MX2007011961A - Inhibidores de neurotripsina. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con un metodo para determinar si un compuesto es un inhibidor de la neurotripsina, caracterizado porque el compuesto es incubado junto con neurotripsina, una variante de la misma o un fragmento que comprende el dominio de proteasa y con una proteina o peptido que comprende agrina, una variante de la misma o un fragmento que comprende el - o el - sitio de escision de la agrina, en una solucion amortiguadora acuosa y la cantidad de escision de la agrina es media. Adicionalmente, la invencion se relaciona con inhibidores de neurotripsina encontrados por este metodo, en particular con compuestos de formula (1) donde Hal1 y Hal2 son fluor, cloro o bromo, y el uso de esos inhibidores para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades causadas por deficiencia de sinapsis, por ejemplo, atrofia de musculo esqueletico, esquizofrenia y perturbacion cognitiva.

Description

INHIBIDORES DE NEUROTRIPSINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un método para determinar si un compuesto es un inhibidor de neurotripsina, con inhibidores particulares de neurotripsina, con el uso de esos inhibidores para el tratamiento y/o profilaxis de atrofia de músculo esquelético y esquizofrenia y el uso como mejoradores cognitivos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las serinas proteasas pertenecen al grupo de enzimas proteolíticas que tienen un mecanismo catalítico en común estudiado intensivamente. Las serinas proteasas se encuentran en virus, bacterias y eucariotes. Ellas incluyen exopeptidasas, endopeptidasas y oligopeptidasas . Existen similitudes en el mecanismo de reacción de varias de las peptidasas con diferentes orígenes evolutivos. La orientación geométrica de los residuos catalíticos es muy similar, a pesar del hecho de que en otras circunstancias los pliegues de proteína son muy diferentes. Una triada catalítica de residuos de serina, histidina y aspartato en el sitio activo es responsable de la escisión hidrolítica eficiente del enlace peptídico. Los ejemplos de serina proteasas incluyen a la trombina, factor Xlla, factor IXa, factor Xa, plasmita, tPA, tripsina, quimiotripsina y proteínas adicionales como la urocinasa, triptasa, elastasa, calicreina, complemento C, proteasa A, serina carboxipeptidasa II. Ellas implican una variedad de procesos importantes como por ejemplo, coagulación sanguínea y digestión de alimentos. Se ha demostrado que los inhibidores de serina proteasa inhiben procesos celulares, como la adhesión, migración, producción de radicales libres y apoptosis. Los inhibidores de serina proteasa administrados intravenosamente proporcionan un efector protector contra el daño tisular. Los inhibidores de molécula pequeña han mostrado tener un alto potencial en el tratamiento de diferentes enfermedades relacionadas con la hematología, oncología, asma, inflamación, neurología, medicina pulmonar e inmunología. Los inhibidores de serina proteasa apropiados pueden ser útiles en el tratamiento de disfunciones en el campo de enfermedades trombóticas, asma, cirrosis, artritis, carcinoma, melanoma, restenosis, ateroma, trauma, choque y daño por repercusión. La enzima investigada, la neurotripsina (WO 98/49322) pertenece a la familia de la quimiotripsina, cuyos miembros están casi en su totalidad confinados a animales. La secuencia de aminoácidos de la neurotripsina define una proteína mosaico de 875 aminoácidos que consiste de un dominio de Kringle, seguido por cuatro repeticiones ricas en cisterna del receptor depurador (tres en el ratón) , y el dominio de serina proteasa (Figuras 1, A y B) . La neurotripsina contiene, al igual que la trombina, tPA, tripsina y algunas otras enzimas, como un residuo de aspartato en el fondo de su cavidad Sl, mostrando por lo tanto especificidad por aminoácidos básicos en ese sitio de unión. La similitud estructural de la neurotripsina con las proteasas de la cascada de coagulación sanguínea y el sistema fibronilítico, como el factor X, factor IX, trombina, activador de plasminógeno tisular, y plasmita sugiere que puede ser un elemento de un mecanismo de señalización extracelular activado por proteasa en el sistema nervioso. (Gschwend, T.P., et al., Molec. Cell Neurosci. 