PT937158E - Processo para a determinacao da actividade catalitica de factor ixa - Google Patents
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Description
Descrição “Processo para a determinação da actividade catalítica de factor IXa” É objecto da invenção um processo para a determinação da actividade catalítica de factor Xla. O processo de acordo com a presente invenção é apropriado para encontrar inibidores de factor Xla (triagem), para a modulação da coagulação do sangue (utilização terapêutica) e para a determinação de factor XI e factor Xla em líquidos corporais (utilização para diagnóstico).
Proteases de plasma sanguíneo desempenham um papel importante não só na coagulação de sangue e na cicatrização de feridas por formação de fibrina mas também na fibrinólise na dissolução de trombos. Depois da formação de uma ferida, por meio da activação sequencial (proteólise específica) de pró-enzimas inactivas com a obtenção de enzimas activas, amplifica-se o “sinal de formação de ferida” por meio do que se inicia a coagulação do sangue e se garante uma rápida cicatrização da ferida. A coagulação do sangue pode iniciar-se por meio de duas vias, a via intrínseca em que todos os componentes da proteína existem no sangue e a via extrínseca em que o assim chamado “factor de tecido” desempenha um papel crítico. O mecanismo molecular da hemóstase sanguínea (coagulação sanguínea, fibrinólise e a regulação deste equilíbrio) e dos componentes que nela participam foi descrito em alguns artigos de síntese que o abrangem (Furie, B. e Furie, B.C., Cell 53 (1988) 505-518; Davie, E.W. et al. Biochem. 30 (1991) 10363-10379; Bergmeyer, H.U. (ed.), Methods of Enzymatic Analysis, Vol. V, Capítulo 3, 3a Edição, Academic Press, Nova Iorque (1983)).
Os factores da cascata de coagulação do sangue são proteínas muito complexas. Elas em geral podem ser isolados apenas com grande despesa em quantidades limitadas, com qualidade, homogeneidade e pureza variáveis a partir das fontes de matérias primas naturais, o plasma sanguíneo (Van Dam-Mieras, M.C.E. et al., em: Bergmeyer, H.U. (ed.), Methods of Enzymatic Analysis, Vol. V, 3a Edição, página 365-394, Academic Press, Nova Iorque (1983)). Eles participam essencialmente na regulação da hemóstase sanguínea, no equilíbrio entre a coagulação do sangue, a formação e a dissolução de trombos. Este sistema bem regulado pode afastar-se do equilíbrio devido a defeitos provocados geneticamente, como por exemplo a hemofilia A (falta do factor VIII) e hemofilia B (falta do factor IX). Perturbações agudas podem provocar um enfarto cardíaco, embolia e derrame cerebral.
Existe portanto uma necessidade de substâncias com as quais o sistema da coagulação sanguínea e fibrinólise possa ser influenciada de acordo com as especificidades medicinais. Por exemplo, para o tratamento da hemofilia A e B utilizam-se respectivamente factor VIII ou facto IX isolado do sangue ou preparado por via recombinante. Para a dissolução de êmbolos, por exemplo depois do enfarto cardíaco, utiliza-se tPA (“Issue type plasminogen activator” = activador de plasminogénio do tipo de tecido) e estreptoquinase (activador do plasminogénio bacteriano). Além das proteínas complexas, utilizam-se também substâncias como por exemplo Hirudina (péptido de 65 amínoácidos, inibidor da trombina), Heparína (heteroglicano, cofactor de inibidores endógenos) e antagonistas da Vitamina K (inibidores da γ-carboxilação dos radicais Glu dos domínios de GLA) para a inibição da coagulação do sangue. As substâncias utilizáveis no entanto muitas vezes são ainda muito caras (factores proteicos) e relativamente à sua utilização medicinal não são ideais (actividades secundárias), de maneira que existe a necessidade de 3 medicamentos com os quais a coagulação do sangue e a dissolução dos trombos possam ser moduladas especificamente. A procura de novos moduladores (activadores, inibidores) da coagulação do sangue, fibrinólise e hemóstase pode realizar-se por exemplo por triagem de bibliotecas de substâncias e subsequente melhoramento de uma estrutura condutora identificada por “modelação da droga” (drug modelling). Para isso, é necessário que esteja à disposição i) um ensaio apropriado e ii) a (as) proteínas chave [alvo(s)] em quantidade e qualidade suficientes para uma triagem e para ensaios da estrutura de cristais (por exemplo, melhoria da estrutura dos vasos por previsão pretendida de modificações com base na estrutura 3D dos componentes proteínicos e estrutura dos vasos. O facto Xla (FIXa) é um alvo interessante para a triagem de inibidores para encontrar substâncias inibidoras para a modulação da coagulação do sangue. O quadro de sintomas conhecidos da doença da hemofilia B (defeito de factor Xla) leva a aceitar que inibidores do factor Xla específicos ultrapassam os inibidores de trombina conhecidos relativamente às acções secundárias pleiotrópicas ainda consideráveis.
Até agora, uma triagem da actividade de inibidor de FIXa falhou por causa da disponibilidade e da actividade catalítica extremamente pequena de FIXa. O isolamento da protease de serina FIX (zimogénio) inactiva do plasma sanguíneo e a subsequente activação por proteólíse é difícil, dispendioso, caro e muitas vezes não origina a quantidade pretendida nem a qualidade. Assim a concentração do plasma do protease zimogénio FIX monta apenas a 0,5 mg/1 (Furie, B. e Furie, B.C., Cell 53 (1988) 505-518). Além disso, as preparações de protease isoladas do plasma e activadas in vitro muitas vezes são muito heterogéneas e instáveis. O FIX-zimogénio inactivo pode por exemplo ser activado/convertido por meio de FXIa purificado (Van Dam-Mieras, M.C.E.; Muller, A.D.; van Dieijen, G.; Huemker, H.C.: Blood coagulation factors Π, V, VII, VIII, IX, X e XI: Determination with synthetic substrates em Bergmeyer, H.U. (ed): Methods of Enzymatic Analysis, Vol. V, Enzymes 3: Peptidases, Proeinases and Their Inhibitors, página 365-394, 3a Edição, Academic Press, Nova Iorque (1983)).
Proteases do plasma sanguínea são glicoproteínas complexas que pertencem à família das serinaproteases. Elas são sintetizadas no fígado sob a forma de pró--enzimas inactivas (zimogénio), seccionados para o sangue e activados no caso de necessidade por proteose específica, isto é, por separação de uma ou duas ligações peptídicas. Eles são estruturalmente muito semelhantes relativamente à ordenação dos domínios da proteína e à composição (Furie, B. e Furie, B.C., Cell (1988) 505--518).
As proteases da família do factor IX (factor VII, IX, X e proteína C) consistem, de acordo com Furie, B. e Furie, B.C., em um pró-péptido, um domínio GLA, um domínio “pilha de aminoácidos aromáticos” (aromatic amino acid stack), dois domínios EGF (EGF1 e EGF2), um domínio da activação de zimogénio (péptido de activação, AP) e um domínio catalítico de protease (CD).
Além disso, as proteases de plasma sanguíneo durante a secreção, são modificadas pós-translacionalmente: 11-12 pontes de dissulfureto N- e/ou O-glicosilação (domínio GLA e péptido de activação) - Bharadwaj, D. et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 6537-6542 - Medved, L. V. et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 13652-13659 separação do pró-péptido γ-carboxilação dos radicais Glu (domínio GLA) β-hidroxilação de um radical Asp (domínios EGF) separação da região do zimogénio (parcial).
Depois da activação dos zimogénios (forma zimogénica das proteínas) por separação específica de uma ou duas ligações peptídicas (separação de um péptido de activação), as proteases enzimaticamente activas consistem em duas cadeias que, correspondendo ao seu peso molecular, se designam cadeias pesada e leve. As duas cadeias são conservadas intactas na família das proteases do factor IX por uma ponte de dissulfureto intermolecular entre o domínio EGF2 e o domínio de protease. A transformação zimogénio-enzima (activação) origina alterações da conformação dentro do domínio da protease. Desta forma, pode ser necessário formar uma ponte de sal indispensavelmente essencial para a actividade de protease entre o amino-ácido da extremidade N do domínio da protease e o radical Asp dentro do domínio da protease. Para o subgrupo de proteases de serina, a região da extremidade N é muito crítica e não precisa de ser modificada. Só então se pode formar o “sítio activo” (active site) com a tríade catalítica Ser, Asp e His [Blow, D.M.: Acc. Chem. Res. 9 (1976) 145-152; Polgar, L.: em Mechanisms of protease action. Boca Raton, Florida, CRC Press, Capítulo 3 (1989)]. 6
As proteases de plasma sanguíneo classicamente podem ser preparadas por isolamento do zimogénio inactivo a partir do sangue e subsequente activação ou recombinantemente por expressão do correspondente cDNA numa linha de células de um animal mamífero apropriada ou leveduras. WO 92/15324 descreve a preparação e a purificação de factor IX como plasma humano assim como o processo melhorado para evitar a separação catalítica de factor IX com a obtenção de factor Xla. Além disso, descreve-se um processo para a determinação de factor IX por meio da determinação do tempo tromboplàstico parcial (PTT).
