoa käytettiin : v. terapeuttisiin tarkoituksiin. Tyypillisesti tämä vähäsuolainen protrombiinikompleksi- : . , 25 konsentraattimuoto sisälsi proteaaseja, jotka aktivoivat ennenaikaisesti tekijä IX:ää kliinisesti vaaralliseksi tekijä IXa:ksi. Näissä olosuhteissa tekijä IX hajoaa myös muiksi peptideiksi, jotka voivat olla kliinisesti vaarallisia. Tällainen tekijä IX:n proteolyysi ; v. on erityisen vakavaa kun tekijä IX: ää varastoidaan pidennettyjä ajanjaksoja alhaisen * » • * . ·. molaarisuuden omaavissa suolaliuoksissa. Tämän tyyppisen tuotteen annosta on ' J i 30 kuvattu kuolemantapauksia. Plat, P.M. et ai., Annals of Internal Medicine 81 (1974) i * t ’* '! 766-770.
:: Eräässä yrityksessä protrombiinikompleksikonsentraatin kliinisesti riittämättömän » : : puhtauden parantamiseksi tutkijat ovat modifioineet edellä kuvattua perusprosessia 114969 15 esimerkiksi lisäämällä erilaisia lisävaiheita tai erotusmenettelyjä, tai soveltamalla vaihtelevia strategioita tekijä IX:n proteolyysin estämiseksi ja lisäkontaminanttien poistamiseksi. Uudemmat protokollat ovat tyypillisesti muunnelma seuraavasta: 1) kryosaostus; 2) anioninvaihto, jossa hyödynnetään K-vitamiinista riippuvien hyy-5 tymistekijöiden yhteistä spesifistä adsorboitavuutta; ja 3) lisäerotusmenettely, joka erottaa tekijä IX:n muista protrombiinikompleksiproteiineista.
Esimerkkejä tällaisista lisäerotusmenettelyistä on mm. kromatografian käyttö aga-roosigeelillä, johon on kiinnitetty hepariiniryhmiä, kationinvaihto sulfatoidulla dekst-10 raanigeelillä, tai immunoaffiniteettikromatografia, jossa erotus(puhdistus)järjes-telmän stationäärifaasi koostuu tekijä IX-spesifisistä vasta-aineista.
Erääseen toiseen strategiaan liittyy ammoniumsulfaattifraktioinnin käyttö ja/tai tekijä IX:n eluointi adsorptiokompleksista, joka on muodostunut saostuneista barium-15 suoloista, minkä jälkeen seuraa anioninvaihtokromatografia. On käytetty myös selektiivistä adsorptiota alumiinihydroksidigeeliin. Edelleen erääseen toiseen strategiaan liittyy lisäanioninvaihtohartsin käyttö, joka hartsi aikaansaa erottumisen pro-trombiinikompleksiproteiineilla, jotka eivät eronneet kun ne aikaisemmin saatettiin kontaktiin erityyppisen anioninvaihtohartsin kanssa.
20
Edelleen eräs toinen lähestymistapa on lisätä kokoplasmaa tai kryosakatonta plasmaa suoraan tekijä IX-spesifiseen immunoaffiniteettikromatografiaharstiin, joka on . v, läsnä erä- tai kolonnimuodossa.
* * :·. ·, 25 Käytettävissä oleviin menetelmiin tekijä IX:n puhdistamiseksi, kuten edellä kuvattui- * * . ·: <, hin, liittyy erotusprosesseja ja -käsittelyjä. Käsite "erotusprosessi" viittaa tässä käy tettäessä vaiheeseen, johon liittyy tekijä IX: n erotus yhdestä tai useasta muusta : ·. ·. peptidistä (proteiinista), jo(t)ka on/ovat seoksena sen kanssa. Käsite "käsittely," *.···, viittaa tässä käytettäessä vaiheeseen, joka ei aikaansaa tekijä IX: n erottumista 30 muista peptideistä (proteiineista), mutta joka suoritetaan ennen erotusprosessia tai ’ ’; sen jälkeen. Esimerkkejä käsittelyistä ovat dialyysi, steriilisuodatus, lämpösterilointi ’, ’ tekijä IX-liuoksissa olevien kontaminoivien mikro-organismien tai viruspartikkelien inaktivoimiseksi, ja myös diasuodatus, jossa tekijä IX pysyy selektiivisesti selektiivi- 114969 16 sesti läpäisevää membraania vasten samalla kun liuotin, johon tekijä IX on suspen-doitu, suodattuu läpi ja korvataan.
Kun tekniikan tason erotusprosessi tai käsittely vaatii suolan käyttöä, se suoritetaan 5 rutiininomaisesti käyttämällä alhaisen moiaarisuuden omaavaa suolaliuosta (yleensä 0,15 M) paitsi kun prosessin tai käsittelyn luonne vaatii sen suorittamista korkeaa suolakonsentraatiota käyttäen. Viimeksi mainitussa tapauksessa on tavanomaista alentaa suolakonsentraatio heti sen jälkeen kun vaihe, johon sen käyttö liittyy, on päättynyt ja suorittamatta tekijä IX:n varastointia siinä. Esimerkkejä käsittelyistä, 10 joissa korkea suolakonsentraatio, jota ei ole tarkoitettu suojaamaan tekijä IX:ää proteolyysiltä, poistetaan välittömästi vaiheen jälkeen johon sen käyttö liittyy, ovat mm. (1) tekijä IX:n eluointi kromotografiakolonnista korkean suolapitoisuuden omaavaa puskuria käyttämällä ja sitten suolan poistaminen sellaisilla menettelyillä kuten dialyysi tai pakastamalla ja lyofilisoimalla eluaatin, poistaen suolan täten haih-15 duttamalla, tai (2) tekijä IX:ää sisältävän liuoksen kuumentaminen mikro-organismien tai virusten inaktivoimiseksi. Tämän keksinnön kehityksen kuluessa on havaittu, että orgaanisen tai epäorgaanisen suolan konsentraation alentaminen tekijä IX:ää sisältävässä liuoksessa erotus- tai käsittelymenettelyn aikana tai sen jälkeen aikaansaa tärkeän mahdollisuuden tekijä IX:n aktivoitumiselle tekijä IXa:ksi tai tekijä 20 IX:n hajoamiselle muiksi tekijä IX:stä peräisin oleviksi peptideiksi. Uskotaan, että on olemassa kaksi yleistä syytä siihen, että tekijä IX:n proteolyysin ja tulokseksi saadun ; tekijä IXa'.n tuotannon merkittävyys alhaisen suolapitoisuuden omaavissa ympäris- . , töissä on jäänyt tekniikan tasolla huomaamatta.
|25 Ensinnäkin, korkean moiaarisuuden omaavat suolaliuokset häiritsevät tietyntyyppisiä ‘; , erotusprosesseja. Korkeat suolojen konsentraatiot voisivat esimerkiksi estää tekijä t * > IX:llä sitoutumisen määrättyihin ioninvaihtohartseihin tai immunoaffiniteettikolon-• · neihin. Ei saataisi aikaan erotusta.
t t 1 » ’ 30 Toiseksi, tekijä IX:ää sisältäviä korkean moiaarisuuden omaavia suolaliuoksia ei voi- ‘ ; da injisoida potilaisiin koska ne ovat elävän kudoksen kanssa osmoottisesti yhteen sopimattomia. Tuloksena tekniikan taso pitää "ylimääräistä" suolaa jonakin, joka :: pitäisi poistaa tekijä IX-valmisteesta ensimmäisen tilaisuuden tullen.
114969 17
Keksinnön mukainen suolojen käyttö suhteellisen korkeilla konsentraatioilla mahdollistaa tekijä IX:n suojaamisen ei ainoastaan käsittelyjen välillä tai erotusprosessien jälkeen, vaan itse erotusprosessien välillä.
5 Seuraavissa julkaisuissa kuvataan esimerkkejä tekijä IX: n puhdistuksista, joita voidaan modifioida tämän keksinnön mukaisesti tarkoituksena korkeamman puhtauden, parantuneen varmuuden ja stabiilisuuden omaavan terapeuttisen materiaalin tuottaminen. Tällaisten modifikaatioiden eräässä esimerkinomaisessa suoritusmuodossa sisällytetään ja ylläpidetään epäpuhtaassa tekijä IX-liuoksessa liukoista suolaa 10 (esimerkiksi kaliumkloridia) suhteellisen korkeassa konsentraatiossa, esimerkiksi ainakin noin 0,5 M.
(A) US-patenttijulkaisussa 4447416 kuvataan menetelmä tekijä IX:n puhdistamiseksi käyttämällä anioninvaihtohartsia alhaisen molaarisuuden omaa-15 vassa suolaliuoksessa, jolloin seuraa vaiheet, joissa kirkastetaan ja kon sentroidaan suodattamalla alhaisessa suolakonsentraatiossa. Sulfatoidulla dekstraanikationinvaihtohartsilla edelleen puhdistuksen jälkeen liuos dialy-soidaan alhaisen molaarisuuden omaavaa suolaliuosta vastaan.
20 (B) Michalski et ai. Vox. Sana. 55 (1988) 202-210 kuvaa tekijä IX-tuotteen, joka on puhdistettu perinteisellä anioninvaihtokromatografialla ja seuraa-valla hepariiniliitetyn hartsin käytöllä. Lukuisat alhaisen ionivahvuuden menettelyt ovat osallisina, kuten eluointi anioninvaihtohartsista NaCI-; 1 < , puskurilla, laimentaminen ennen sitomista hepariinilla päällystettyyn hart-
Ji _ 25 siin, ja elutointi siitä.
(C) Miletich J.P. et ai. teoksessa Methods in Enzymology 80 (1981) 221-228 : ·, >, kuvaa tekijä IX-tuotteen, joka on peräisin peräkkäisistä bariumsitraattiad- ’.···. sorptio-, ammoniumsulfaattifraktiointi-, ioninvaihto- ja dekstraanisulfaatti- 30 kromatografiavaiheista (ja siitä eluoinnista), jotka sijoittavat keskinkertai- ‘ ; sen puhtauden omaavat tekijä IX-fraktiot pitkiksi ajanjaksoiksi liuoksiin, joissa on alhaiset suolakonsentraatiot. Ei kuvata tekijä IXa-määrityksiä tai :: trombogeenisyyden arviointeja.
114969 18 (D) Bajaj, S.P., et al. Preparative Biochemistry 11(4) (1981) 397-412 kuvaa tekijä IX-valmisteen, joka on peräisin tekniikasta, johon liittyy neljä peräkkäistä puhdistusmenettelyä, joihin liittyy bariumsitraattiadsorption ja elu-oinnin, ammoniumsulfaattifraktioinnin, DEAE-SephadexR-kromatografian ja 5 hepariini/agaroosi-kromatografian käyttö. Raakaa - ja keskinkertaisen puh tauden omaanaa tekijä IX:ää pidetään alhaisen molaarisuuden omaavissa suolaliuoksissa huomattavia ajanjaksoja kunkin erotusmenettelyn aikana ja näiden välillä. Ei kuvata tekijä IXa:n entsymaattista määritystä eikä trom-bogeenisyyden arviointeja.
10 (E) US-patenttijulkaisussa 4786726 kuvataan tekijä IX:n monivaiheinen puhdistus, johon liittyy bariumsuolasaostuksen, anioninvaihtokromatografian, ammoniumsulfaattisaostuksen ja dekstraanisulfaattikromatografian käyttö ennen edelleen puhdistamista immunoaffiniteettikolonnilla. Tekijä IX:ää 15 käsitellään useilla pidennetyillä dialyysiajanjaksoilla tekijä IX:ää suojaamat tomien, alhaisen molaarisuuden omaavia suolaliuoksia vastaan.
(F) Goodall, A.H. et ai. Blood 59(3) (1982) 664-670 menettelyssä, joka edustaa immunoaffiniteettimenetelmiä, kuvaa monoklonaalisten vasta-aineiden käytön protrombiinikompleksikonsentraattilähtöainemateriaalissa läsnä 20 olevan tekijä IX:n puhdistukseen, jolloin konsentraatti on valmistettu stan dardimenetelmillä, kiinnittämättä huomiota tekijä IX:n suojaukseen aktivoi- >; · | tumiselta tai hajoamiselta varhaisissa vaiheissa.