Na patente US 4 904 641, descreve-se um processo para a inactivação de patogénios filtráveis a partir de produtos de plasma sanguíneo, em que um desses produtos pode conter factor IX. A determinação do factor IX dessas preparações realiza-se por meio da determinação do tempo tromboplàstico parcial activado (PTT).
Na patente US 4 480 030 descreve-se um processo para a determinação quantitativa de factor Xla, em que como substrato se utiliza um tripéptido, que contém um cromóforo separável covalentemente ligado. De acordo com o Quadro 3 da patente US 4 904 641, de acordo com a determinação de factor IX, determina-se a cinética da inactivação do vírus em presença de vapor de etanol. A preparação de factores de coagulação por expressão/secreção dos zimogénios ou de proteases activas por meio de sistemas de hospedeiro/vector eucarióticos é descrita para FVII: Hagen , F.S. et al., EP 0 200 241; Pedersen, A.H. et al., Biochem, 28 (1989) 9391-9336; FIX: Lin, S.-W. et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 144-150; FX: Wolf, D.L. et al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 13726-13730;
Protein C: Bang, N.U. et a1., EP 0 191 606.
Em geral utilizam-se células hospedeiras que estão em posição de modificar os factores de coagulação durante o processo de secreção correspondentemente à enzima natural pós-translaccional. A transformação zimogénio-enzima realiza-se então posteriormente durante o processamento em “corrente descendente” (“down stream”), como por exemplo no caso de protrombina ou factor X com um activador de veneno de serpente (Sheehan, J.P. et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 3639-3645; Fujikawa, K. et al., Biochem. 11 (1972) 4892-4898).
Para a activação zimogénio-enzima in vivo (já durante a secreção) foram trocados sítios de segmentos de zimogénio naturais ou todo o péptido de activação por sítios de corte de protease (vários aminoácidos vizinhos), que podem ser separados pelas proteases que separam especifícamente existentes naturalmente na via de secreção das células hospedeiras como por exemplo Kex2 (leveduras) ou PACE (linhas de células de mamíferos) (FX: Wolf, D.L. et al., J. Biol. Chem. 226 (1991) 13726-13730; Pró-frombina: Holly, R.D. e Foster, D.C. WO 93/13208). A preparação de variantes de factores de coagulação (FX: Rezaie, A.R. et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 8176-8180; FIX: Zhong, D.G. et al., Proc. Acad. Sei. USA 91 (1994) 3574-3578), mutantes (FX: Rezaie, A.R. et al., J. Bio. Chem. 269 (1994) 21495-21499; Trombina: Yee, J. et al., Biol. Chem. 269 (1994) 17965--17970; FVH: Nicolaisen, E.M. et al., WO 88/10295) e quimeras, por exemplo de FIX e FX (Lin, S.-W. et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 144-150; Hertzberg, M.S. et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 14759-14766) por meio de sistemas hospedeiro/vector eucarióticos é conhecida. A expressão em linhas de células eucarióticas de mamíferos é no entanto dispendiosa, limitativa em relação à capacidade de expressão e cara. Além disso, podem se realizar modificações pó-translacionais indesejadas. A preparação de proteases de plasma sanguíneo por expressão em células pró-carióticas e subsequente naturação do produto de expressão é descrito por Thogersen, H.C. et al. (WO 94/18227). De acordo com este processo, realiza-se a naturação de variantes apurantes de FX por meio do que um processo de naturação cíclico, em que a proteína FX inactiva é fixada por meio de um complexo de quelato metálico (“poly(His)-affinity handle” = tratamento de poli(His)-afinidade) numa coluna de cromatografia. Para isso, utilizou-se uma proteína de fusão que consiste numa variante de FX encurtada (EGF1, EGF2 e domínios de protease), uma sequência adicional de reconhecimento de protease FXa e um auxiliar de fixação consiste em 6 radicais de histidina na extremidade C do domínio catalítico.
Surpreendentemente, descobriu-se que a actividade catalítica de factor Xla em relação a substratos pode ser estimulada por álcoois e dessa forma pode ser construído de maneira simples um ensaio de factor Xla muito sensível. E portanto objecto da presente invenção um processo para a determinação de factor Xla numa solução a examinar caracterizado pelo facto de se adicionar um substrato de factor Xla determinável e um álcool homogeneamente miscível com água e que forma uma fase e se determinar a separação do substrato do factor Xla como medida para a actividade do factor Xla. Verificou-se surpreendentemente que a actividade catalítica do factor Xla pode ser aumentada mais de 20 vezes por álcoois. Dessa forma, é possível determinar directamente a actividade do factor Xla directamente em soluções de amostras. Uma determinação do factor IX em soluções de amostras, de preferência em líquidos corporais com plasma, pode realizar-se depois da activação do factor IX para obtenção do factor Xla por meio de “veneno de víbora Russels” ou a partir de protease obtida a partir de veneno de serpente (RW -X-Protease).
Um outro objectivo da invenção é a utilização do processo de determinação de acordo com a presente invenção do factor Xla para triagem de substâncias que modulam (inibem ou activam) a actividade do factor Xla. Por consequência, é um objecto da invenção um processo para a identificação de uma substância, que modula a actividade do factor Xla, caracterizado pelo facto de a) se separar um substrato de factor Xla por meio de um polipéptido com a actividade de factor Xla em concentração definida em presença de um álcool e se determinar a velocidade da separação do referido substrato como meio para exprimir a actividade de factor Xla, b) se medir a referida actividade em presença de uma substância padrão, c) se comparar a actividade com e sem substância padrão e d) se utilizar a diferença da actividade como resultado da medida da modulação da actividade provocada pela substância de ensaio.
Preferivelmente, ensaia-se a inibição de factor Xla por meio de uma substância padrão.
Como substratos do factor Xla são por exemplo apropriados substratos do factor Xa, como se descrevem na EP-B 0 034 122. Especialmente, são apropriados substratos do tipo R-Xxx-Gli-Arg-pNA, em que Xxx significa um D-amino ácido hidrófobo e pNA exemplos de um grupo de saída determinável. R é definido analogamente a EP-B 0 034 122. São preferidos substratos da fórmula geral I da
Como substratos neste caso são preferidos tripéptidos com um D-amino ácido hidrófobo na extremidade N, em que de preferência se utiliza um D-amino ácido hidrófobo substituído por ciclo-hexilo. Neste caso são preferidas ciclo--hexiloglícina e ciclo-hexilalanina.
Outros substratos preferidos são por exemplo substratos que são separados por factor Xa, como por exemplo Cromozimo X (Boehringer Mannheim GmbH, Moc-D-Nle-Gli-Arg-pNA) ou pefacromo tPA (Pentapharm Ltd., Basileia, MeS02--D-HHT-Gli-Arg-pNA). Preferivelmente utilizam-se substratos usuais no comércio, opticamente mensuráveis (de preferência, cromogénios ou flúorogénios). Nos últimos casos, trata-se de péptidos/substratos cromogénicos como um radical separável facilmente determinável opticamente (de preferência, é o radical p-nitroanilina). Preferivelmente o processo de acordo com a invenção realiza-se no seio de uma solução tampão. Como substâncias tampão podem-se utilizar todos os tampões activos na gama de pH 7-10 (preferivelmente entre pH 7,5-9,0) preferem-se tampão tris, tampão de trietanolamina e tampão tris-imidazol. A determinação da actividade de FIXa ou o ensaio de triagem realiza-se de preferência 20-40°C e, de maneira muito especialmente preferida, à temperatura ambiente e a quantidade do grupo opticamente determinável separado é determinada fotométrica/fluorometricamente. Preferivelmente determina-se a extinção a 405 nm. A actividade enzimática e as constantes cinéticas são determinadas a partir do aumento inicial linear de acordo com a equação de Michaelis-Menten. O factor IX ou a proporção do factor IX para o factor IXa pode determinar-se analogamente depois da activação do factor IX para a obtenção do factor IXa. Para a determinação do factor IX no plasma, em primeiro lugar activa-se o factor IX com a obtenção do factor IXa por meio do “veneno de víbora Russels” (“Russels viper venom”) (de preferência, 0,2 mg/ml) ou de RVV-X-Protease (de preferência, 0,1 mg/ml) em presença de CaCl2 (10 mmol/1) a 20-40°C, preferivelmente a 37°C. Depois de realizada a activação, (de preferência, 15 minutos), adiciona-se etileno glicol e o substrato separável em concentrações de 20-40% ou 0,2-1 mmol/1.
Para um ensaio de triagem verificou-se ser vantajoso adicionar factor IX com uma concentração de 0,02-0,5 μηιοΐ/ΐ, preferivelmente 0,05 μιηοΐ/ΐ e o substrato separável numa concentração de 0,2-1 mmol/1 a uma concentração de substância de ensaio da gama dos pmol/l. Como álcool utiliza-se preferivelmente etilenoglicol, etanol ou metanol. A concentração do álcool é de preferência compreendida no intervalo de 20-40%. Como factor IXa pode utilizar-se preferivelmente factor IXa humano natural ou factor IXa de porco ou de vitelo ou factor IXa humano preparado recombinantemente. De maneira especialmente preferida, utiliza-se um factor IXa recombinante humano encurtado, como se descreve na EP 96 109 288.9.