• * » • * · ; Vaikka monoklonaalisten vasta-aineiden kolonnit ovat hyvin spesifisiä tekijä IX:n • > •' · ‘: 25 suhteen ja niitä käytetään tehokkaasti muiden kontaminoivien hyytymistekijöiden • c :' '; poistamiseen, uskotaan, että nykyisin ei ole saatavilla vasta-aineaffiniteettipuhdis- » tusstrategiaa, joka voi sitoa tekijä IX:n ja hylkiä tekijä IXa:ta, (tai kääntäen) (Smith, ·:· KJ. et ai., Thrombosis Research 33 (1984) 211-224). Julkaisussa Tharakan, J. et ai.
Vox. Sana. 58 (1990) 21-29 kuvataan hyvin spesifisen aktiivisuuden omaava immu- ,t],i 30 noaffiniteettipuhdistettu tekijä IX-tuote, joka on siitä huolimatta kontaminoitunut · ,,,,: tekijä IX:n hajoamistuotteilla, jotka ovat peräisin perinteisesti valmistetusta pro-
t I
trombiinikompleksilähtöainemateriaalista.
• * t 1 1 4969 19
Ihmisen hyytymistekijä IX:n ekspressio yhdistelmä-DNA-klooneista on aikaisemmin osoitettu nisäkässoluilla. Anson, D.S. et ai., Nature 315 (1985) 683-685, Jallat, S. et ai., EMBO Journal 9 (10) (1990) 3295-3301. Tällaisen tekijä IX:n puhdistukseen liittyy yleensä solu-uutteen kerääminen ja sitten uutteen altistaminen yhdelle tai 5 usealle edellä mainituista erotusmenettelyistä. Tekijä IX: n suojaaminen puhdistuksen aikana endogeenisiltä soluproteaaseilta voidaan toteuttaa maksimoimalla ajan, jona tekijä IX:ää sisältävät fraktiot pidetään tämän keksinnön mukaisesti kontaktissa yhden tai usean orgaanisen tai epäorgaanisen suolan suhteellisen korkeiden kon-sentraatioiden kanssa, 10
Pitäisi ymmärtää, että tässä kuvatun suhteellisen korkean suolakonsentraation käyttö voi vaikuttaa haitallisesti erityiseen erotusprosessiin tai käsittelyyn, jota käytetään tekijä IX:n puhdistuksessa. Tällaisessa tapauksessa suhteellisen korkean suolakonsentraation käyttöä pitäisi tietysti välttää tuolla erityisellä erotusprosessilla tai käsit-15 telyllä, ymmärtäen, että tällaista korkeaa suolakonsentraatiota voidaan käyttää tehokkaasti muissa puhdistus- tai oheisissa vaiheissa, joihin ei vaikuteta haitallisesti, ja osaksi puhdistetun tekijä IX-liuoksen varastoinnissa. Siten keksinnön erästä näkökantaa voidaan kuvata sen ymmärtämiseksi, että proteaasin aiheuttamaa vauriota tekijä IX:lle, jota voi tapahtua suolojen alhaiset konsentraatiot sisältävissä liuoksissa, 20 voidaan vähentää oleellisesti suunnittelemalla puhdistusmenettelyn uudelleen maksimoimaan aikamäärän, jonka raa'an ja keskinkertaisen puhtauden omaavia tekijä , DC-fraktioita pidetään suhteellisen korkean suolapitoisuuden ympäristössä, jossa , ·, ·, käytetään yhtä tai useaa keksinnön mukaista liukoista suolaa.
| ·, ·, 25 Keksinnön toteutuksessa voidaan käyttää laajaa joukkoa erityyppisiä suoloja. Eräs ' ·; . mahdollinen vaikutusmekanismi on, että tehokkaat suolat toimivat modifioimalla relevanttien proteaasienkatalyysin energiaoppia. Tehokas suola voi toimia destabi--, ·, loiden proteaaseja, stabiloimalla tekijä IX: n rakennetta, muuttamalla tekijä IX: n ra- , * · *, kennetta reversiibelisti niin, että se ei edusta millekään erityiselle proteaasille niitä 30 rakenneominaispiirteitä, joihin normaalisti hyökätään, kohottamalla aktivaatioener-‘ ‘ * giaa, joka on välttämätön sijoittamaan ja/tai katkaisemaan tekijä IX: n proteaasiak- tiivisessa kohdassa, tai millä hyvänsä edellä olevien yhdistelmällä. Koska spesifinen ,,.: luonne kaikilla veriplasma- tai muista proteaaseista, jotka voivat katkaista tekijä ': ‘ : IX: n, on tuntematon, on vaikeaa tunnistaa erityisiä mekanismeja, joilla kukin käyt- 114969 20 tökelpoisista proteolyysi-inhibiittoreista toimii. Oletetaan, että tekijä IX-molekyyli on hyvin kestävä liukoisten epäorgaanisten tai orgaanisten suolojen sen tertiääriselle rakenteelle aiheuttamia merkittäviä palautumattomia muutoksia vastaan.
5 Huomautetaan, että proteiinien erotus- tai käsittelymenettelyjen aikaiseen tai liuoksessa varastoinnin aikana tapahtuvaan denaturoitumiseen (josta on tuloksena katalyyttisen aktiivisuuden menetys tai 3-ulotteisen rakenteen rappeutuminen) on olemassa useita muita syitä. Esimerkkejä prosesseista, joiden tiedetään denaturoivan, rikkovan tai vaikuttavan proteiineihin muuten haitallisesti liuoksessa, ovat mm. leik-10 kääminen, kiinnittäminen astian kuten lasiseinän pinnalle, liuoksen vaahtoaminen, ja kysteiinitähteiden hapetus ilmakehän hapella. Keksinnön toteutuksessa käyttökelpoiset suolaliuokset voivat myös olla tehokkaita näiden muiden tekijä IX:n hajoamisen mahdollisten syiden estämisessä.
15 Keksinnön toteutuksessa voidaan käyttää mitä hyvänsä vesiliukoista epäorgaanista tai vesiliukoista orgaanista suolaa, joka voi vähentää proteaasin aiheuttamaa hyytymistekijä IX: n katkaisua suolakonsentraatiolla, joka ei palautumattomasti muuta tekijä IX:n rakennetta tai aiheuta tekijä IX:n saostumista. Suolat käsittävät positiivisesti varautuneen kationisen komponentin ja negatiivisesti varautuneen anionisen 20 komponentin, jotka dissosioituvat vesiväliaineissa ionimuotoon. Käsite "orgaaninen suola" viittaa suolaan, jossa joko sen kationi- tai anionikomponentti on hiiltä sisältävää ainetta.
: v. Esimerkkejä vesiliukoisista epäorgaanisista ja orgaanisista suoloista käytettäväksi 25 tekijä IX:ää aktivoivien tai hajottavien proteaasien inhibiittoreina ovat: ammonium-, . ·: ·, alkalimetalli- tai maa-alkalimetallihalogenidit; ammonium-, alkalimetalli- tai maa- alkalimetallitiosyanaatit; ammonium- tai alkalimetallifosfaatit tai -sulfaatit; magnesi-: ·, umsulfaatti tai -fosfaatti; maa-alkali- tai alkalimetallisetaatit; alkyyliammoniumhalo- , · ·, genidit, mukaan lukien kvaternääriset ammoniumhalogenidit; ja imidatsolin, lysiinin 30 ja trihydroksiaminometyylimetaanin ("Tris") kloridit.
Edullisia suoloja keksinnön toteutuksessa käytettäväksi ovat natriumkloridi; natrium-ja kaliumtiosyanaatti; magnesium-, kalium-, ja litiumkloridi; ja natriumsulfaatti, jol-’:: loin edullisimpia suoloja ovat natriumkloridi ja natriumsulfaatti.
114969 21
Tehokkaat suolojen konsentraatiot keksinnön toteutuksessa käytettäväksi voivat vaihdella erityisestä käytetystä suolasta riippuen. Konsentraation alemman rajan sanelee se, kuinka paljon suolaa tarvitaan tekijä IX:n hajoamisen ja aktivoitumisen estoon. Ylemmän rajan määrää se määrä, joka voi vaikuttaa tekijä IX:ään haitalli-5 sesti ja/tai jossa suhteellisia hyötyjä ei saada suolan määrää lisättäessä. Kun tekijä IX-molekyylin hajoamiselta tai proteolyysilyä suojaamisen periaate ymmärretään tässä esitetyllä tavalla, optimaalisten suolakonsentraatioiden määrittäminen saadaan helposti tässä kuvatuilla yksinkertaisilla inkubointikokeilla.
10 Pitäisi myös ymmärtää, että on olemassa tekijöitä, jotka vaikuttavat konsentraatioi-den alueeseen, jolla erityinen suola on tehokas. Tällaisia tekijöitä ovat mm. ajan pituus tai lämpötila, jossa suojaavat vaikutukset halutaan, näytteessä läsnä olevien makromolekyylien, mukaan lukien proteaasien konsentraatio, ja käsittelyn, erotus-prosessin ja/tai suojaukseen haluttujen varastointiolosuhteiden luonne. Nämä teki-15 jät, yhdistyneinä erityisen suolan luontaiseen kykyyn muuttaa proteolyysin energe-tiikkaa, pitäisi ottaa huomioon tehokkaiden konsentraatioiden valinnan suhteen.
Uskotaan, että useimpiin sovellutuksiin, erityisestä käytetystä suolasta riippuen, on tyydyttävää käyttää suolakonsentraatiota noin 0,4 - noin 1,4 M.
20 Pitäisi ymmärtää, että voidaan käyttää korkeampaa suolakonsentraatiota. Suolat kuten esimerkiksi magnesium-, kalium- ja litiumkloridi ja natriumsulfaatti ovat tehokkaita määräalueen alemmassa päässä. Nämä suolat ovat erityisen käyttökelpoi-, , siä koska tekijä IX:ää suojaavat vaikutukset voidaan toteuttaa suolakonsentraatioil- la, jotka vähemmän todennäköisesti häiritsevät erotusmenettelyjä kuten niitä, joihin ·*.·, 25 liittyy tekijä IX:n lisääminen ja kiinnittäminen affiniteettikolonniin tai ioninvaihtohart- ’··,·, siin. Sen vuoksi tekijä IX voidaan suojata jatkuvasti koko monivaiheisen puhdistus- menettelyn ajan. On olemassa muita suoloja, joita on käytettävä alueen ylärajalla, esimerkiksi konsentraatio ainakin noin 0,7 M. Edullinen määräalue edellä mainituille » · , ·. edullisille ja edullisimmille suoloille on noin 0,35 - noin 3 M, erityisestä käytetystä 30 suolasta riippuen.
» * * » a ·
Eri suolatyyppien suhteellisesta tehokkuudesta, yhdessä testien sarjassa orgaanisten * I ♦
:: suolojen kuten Tris-, lysiini- ja imidatsolihydrokloridien, ja natriumasetaatin 1 M
’: ”: konsentraatioilla havaittiin olevan alhaisemmat, tekijä IX:ää stabiloivat vaikutukset 114969 22 kuin 1 M NaCI-konsentraatiolla. Tällaiset orgaaniset suolaliuokset ovat kuitenkin suo-jaavia 0,15 M NaCkään verrattuna.
Eräs tämän keksinnön tärkeä näkökanta on, että tekijä IX:n paljon suolaa sisältävä 5 keskinkertaisen puhtauden omaavaa fraktiota, joka on osaksi puhdistettu ioninvaih-tokromatografialla tai muulla erotusprosessilla, mutta jota ei vielä ole altistettu im-munoaffiniteettikromatografialle tai muulle erotusprosessille, voidaan varastoida tehokkaasti pidennettyjä ajanjaksoja, esimerkiksi ainakin noin 12 tuntia 4°C:ssa tai ainakin noin 3 kuukautta pakastettuna varastoitaessa. Tällaisessa varastoinnissa 10 tekijä IX: n hajoaminen tai aktivoituminen estetään käyttämällä tässä kuvattua suhteellisen korkean suolakonsentraation omaavaa tekijä IX:ää. Tämä toimii kliinisesti tärkeänä vaihtoehtona tällaisten fraktioiden varastoinnille toksisten orgaanisten pro-teaasi-inhibiittorien läsnä ollessa, joiden inhibiittorien poistaminen lopputuotteesta voi olla hyvin vaikeaa. On olemassa lukuisia käsittelyetuja, jotka liittyvät siihen, että 15 voidaan varastoida tekijä IX:n keskinkertaisen puhtauden omaavia fraktioita sen puhdistuksen aikana.