Factor IXa recombinante enzimaticamente activo pode ser preparado por expressão de um correspondente DNA em célula procarióticas, naturação do produto de expressão e separação enzimática, quando ele é formado por um domínio de FIXa-serina protease (domínio catalítico), ligado na extremidade N com um domínio de EGF (EGF1 e/ou EGF2) e um domínio de activação do zimogénio.
Preferivelmente utiliza-se um factor IXa glicosilado, enzimaticamente activo, que consiste nos seguintes domínios: a) o domínio de FlXa-protease ligado no terminal N com b) um domínio de activação do zimogénio, ligado na extremidade N com c) um domínio de EGF1 e/ou de EGF2 (de preferência, EGF2 ou EGF1 e EFG2).
Preferivelmente, entre o domínio de activação do zimogénio e o domínio de EGF (ou os domínios de EGF) insere-se um espaçador com até 50 amino ácidos. Na separação da forma de cadeia zimogénica única de acordo com a presente invenção no domínio de activação do zimogénio obtém-se uma proteína activa com uma forma de duas cadeias. Na forma de duas cadeias, ambas as cadeias estão ligadas por uma ponte de dissulfúreto intermolecular. Preferivelmente as proteínas de acordo com a presente invenção consistem no domínio de EGF2, no péptido da activação e no domínio catalítico de factor IX. Muteínas do factor IX deste tipo são descritas no pedido de patente europeia N°. 96 110 959.2.
No processo de determinação de acordo com a presente invenção pode utilizar-se qualquer plasma, de preferência plasma com citrato. O processo pode realizar-se a valores de pH neutros ou ligeiramente alcalinos, de preferência no intervalo de pH de 7,5 a 9,0. Como tampões podem utilizar-se os tampões activos neste intervalo fisiologicamente aceitáveis. É ainda igualmente possível adicionar os agentes estabilizadores e conservantes usuais para o ensaio de coagulação como albumina de soro de vitelo, mertiolato e semelhantes.
No processo de acordo com a presente invenção e no reagente de acordo com a presente invenção pode ainda ser contido um agente tensioactivo, de preferência um agente tensioactivo não iónico como Tween 80®. Neste caso, a concentração de preferência monta a 0,01-1 % em volume.
Um outro objecto da presente invenção é um reagente para a determinação de factor IXa, que contém um substrato determinável opticamente separável pelo factor IXa, álcool e tampão na gama compreendida entre pH 7 e 10.
Os seguintes exemplos, publicações, o protocolo das sequências e as figuras esclarecem mais completamente a invenção e o seu âmbito de protecção é referido nas reivindicações. Os processos descritos devem considerar-se como exemplos que descrevem ainda do objecto da invenção, depois de modificações. A Fig. 1 mostra a influência de etanol e de etilenoglicol sobre a actividade de rFIXa recombinante (0,48 pmol/l) e de FIXa natural (0,14 pmol/l). pH 7,4; substrato: MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA (1,02 mmol/1) - Esquema do Quadro 2. A Fig. 2a representa a influência de etilenoglicol sobre a actividade de rFIXa. SI = MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA; S2 = MOC-D-Nle-Gli-Arg-pNA; S3 = MeS02--D-CHG-Gli-Arg-pNA; S4 = MeS02-D-CHA-Gli-Arg-pNA; S5 = MeS02-D-CHA--Gli-Arg-AMC; rFIXa = 0,48 pmol/l; pH = 7,4 - Esquema do Quadro 3. A Fig. 2b mostra a influência de etanol sobre a actividade de rFIXa. SI = MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA; S2 = MOC-D-Nle-Gli-Arg-pNA; S3 = MeS02-D--CHG-Glí-Arg-pNA; S4 = MeS02-D-CHA-GIi-Arg-pNA; S5 = MeS02-D-CHA--Gli-Arg-AMC; rFIXa = 0,48 jjmol/l; pH = 7,4 - Esquema do Quadro 3. A Fig. 3a representa a influência de etanol sobre a actividade de P-Kallikrein, FXHa, FXIa, FIXa, FXa e trombina (pH 7,4; 1,02 mmol/1 de MeS02-D-HHT-Gli--Arg-pNA) - Esquema do Quadro 5. A Fig. 3b mostra a influência de etilenoglicol sobre a actividade de P--Kallikrein, FXIIa, FXIa, FIXa, Fxa e trombina (pH 7,4; 1,02 mmol/1 MeS02-D--HHT-Gli-Arg-pNA) - Esquema do Quadro 6. Métodos Técnica de DNA recombinante
Para a manipulação de DNA utilizaram-se métodos estandardizados como são descritos em Sambrook, J. et al. (1989): Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. Utilizaram-se os reagentes moleculares biológicos de acordo com as indicações do fabricante.
Determinação da proteína A concentração da proteína das variantes de FIX foi determinada por meio da densidade óptica (DO) a 280 nm com o auxílio dos coeficientes de extinção molares calculados com o auxílio da sequência de aminoácidos.
Vector de expressão O vector para a expressão das variantes de FIX baseia-se no vector de expressão pSAM-CORE para estreptavidine core. A preparação e a descrição do plasmídio pSAM-CORE são descritas na WO 93/09144. O gene de estreptavidine core foi substituído pelo gene da variante pretendida no vector pSAM-CORE.
Exemplo 1
Clonagem do domínio catalítico do gene FIX (Plasmídio: pFIX-CD) O DIX-cDNA na posição Bp 690-1403, que codifica o domínio de FIX--protease de posição de aminoácidos 181-415 (a numeração da sequência de cDNA e da sequência de aminoácidos que corresponde à publicação de McGraw, R.A. et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 2847-2851), foi ampliado com a utilização do primário PCRN1 (SEQ ID NO: 1) e N2 (SEQID NO: 2)
Ncol NI 5^AAAAAA£CATGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACC-3’
MetV al V alGlyGly Glu Asp AlaLy s
HindlII N2: 5 ’ -AAAAA AAAGCTTCATTAAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATC-3 ’ e um banco de genes e de um cDNA que se pode obter comercialmente de fígado humano de um banco de genes (Vector: Lamba ZAP® II) da Firma Stratagene (La Jolla, CA, U.S.A.) como padrão de DNA. Por meio do primário PCR na extremidade 5’ da região de codificação foi inserido uma posição de corte Ncol e um codão ATG de iniciação e na extremidade 3’ da região de codificação um sítio de corte HindlII singular. O produto PCR com cerca de 730 Bp de comprimento foi digerido com as endonucleases de extremidade de restrição Ncol e HindlII e o fragmento NcolI/HindIII-FIX com cerca 720 Bp de comprimento, depois da purificação por electroforese em agarose foi ligado com o fragmento vector NcoI/HindlII-pSAM-CORE com cerca de 2,55 kBp (vide WO 93/09144). O plasmídio pretendido pFIX-CD foi identificado por encartamento de restrição e a sequência ΠΧ-cDNA isolada por PRC foi examinada por sequenciamento de DNA.
Exemplo 2
Construção do gene de FIX-protease com domínios EGF2, péptido de activação e domínio catalítico (Plasmídio: pFIX-EGF2-AP-CD)
Amplificou-se o FIX-cDNA de posição Bp 402-986 que codifica os domínios EGF2, o péptido de activação e a zona do terminal N do domínio de FIXa-protease da posição de aminoácidos 85-278 (McGraw et al., Proc. Natl. Acad. Sei. Usa 82 16 (1985) 2845-2851) com utilização do primário PCR N3 (SEQ ID NO: 3) e N4 (SEQ ID NO: 4)
Ncol N3: 5 ’-AAAAAACCATGGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCA-3 ’
Met Asp V alThrCy s AsnlleLy sAsnGly N4: 5 ’-GGGTTCGTCCAGTTCCAGAAGGGC-3 ’ e de cDNA de fígado humano de um banco de genes que se pode obter comercialmente (Vector: Lamba ΖΑΡ® Π) da Firma Stratagene (La Jolla, CA, U.S.A.) como modelo. Por meio do primário PCR N3 foi inserida na extremidade 5’ da região de codificação um codão de iniciação ATG e um sítio de corte Ncol. O produto PCR com cerca de 590 Bp de comprimento foi digerido com as endonucleases de restrição Ncol e Bsml e o fragmento com NcoI/BsmI-FIX-EGF2--AP de cerca de 360 Bp de comprimento depois da purificação por electroforese em gel de agarose foi ligado com formação do fragmento do vector NcolI/Bsml-pFIX--CD de cerca de 3,2 kBp de comprimento (Exemplo 1). O plasmídio pretendido pFIX-EGF2-AP-CD foi identificado por encartamento de restrição e a sequência FIX-cDNA isolada por PCR foi examinada por sequenciamento de DNA.
Exemplo 3 a) Expressão do gene FIXa-protease em E. coli
Para a expressão do gene FIX com péptido de activação transformou-se a estirpe E. coli-K12 UT5600 (Grodberg, J. e Dunn, J.J., J. Bacteriol. 170 (1988) 1245-1253) com o plasmídio de expressão pFIX-EGF2-AP-CD (resistência à ampicilina) descrito no Exemplo 2 e com o plasmídio de repressão laclq- pUBS520 (resistência a canamicina, preparação e descrição vide: Bnnkmann, U. et al., Gene 85 (1989) 109-114). Em vez da estirpe UT5600 podem-se também utilizar outras estirpes de E. coli conhecidas e que podem ser obtidas pelos especialistas na matéria, como por exemplo HB101 e E. coli.
As células UT5600/pBBS520 transformadas com o plasmídio de expressão pFIX-EGF2-AP-CD foram cultivadas em cultura de sacudimento em meio DYT (1% (peso/volume) de extracto de levedura, 1% (peso/volume) de Bacto Triptona, Difco e 0,5% de NaCl) com 50-100 mg/1 de ampicilina e 50 mg/1 de canamicina a 37°C até se atingir uma densidade óptica a 550 nm (DO550) de 0,6-0,9 e, em seguida, foi induzida com IPTG (1-5 mmol/1 de concentração final). Depois de uma fase de indução de 4 - 8 horas (h) a 37°C, as células foram colectadas por centrifugação (Centrífuga Sorvall RC-5B, Rotor GS3, 6000 RPM, 15 minutos), lavadas com tampão Tris-HCl 50 mmol/1 de pH 7,2 e armazenadas a -20°C para posterior processamento. O rendimento de células a partir de 1 litro de cultura sacudida montou a 4-5 g (peso húmido), b) Análise da expressão A expressão das células pFIX-EGF2-AP-CD transformadas com o plasmídio UT5600/pUBS520 foi analisada. Para isso suspenderam-se peletes de células obtidos a partir de respectivamente 1 ml de meio de cultura centrifugado em 0,25 ml de Tris-HCl 10 mmol/1, pH 7,2 as células foram abertas por tratamento com ultra--sons (2 impulsos de 30 s com a intensidade de 50%) com um disruptor de células Sonifíer® B15 da Firma Branson (Heusenstamm, Alemanha). Os componentes insolúveis das células foram sedimentados (Centrífuga Eppendorf 5415, 1400 UPM, 5 minutos) e o sobrenadante foi misturado com 1/5 em volume (Vol) de tampão de amostras 5xSDS (lxSDS-tampão de amostras: 50 mmoL/1 de Tris-HCl, pH 6,8, 1% de SDS, 1% de mercaptoetanol, 10% de glicerina, 0,001% de azul de bromofenol). A fracção insolúvel dos destroços de células (pelete) foi resuspensa em 0,3 ml de tampão para amostras lxSDS com ureia 6 - 8 M, as amostras foram incubadas a 95°C durante 5 minutos e novamente centrifiigadas. Em seguida, as proteínas foram separadas por electroforase (PAGE) em gel de SDS-poliacrilamida (Laemmli, U.K. Nature 227 (1970) 680-685) e coradas com corante azul brilhante R de Coomassie. A variante FIX sintetizada em E. coli era homogénea e foi exclusivamente encontrada na fracção dos destroços de células solúveis (“corpos de inclusão”, IBs). O valor da expressão montou a 10-50% relativamente à proteína total de E. coli. Exemplo 4
Lise das células, solubilização e naturação a) Lise das células e preparação dos “corpos de inclusão” IB (“inclusion bodies” IBs) A pelete de células proveniente de 3 litros de cultura sacudida (cerca de 15 g de peso húmido) foi ressuspensa em 75 ml de Tris-HCl 50 mmol/1, pH 7,2. A suspensão adicionou-se 0,25 mg/ml de lisózima e incubou-se a 0°C durante 30 minutos. Depois da adição de MgCl2 2 mmol/1 e 10 pg/ml de Dnase I (Boehringer Mannheim GmbH, Número de Catálogo 104159) abriram-se as células mecanicamente por meio de dispersão sob alta pressão numa prensa French® da Firma SLM Amico (Urbana, IL, U.S.A.). Em seguida, digeriu-se o DNA durante 30 minutos à temperatura ambiente (TA). Misturou-se a solução reaccional com 37,5 ml de Tris-HCl 50 mmol/1 pH 7,2, EDTA 60 mmol/1, NaCl 1,6 mol/1, 6% de Triton X-100, incubou-se à TA durante maís 30 minutos e centrifugou-se numa centrífuga Sorvall RC-5B (Rotor GSA, 12000 RPM, 15 minutos). Rejeitou-se o sobrenadante, misturou-se a pelete com 100 ml de Tris-HCl 50 mmol/1, pH 7,2, EDTA 20 mmol/1, incubou-se a 4°C durante 30 minutos sob agitação e sedimentou-se novamente. Repetiu-se a última fase de lavagem. Os IB purificados (1,5-2,0 g de peso húmido, 25-30% de massa seca, 100-150 mg de protease) foram guardados a -20°C para processamento posterior.
b) Solubilização e derivatização dos IB
Os IB depurados foram suspensos sob agitação à TA durante 1-3 horas numa concentração de 100 mg de pelete IB (peso húmido)/ml correspondendo a 5-10 mg/ml de proteína em guanidina-HCl 6 mol/1, Tris-HCl 100 mmol/1, EDTA 20 mmol, GSSG 150 mmol/1 e GSH 15 mmol, pH 8,0. Em seguida, regulou-se o pH para o valor de 5,0 e separou-se a parte insolúvel por centrifugação (Centrífuga Sorvall RC-5B, Rótor SS34, 16000 RPM, 10 minutos). Dialisou-se o sobrenadante contra 100 volumes de HCl-guanidina 4-6 mol/1 de pH 5,0 durante 24 horas a 4°C. c) Naturação A naturação das proteínas solubilizadas em HCl-guanidina 6 mol/1 e derivatizadas com GSSG/GSH realizou-se a 4°C por adição repetida (por exemplo, 3 vezes) de respectivamente 0,5 ml de solubilizado de IB/derivado a 50 ml de Tris--HC1 50 mmol/1, arginina 0,5 mol/1, CaCl2 20 mmol/1, EDTA 1 mmol/1 e cisteína 0,5 mmol/1 (pH 8,5) com o intervalo de tempo de 24 horas e subsequente incubação durante 48 horas a 4°C. Depois da reacção de naturação ter terminado, os componentes insolúveis foram separados por filtração com um dispositivo de filtração da Firma Satorius (Gõttingen, Alemanha) dotado com filtro K 250 da Firma Seitz (Bad Kreuznach, Alemanha), d) Concentração e diálise da mistura da naturação O sobrenadante transparente que contém a protease foi concentrado 10-15 vezes por filtração em caudal dosado numa minisete (Tipo de membrana: Omega 10K) da Firma Filtron (Karlstein, Alemanha) e para a eliminação de guanidinio-HCl e arginina realizou-se com 100 volumes de Tris-HCl 20 mmol/1 e NaCl 50 mmol/1, pH 7,2, durante 24 horas a 4°C. Separou-se a proteína precipitada por centrifugação (Centrífuga Sorvall RC-5B, Rótor SS34, 16000 RPM, 20 minutos) e o sobrenadante límpido é filtrado com uma unidade de filtração única Nalgene® (diâmetro dos poros 0,2 pm) da Firma Nalge (Rochester, NY, U.S.A.).
Exemplo 5
Purificação das variantes FIX naturadas
As variantes de FIX provenientes da mistura de naturação podem ainda ser purificadas, caso seja necessário, por métodos cromatográficos conhecidos pelos especialistas na matéria. a) Purificação das variantes de FIX por cromatografia de permuta iónica em Q-Sepharose-ff
A mistura reaccional de naturação concentrada e dialisada contra Tris-HCl 20 mmol/1 e NaCl 50 mmol/1, a pH 8,0 foi colocada numa coluna de Q-Sepharose-ff equilibrada com o mesmo tampão (1,5 x 11 cm, V = 20 ml; capacidade de carga: 10 mg de proteína/ml de gel) da Firma Pharmacia Biotech (Friburgo, Alemanha) (2 volumes de coluna/hora, 2 SV/h) e lavada durante o tempo necessário com o tampão de equilíbrio até a absorção diluído ter atingido o valor em branco do tampão. A 21 /¾ eluição do material apropriado realizou-se por meio de um gradiente de NaCl 50-500 mmol/1 em Tris-HCl 20 mmol/1, a pH 8,0 (2 SV/h). A variante de FIX foi eluida com uma concentração de NaCl 100-150 mmol/1. As fiacções que contêm FIX foram identificadas por SDS PAGE não redutor e redutor e reuniu-se o pico da eluição.
b) Purificação final da variante de FIX por cromatografia com permuta de iões em Heparinsepharose CL-6B 9 9
As fiacções que contêm FIX obtidas por cromatografia em Q-Sepharose-ff depois de diluídas foram directamente aplicadas a uma coluna de Heparinsepharose CL-6B equilibrada com Tris-HCl 20 mmol/1 e NaCl 200 mmol/1, a pH 8,0 (1,5 x 11 cm; V = 20 ml, capacidade de carga: 1 mg de proteína/ml de gel) da Firma Pharmacia Biotech (Friburgo, Alemanha) (2 SV/h). Em seguida, lavou-se com o tampão de equilibração durante o tempo necessário até que a absorção do eluído a 280 nm tenha atingido o valor em branco do tampão. A eluição do material ligado realizou-se com um gradiente de NaCl 0,2-1,0 mol/1 em Tris-HCl 20 mmol/1, pH 8,0 (2 SV/h). As variantes de FIX foram eluídas com uma concentração de NaCl 500--600 mmol/1. As fiacções que contêm FIX foram identificadas por meio de SDS PAGE, não redutora e redutora, diluiu-se o pico da eluição e dialisou-se contra Tris--HC120 mmol/1, NaCl 50-200 mmol/1, CaCl2 5 mmol/1, pH 7,8.