Myös korkeimman puhtauden omaavat tekijä IX-tuotteet voivat sisältää pieniä määriä lukuisia proteaaseja, jotka lopulta hajottavat tai aktivoivat tekijä IX:ää, erityisesti 20 jos tuote, jopa alhaisessa lämpötilassa, altistetaan pitkäaikaiselle varastoinnille nes-, temuodossa. Tämän keksinnön mukaisesti ja vaihtoehtona lyofilisoinnille tai pakas tukselle puhdistetun tekijä IX:n tuotteisiin voidaan lisätä suoloja nestemuodossa , . tapahtuvan pitkäaikaisvarastoinnin tekemiseksi mahdolliseksi. Tekijä IX-koostu- i ·, ·. muksen terapeuttisen muodon aikaansaamiseksi suolan konsentraatio koostumuk- i « ; v. 25 sessa pitäisi alentaa kliinisesti hyväksyttävälle tasolle, esimerkiksi noin 0,15 M tai I t ! ·; ’, alle. Tämä voidaan toteuttaa menettelyillä kuten dialyysi, tai diasuodatuksella ennen tuotteen välittämistä kliiniseen laitokseen tai potilaalle.
S t I
» · I » . · * *. Tekijä IX-valmisteiden puhdistetun, terapeuttisen muodon, joka on valmistettavissa 30 keksinnön mukaisesti, ei odoteta laukaisevan ei-toivottuja kliinisiä seurauksia (kuten » · · ’ '; sydäninfarkti, veritulppa ja DIC:tä (disseminated intravascular coagulation)), jotka f M 1 · ’ voivat muuten olla seurauksena nykyisin saatavilla olevien tekijä IX-tuotteiden an- » · » :: nosta. Alla oleva esimerkkikappale antaa käyttöön tietoja, jotka vahvistavat keksin- nön mukaisella menetelmällä valmistetun tekijä IX:n lisääntyneen luotettavuuden.
23 114969
Seuraa kuvaus edullisesta tekijä IX:n kokonaispuhdistuksesta keksinnön toteutuksessa käytettäväksi.
Edullisessa puhdistuksessa käytetään veriplasman kryosaostusta proteiinien kuten 5 tekijä VIII:n poistamiseksi, minkä jälkeen seuraa anioninvaihtokromatografia, jossa hyödynnetään «-vitamiinista riippuvien hyytymistekijöiden spesifistä adsorboitavuut-ta, minkä jälkeen seuraa immunoaffiniteettikromatografia monoklonaalisia vasta-aineita käyttämällä, jolloin viimeksi mainitulla erotusprosessilla on suuri spesifisyys tekijä IXrää kohtaan muihin proteiinilajeihin verrattuna.
10
Edullinen anioninvaihtohartsi tekijä IX:n puhdistamiseksi on hyvin hydrofiilinen hel-mimuotoinen geeli epikloorihydriiniristiliitetystä dekstraanista, johon on kiittynyt dietyyliaminoetyylieetteri(DEAE)-vaihtoryhmiä, kuten DEAE-SephadexR A-50, joka on saatavissa yhtiöstä Pharmacia, Uppsala, Ruotsi. Lämpötila pidetään Sephadex-15 adsorptiotasapainotusprosessin aikana alle 15°C:ssa, ja edullisesti alle 4°C:ssa.
Vaikka tekijä IX sitoutuu DEAE-SephadexR A-50:een nopeammin ja täydellisemmin 20°C:ssa kuin 4°C:ssa, suositellaan, että lämpötila on mahdollisimman alhainen tekijä IX:ään kohdistuvan proteaasiaktiivisuuden minimoimiseksi. Niinpä tekijä IX:n adsorptio 4°C:ssa on edullista. Myös tekijä IXa minimoidaan kontaminoivana aineena 20 lopputuotteessa pitämällä tekijä IX-fraktiot (sellaiseen hetkeen asti, jolloin ne on erotettu jäljellä olevista kontaminoivista proteaaseista monoklonaalisen vasta-aineen kolonnilla) alhaisen lämpötilan ympäristössä (kuten 4°C:ssa tai alle) keksinnön mu-, „ kaisesti saaduissa korkean molaarisuuden omaavissa suolaliuoksissa.
» * * 25 Keksinnön edullisen toteutuksen mukaan tekijä IX:n proteolyysi estetään anionin-, ; ·, vaihtokromatografiaeluaateissa pitämällä proteiinin yhden tai usean sopivan orgaa nisen tai epäorgaanisen suolan läsnä ollessa suhteellisen korkeassa molaarisuudessa ajanhetkeen välittömästi ennen tekijä IX:llä rikastuneiden fraktioiden altistamista t » edelleen erotukselle immunoaffiniteettikromatografiamenettelyllä käyttäen monoklo-, 30 naalisia vasta-aineita, joita käytetään tekijä IX:n erottamiseksi jäljellä olevista hyy- * ; tymistekijöistä ja muista proteiineista.
* i i * » I i · 1 1 4969 24
Arvioitaessa puhtautta tekijä IX-koostumuksilla, jotka voidaan tuottaa keksinnön mukaisesti on määritettävä kaksi parametriä, proteiinikonsentraatio ja spesifinen aktiivisuus.
5 Mittaukset, jotka määrittävät proteiinikonsentraatiot tekijä IX-näytteissä, vaihtelevat täsmällisestä käytetystä menetelmästä riippuen. Tämän keksinnön toteutuksessa proteiinin konsentraatio tekijä IX-näytteissä määritetään 280 nm:llä perustuen puhtaan tekijä IX:n 10 mg/ml liuoksen ekstinktiokertoimeen 13,7 yksikköä 1 cm reitillä. Koijaukset Rayleigh-sirontaa varten tehdään menetelmillä, jotka kuvataan julkaisus-10 sa Bloom, J.W. et ai., Biochemistry 18 (1979) 4419-4425. Katso myös Shapiro, S.S. et ai., Thromb. Diath. Haemorr. 16 (1966) 469.
Tekniikan tasolla on kuvattu useita määritysmenetelmiä tekijä IX-koostumusten spesifisen aktiivisuuden (yksikköä tekijä IX-aktiivisuutta/mg proteiinia). Tällaisissa mää-15 ritysmenetelmissä jätetään usein tekemättä korjaukset tekijä IX-näytteen tekijä IXa:lla kontaminoitumisen vuoksi. Tuloksena on vaikeaa arvioida eri menetelmillä tuotettujen ja/tai eri protokollien mukaan määritettyjen terapeuttisten tekijä IX-valmisteiden puhtautta ja luotettavuutta.
20 Jotkin määrityksistä, joita nykyisin käytetään, ovat mm. kaksivaiheinen hyytymis-määritys (Leibman, H.A. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 82 (1985) 3879-3883); .: määritys, joka perustuu yksivaiheiseen aktivoituun osittaiseen tromboplastiiniaikaan . · '. ("APTT"), Smith, KJ. et ai., Blood 72 (1988) 1269-1277; ja määritykset, jotka ovat : v. APTT-testin modifikaatioita, esimerkiksi, Jenny, R. et ai., Preparative Biochemistry : . . 25 16 (1986) 227-245. Määrityksiä, jotka perustuvat tekijä IX:n antigeeniseen tehoon, . *: ·. on myös ehdotettu puhtauden mitaksi (Smith, K.J. et ai., Thromb. Haemostas. 58 (1987) 349).
:'". Tämän keksinnön tarkoitukseen tekijä IX-koostumusten spesifinen aktiivisuus määri- . ‘ . 30 tetään yksivaiheisella aktivoitu osittainen tromboplastiiniaika "ΑΡΤΤ'-menetelmällä, ’ ! jonka on kuvannut Smith, K.J. et ai. Blood 72 (1988) 1269-1277.
' * · · ’ Tekniikan tason määrityksissä useat tutkijat ovat myös käyttäneet tekijä IX-stan- ‘ * dardina ihmisplasmanäytteitä, joille on määrätty oletettu tehokkuus 1,0 yksikköä/ml.
114969 25
On kuitenkin painotettava, että normaali ihmisen plasma sisältää usein tekijä IX-konsentraation, joka poikkeaa merkittävästi tasosta 1,0 yksikköä/ml. Keksinnön tarkoituksiin viitataan julkaisuun the International Reference Standard of factor IX, WHO #1, jonka on toimittanut Maailman terveysjärjestö.
5
Puhdistetun tekijä IX:n spesifisen aktiivisuuden kirjallisuusarvojen on havaittu olevan alueella 130-220 yksikköä/mg.
Proteiinimäärityksen, määritystekniikan ja kalibrointistandardien menetelmien erot 10 ovat luultavasti vastuussa kuvatuista eroista. Vertaa Smith, KJ. et ai., Blood 72, (1988) 1269-1277 (134-155 yksikköä/mg); Bajaj, P.S. et ai., Preparative Biochemist-ry 11(4) (1981) 397-412 (180-220 yksikköä/mg); Osterud, B. et ai., J. Biol. Chem. 253(17) (1978) 5946-5951 (207 yksikköä/mg); Jenny, R. et ai., Preparative Biochemistry 16 (1986) 227-245 (132 yksikköä/mg).
15
Myös tekijä IXa:n määritykseen eri menetelmiä käyttävien eri laboratorioryhmien tulosten vertailu on hyvin vaikeaa. Tämä on erityisen tärkeää, koska tekijä IX ja tekijä IXa voivat kumpikin häiritä määrityksiä, jotka on suunniteltu toisen suunnitteluun. Eräs lisämyötävaikutus, joka liittyy tämän keksinnön kehitykseen, käsittää hy-20 vin herkän määrityksen aikaan saamisen tekijä IXa:lle perustuen osittaiseen trombo-plastiinitestiin ("PTT"). Tässä kuvattuun määritykseen ei vaikuta tekijä IX:n läsnäolo, : ja kuten alla olevassa esimerkkikappaleessa osoitetaan, se varmistaa tämän keksin- . nön mukaisten tekijä IX:ää stabiloivien prosessien käyttökelpoisuuden.
... 25 Terapeuttisten tekijä IX:ää sisältävien koostumusten, jotka ovat käyttökelpoisia he- ;mofilia B:n hoidossa, ei tarvitse koostua tekijä IX:stä spesifisen aktiivisuuden ehdottomalla rajalla kunhan vain jäljellä olevat kontaminoivat proteiinit eivät aiheuta ha-:' ·'. väittäviä haitallisia kliinisiä vaikutuksia ihmisillä kun tällaisia koostumuksia annetaan ; muuten terapeuttisina annoksina. Kuten alla olevassa esimerkkikappaleessa osoite- . ‘ . 30 taan, voidaan esimerkin 1 puhdistusmenettelyä käyttää tuottamaan tekijä IX:ää ‘ ; terapeuttiseen käyttöön spesifisellä aktiivisuudella ainakin 194 yksikköä/mg proteii nia tekijä IXa-kontaminaatiotasolla alle 0,02 % (paino/paino). Tekijä IX-koostumuk-set, jotka soveltuvat potilaaseen injektoitavaksi, voidaan valmistaa esimerkiksi muo- 26 114969 dostamalla uudelleen farmakologisesti hyväksyttävällä laimennusaineella lyofilisoitua näytettä, joka käsittää puhdistettua tekijä IX:ää ja stabiloivia suoloja.
Tekniikoiden joukossa, joita voidaan käyttää tulokseksi saadun tekijä IX:n puhtau-5 den osoitukseen, ja kontaminoivan tekijä IXa:n tai tekijä IX:n hajoamispeptidien minimointiin keksinnön mukaisella tavalla valmistetuissa terapeuttisissa koostumuksissa, ovat natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE), elektroforeettisesti ajettujen tekijä IX:ää sisältävien näytteiden "Western blotting", ja tekijä IX: n ja tekijä IXa:n suorat entsymaattiset määritykset.