Exemplo 6
Activação e purificação da variante de FIX A variante de FIX purificada naturada foi activada com protease de “veneno de víbora” (“Russels viper venom”) (RW-X) purificada. A protease de RW-X foi purificada como se descreveu na publicação de Esmon, C.T. (Prothrombin activation, dissertação de doutoramento, Universidade de Washington, St. Louis, MO (1973)), a partir do veneno de cobra (liofilizado) obtido comercialmente da Firma Sigma Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen, Alemanha) por filtração em gel seguida por cromatografia de permuta de iões em Q-Sepharose-ff. a) Activação e purificação da variante de FIX naturado A variante FIX foi digerida numa concentração de 0,5 a 20 mg/ml e uma proporção protease/substrato de 1:10 a 1:20 em Tris-HCl 20 mmol/1, NaCl 50 mmol/1, CaCl2 10 mmol/1, pH 7,8 a 25°C. A variação ao longo do tempo da activação enzimática de FIX foi seguida por determinação da actividade com um substrato cromogénico (vide Exemplo 13 a) até se completar a digestão (valor constante, activação máxima). Para esse efeito, retiraram-se amostras (10 a 100 μΐ) a partir da mistura reaccional durante um intervalo de tempo de até 24 horas com o intervalo de 3-4 horas e determinou-se a actividade de FIXa libertado. Depois de se atingir o valor constante da actividade, a mistura de activação foi purificada por cromatografia negativa em Q-Sepharose-ff. RVV-X e a variante FIX não activada nas condições indicadas antes não ligam à Q-Sepharose-ff, a variante FIXa activada. A mistura reaccional da activação foi colocada numa coluna contendo Q--Sepharose-ff (1,0 x 10 cm, V = 8 mol), da Firma Pharmacia Biotech (Friburgo, Alemanha) (2 SV/h) equilibrada com Tris-HCl 20 mmol, NaCl 50 mmol/1, pH 7,8 e desenvolveu-se a coluna com tampão de equilíbrio sob fraccionamento. As fracções que contêm a protease foram identificadas por SDS PAGE não redutora e redutora e por determinação da actividade.
Exemplo 7
Caracterização das variantes de protease purificadas a) Ensaio de actividade A actividade da variante de FIXa foi determinada com substrato cromogénico cromózima X (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemanha, N°. de catálogo 789763). Misturaram-se amostras de 10-100 μΐ diluídas com 190--100 μΐ de Tris-HCl 50 mmol/1, NaCl 150 mmol/1, CaCl2 5 mmol/1, 0,1% de PEG 8000, pH 8,0 a 200 μΐ, com 20 μΐ de cromózima X (0,5-40 mmol/1) e mede-se com um leitor de ELISA a um comprimento de onda de 405 nm e à TA contra um valor branco dos reagentes. A actividade e as constantes eméticas foram determinadas a partir do aumento inicial linear de acordo com a equação de Michaelis-Menten.
b) SDS-PAGE
Ensaiou-se não só a formação de oligómeros e de agregados por formação intermolecular de pontes de dissulfureto mas também a homogeneidade e a pureza das variantes de FIXa-protease naturada activada e purificada por SDS PAGE não redutora (menos mercaptoetanol) e redutora (mais mercaptoetanol) (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685).
Exemplo 8
Ensaio de Factor IXa
Realizou-se um ensaio de FIXa com FIXa humano natural preparado recombinantemente como amostra e com substrato peptídíco MeS02-D--HHT-Gli-Arg-pNA (Pefacromo tPA, Pentapharm Ltd., Basileia, Suíça) e outros substratos cromogénicos/fluorogénicos do tipo R-D-Xxx-Gli-Arg-pNA (EP-B 0 034 122) em tampão Tris-HCl e as substâncias a ensaiar (álcool, dissolventes e inibidores). Iniciou-se a reacção por adição de FIXa
Princípio do ensaio: FIXa
MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA -> MeS02-D-HHT-Gli-Arg + pNA
Sinal de medição:
pNA
Substrato de FIXa: MOC-D-Nle-Gli-Arg-pNA (Cromózima X)
MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA (Pefacromo tPA)
MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA
MeS02-D-CHA-Gli-Arg-pNA
MeS02-D-CHA-Gli-Arg-AMC
Abreviaturas: pNA, p-nitroanilino AMC, 7-amino-4-metil-cumaril MOC, metiloxicarbonil HHT, hexa-hidrotirosina CHG, ciclo-hexilglicina CHA, ciclo-hexilalanina
Mistura Geral de Ensaio: 200 μΐ de tampão - 50-100 mmol/1 de Tris-HCl, pH 7-9,5 - 100-200 mmol/1 de NaCl - 5 mmol/1 de CaCl2 - com aditivos (álcoois, dissolventes e inibidores) + 25 μΐ de substrato peptídico (1-20 mmol/1) + 20 μΐ de FIXa (0,02-0,5 μπιοΐ/ΐ) Incubou-se a mistura de ensaio à temperatura ambiente (25°C) numa placa de 25
microtitulação e determinou-se a variação da extinção (ΔΕ/min) a 405 nm çom leitor de ELISA. Determinaram-se a actividade e as constantes cinéticas a partir do aumento inicial linear de acordo com a equação de Michael-Menten.
Exemplo 9
Influência de álcoois e dissolventes orgânicos sobre a actividade de rFIXa
Investigou-se a influência de diferentes álcoois miscíveis completamente de maneira monofásica com água (metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, t-butanol, etilenoglicol e glicerina) e dissolventes orgânicos [acetonitrilo, DMSO (sulfóxido de dimetilo) e DMF (dimetilformamida) assim como de álcoois polivalentes muito solúveis [m-eritrite, PEG (polietilenoglicol)] sobre a actividade de rFIXa em função da concentração dos álcoois ou dos dissolventes orgânicos (0-50%).
Mistura de ensaio (Concentração no Ensaio): - 41 mmol/1 de Tris-HCl, pH 7,4 - 82 mmol/1 de NaCl -4,1 mmol/1 de CaCl2
- 1,02 mmol/1 de MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA - 0,48 pmol/l de rFIXa (humano) - 0-50% (álcool ou dissolvente orgânico)
Os resultados estão reunidos no Quadro 1. Para tomar explicita a estimulação da actividade catalítica de rFIXa calculou-se o quociente V/V0. V0, Velocidade da reacção sem aditivos V, Velocidade da reacção na presença de aditivos
Quadro 1
Adição [%] V/V0 0 8 16 25 33 41 50 Metanol 1 2,16 3,46 3,71 2,83 1,55 0,588 Etanol 1 2,99 5,52 5,57 3,35 1,48 0,606 n-Propanol 1 3,43 2,26 0,339 0,186 0,056 0,056 i-Propanol 1 2,17 2,48 1,18 0,346 0,164 0,164 t-Butanol 1 2,05 1,67 0,702 0,368 0,263 0,263 Etilenoglicol 1 2,91 6,05 10,27 12,68 9,68 3,41 Glicerina 1 U2 1,64 2,47 3,38 4,82 5,91 m-Eritrite* 1 1,16 1,35 1,49 1,56 1,64 1,77 PEG* 1 0,691 0,410 0,352 0,309 0,216 0,173 Acetonitrilo 1 0,828 0,314 0 0 0 0 DMSO 1 1,27 1,45 1,59 1,43 0,922 0,157 DMF 1 0,649 0,514 0 0 0 0 *) g/100 ml
Resultado: A actividade de rFIXa é estimulada por alguns álcoois (etilenoglicol > etanol > metanol) na gama de concentrações de 15-40% cerca de 5-15 vezes. A glicerina só estimula a maiores concentrações (25-50%), enquanto a influência de n--eritrite é pequena. Pelo contrário, o polietilenoglicol (PEG) inibe a actividade de rFIXa. Em dissolventes que não contêm o grupo OH, o sulfóxido de dimetilo (DMSO) apenas não inibe rFIXa até 30%, enquanto dimetilformamida (DMF) e acetonitrilo inactivam a enzima.
Exemplo 10
Influência do etanol e etilenoglicol sobre a actividade de FIXa humano recombinante e FIXa natural
Investigou-se a estimulação observada de rFIXa (variante de rFXa activa que consiste em domínio de EGFII, péptido de activação processado e domínios catalíticos) por etanol e etilenoglicol também se verifica no caso de FIXa natural (humano).
Mistura de ensaio (Concentração do Ensaio): - Tris-HCl, 41 mmol/1, pH 7,4 - NaCl 82 mmol - CaCl2 4,1 mmol - MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA 1,02 mmol - rFIXa humano 0,48 pmol/l ou - FIXa (humano) natural 0,14 jrmol/l - 0-50% etanol ou etilenoglicol
Os resultados estão reunidos no Quadro 2 e representados na Figura 1.
Quadro 2
Adição [%] V/Vn 0 8 16 25 33 41 50 RFIXa Humano Etanol 1 2,99 5,52 5,57 3,35 1,48 0,61 Etilenoglicol 1 2,91 6,05 10,27 12,68 9,68 3,41 FIXa Natural (humano) Etanol 1 3,40 5,46 5,96 4,82 1,69 1,17 Etilenoglicol 1 3,13 6,19 9,36 12,21 8,29 3,92
Resultado:
Para rFIXa humano recombinante e FIXa humano natural, não se encontraram quaisquer diferenças relativamente à activação por etanol e etilenoglicol.
Exemplo 11
Influência de etanol e etilenoglicol sob a actividade de rFIXa em relação a substratos de péptidos cromogénicos e fluorogénicos
Ensaiou-se a estimulação de rFIXa humano por meio de etanol e etilenoglicol sob utilização do substrato peptídico MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA (Pefacromo tPA, Pentapharm Ltd., Basileia, Suíça). MOC-D-Me-Gli-Arg-pNA (Cromózimo X, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemanha, N°. de Catálogo 789763), MeSC>2-D-CHG-Gli-Arg-pNA (Pentapharm Ltd., Basileia, Suíça), MeS02-D-CHA-Gli-Arg-pNA (Pentapharm Ltd., Basileia, Suíça) e MeS02-D-CHA-Gli-Arg-AMC (Pentapharm Ltd., Basileia, Suíça).
Mistura de ensaio cromogénica (Concentração no ensaio) - Tris-HCl 42 mmol/1, pH 7,4 -NaCl 82 mmol/1 - CaCl2 4,1 mmol/1 - 0-50% Etilenoglicol - MeS02-D-HHT -Gli-Arg-pNA, 1,02 mmol/1 - rFIXa (humano) 0,48 mmol/1 ou - MOC-D-Nle-Gli-Arg-pNA 0,82 mmol/1 - rFIXa (humano) 0,48 pmol/l ou - MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA 1,02 mmol/1 - rFIXa (humano) 0,28 pmol/l ou - MeS02-D-CHA-Gh-Arg-pNA 1,02 mmol/1 - rFIXa (humano) 0,48 pmol/l 29 29
Mistura reaccional de ensaio fluorogénica (Concentração no ensaio) - Tris-HCl 42 mmol/I, pH 7,4 - NaCl 82 mmol/1 - CaCl2 4,1 mmol/1 - 0-50% Etilenoglicol - MeS02-D-CHA-Gli-Arg-AMC 0,51 mmol/1 - rFIXa (humano) 0,08 μmol/l
Os resultados estão reunidos no Quadro 3, os valores encontrados com etilenoglicol estão representados na Figura 2a e os resultados obtidos com etanol na Figura 2b.
Quadro 3
Substrato Adição V/V0 Adição [%] 0 8 16 25 33 41 50 MeS02-D-HHT- Gli-Arg-pNA Etanol 1 2,99 5,52 5,57 3,35 1,48 0,60 Etilenoglicol 1 2,91 6,05 10,27 12,68 9,68 3,41 MOD-D-Nle-Gli- Arg-pNA Etanol 1 3,63 7,28 9,95 7,51 3,15 1,39 Etilenoglicol 1 3,91 8,85 17,07 22,42 17,80 6,96 MeS02-D-CHG- Gli-Arg-pNA Etanol 1 3,33 6,02 6,16 4,50 1,74 0,87 Etilenoglicol 1 5,47 13,13 19,37 23,20 17,40 5,67 MeS02-D-CHA- Gli-Arg-pNA Etanol 1 3,30 5,40 5,38 4,30 1,48 0,89 Etilenoglicol 1 2,84 6,26 9,34 11,18 7,54 2,56 MeS02-D-CHA- Gli-Arg-AMC Etanol 1 2,09 2,50 1,37 1,01 0,70 0,58 Etilenoglicol 1 2,55 5,59 8,40 8,90 5,79 1,44 30
Resultado: A estimulação de rFIXa por meio de etanol e de etilenoglicol, expressa pelo quociente V/Vo, no caso da utilização dos substratos peptídicos MOC-D-Nle-Gli--Arg-pNA ou MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA em vez de MeS02-D-HHT-Gli-Arg--pNA é ainda aumentada. O quociente V/V0, acima de 25% de etilenoglicol, é 1,5-2 vezes maior do que no substrato MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA. A separação do substrato fluorogénico MeS02-D-CHA-Gli-Arg-AMC é também estimulada de maneira comparável por meio de álcoois. A separação dos tripéptidos com a sequência MeS02-D-CHA-Gli-Arg e AMC ou pNA no terminal C é potenciada por etilenoglicol (33%) 9 e 11 vezes. Por causa da maior sensibilidade para a separação do substrato fluorogénico MeS02-D-CHA-Gli-Arg-AMC deve utilizar-se essencialmente menor proporção de rFIXa (1/10).
Exemplo 12
Influência de etilenoglicol sobre a cinética da separação dos substratos peptídicos cromogénicos MeS02-D-HJtlT-Gli-Arg-pNA, MOC-D-NIe-Gli-Arg--pNA e MeS02
Mistura de ensaio ÍConcentracão do Ensaio): - Tris-HCl 42 mmol/1, pH 7,4 - NaCl 82 mmol/1 - CaCl2 4,1 mmol/1 - Etilenoglicol 0-50% - MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA, (0,102 - 1,02 mmol/1) - rFIXa (humano) 0,48 mmol/1 - MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA (0,102 - 1,02 mmol/1) - FIXa (humano) natural 0,29 pmol/l - MOC-D-Nle-Gli-Arg-pNA (0,102 - 1,02 mmol/1) - rFIXa (humano) 0,48 pmol/l ou - MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA (0,102 - 1,02 mmol/1) - rFIXa (humano) 0,28 pmol/l A determinação das constantes eméticas (k^/K™) não se realizou graficamente (Km e krat não podem ser determinadas separadamente porque as rectas passam através da origem).
Quadro 4a
Enzima Kcat/Km [l/mmol*s] Concentração de etilenoglicol f%] 0 8 16 25 33 41 50 RFIXa n.l. 0,348 0,515 1,018 1,018 0,692 0,172 FIXa natural n.l. 0,299 0,737 1,169 1,395 0,922 0,390
Quadro 4b
Diversos substratos, rFIXa
Substrato Kcat/K^, [l/mmol*s] Concentração de etilenoglicol f%l 0 8 16 25 33 41 50 MeS02-D-HHT-Gli- Arg-pNA n.l. 0,348 0,515 1,018 1,018 0,692 0,172 MOC-D-Nle-Gli-Arg- pNA n.l. n.l. 0,326 0,565 0,552 0,360 0,148 MeS02-D-CHG-GIi- Arg-pNA n.l. 0,637 1,974 2,880 3,480 1,929 0,576 n.l. = não linear
Resultado: A estimulação dos substratos peptídicos cromogénicos por separação catalisada por FIXa humano recombinante ou nativo é também bem notada para as constantes eméticas, krat/Km aumenta até uma concentração de etilenoglicol de 33%. Para o substrato MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA acha-se a actividade catalítica máxima, isto é, o máximo valor de k^/Km, verifica-se a 33% de etilenoglicol. A relação não é linear, não sendo possível determinar constantes.
Exemplo 13
Influência de etanol e etilenoglicol sobre a actividade de FIXa em comparação com plasma alcalino puro, FXIIa, FXIa, Fxa e trombina
Composição de ensaio de FIXa ('Concentração no ensaio) - 42 mmol/1 de Tris-HCl, pH 7,4 - 82 mmol/1 de NaCl - 4,1 mmol/1 de CaCl2
- 1,02 mmol/1 de MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA - 0,14 jimol/l de FIXa (humano) natural - 0-50% de etanol ou etilenoglicol
Composição de ensaio de plasma alcalino puto (Concentração no ensaio! - 42 mmol/1 de Tris-HCl, pH 7,4 - 82 mmol/1 de NaCl -4,1 mmol/1 de CaCl2
-1,02 mmol/1 de MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA - 0,0176 U/ml de plasma alcalino puro (humano) - 0-50% de etanol ou etilenoglicol
Concentração de ensaio de FXIIa (Concentração no ensaio) - 42 mmol/1 de Tris-HCl, pH 7,4 - 82 mmol/1 de NaCl -4,1 mmol/1 de CaCl2
- 1,02 mmol/1 de MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA - 0,0045 U/ml de FXIIa (humano) - 0-50% de etanol ou etilenoglicol
Composição de ensaio de FXIa (Concentração no ensaio) - 42 mmol/1 de Tris-HCl, pH 7,4 - 82 rnmol/l de NaCl -4,1 mmol/1 de CaCl2
- 1,02 mmol/1 de MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA - 0,0012 pmol/l de FIXa (humano) - 0-50% de etanol e etilenoglicol
Composição de ensaio de FXa (Concentração no ensaio) - 42 mmol/1 de Tris-HCl, pH 7,4 - 82 mmol/1 de NaCl - 4,1 mmol/1 de CaCl2
- 1,02 mmol/1 de MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA - 0,088 pmol/l de FXa (Vitelo) - 0-50% de etanol e etilenoglicol
Composição de ensaio de trombina (Concentração no ensaio) - 42 mmol/1 de Tris-HCl, pH 7,4 - 82 mmol/1 de NaCl - 4,1 mmol/1 de CaCl2
- 1,02 mmol/1 de MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA - 0,14 jimol/l de trombina (Vitelo) - 0-50% de etanol e etilenoglicol
Os resultados estão reunidos no Quadro 5 e no Quadro 6, a influência por acção do etanol é representada na Figura 3a e a influência do etilenoglicol na Figura 3b.