10 Tämän keksinnön toteutuksessa, ja johtuen vaikeuksista in vitro-määritysten korre-loimisessa invivo-trombogeenisten tapahtumien kanssa, puhdistetun tekijä IX: n valmisteiden mahdollinen trombogeenisyys arvioidaan käyttämällä (1) "Wessler Rabbit Stasis"-määritystä, (2) SDS-PAGE:a ja "Western blots"-määritystä likimääräi-15 sen molekyylimassan 54 kDa omaavan/omaavien peptidi(e)n määrän määrittämiseksi, ja (3) APTT-määrityksen uutta modifioitua muotoa tekijä IXa:n tai muiden IXa-tyyppistä aktiivisuutta aiheuttavien peptidien tason määrittämiseksi. Uskotaan, että paras nykyisin käytettävissä oleva terapeuttisten tekijä IX-valmisteiden turvallisuuden ilmaisin aikaansaadaan kun näytteellä on alhainen vaste "rabbit stasis"-20 testissä, sisältää (SDS-PAGE:lla) alle 10 % 54-kDa materiaalia, ja antaa lisäindikaa-tion alhaisen tekijä DQ-sisällön sisältämisen mittana modifoidussa (katso esimerkkiä ,: 3 alla) APTT-testissä.
» r
Esimerkit 25 . : ·. Seuraavat esimerkit kuvaavat keksinnön toteutusta.
: v; Esimerkki 1 Tekijä IX: n puhdistus * » , 30 Tämä esimerkki osoittaa terapeuttisesti käyttökelpoisen tekijä IX:n preparatiivisten ' ; määrien puhdistamiseksi veriplasmasta hyödyntämällä korkeita natriumkloridikon- . sensaatioita erityisissä vaiheissa proteolyyttisen vaurion tekijä IX:lle aiheuttamisen estämiseksi.
114969 27
Kaupallinen pakastetun plasman valmistusmäärä sai sulaa hitaasti noin °C:seen tuottaen supernatantin ja saostuneita fraktioita (katso Pool, J.G. et ai., Nature 203 (1964) 312). Plasman supernatanttifraktio, joka on jäljellä kryosaostuksen jälkeen, sisältää tekijä IX:ää ja paljon tekijöiden II, Vilja X alkuperäisistä konsentraatioista.
5 Supernatanttiplasmafraktioon noin 4°C:ssa lisättiin DEAE-SephadexR A-50-anionin-vaihtohelmiä (noin 1,5 g/l supernatanttia). Tulokseksi saatua suspensiota sekoitettiin varovasti 1 tunnin ajan kylmässä tekijä IX:n sitoutuessa hartsihelmiin. Noin 96 paino-% plasmassa alunperin läsnä olevasta tekijä IX:stä paikallistui hartsihelmiin. Muös muita protrombiinikompleksiproteiineja sitoutui. Hartsihelmet, jotka pi-10 dättivät proteiinia, kerättiin suodattamalla ja pestiin sitten pesupuskuritilavuudella, esijäähdytettynä noin 4°C:seen, joka oli ainakin yhtä suuri kuin kryosakattoman supernatantin tilavuus. Pesupuskuri käsitti liuosta, jossa oli 0,2 M NaCI, 0,01 M Na3-sitraattia, pH 7,0, ja 0,04 yksikköä/ml natriumhepariinia. Pesupuskurin ionivahvuus oli riittämätön tekijä IX: n merkittävän SephadexR-helmistä dissosioitumisen aiheut-15 tamiseksi. Lisättiin eluointipuskuria (vesiliuos, jossa oli 2 M NaCI:ää 10 mM natrium-sitraatin kanssa, pH 7,0, ja esijäähdytetty noin 4 °C:seen) ja sekoitettiin sitten varovasti hartsihelmien kanssa 30 min ajan. Tulokseksi saatu eluaatti kerättiin ja säästettiin tai käsiteltiin edelleen. Hartsihelmien eluointi voidaan toistaa ja yhdistää elu-aatit. Lämpötilakontrolli pidettiin välillä 2 ja 8°C kussakin DEAE-SephadexR-sitomis-20 ja eluointimenettelyn vaiheista.
j Tekijä IX:llä rikastuneen fraktion (protrombiinikompleksi) eluointi DEAE-SephadexR- :hartsista liuoksella, jossa oli 2 M NaCI puskuroituna 10 mM natriumsitraatilla, antaa ' · ’; tulokseksi yhdistetyn eluaattifraktion, jonka lopullinen NaCI-molaarisuus (johtuen 25 huokostilavuuden liuoksen alhaisemmasta ionivahvuudesta) on noin 1,0 M.
Kun yhdistetty eluaatti (keksinnön mukaisesti saatu "stabiili tekijä IX:llä rikastunut fraktio") oli kirkastettu ja steriilisuodatettu, sitä varastoitiin pakastettuna -40°C:ssa ; ’'': tai alle ennen seuraavaa käsittelyä. Varastointi pakastetussa tilassa -40°C:ssa tai alle • ] : 30 ajan 4 viikkoa tai alle ei heikennä tekijä IX:ää sisältävien näytteiden käyttökelpoi- , ’,, J suutta. Tuloksena keksinnön toteutuksessa käyttökelpoisen suolan stabilointivaiku- tuksesta varastointi kaupallisesti toteutettavia ajanjaksoja antaa tulokseksi keskin-’*··’ kertaisen puhtauden omaavia tekijä IX-valmisteita, joilla on alle 10 % tehon mene tys ja vähän tai ei lankaan aktivoitumista tai hajoamista. Näin ei olisi, jos varastointi 28 1 1 4969 suoritettaisiin puskurissa, joka sisältää alhaisemman suolamolaarisuuden, kuten 0,15 M NaCI, edes -40°C:ssa.
Vaihtoehtoisesti stabiilia tekijä IX:llä rikastunutta fraktiota varastoitiin 4°C:ssa jopa 5 12 tuntia ennen edelleen käsittelyä. Tämä menettely on vastakohtana tekniikan ta son menetelmillä, jotka opettavat, että eluaatti pitäisi dialysoida tai diasuodattaa perin pohjin alhaisen suolakonsentraation omaavaa puskuria vastaan ennen edelleen puhdistamista tai kliinistä käyttöä.
10 Välittömästi ennen "stabiilin tekijä IX:llä rikastuneen fraktion" lisäämistä monoklo-naalisen vasta-aineen affiniteettikolonniin se laimennettiin 1:1 vedellä, alentaen valmisteen natriumkloridikonsentraation tasoon 0,5 M. Tekijä IX:ää sisältävä pro-trombiinikompleksiliuos lisätään monoklonaalisen vasta-aineen kolonniin, pestiin perinpohjaisesti ja eluoitiin 3 M natriumtiosyanaatilla. Eluaatin testaus hajonneen 15 tekijä IX:n tai tekijä D<a:n suhteen osoittaa, että niitä on läsnä hyvin alhaiset tasot, sallien fraktioinnin loppuun saattamisen.
Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus ja käyttö stabiilin tekijä IX:llä rikastuneen fraktion immunoaffiniteettikromatografiaa varten noudatta hyvin vakiintuneita 20 menettelyjä. Tekijä IX:n puhdistaminen riittävän puhtaaksi monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusta varten noudatti menetelmää, jonka on kuvannut Osterud, B. et ai., J. Biol. Chem. 253(17) (1978) 5946-5951. Pernoja hiiristä, jotka oli aikaisem-.min injisoitu hyvin puhdistetulla tekijä IX:llä, poistettiin ja soluja niistä fuusioitiin :'. vakiomenettelytavan mukaisesti. Brown, J.P., et ai., J. Biol. Chem. 225 (1980) t * 25 4980-4983. Immunoadsorbanttijärjestelmän valmistuksen ja käytön yksityiskohdat
.': ·. kuvataan julkaisussa "Immunoadsorbent, and Method of Recovering Vitamin-K
Dependent Protein Therewith" julkaisu EPO 84-301162.8, julkaistu 12.09.1984 numerolla 0 118 256.
I »
/ . 30 Tekijä IX eluoitiin monoklonaalisen vasta-aineen kolonnista liuokseen, jossa oli 3 M
» i I
[ ! natriumtiosyanaattia, 50 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 8,0, ja diasuodatettiin sitten liuosta vastaan, joka sisälsi 50 mM NaCI, 5 mM histidiini, pH 7,0. Diasuodatettu teki-'··' jä IX:n liuos altistettiin sitten ultrasuodatukselle YMlOO-membraania (Amicon Co.
Danvers, MA) vastaan, jonka molekyylimassaraja pallomaisille proteiineille oli 114969 29 100 kDa, sallien täten tekijä IX:n kulkea membraanin läpi virusspartikkelien pidättyessä. Tekijä IX:ää sisältävä suodos kerättiin, ja altistettiin sitten suodatuskonsent-roinnille membraania vastaan, joka oli sovelias pidättämään pallomaiset proteiinit, joiden molekyylimassat olivat yli 10 kDa. Sitten puhdistettu tekijä IX:n liuos pakas-5 tettiin ja varastoitiin -70°C:ssa ennen lopullista käsittelyä, soveltaen siten kaupallista tuotantokaaviota. Puhdistettu tekijä IX:n liuos altistettiin lopuksi kromatografialle helmimuotoisella agaroosigeelillä, joka sisälsi positiivisesti varautuneita aminohek-syyliryhmiä (AH SepharoseR 4B, Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). Agaroosigeelikromato-grafia ei toteuta todellista tekijä IX:n puhtauden edelleen lisäämistä muihin hyyty-10 mistekijöihin verrattuna, mutta toimii konsentroiden tekijä IX:ää ja poistaen tekijä IX-vasta-aineen vähäiset tasot, jotka ovat voineet tihkua monoklonaalisen vasta-aineen kolonnista. Voidaan käyttää myös muita kaupallisesti saatavia geelejä.
Kun tekijä IX:n oli annettu sitoutua agaroosigeelihelmiin, geeli pestiin liuoksella,
15 jossa oli 0,15 M NaCI, 10 mM histidiini-HCI, 5 mM lysiini-HCI, pH 7,0. Tekijä IX eluoi-tiin geelistä liuoksella, jossa oli 0,05 M CaCI2, 0,15 M NaCI, 10 mM histidiini-HCI, pH
7,0. Sitten eluaatti diasuodatettiin liuosta vastaan, jossa oli 66 mM NaCI, 10 mM histidiini-HCI, 3% (paino/tilavuus) mannitolia, pH 7,0, kirkastettiin, steriiIisuodatettiin ja varastoitiin -40°C:ssa tai alle. Vaihtoehtoisesti suodatettu liuos voidaan pakaste-20 kuivata. Tulokseksi saatu materiaali on keksinnön mukaisesti saatu "parannettu teki-:. jä IX-lopputuote", ja sen spesifinen aktiivisuus on keskimäärin 180-200 yksikköä aktiivisuutta/mg proteiinia.
Esimerkki 2 Vertailu tekniikan tason tuotteiden kanssa V; 25
Tekniikan tasolla kuvataan, että protrombiinikompleksikonsentraatti, jossa on noin 1-2 M NaCI:ää, pitäisi altistaa pitkähköille käsittelyille kuten dialyysi, jotka vievät mahdollisesti 24 tuntia, tekijä IX:ää sisältävän isolaatin suolakonsentraation alenta-miseksi fysiologiselle alueelle (noin 0,15 M) kliiniseen käyttöön tai ennen lisäpuhdis-. ’ . 30 tusta alhaisen ionivahvuuden olosuhteissa.
; Kirkastetulla, suodatetulla protrombiinikompleksikonsentraatilla, jota pidettiin 1,0 M
* I
' · · * | NaCI-liuoksessa, joka sisälsi myös 10 mM natriumsitraattia, pH 7,0 (esimerkin 1 "stabiili tekijä IX:llä rikastunut fraktio") tehtiin vertailu tekniikan tason tyyppisen 30 114969 DEAE-Sephadex-anioninvaihtokromatografiaeluaatin (protrombiinikompleksikonsent-raatti) kanssa, joka oli vakiokäytännön mukaan, altistettu dialyysille tai diasuodatuk-selle sen suolakonsentraation alentamiseksi fysiologiselle alueelle. Sitten molemmat eluaattifraktioiden tyypit altistettiin edelleen puhdistukselle edellä kuvattuja mono-5 klonaalisia vasta-aineita käyttämällä, jolloin tulokseksi saatiin "parannettu tekijä IX-lopputuote", ja tyypillinen tekniikan tason lopputuote.