Quadro 5
Protease V/V0 Concentração de etanol f%] 0 8 16 25 33 41 50 P. alcalino puro 1 1,48 1,10 0,377 0,280 0,215 0,174 FXIIa 1 0,904 0,579 0,187 0,051 0,009 0 FXIa 1 1,08 0,845 0,657 0,469 0,353 0,258 FIXa 1 3,40 5,46 5,96 4,82 1,69 1,17 Fxa 1 0,899 0,752 0,510 0,377 0,203 0,086 Trombina 1 0,846 0,685 0,507 0,343 0,184 0,087
Quadro 6
Protease V/V„ Concentração de etilenoglicol [%] 0 8 16 25 33 41 50 P. alcalino puro 1 1,05 0,763 0,676 0,536 0,478 0,290 FXIIa 1 0,892 0,729 0,551 0,355 0,187 0,103 FXIa 1 0,922 0,790 0,569 0,422 0,275 0,165 FIXa 1 3,13 6,19 9,36 12,21 8,29 3,92 Fxa 1 0,973 0,902 0,741 0,558 0,347 0,191 Trombina 1 0,924 0,862 0,763 0,653 0,508 0,395
Resultado:
Dos factores de coagulação da via intrínseca de activação - plasma alcalino puro, FXIIa, FXIa, FIXa, Fxa e trombina - só FIXa é activado por etanol e etilenoglicol. Observa-se uma ligeira activação em presença de 10-20% de etanol no plasma alcalino puro.
Exemplo 14
Influência do pH sobre a actividade de rFIXa e de FIXa natural em presença de etilenoglicol
Composição de ensaio (Concentração no ensaio) - 42 mmol/1 de Tris-HCl, pH 7,0 - 10,0 - 82 mmol/1 de NaCl - 4,1 mmol/1 de CaCl2
- 1,02 mmol/1 de MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA, MOC-D-Nle-Gli-Arg-pNA ou MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA - 25% de etilenoglicol - 0,28 pmol/l de FIXa (humano) natural
Os resultados estão reunidos nos Quadros 7a-d.
Quadro 7a
Substrato: MeS02-D-HHT-GIi-Arg-pNA, rFIXa (humano)
Adição/pH mE/min 7,0 7,5 8,0 8,25 _A5_ oo 9,0 9,5 10,0 sem 6,5 10,7 16,0 17,0 16,3 16,3 16,0 12,9 10,4 Etilenoglicol Γ25%] 56,5 124,5 173,6 176,0 182,1 170,7 164,1 112,0 110,1
Quadro 7b
Substrato: MeS02-D-HBT-Gli-Arg-pNA, FIXa (humano) natural
Adição/pH mE/min 7,0 7,5 8,0 8,25 8,5 8,75 9,0 9,5 10,0 sem 3,3 6,8 10,0 10,5 10,3 9,9 9,3 7,4 6,2 Etilenoglicol Γ25%1 23,7 63,0 101,0 106,7 115,4 110,9 105,6 100,6 77,2
Quadro 7c
Substrato: MOC-D-Nle-Gli-Arg-pNA, rFIXa (humano)
Adição/pH mE/min 7,0 7,5 8,0 8,25 8,5 8,75 9,0 9,5 10,0 sem 3,1 5,2 6,8 7,3 7,9 7,1 7,1 7,0 5,2 Etilenoglicol [25%] 31,5 70,1 99,7 10,7 104,3 101,6 97,3 70,7 68,3
Quadro 7d
Substrato: MeS02-D-CHG-GIi-Arg-pNA, rFIXa (humano)
Adição/pH mE/min 7,0 7,5 8,0 8,25 8,5 8,75 9,0 9?5 10,0 sem 6,5 11,3 18,1 18,8 19,6 20,3 18,4 14,8 11,3 Etilenoglicol [25%1 154,7 289,8 372,4 382,2 389,8 395,6 373,3 255,6 244,5
Resultado: A dependência do pH da actividade catalítica de rFIXa não é alterada por álcoois, como por exemplo o mencionado etilenoglicol. Assim entre pH 7,0 e 10,0, as velocidades de separação aumentam na mesma proporção em presença de 25% de etilenoglicol. Neste caso, as velocidades de separação em presença do substrato aumentam de 10 vezes em MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA, em MOC-D-Nle-Gli-Arg--pNA de 14 vezes e em MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA de 20 vezes. A gama óptima de pH fica compreendida entre pH 8,25 e 8,75. De maneira mais eficaz separa-se substrato MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA.
Exemplo 15
Ensaio para a descoberta de inibidores de FIXa
Inibidores específicos de FIXa podem ser identificados pela inibição da actividade de FIXa. Para esse efeito, determina-se a actividade de FIXa com um 37
substrato do tipo R-D-Xxx-Gli-Arg-pNA (Xxx = aminoácido hidrófobo) em presença e na ausência da substância a ensaiar ou de uma mistura de substâncias a ensaiar e por formação do quociente calcula-se a inibição percentual. A constante de inibição K; é determinada a partir de uma cinética de inibição. A presença de concentrações elevadas de determinados álcoois (preferivelmente etilenoglicol) reforçam o sinal de medição.
Princípio do ensaio: FIXa
R-D-Xxx-Gli-Arg-pNA-------------> R-D-Xxx-Gli-Arg + pNA
Sinal de medição: pNA
Substrato de FIXa: MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA (Pefacromo tPA)
MOC-D-Nle-Gli-Arg-pNA (Cromózimo X) MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA FIXa: rFIXa (humano) preparado recombinantemente
Composição de ensaio: 200 μΐ de tampão (100 mmol/1 de Tris-HCl, 100 mmol/1 de NaCl, 5 mmol/1 de CaCl2, 20-40% de álcool, pH 7-9) o tampão contém o inibidor em concentrações diferentes + 25 μΐ de substrato peptídico + 20 μΐ de rFIXa (humano)
Incubou-se a composição dc ensaio à TA numa placa de microtitulação e determinou-se a variação da extinção (AE/min) a 405 nm com um leitor de ELISA. A reacção pode ser terminada também depois de 5-10 minutos por interrupção com ácido acético (25 μΐ, 50%), determma-se a extinção a 405 nm contra um valor do 38 38
reagente em branco.
Exemplo 16
Influência de inibidores de protease conhecidos sobre a actividade de rFIXa diferente valor de pH, álcool e concentração de álcool
Composição de ensaio (Concentração no ensaio) - 42 mmol/1 de Tris-HCl, pH 7,4 ou 8,5 - 82 mmol/1 de NaCl - 4,1 mmol/1 de CaCl2 - Substrato de MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA (1,02 mmol/1) - 0,028 - 0,57 pmol/l de rFIXa (humano) - 4,1% de etanol ou 33% de etilenoglicol - inibidor em concentrações variando em degrau (4,1-163 pmol/l)
Como inibidores utilizaram-se inibidores sintéticos conhecidos do tipo da 3--amidinofenilalanina (Stíirzebecher et al., J. Enzym. Inhibiton 9 (1995) 87 e WO 92/08709 (1991)). Como exemplo investigou-se a acção inibidora com uma concentração pequena e com uma concentração alta de álcool.