Taulukossa 1 esitetään puhtaustulokset esimerkin 1 lopulliselle tekijä IX-tuotteelle ja tyypilliselle tekniikan tason menetelmän lopputuotteelle. Kuten taulukosta voidaan 10 nähdä, yksittäisillä erillä "parannetun tekijä IX-lopputuotteesta", joka on peräisin "stabiilista tekijä IX:llä rikastuneesta fraktiosta", nähdään paljon vähemmän tekijä IXa-kontaminaatiota kuin lopputuotteessa, joka on peräisin DEAE Sephadex-anio-ninvaihtoeluaateista, jotka, johdonmukaisesti tekniikan tason kanssa, altistettiin dia-suodatukselle isotoniseen puskuriliuokseen 3-4 tunnin ajan seuraavalla pakastettuna 15 varastoinnilla ennen immunoaffiniteettikolonniin lisäämistä. Tekijä IX määritettiin "APTT"-menetelmällä, jonka on kuvannut Smith, KJ. et ai., Blood 72 (1988) 1269-1277. Tekijä IXa määritettiin osittaisella tromboplastiinitestillä, "PTT", Varadi, K. et ai., Thromb. Haemos. 35 (1976) 576-585 modifioituna alla olevan esimerkin 3 protokollan mukaan. Vähentyneen tekijä IXa:lla kontaminoitumisen parantuneessa 20 tuotteessa varmistaa edelleen pitemmät hyytymisajat, sekunneissa, tekijä IXa-määri-,tyksessä, kuten taulukossa 1 esitetään.
i « « i I | t * i
• P
» ·
> P
31 114969
Taulukko 1
Tekijä IX-lopputuotteiden vertailumääritystulokset
Tekijä IX Tekijä IX* Hyytymisaika IX,- FIXa/FIX FIX/FIX, 5 yksikköä/ml yksikköä/ml määrityksessä, s Suhde yksi- (l:10-laimennos) kössä %
Tekniikan tason tekijä IX-lopputuote
Erä 1 98,0 0,4875 63,1 0,4974 201 10 Erä 2 100,0 0,4375 62,6 0,4375 229
Erä 3 103,0 0,2350 64,0 0,2282 438
Erä 4 102,0 0,3500 52,5 0,3431 291
Erä 5 115,0 0,2625 68,0 0,2283 438 15
Parannetun menetelmän tekijä IX-lopputuote
Erä 6 78,0 0,0286 146,2 0,0376 2,727
Erä 7 92,0 0,0278 151,1 0,0302 3,309
Erä 8 125,0 0,0247 160,3 0,0198 5,060 20 Erä 9 102,0 0,0088 225,0 0,0086 11,591
Erä 10 110,0 0,0423 134,3 0,0385 2,600 • Anioninvaihtokromatografiaeluaatit ja niistä johdetut lopputuotteet, kun käytetään ,· natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesia (SDS-PAGE) menetel- ,· 25 mällä, jonka on kuvannut Weber, K. et ai., J. Biol. Chem. 244 (1969) 4406-4412, tai : modifioituna tavalla, jonka on kuvannut Laemli, U.K. Nature 227 (1970) 680-685, , : käyttäen akryyliamidikonsentraatiogradienttia 4-12 %, osoittavat (katso kuviota 1), että tekniikan tason tyyppinen anioninvaihtokromatografiaeluaatti (protrombiini-kompleksi) ja tulokseksi saatu lopputuote ovat huomattavasti kontaminoituneet ,,, ·' 30 vyöhykkeellä, jonka näennäinen molekyylimassa on 54 000, ja joka on tunnusomai- ;*·· nen tekijä IXa:lle, (ja määrätyille tekijä IX:n hajoamispeptideille), kun tämä konta- *:. ·; minoiva aine on puolestaan paljon vähemmän näkyvä geeliriveissä, jotka vastaavat keksinnön avulla aikaansaatua stabiilia tekijä IX:llä rikastunutta fraktiota ja siitä joh-'>>i; dettua lopputuotetta. Laattageelin rivit (kuvio 1) on ladattu noin 14 pg:lla proteiinia I · 35 DEAE-konsentraattien tapauksessa ja noin 9 pg:lla niistä johdetuilla lopputuotteilla.
114969 32
Kuvion rivissä 1 nähdään sopivat molekyylimassamerkit. Riveissä 2, 4 ja 6 esitetään yksittäisiä eriä stabiilista tekijä IX:lla rikastuneesta fraktiosta, joka on johdettu esimerkin 1 menetelmän mukaisesta DEAE-SephadexR-kromatografiasta. Rivit 3, 5 ja 7 käsittävät näytteitä niistä johdetuista vastaavista lopputuotteista. Rivi 8 käsittää 5 näytettä DEAE-konsentraatista, joka on valmistettu ei-optimoidulla tekniikan tason menetelmällä, jossa ei käytetä suolan korkeita konsentraatioita tekijä IX:n suojaamiseksi. Rivit 9 ja 10 edustavat niistä johdetun lopullisen tuotteen rinnakkaisnäytteitä.
Lopullisten tekijä IX-tuotteiden ja anioninvaihtokromatografiaeluaattien (molemmat 10 tuotettu parannetulla menetelmällä, ja tekniikan tason mukaisesti) tekijä IXa-konta-minaatiota verrattiin myös käyttämällä hyvin herkkää "Western blot"-tekniikkaa.
Tekijä IXa osoitettiin anti-tekijä IX-vasta-aineen ristireaktiivisuudella. Tässä menettelytavassa testinäytteet altistettiin elektroforeesille 4-12-% akryyliamidigradienttigee-lissä natriumdodekyylisulfaattidetergentin läsnä ollessa. Sitten proteiinit siirrettiin 15 täplinä ja immobilisoitiin nitroselluloosa-arkille. Kuvio visualisoitiin käyttämällä kanin antiseerumia ihmisen tekijä IX:lle ja vuohen anti-kani-IgG:n piparjuuriperoksidaasi-konjugaattia. Väri kehitettiin lopuksi käyttämällä 4-kloori-l-naftolia ja vetyperoksidia. (Katso Pasternack et ai., Nature 322 (1986) 740). Kuviossa 2 osoitetaan, että uusi menetelmä johtaa lopputuotteeseen, jossa on vain jälkiä tekijä IXa:ta myös kun 20 geelit ovat ylipanostettuja, verrattuna tekniikan tason tyypillisen tuloksen kanssa.
. Geelirivit kuviossa 2 vastaavat täsmälleen kuvion 1 geelirivejä ja esittävät "Western .* blot"-analyysiä kuviossa 1 esitetyn SDS-PAGE-geelin kaksoiskappaleesta. Geelirivit on ladattu noin 14 pg:lla näytteillä, jotka käsittävät DEAE-konsentraatteja ja : . . 0,07 pg:lla riveillä, jotka sisältävät lopputuotteita.
:·. . 25 ·; , Esimerkki 3 Parannettu määritys tekijä DC:ta varten tekijä IX-valmisteissa ; *. . Tämän keksinnön työn yhteydessä kehitettiin parantunut hyytymismääritys tekijä ", IXa:ta varten, tai hajonneita 54-kDa tekijä IX:stä peräisin olevia peptidejä tai muita , * , 30 proteiineja varten, joilla on tekijä IXa-tyyppistä aktiivisuutta, ja standardisoitiin an- I ( » ’ ; tamaan veren puhdistukseen liittyvälle alalle parannetun analyyttisen menetelmän.
<» » I » , ’ Periaate uudella hyytymismäärityksellä, joka on hyvin herkkä, perustuu osittaiseen :: tromboplastiinitestiin ("PTT") ja osoittaa edelleen tekijä IXa-aktiivisuuden puuttumi- ';: sen tekijä IX:ssä, joka on puhdistettu tämän keksinnön mukaisesti. Määritys on 114969 33 käyttökelpoinen tekijä IX-valmisteiden in vivo-tromboqeenisvvttä arvioitaessa, erityisesti käytettäessä esimerkin 7 in vivo-määritysten yhteydessä.
Tekijä IXa:n tai tekijä IXa-tyyppistä aktiivisuutta tuottavien peptidien tehokkuus las-5 ketään suoraan perustuen hyytymisaikaan 1-vaiheisessa määrityksessä. Määrityksessä käytetty fosfolipidireagenssi oli peräisin naudan aivoista ja sitä käytettiin ilman aktivaationa. ThrombofaxR, Ortho Diagnostic Systems'* Raritan, NJ. Tyypillistä ΡΤΓ-menetelmää modifioitiin lisäämällä BaS04-adsorboitua naudan plasmaa tekijä IX-vajavaiseen ihmisplasmaan määritysprotokollassa, lisäten siten labiilien tekijöiden V 10 ja VIII toimitusta.
Tätä menetelmää käytetään aktivoidun tekijä IXa:n mittaukseen tekijä IX-lopputuot-teissa, samoin kuin prosessissa olevien näytteiden seuraamiseen. Tulokset naulates-tistä tekijä IX-näytteillä osoittivat hyvän lineaarisuuden ja toistettavuuden tekijä IXa-15 määritykselle alueella 0,0005-0,05 IXa-yksikköä/ml. Sen vuoksi voidaan mitata hyvin pieniä tekijä IXa:n määriä tekijä IX-valmisteissa.
Tutkitiin myös puhdistetun tekijä IX:n vaikutusta tekijä IXa-määritykseen vertaamalla tekijä IXa:ta, joka oli naulattu tekijä IX-laimennoksilla, ja tekijä IX:ää, joka oli 20 naulattu tekijä IXa-laimennoksilla. Tekijä IX ei häiritse tekijä IXa-määritystä. Määritys on helposti sovitettavissa muiden tekijä IX-valmistusmenetelmien tarkkailuun. Taulukossa esitetyt IXa-konsentraatiotiedot laskettiin tämän menetelmän mukaisesti.
; ·, Esimerkin 1 menetelmän mukaisesti valmistetussa lopullisessa monoklonaalisella , \ 25 vasta-aineella puhdistetussa tekijä IX-tuotteessa havaittiin vain äärimmäisen alhai- , : \ set tekijä IXa-tasot. Keksinnön esimerkit 4-8 osoittavat edelleen tekijä IX:n puhtau det ja stabiilisuudet, jotka voidaan saavuttaa tämän keksinnön mukaisia erilaisia : *. ·. suolaympäristöjen tyyppejä käyttämällä.
.· , 30 Esimerkki 4 Tekijä IX:n stabiloiminen eri NaCI-konsentraatioilla • »*
• I
♦ Tämä esimerkki osoittaa eri natriumkloridikonsentraatioiden vaikutukset tekijä X:n :: stabiilisuuteen keskinkertaisen puhtauden omaavissa valmisteissa (DEAE SephadexR- • : eluaattifraktiot) 5-päiväisen 4°C:ssa varastoinnin aikana.
114969 34
Protrombiinikompleksi (sisältäen tekijä IX:ää, merkittävät määrät tekijöitä II, VII, X ja lukuisia muita kontaminoivia proteiineja) eluoidaan DEAE-SephadexR-hartsista käyttäen 2 M NaCI:ää esimerkin 1 menetelmän mukaisesti. Sekä ensimmäinen että 5 toinen eluaatti hartsista kerätään ja varastoidaan erikseen 4°C:ssa. Eluoidut fraktiot saavuttavat erilaiset lopulliset NaCI-molaarisuudet (0,96-1,4 M) koska huokostila-vuudessa läsnä ollut puskuri on syrjäytettävä.
Eluaattien näytteet, jotka muodostettiin tätä esimerkkiä varten, ovat: 10
(A) 1. kolonnieluutiosta tasolla 0,956 M NaCI
(B) materiaalin (A) näyte laimennettuna tasolle 0,524 M NaCI
(C) materiaalin (A) näyte ultrasuodatus ja diasuodatukselle altistettuna kuten tyypillisessä tekniikan tason menetelmässä, alentaen NaCI-konsentraation tasolle 15 0,056 M.
(D) osa näytteestä (C) is suodatusmenettelyn loppuun saattamisen jälkeen saatettu takaisin tasolle 0,481 M NaCI analyysiä varten 5 päivän aikana.
(E) toisesta kolonnieluoinnista tasolla 1,4 M NaCI.
(F) materiaalin (E) näyte laimennettuna tasolle 0,532 M NaCI.
20 .:. Valmistuksen jälkeen näitä näytteitä varastoitiin 4°C:ssa ja tutkittiin sitten ajankoh- * · » ,..: dilla 0,1, 2 ja 5 päivää tekijä IX:n ja tekijä IXa:n suhteen. Tekijä IX määritettiin 1- .'. ·. vaiheisella aktivoitu osittainen tromboplastiiniaika"APTT"-menettelyilä menetelmän • » : ·. 1. mukaan, jonka on kuvannut Smith, KJ. et ai. Blood 72 (1988) 1269-1277, ja tekijä 25 IXa-tasot määritettiin esimerkissä 3 esitettyä uutta tekijä IXa-määritystä käyttäen.
. ·: ·. Taulukossa 2 osoitetaan, että NaCI konsentraatiossa 1,4 M tai yli antaa tulokseksi tekijä IX:n maksimaalisen suojan proteaasiaktiivisuutta vastaan ja minimoi tekijä : 1. ·. IXa:n muodostuksen ilmaistuissa olosuhteissa.
» 1 »♦
* I
* 1 ·
Taulukko 2 35 114969
Natriumkloridikonsentraation vaikutus DEAE-Sephadex-anioninvaihtokromatografia- eluaattivalmisteiden stabiilisuuteen 4°C:ssa 5
Lopullinen _0 päivää_ _1 päivä
NaCI- F.IX (%) F.IXa (%) F.IX (%) F.IXa (%)
Molaarisuus U/ml U/ml U/ml U/ml Näyte A 0,956 16,5 (100) 0,0500 17,0 0,0500 10 (100) (103) (100) Näyte B 0,524 9,1 (100) 8,2(90) 0,0385 Näyte C 0,056 14,0 (100) 0,0125 9,5 (68) 0,0260 (100) (208) Näyte D 0,481 11,0 (100) 8,6 (78) 0,0339 15 Näyte E 1,40 4,1 (100) 0,0143 4,4(107) 0,0159 (100) (100) Näyte F 0,532 1,35 (100) 1,2 (89) 0,0079 _2 päivää_ _5 päivää 20 F.IX (%) F.IXa (%) F.IX (%) F.IXa (%) U/ml U/ml U/ml U/ml Näyte A 0,956 16,5(100) 0,0408 19,8 0,0909 (82) (118) (223) Näyte B 0,524 6,2(68) 0,0400 3,9(43) 0,0667 .·. 25 Näyte C 0,056 6,5(46) 0,0297 2,5(19) 0,3226 (238) (2581) Näyte D 0,481 6,2 (56) 0,0238 2,7 (25) 0,0385 Näyte E 1,40 3,8(86) 0,0100 5,0(131) 0,0294 (70) (294) 30 Näyte F 0,532 0,88(65) 0,0044 0,32(24) 0,0093 • * * » * , Taulukosta 2 voidaan nähdä, että tämän keksinnön käytöllä on perusteellinen vaiku- , ' · · tus tekijä IX:n stabiilisuuteen protrombiinikompleksifraktioissa. Tulokset 0 ja 5 päi- • vän ajanhetkille varmistettiin myös esimerkin 2 "Western blot"-määritysjärjestel- 36 114969 mässä käyttäen monoklonaalista anti-tekijä IX-vasta-ainetta, joka reagoi myös tekijän IXa ja muiden 54-kDa tekijä IX:sta johdettujen peptidien kanssa.
Esimerkki 5 Suolakonsentraation vaikutus tekijä IX:n stabiilisuuteen kahdessa eri 5 lämpötilassa Tässä esimerkissä kuvataan, että tämän keksinnön mukainen suhteellisen korkean suolakonsentraation käyttö on tehokas laajalla lämpötila-alueella.
10 Näyte DEAE SephadexR-eluaatista, joka tuotettiin edellä olevan esimerkin 1 menettelytavalla, ja joka on kirkastettu ja steriilisuodatettu ja sisälsi 1 M NaCI ja 10 mM natriumsitraattia, pH 7,0, sulatettiin -80°C:ssa varastoinnin jälkeen. Näytteen erillisiä 5 ml eriä dialysoitiin yön yli joko 3°C:ssa tai 25°C:ssa, 1,0, 0,75, 0,5 tai 0,15 M nat-riumkloridiliuoksia vastaan ja analysoitiin sitten "Western blots"-analyysillä ja tekijä 15 IX- ja IXa-aktiivisuusmäärityksissä. Dialyysisuolan alhaisilla konsentraatioilla tekijä IX-aktivaatio on oleellisen tasainen 3°C:ssa. Esimerkiksi pidettäessä 3°C:ssa ja tasolla 0,15 M NaCI, noin kaksi kolmasosaa alkuperäisestä tekijä IX:stä on hajonnut 12 tunnin kuluttua. Tekijä IXa-tasojen havaittiin myös alenevan näytteissä, joita dialysoitiin alhaisella suolakonsentraatiolla, 3 tai 25°C:ssa, antaen lisätodisteita protrom-20 biinikonsentraattien proteolyysin mahdollisesta laajuudesta.
Kuviossa 3 esitetään "Western blot"-analyysin tulokset 25°C:ssa. Tulokset 3°C:ssa olivat hyvin samanlaiset. Analyysin vastaavat rivit ovat (1) molekyylimassamerkit; (2) kontrolli, joka koostuu DEAE-SephadexR-hartsista olevasta pakastetusta DEAE ' f. 25 konsentraattieluaatista, jota on pidetty keksinnön toteutuksen mukaisesti korkeassa suolapitoisuudessa; (3) sulatettu DEAE-konsentraattinäyte (tuotettu esimerkin 1 menettelytavalla ja sisältää myös noin 1 M NaCI) lisättynä suoraan kanta-akryyli-: amidigeeliin ilman yön yli dialyysiä; (4) näyte DEAE-konsentraatista, joka on valmis- ’ : tettu esimerkin 1 menetelmällä ja dialysoitu yön yli 1,0 M NaCkää vastaan; (5) näy- / . 30 te kuten kohdassa (4) edellä, mutta dialysoitu 0,75 M NaCI:ää vastaan; (6) näyte [ kuten kohdassa (4) edellä, mutta dialysoitu 0,5 M NaCI:ää vastaan; ja (7) näyte kuten kohdassa (4) edellä, mutta dialysoitu 0,15 M NaCI:ää vastaan.
• > 37 114969
Esimerkki 6 Eri suolojen käyttö Tämä esimerkki osoittaa, että erilaisilla liukoisilla suoloilla on tekijä IX:ää suojaavia vaikutuksia.
5 Näyte DEAE SephadexR-eluaatista, joka on tuotettu esimerkin 1 menetelmällä ja sisältää 1 M NaCI ja 10 mM natriumsitraattia, pH 7,0, kirkastettiin ja steriilisuodatet-tiin ennen -80°C:ssa varastointia. Erillisiä 5 ml eriä sulatetusta liuoksesta dialysoitiin yön yli 3°C:ssa natriumasetaatin, litiumkloridin, magnesiumkloridin, kaliumkloridin, 10 natriumkloridin tai natriumsulfaatin 1 M liuoksia vastaan. Dialysoiiduista liuoksista määritettiin tekijä IX, tekijä IXa, ja analysoitiin myös ei-aktivoidussa osittaisessa tromboplastiiniaika"NAPTr-testissä (Kingdon, H.S. et ai., Thromb. Diath. Haemorrh.
33 (1975) 617-631). Tulokset esitetään yhteenvetona taulukossa 3 ja varmistettiin "Western blots"-analyysillä. Voidaan nähdä, että LiCI, KCI, NaCI, MgCI2 ja Na2S04 15 ovat voimakkaasti tekijä IX:ää suojaavia konsentraatiolla 1,0 M. Huomautetaan, että tällaiset vaikutukset voidaan osoittaa sekä määrätyillä voimakkaasti ulossuolaavilla suoloilla (Na tai KSCN) ja määrätyillä kohtuullisesti ulossuolaavilla suoloilla (KCI ja Na2S04).
20 Natriumasetaattidialysaatilla nähtiin huomattavasti enemmän tekijä IXa-tuotantoa kuin muiden liukoisten suolojen liuoksilla, vaikka siinä nähtiin vähemmän tekijä IX:n .: aktivoitumista ja hajoamista kuin voitaisiin odottaa käytettäessä dialyysiliuosta, jos- sa on 0,15 M NaCI.
♦
* I
114969 38
Taulukko 3
Tekijä IX:n alhaisen lämpötilan stabiilisuus erilaisten suolojen 1 M konsentraatioissa
5 NAFTT
F.IX F.IXa Näyte no. 1M Suola U/ml U/ml Laimennos % 1 Na-asetaatti 25,5 0,130 1:10 45 10 1:100 82 2 LiCI 20,5 0,0294 1:10 62 1:100 91 3 KCI 20,5 0,0200 1:10 90 1:100 94 15 4 MgCI2 19,0 0,0016 1:10 Ei hyytynyt 1:100 106 5 Na2S04 20,5 0,0192 1:10 100 1:100 108 6 NaCI 21,0 0,0247 1:10 90 20 1:100 99
Kontrolli NaCI 21,0 0,0333 1:7 77 (sulatettu DEAE Sepha- 1:100 91 dex-eluaatti, ilman dialyysiä, yön yli : 25 varastoinnin jälkeen.) I ·
Esimerkki 7 Tekijä IX:n puhtaus varmistettuna "Wessler Rabbit Stasis"-määritvksellä.
’ * 30 Tässä esimerkissä osoitetaan että tekijä IX, joka on puhdistettu esimerkin 1 mene-/ . telmällä, ei aiheuta ei-toivottua hyytymistä mitattuna in vivo "Wessler Rabbit Sta- ’ t ! sis"-määrityksellä trombogeenisyyttä varten.
> I
'···' Tekijä IX-valmisteet, jotka koostuvat tekniikan tason DEAE SephadexR-eluaateista 35 (diasuodatettu fysiologisesti isotonista puskuria vastaan) ja tekijä IX-lopputuotteista, 39 114969 jotka on tuotettu tämän keksinnön käytännön mukaisesti (käyttäen anioninvaihto-kromatografiaa ja pidettiin korkeassa natriumkloridikonsentraatio ennen seuraavaa immunoaffiniteettikromatografiaa) injisoitiin in vivo eristettyihin, sidottuihin kanin kaulalaskimoiden jaokkeisiin menetelmällä, jonka on kuvannut Wessler et ai., 1 5 Appi. Phvsiol. 14 (1959) 943-946 vahvistamaan pysähtyneiden veritulppien muodostuminen.
Pisteytys suoritettiin Wessler, et al.:in järjestelmän mukaan, hyytymän koon mukaan, jolloin +4-hyytymä edustaa suurimmankokoista hyytymää, joka voidaan nor-10 maalisti muodostaa trombogeenisillä materiaaleilla valitun kokoisessa ja tyyppisessä suonessa, ja +1 on pienin tällainen hyytymä, joka voidaan havaita silmin. Tekniikan tason ja keksinnön avulla saatujen koostumusten arvioiden tulokset osoittavat, että vastakohtana tekniikan tason koostumusten käytölle keksinnön avulla saaduilla koostumuksilla ei nähdä haitallisia vaikutuksia in vivo tekijä IX:n konsentraatioilla/kg 15 painoa, jotka ovat huomattavasti korkeammat kuin hemofilia B-ihmispotilaalle annettaisiin. Ehdotetaan, että tämän määrityksen käyttö SDS-PAGE-geelien analyysin yhteydessä 54-kDa peptidejä varten, ja myös tekijä IXa-määritys (esimerkki 3) on paras käytettävissä oleva menetelmä terapeuttisten tekijä IX-valmisteiden in vivo käyttökelpoisuuden ja luotettavuuden ennustamiseksi.