Quadro 8a
Inibição da actividade de Factor IXa (em %) pelo inibidor ácido Na-(2,4,6-tri--isopropilbenzenolssiifonil)-3-amidino-(DX)-fenilalanina-isonipecotinocarboxí-lico [TIPPS-(3-Am)Fen-iNip-OH]
Condições Concentração de inibidor fpmol/ll 4,1 8,2 16,3 40,8 81,6 163 pH 7,4; 4,1% de etanol 0,57 μιηοΙ/Ί de rFIXa 89,5 87,6 76,2 55,8 36,3 23,8 pH 8,5; 4,1% de etanol 0,28 μτηοΙΛ de rFIXa 90,6 85,2 74,8 55,2 35,3 20,8 pH 7,4; 33% de etilenoglicol 0,057 μιηο1/1 de rFIXa 86,9 79,4 61,7 38,9 21,2 15,0 pH 8,5; 33% de etilenoglicol 0,028 pmol/l de rFIXa 85,6 72,8 58,0 33,6 20,7 15,8
Quadro 8b
Inibição da actividade de factor IXa (em %) por meio do inibidor do ácido Na-(2-naftilsulfonÍI)-3-amidmo-(D,L)-feniIaIanmo-l,2,3,4-tetra-hidro-isoqumolino--3-carboxíIico [pNAPS-(3-Am)Phe-TIC-OHJ
Condições Concentração de inibidor [pmol/l] 4,1 8,2 16,3 40,8 81,6 163 pH 7,4; 4,1 % de etanol 0,57 pmol/l de rFIXa 97,2 97,2 88,2 75,4 57,0 25,7 pH 8,5; 4,1% de etanol 0,28 pmol/l de rFIXa 100 96,2 86,2 77,5 63,8 48,8 pH 7,4; 33% de etilenoglicol 0,057 pmol/l de rFIXa 100 100 85,4 62,6 C5 T"—í Tf 28,9 pH 8,5; 33% de etilenoglicol 0,028 μχηοΐ/l de rFIXa 100 97,9 88,4 78,4 66,0 45,4
Resultado: A inibição de rFIXa por um inibidor sintético pode ser investigada a diferentes valores de pH (pll 7-9) e diferente teor dc um álcool (preferivelmente, etanol ou etilenoglicol). Para uma inibição de 50% de rFIXa, determinaram-se para o inibidor TIPPS-(3-Am)Phe-iNip-OH valores de CI50 compreendidos entre 20 e 50 pmol/í, para o inibidor pNAPS-(3-Am)Fen-TIC-OH valores de CI5o compreendidos entre 60 e 150 pmol/l. Com concentração mais elevada de etilenoglicol e pH 8,5, a acção de inibição verificou-se ser mais sensível. Este método é apropriado como processo de triagem para procura de inibidores de FIXa, porque são precisas quantidades extraordinariamente pequenas de rFIXa e a elevada concentrações de álcool facilitam a utilização da solução como substâncias de ensaio.
Exemplo 17
Determinação das constantes de dissociação Kj de acordo com o processo de DIXON
Composição de ensaio (Concentração no ensaio) - 42 mmol/l de Tris-HCl, pH 8,5 - 82 mmol/l de NaCl -4,1 mmol/l de CaCl2 - 33% de Etilenoglicol - inibidor em concentrações entre graus (0, 20,4 e 40,8 pmol/l) - MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA (1,02, 0,51 ou 0,25 mmol/l) -0,14 pmol/l de rFIXa (humano) ou - MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA (1,02, 0,51 ou 0,25 mmol/l) - 0,07 pmol/l de FIXa (humano) natural ou - MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA (1,02, 0,51 ou 0,25 mmol/I) - 0,057 pmol/l de rFIXa (humano)
Como inibidor utilizou-se TIPPS-(3-Am)Fen-iNip-OH e, por exemplo, 41 determinou-se a acção de dois substratos nas condições óptimas (pH 8,5, 33% de etilenoglicol).
Quadro 9a
Substrato: MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA, 0,14 μπιοΙ/1 de rFIXa
Concentração do Substrato Concentração de inibidor [μηιοΐ/ΐ] IA' [min/mE] 0 20,4 40,8 1,02 pmold 9,5 16,6 31,2 0,51 pmol/l 20,9 43,5 90,9 0,25 pmol/l 33,2 69,4 137
Quadro 9b
Substrato: MeSQ2-D-HHT-Gli-Arg-pNA, 0,07 μιηοΙ/1 de FIXa natural
Concentração do Substrato Concentração de inibidor [μιηοΐ/ΐ] 1A^ [min/mE) 0 20,4 40,8 1,02 μηκ>1/1 16,4 29,5 53,2 0,51 pmol/l 38,6 77,5 154 0,25 pmol/l 59,5 129 255
Quadro 9c
Substrato: MeSQ2-D-CHG-Gli-Arg-pNA, 0,057 μπιοΙ/Ι de rFIXa
Concentração do Substrato Concentração de inibidor [pmol/l] 1/V [min/mEl 0 20,4 40,8 1,02 μιηοΐ/ΐ 15,5 23,8 44,6 0,51 pmol/l 28,7 55,6 109 0,25 pmol/l 43,1 78,1 153
Resultado: A determinação das constantes de dissociação K; de acordo com DIXON para a inibição de FIXa humano recombinante ou natural realizou-se por meio de HPPS-(3-Am)Fen-iNip-OH a pH 8,5 e concentração óptima de etilenoglicol (33%). Para a inibição do FIXa recombinante ou natural, determinaram-se valores de K, com a utilização dos valores reunidos nos Quadros 9a e 9b graficamente comparáveis (12 ou 9 pmol/l). Também no caso de utilização dos substratos originam valores de K; comparáveis para inibição rFIXa de MeS02-D-HHT-Gli-Arg-pNA e MeS02-D-CHG-Gli-Arg-pNA (12 ou 16 pmol/l). A composição escolhida com maior concentração de etilenoglicol é especialmente apropriada para a determinação das constantes de inibição porque são necessárias pequenas concentrações de rFIXa. Uma elevada concentração de álcool facilita adicionalmente a solução da substância a ensaiar.
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PROTOCOLO DA SEQUÊNCIA (1) INDICAÇÕES GERAIS: (i) REQUENTE:
(A) NOME: BOERINGER MANNHEIM GMBH (B) RUA: Sandhofer Str. 116 (C) LUGAR: Manheim (E) PAÍS: Alemanha (F) NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: D-68305 (G) TELEFONE: 08856/60-3446 (H) TELEFAX: 08856/60-3451 (ii) DESIGNAÇÃO DA INVENÇÃO: Processo para a determinação da actividade catalítica de Factor IXa (iii) NÚMERO DAS SEQUÊNCIAS: 4 (iv) VERSÃO LEGÍVEL POR COMPUTADOR : (A) SUPORTE DE DADOS: Disco macio (B) COMPUTADOR: PC IBM compatível
(C) SISTEMA DE ACTUAÇÃO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Release N9.10, Versão N° 1 30B (EPA) (2) INDICAÇÕES PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: Nucleótido (C) FORMA DE HÉLICE: Hélice única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “Primário” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO. 1: AAAAAACCAT GGTTGTTGGT GGAGAAGATG CCAACC (2) INDICAÇÕES PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 47 pares de bases (B) TIPO: Nucleótido (C) FORMA DA HÉLICE: Hélice única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “Primário” (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: AAAAAAAAGC TTCATTAAGT GAGCTTTGTT TTTTCCTTAA TC (2) INDICAÇÕES PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: Nucleótido (C) FORMA DA HÉLICE: Hélice única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “Primário”
(ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: AAAAAACCAR GGATGTAACA TGTAACATTA AGAATGGCA (2) INDICAÇÕES PARA SEQID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: Nucleótido (C) FORMA DA HÉLICE: hélice única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “Primário”
(ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4 GGGTTCGTCC AGTTCCAGAA GGGC
Lisboa, 12 de Março de 2001 ,/ (Μ O Agente Oficial da Propriedade Industrial
Rua do Salitre, 195, r/c-Drt. 1250 LISBOA
Claims (6)
- Reivindicações 1. Processo para a determinação de Factor IXa numa solução de amostra, que contém Factor IXa ou em que se obtém ou consome Factor IXa, caracterizado pelo facto de à mencionada solução de amostra se adicionar um substrato de Factor IXa determinável e um álcool miscível monofasicamente com água e se determinar a acção catalítica de Factor IXa sobre o mencionado substrato por meio de separação do substrato de Factor IXa como medida para a actividade do Factor IXa.
- 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de como substrato se utilizar um tripéptido com um D-aminoácido hidrófobo na extremidade N.
- 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se usar um D-amino ácido hidrófobo substituído por ciclo-hexilo.
- 4. Processo para a identificação de uma substância, que modula a actividade de Factor IXa, caracterizado pelo facto de a) se separar o substrato de Factor IXa por meio de um polipéptido com a actividade de Factor IXa em concentração definida em presença de um álcool miscível monofasicamente com água e de se determinar a velocidade de separação do mencionado substrato como medida para a actividade do Factor IXa, b) se medir a mencionada actividade em presença de uma substância de ensaio, c) se comparar a actividade com e sem substância de ensaio e d) se utilizar a diferença das actividades como medida para a modulação da actividade por meio da substância de ensaio.
- 5. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo 2 facto de, como álcool monofasicamente miscível com água, se utilizar metanol, etanol, n-proponol ou i-propauol, t-butanol, glicerina ou especialmente etilenoglicol.
- 6. Reagente para a determinação de Factor IXa numa solução de amostra, que contém substrato cromogénico separável por meio de Factor IXa, um álcool monofasicamente miscível com água assim como um tampão de pH compreendido no intervalo entre 7 e 10. Lisboa, 12 de Março de 2001 jjp O Agente Oficie! da Propriedade IndustriaiRas do SaH; <\ r'5. >vc- Drt. .?·''· O A
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