20 « » * · * 1 • ♦
Taulukko 4 1 1 4969 40 "Wessler Rabbit Stasis"-määritys prosessioptimoinnin trombogeenisyysvaikutuksesta tekijä IX:n trombogeeniseen potentiaaliin 5
Tekniikan tason menetelmä tekijä IX:lle Erä numero _Kani pisteet_ 10 Teho 100 U/ka 200 U/ka 400 U/ka (u/vl) 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 1060 +2 +3 +2 +2 +2 +2 +3 +4 +4 2 500 +1 +1 +2 +3 +2 +2 +3 +2 +2 3 230 +1 +1 +2 +1 +1 +1 +2 +1 +1 15 4 255 0 0 0 +2 +3 +3 +2 +3 +3 5 1000 0 0 0 +1 +2 +1 +2 +1 +2 6 525 0 0 0 ± 0 ± +1 0 ±
Optimoitu menetelmä monoklonaaliselle tekijä IX:Ile 20
Erä ,: numero _Kani pisteet_
Teho 100 U/kq 400 U/ka (u/vl) 12 3 12 3 I· ;. 25 7 590 0 0 0 0 0 0 8 465 0 0 0 0 0 0 * · 9 540 0 0 0 0 +1 0 10 490 0 0 0 0 0 +1 ’ 11 520 0 0 0 0 0 0 ·. 30 114969 41
Esimerkki 8 Määrättyjen suolojen kohtuulliset konsentraatiot ovat tehokkaita tekijä IX:n suojaamiseen Tämä esimerkki osoittaa, että määrätyt liukoiset suolat ovat tehokkaita tekijä IX:n 5 suojauksessa käytettäessä alhaisemmilla konsentraatioilla kuin yleensä tarvitaan natriumkloridille. Koska protrombiinikompleksikonsentraatin käyttö voi johtaa vaarallisiin kliinisiin vaikutuksiin, hiljattain kehitetyt puhdistusstrategiat sisällyttävät niiden protokolliin lisävaiheita tekijä IX:n edelleen puhdistamiseksi. Kaikkia näitä erotustekniikkoja (esimerkiksi määrättyjä kolonnitekniikkoja) ei voida saada toimimaan kor-10 keamolaarisen suolan olosuhteissa. Esimerkiksi tekijä IX ei voi tarttua erityiseen monoklonaalisen vasta-aineen affiniteettikolonniin jos suolakonsentraatio on paljon yli 0,5 M. Sen vuoksi olisi toivottavaa tunnistaa liukoisia suoloja, joilla on tekijä IX:ää suojaavia vaikutuksia ollessaan läsnä kohtuullisilla molaarisuuksilla kuten välillä noin 0,4 ja noin 0,7 M, tai alle.
15
Niinpä erillisiä 5-ml eriä DEAE-konsentraattinäytteestä, "stabiili tekijä IX:llä rikastunut fraktio", joka tuotettiin esimerkin 1 protokollalla (sisältäen myös 1,0 M NaCkää puskuroituna pH-arvossa 7,0 10 mM natriumsitraatin kanssa) ja jota oli varastoitu pakkasessa -80°C:ssa, dialysoitiin yön yli 4°C:ssa NaCI:n, KCI:n, LiCI:n, Na2S04:n tai 20 MgCI2:n 0,5 M liuoksia vastaan. Kontrollina käytettiin sitraattipuskuroitua 1,0 M :· NaCI-dialysaattia. Sitten suoritettiin tekijä IX- ja tekijä IXa-määritykset, ja näytteet *· seulottiin (kuvio 4) "Western blot"-järjestelmässä.
* · : ‘ ‘: Kuten kuvion 4 "blot"-analyysistä helposti käy ilmi, puskuroiduilla liuoksilla, joissa on ;' 25 0,5 M magnesiumkloridia (rivi 3), natriumsulfaattia (rivi 4), litiumkloridia (rivi 5) ja kaliumkloridia (rivi 6), on kaikilla tekijä IX:ää stabiloiva kyky, joka on suunnilleen yhtä suuri kuin 1,0 M NaCkllä (rivi 8) ja huomattavasti parempi kuin 0,5 M NaCkllä (rivi 7). Kuvion 4 rivillä 9 esitetään sopivat molekyylimassamerkit. Rivillä 1 näkyy DEAE-konsentraatin kontrolli, joka on tehty tekniikan tason tyypillisellä menetelmällä ’ : 30 ja dialysoitu isotonista puskuria vastaan ennen pakastusta, antaen tulokseksi suuren . * sisällön 54-kDa hajonnutta peptidiä; ja rivillä 2 esitetään näyte pakastetusta DEAE- konsentraatista, joka on tuotettu eluaatiksi DEAE-SephadexR-hartsista, jota pidetään ‘ keksinnön toteutuksen mukaisesti korkeassa suolakonsentraatiossa.
Claims (20)
1. Menetelmä tekijä IX:n stabiloimiseksi liuoksessa tekijä IXa:ksi aktivoitumista tai muuttuneen pituuden ja/tai konformaation omaaviksi peptideiksi hajoamista vastaan, 5 johon menetelmään kuuluu vaiheet: (A) lisätään yhtä tai useaa liukoista orgaanista tai epäorgaanista suolaa tekijä IX:ää sisältävään liuokseen konsentraatioon, joka on riittävä estämään tai oleellisesti minimoimaan tekijä IX:n aktivoitumisen tai hajoamisen, mutta konsentraatiossa, joka on riittämätön aiheuttamaan tekijä IX-molekyylin saostumista, irreversiibeleitä muutoksia 10 tai denaturoitumista; ja (B) pidetään suola(t) liuoksessa mainitussa konsentraatiossa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, missä tekijä IX on peräisin yhdistelmä-teknologiasta, jossa käytetään bakteeri-, hiiva- tai muita soluja. 15
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä käytettäväksi tekijä IX:n stabiloimises-sa ihmisen veriplasmasta tai muusta lähteestä peräisin olevan tekijä IX:n puhdistamiseen tai säilömiseen tarkoitetun prosessin aikana.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu suola on yhtä tai useaa seuraavista: ammonium-, alkalimetalli- tai maa-alkalimetallihalo-• genidit; ammonium-, alkalimetalli- tai maa-alkalimetallitiosyanaatit; ammonium- tai : a I ka I im eta 11 ifosfaatit tai -sulfaatit; magnesiumsulfaatti; alkali- tai maa-alkalimetallien :‘ asetaatit; alkyyliammoniumhalogenidit; ja/tai imidatsolin ja lysiinin suolat. ; ·*: 25
; : 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suola on yhtä tai useaa seuraavista: kaliumkloridi, litiumkloridi, magnesiumkloridi, natriumtiosya-; ’ ; naatti, kaliumtiosyanaatti ja/tai natriumsulfaatti. i. ‘ . 30
6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suola on nat- ! riumkloridi. I I « M
’ · · · * 7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suolaa/suoloja on läsnä konsentraatiossa noin 0,4 - noin 1,4 M. 114969 43
8. Menetelmä tekijä IX:n puhdistamiseksi liuoksessa, johon puhdistukseen kuuluu kaksi tai useampia peräkkäisiä erotusprosesseja, johon menetelmään kuuluu vaiheet: (A) lisätään erityisen erotusprosessin aikana tai sen jälkeen, yhtä tai useaa liukoista 5 orgaanista tai epäorgaanista suolaa tekijä IX:ää sisältävään liuokseen suolakonsent-raatioon, joka on riittävä estämään tai oleellisesti minimoimaan proteaasien katalyyttisen vaikutuksen tekijä IX:ään, mutta mainitun suolan tai suolojen kokonaiskon-sentraatiossa, joka on riittämätön aiheuttamaan tekijä-IX-molekyylin saostumista, irreversiibeleitä muutoksia, tai denaturoitumista; ja 10 (B) pidetään osaksi puhdistettu proteiini kontaktissa mainitun suolaliuoksen kanssa mainitussa riittävässä suolakonsentraatiossa ajanjakson ainakin kunnes seuraava erotusprosessi aloitetaan.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksi tai usea 15 kahdesta tai useammasta peräkkäisestä erotusprosessista on kryosaostus, ionin- vaihtokromatografia, adsorptio hepariinilla, saostus bariumsuolalla, ammoniumsul-fa attifra kti oi nti ja/tai vasta-aineaffiniteettikromatografia.
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu 20 liuos sisältää K-vitamiinista riippuvia hyytymistekijöitä, ja jossa yhteen tai useaan kahdesta tai useammasta peräkkäisestä erotusprosessista liittyy mainitun liuoksen • saattaminen kontaktiin anioninvaihtohartsin kanssa, jolle mainitut K-vitamiinista : riippuvat hyytymistekijät, mukaan lukien tekijä IX, adsorboituvat. : : 25
11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhteen tai : useaan kahdesta tai useammasta peräkkäisestä erotusprosessista liittyy mainitun tekijä IX-liuoksen saattaminen kontaktiin tekijä IX-spesifisen vasta-aineen kanssa ; mainitun erotuksen saavuttamiseksi.
12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tekijä IX- ! liuos, joka sisältää mainitun suolan/suolat, altistetaan käsittelylle aikavälillä ensim mäisen ja seuraavan erotusprosessin välillä. 114969 44
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuun käsittelyyn liittyy yksi tai usea käsittely, joka on dialyysi, ultrasuodatus, suodatus-konsentrointi, diasuodatus, saostus, uudelleensuspendointi, steriilisuodatus, suoda-tinsentrifugointi, elektrodialyysi, menetelmät, jotka voivat alentaa suolakonsentraa- 5 tiota, ja/tai tekijä IX:ää sisältävän liuoksen kuumakäsittely kontaminoivien mikro-organismien tai virusten inaktivoimiseksi.
14. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tekijä IX-liuosta, joka on altistettu erotusprosessille ja johon on lisätty yhtä tai useaa liukoista 10 orgaanista tai epäorgaanista suolaa, varastoidaan ennen mainitun liuoksen altistamista lisäerotusprosessille.
15. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu suola on yhtä tai useaa seuraavista: ammonium-, alkalimetalli- tai maa-alkalimetallihalo- 15 genidit; ammonium-, alkalimetalli- tai maa-alkalimetallitiosyanaatit; ammonium- tai alkalimetallifosfaatit tai -sulfaatit; magnesiumsulfaatti; alkali-tai maa-alkalimetallien asetaatit; alkyyliammoniumhalogenidit; ja/tai imidatsolin ja lysiinin suolat.
16. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suola on yhtä 20 tai useaa seuraavista: kaliumkloridi, litiumkloridi, magnesiumkloridi, natriumtiosya- • naatti, kaliumtiosyanaatti ja/tai natriumsulfaatti.
: 17. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suola on nat- : riumkloridi. ; 25
18. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suolaa/suo-loja on läsnä konsentraatiossa noin 0,4 - noin 1,4 M.
: 19. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksi tai usea : 30 peräkkäisistä erotusprosesseista on anioninvaihtokromatografia, adsorptio alumiini- ,, l hydroksidigeelillä tai bariumkloridisaostus.
‘ 20. Menetelmä hemofilia B:n hoidossa käyttökelpoisen terapeuttisen koostumuksen valmistamiseksi, jolla koostumuksella on spesifinen aktiivisuus yli noin 50 yksikköä 1 1 4969 45 tekijä IX-aktiivisuutta/mg proteiinia, ja jota voidaan varastoida liuosmuodossa ajanjakso noin 2 viikkoa varastointilämpötilassa jopa 15-30°C pysyen samalla vapaana tekijä IXa:sta, tekijä IX:n denaturoiduista muodoista ja/tai muiden hyytymistekijöiden aktiivisista muodoista konsentraatioissa, joilla olisi taipumus aiheuttaa havaitta-5 via haitallisia kliinisiä vaikutuksia ihmisessä kun mainittua koostumusta annetaan terapeuttinen annos, tunnettu siitä, että menetelmässä: (A) saatetaan kryosakatonta veriplasmaa kontaktiin anioninvaihtohartsin kanssa, johon tekijä IX ja muut tekijät adsorboituvat; 10 (B) eluoidaan tekijä IX anioninvaihtohartsista saattamalla hartsin kontaktiin suolaliuoksen kanssa, jolla on ainakin riittävä molaarisuus tekijä IX:n eluoimiseksi ja tekijä IX:ää sisältävän eluaatin aikaansaamiseksi; 15 (C) pidetään tekijä IX:ää sisältävässä eluaatissa yhtä tai useaa liukoista orgaanista tai epäorgaanista suolaa konsentraatiossa, joka on riittävä estämään tai oleellisesti minimoimaan proteaasien katalyyttisen vaikutuksen tekijä IX:ään, mutta riittämätön aiheuttamaan tekijä IX:n irreversiibeleitä muutoksia, saostumista tai denaturoitumista; 20 (D) altistetaan tekijä IX:ää sisältävä eluaatti kromatografialle immunoaffiniteettiko- ; ·; (onnilla tekijä IX:n sitomiseksi siihen; ja * * i ‘ : (E) poistetaan tekijä IX immunoaffiniteettikolonnista puhdistettua tekijä IX:ää sisäl- 25 tävän liuoksen aikaansaamiseksi. i > « 114969
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66292791A | 1991-03-01 | 1991-03-01 | |
| US66292791 | 1991-03-01 | ||
| PCT/US1992/001600 WO1992015324A1 (en) | 1991-03-01 | 1992-02-26 | Preparation of factor ix |
| US9201600 | 1992-02-26 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI933814A0 FI933814A0 (fi) | 1993-09-01 |
| FI933814A FI933814A (fi) | 1993-09-01 |
| FI114969B true FI114969B (fi) | 2005-02-15 |
Family
ID=24659784
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI933814A FI114969B (fi) | 1991-03-01 | 1993-09-01 | Tekijä IX:n valmistus |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6063909A (fi) |
| EP (1) | EP0573605B1 (fi) |
| JP (1) | JP3418621B2 (fi) |
| AT (1) | ATE195877T1 (fi) |
| AU (1) | AU671586B2 (fi) |
| BR (1) | BR9205700A (fi) |
| CA (1) | CA2105282C (fi) |
| DE (1) | DE69231401T2 (fi) |
| DK (1) | DK0573605T3 (fi) |
| ES (1) | ES2150914T3 (fi) |
| FI (1) | FI114969B (fi) |
| GR (1) | GR3034946T3 (fi) |
| MX (1) | MX9200882A (fi) |
| NO (1) | NO315856B1 (fi) |
| RU (1) | RU2142806C1 (fi) |
| SG (1) | SG48282A1 (fi) |
| WO (1) | WO1992015324A1 (fi) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0573605B1 (en) * | 1991-03-01 | 2000-08-30 | Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. | Preparation of factor ix |
| CA2143125C (en) * | 1992-08-27 | 2008-09-23 | Koenraad Mertens | Antibodies specific for a haemostatic protein, their use for isolating intact protein, haemostatic compositions devoid of proteolytic cleavage products of the protein |
| DE19506633A1 (de) * | 1995-02-25 | 1996-08-29 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung von Faktor IX aus biologischen Quellen |
| PT937158E (pt) * | 1996-10-31 | 2001-06-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Processo para a determinacao da actividade catalitica de factor ixa |
| AU2002226028A1 (en) * | 2000-11-14 | 2002-05-27 | Board Of Regents, Unversity Of Texas Systems | Mutant human factor ix with an increased resistance to inhibition by heparin |
| EP1617799A2 (en) * | 2003-04-09 | 2006-01-25 | Wyeth | Hemophilia treatment by inhalation of coagulation factors |
| US8012498B2 (en) | 2004-07-12 | 2011-09-06 | Sandhya Goyal | Topical gel formulation comprising organophosphate insecticide and preparation thereof |
| US8158139B2 (en) * | 2004-07-12 | 2012-04-17 | Taro Pharmaceuticals North America, Inc. | Topical gel formulation comprising organophosphate insecticide and preparation thereof |
| US7560445B2 (en) * | 2005-07-06 | 2009-07-14 | Taro Pharmaceuticals North America, Inc. | Process for preparing malathion for pharmaceutical use |
| KR20120118028A (ko) | 2010-01-18 | 2012-10-25 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 혈액 응고 인자의 정제 |
| ES2610529T3 (es) * | 2010-03-30 | 2017-04-28 | Octapharma Ag | Un procedimiento de purificación de proteínas dependientes de vitamina K, tales como el factor de coagulación IX |
| SG191186A1 (en) | 2010-12-15 | 2013-07-31 | Baxter Int | Eluate collection using conductivity gradient |
| US9663553B2 (en) | 2014-01-29 | 2017-05-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, immunoglobulins, clotting factor VIII and clotting factor IX) from human plasma |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT368883B (de) * | 1980-07-22 | 1982-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer neuen blutgerinnungsfoerdernden praeparation auf basis von humanproteinen |
| DE3045153A1 (de) * | 1980-11-29 | 1982-07-08 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur herstellung von blutgerinnungsfaktoren und danach hergestellte praeparation der faktoren ix und x |
| DE3101752A1 (de) * | 1981-01-21 | 1982-08-26 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | "verfahren zur reinigung der blutgerinnungsfaktoren ii, vii, ix und/oder x und danach hergestellte praeparationen" |
| US4447416A (en) * | 1982-04-28 | 1984-05-08 | American National Red Cross | Plasma protein concentrates of reduced thrombogenicity and their use in clinical replacement therapy |
| US4379085A (en) * | 1982-05-14 | 1983-04-05 | American National Red Cross | Heat stabilization of plasma proteins |
| US5614500A (en) | 1983-03-04 | 1997-03-25 | The Scripps Research Institute | Compositions containing highly purified factor IX proteins prepared by immunoaffinity chromatography |
| US5055557A (en) * | 1983-03-04 | 1991-10-08 | Scripps Clinic & Research Foundation | Ultrapurification of factor IX and other vitamin K-dependent proteins |
| DE3485711D1 (de) * | 1983-03-04 | 1992-06-17 | Scripps Clinic Res | Immunoadsorbens und verfahren zur zurueckgewinnung von vitamin-k-abhaengigen proteinen mittels dieses adsorbens. |
| DE3473407D1 (en) * | 1983-05-02 | 1988-09-22 | Immuno Ag | Method of inactivating pathogens |
| JPS60132912A (ja) * | 1983-12-21 | 1985-07-16 | Kao Corp | シヤンプ−組成物 |
| US4770999A (en) * | 1985-04-22 | 1988-09-13 | Genetics Institute, Inc. | High yield production of active Factor IX |
| US4786726A (en) * | 1986-01-06 | 1988-11-22 | Blood Systems, Inc. | Factor IX therapeutic blood product, means and methods of preparing same |
| FR2600334B1 (fr) | 1986-06-23 | 1989-05-12 | Transgene Sa | Vecteurs d'integration dans les cellules eucaryotes assurant l'expression du facteur ix, lignees celullaires obtenues et procede pour leur preparation |
| US4725673A (en) * | 1986-08-29 | 1988-02-16 | Alpha Therapeutic Corporation | Plasma fraction purification using silica resin bound to a ligand |
| DE3877529T2 (de) | 1987-10-23 | 1996-11-07 | Centre Regional De Transfusion | Herstellung von hoch-gereingtem menschlichen Faktor IX sowie anderem Plasmaproteinkonzentrat und dessen therapeutische Verwendung. |
| JPH01258700A (ja) | 1988-04-05 | 1989-10-16 | Green Cross Corp:The | 血液凝固第４因子の精製方法 |
| DE3826792C1 (fi) * | 1988-08-06 | 1989-07-06 | Biotest Pharma Gmbh, 6072 Dreieich, De | |
| US4981952A (en) * | 1988-10-04 | 1991-01-01 | Eli Lilly And Company | Method for the purification of vitamin K-dependent proteins |
| DE3914869C1 (fi) * | 1989-05-05 | 1990-08-09 | Biotest Pharma Gmbh, 6072 Dreieich, De | |
| AT402261B (de) * | 1991-01-25 | 1997-03-25 | Immuno Ag | Komplex enthaltend den gerinnungsfaktor ix |
| EP0573605B1 (en) * | 1991-03-01 | 2000-08-30 | Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. | Preparation of factor ix |
-
1992
- 1992-02-26 EP EP92908513A patent/EP0573605B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-26 ES ES92908513T patent/ES2150914T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-26 CA CA002105282A patent/CA2105282C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-26 JP JP50823092A patent/JP3418621B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-26 RU RU93053992A patent/RU2142806C1/ru active
- 1992-02-26 DE DE69231401T patent/DE69231401T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-26 WO PCT/US1992/001600 patent/WO1992015324A1/en active IP Right Grant
- 1992-02-26 AU AU16429/92A patent/AU671586B2/en not_active Ceased
- 1992-02-26 BR BR9205700A patent/BR9205700A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-02-26 SG SG1996008689A patent/SG48282A1/en unknown
- 1992-02-26 DK DK92908513T patent/DK0573605T3/da active
- 1992-02-26 AT AT92908513T patent/ATE195877T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-02-28 MX MX9200882A patent/MX9200882A/es unknown
-
1993
- 1993-08-03 US US08/101,175 patent/US6063909A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-01 FI FI933814A patent/FI114969B/fi not_active IP Right Cessation
- 1993-09-01 NO NO19933114A patent/NO315856B1/no not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-06 US US08/465,867 patent/US6043215A/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-03-13 US US09/524,206 patent/US6280729B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-30 GR GR20000402648T patent/GR3034946T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR3034946T3 (en) | 2001-02-28 |
| EP0573605A1 (en) | 1993-12-15 |
| WO1992015324A1 (en) | 1992-09-17 |
| NO315856B1 (no) | 2003-11-03 |
| JP3418621B2 (ja) | 2003-06-23 |
| US6280729B1 (en) | 2001-08-28 |
| MX9200882A (es) | 1992-09-01 |
| DE69231401T2 (de) | 2001-02-08 |
| FI933814A0 (fi) | 1993-09-01 |
| FI933814A (fi) | 1993-09-01 |
| CA2105282C (en) | 2002-09-24 |
| EP0573605B1 (en) | 2000-08-30 |
| US6043215A (en) | 2000-03-28 |
| JPH06505494A (ja) | 1994-06-23 |
| AU1642992A (en) | 1992-10-06 |
| SG48282A1 (en) | 1998-04-17 |
| DE69231401D1 (de) | 2000-10-05 |
| DK0573605T3 (da) | 2001-01-02 |
| EP0573605A4 (en) | 1994-11-23 |
| NO933114L (no) | 1993-09-01 |
| BR9205700A (pt) | 1994-06-28 |
| NO933114D0 (no) | 1993-09-01 |
| ATE195877T1 (de) | 2000-09-15 |
| RU2142806C1 (ru) | 1999-12-20 |
| AU671586B2 (en) | 1996-09-05 |
| ES2150914T3 (es) | 2000-12-16 |
| CA2105282A1 (en) | 1992-09-02 |
| US6063909A (en) | 2000-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3701028B2 (ja) | 高純度フォンビルブラント因子の入手方法 | |
| AU725442B2 (en) | A pharmaceutical preparation for treating blood coagulation disorders | |
| DK166587B1 (da) | Blodkoagulationshaemmende proteiner, fremgangsmaade til deres fremstilling samt deres anvendelse | |
| EP0197901B1 (en) | Biologically active fragments of the human antihemophilic factor and method for their preparation and pharmaceutical preparations | |
| JP2533050B2 (ja) | 高純度活性因子ＶＩＩａの濃縮物の製造方法 | |
| Griffith et al. | Heparin cofactor activities in a family with hereditary antithrombin III deficiency: evidence for a second heparin cofactor in human plasma | |
| FI114969B (fi) | Tekijä IX:n valmistus | |
| JP2008289498A (ja) | 精製されたマルチメラ−ゼ | |
| US4364861A (en) | Blood-coagulation-promoting products and methods of preparing them | |
| EP0201574B1 (en) | A preparation for the treatment of hemophilia a inhibitor patients and a process for producing such a preparation | |
| Tollefsen et al. | Modulation of heparin cofactor II activity by histidine-rich glycoprotein and platelet factor 4. | |
| AU9244998A (en) | Pharmaceutical substance containing various vitamin k-dependent factors | |
| US4391746A (en) | Blood-coagulation-promoting products and methods of preparing them | |
| EP0239644A1 (en) | Novel physiologically active substance having blood coagulation controlling activity | |
| AU627450B2 (en) | A method for the purification of factor xiii by affinity chromatography | |
| JPH07291999A (ja) | 血小板安定化因子ｉｘ−フラグメント、その製造方法及びこれを含有する薬剤 | |
| Barrowcliffe et al. | Studies of anti-Xa activity in human plasma I: Comparison of a fast-acting inhibitor with antithrombin III | |
| US20020031518A1 (en) | Plasminogen fragment having activity to inhibit tumor metastasis and growth and process for preparing same technical field | |
| JPH09176041A (ja) | α２プラスミンインヒビターを含有するＤＩＣ治療用薬剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 114969 Country of ref document: FI |
|
| MA | Patent expired |