9:2007-219, 1997; Proba, K., et al., biochim. Biophys. Acta 1396 : 143-147, 1998) . Como será aquí más adelante, la neurotripsina se localiza en la terminal del nervio presináptico de la sinapsis del sistema nervioso central (SNC) y la unión neuromuscular (NMJ) . La sinapsis es la conexión entre las células nerviosas (neuronas) donde los mensajes son comunicados en forma de sustancias químicas, llamadas neurotransmisores. La sinapsis está compuesta de una terminal presináptica formada por la célula que emite señales y la especialización postsináptica de la célula que recibe señales. Los neurotransmisores liberados y la terminal presináptica cruzan la hendidura sináptica y se unen a los receptores de neurotransmisor en la especialización postsináptica . Tras la unión del neurotransmisor el receptor induce a la generación de un impulso eléctrico en la célula postsináptica. La transmisión de señales entre dos neuronas es la base de la función neuronal. Las funciones del cerebro son el resultado del montaje específico de un enorme número de neuronas a redes de procesamiento de información. La mayoría de la sinapsis se encuentra en el sistema nervioso central (SNC, cerebro) , donde cada sinapsis conecta dos neuronas. Por esas conexiones punto a punto bilaterales, cada neurona puede conectarse a miles de otras neuronas. Sin embargo, la sinapsis también conecta una neurona a una glándula o una célula muscular. La unión neuromuscular (NMJ, placa final muscular) es la sinapsis que conecta una célula nerviosa con una célula de músculo estriado. La sinapsis es localizada fuera del cerebro, como el tallo cerebral y la médula espinal son llamadas sinapsis del sistema nervioso periférico (SNP) . La sinapsis del SNC y sinapsis del SNP exhiben muchas características estructurales y funciones comunes y comparten muchos de esos componentes moleculares (moléculas sinápticas) . Por lo tanto, las moléculas blanco sinápticas pueden ser útiles para dirigir funciones sinápticas de ambos del SNC y el SNP. La atrofia del músculo esquelético (sarcopenia) , definida como la pérdida de masa y fuerza muscular, juega un papel importante en la patogénesis de la debilidad y daño funcional que ocurre con la edad. Esta juega un papel principal en la pérdida de fuerza muscular, velocidad metabólica disminuida, reducción gradual de la densidad ósea y disminución de la capacidad aeróbica (Doherty, T.J., J. Appl. Physiol. 95; 1717-1727, 2003). La pérdida de masa muscular se manifiesta con una disminución en el área de sección transversal del músculo con la edad, que se ha determinado resulta del efecto combinado de una reducción tanto en el número de fibras musculares como en el espesor de las fibras restantes individuales. Durante años anteriores, ha habido un considerable progreso de identificación y caracterización de factores que contribuyen a la degradación de la masa muscular. Los genes importantes asociados con esos procesos codifican para ubiquitina proteína ligasas que se encontraron incrementadas en músculo atrófico. Entre los factores que tienen una actividad hipertrófica y, por lo tanto, bloquean la atrofia, se ha encontrado que el factor del crecimiento 1 similar a la insulina (IGF-1) juega un papel esencial. Estas y varias otras vías reguladoras que controlan la masa del músculo esquelético han sido investigadas intensamente (para una revisión véase: Glass, D. J., Nature Cell Biol. 5: 87-90, 2003) . A pesar del importante progreso tanto en la caracterización de los mecanismos moleculares que controlan la degradación muscular que conduce a la atrofia y los efectos hipertróficos en el factor de crecimiento similar a la insulina, y a pesar del hecho de que varias compañías trabajan en el desarrollo de fármacos capaces de estimular el incremento de la masa muscular, no han sido aprobados fármacos hasta ahora. La marca morfológica de la atrofia del músculo esquelético encontrada en viejos (sarcopenia) es una reducción considerable del número de fibras musculares. Amplia evidencia de numerosos estudios independientes sostienen que la entrada neuronal a una fracción de las fibras musculares se perturba con la edad, dando como resultado una atrofia subsecuente y eventualmente la desaparición de las fibras denervadas (Kamal, H.K., Nutrition Reviews 61:157-167, 2003). Otro rasgo característico del músculo esquelético encontrado en viejos es una coincidencia de la atrofia muscular con una reducción considerable del número de motoneuronas (Welle, S., Can. J. Appl. Physiol. 27:19-41, 2002) y la alteración estructural notable de la unión neuromuscular (Tapia, J. C. et al., Abstract Viewer/Itinerary Planner, Washington DC: Society for Neuroscience) . Esas características indican que un deterioro significativo relacionado con la edad de la estructura y la función de la unión neuromuscular es un factor contribuyente principal a un proceso que finalmente da como resultado una denervación estructural y funcional. Las fibras musculares denervadas que no reciben reinervación compensatoria dentro de semanas se vuelven progresivamente atróficas y eventualmente desaparecen. La esquizofrenia es una enfermedad cerebral crónica, severa y discapacitante. Aproximadamente el 1% de la población mundial desarrolla esquizofrenia durante su vida. Los individuos que desarrollan esquizofrenia experimentan sufrimiento severo. Aproximadamente el 10% cometen suicidio. Aunque la esquizofrenia afecta a hombres y mujeres con igual frecuencia, el trastorno con frecuencia aparece primero en el hombre, usualmente al final de la adolescencia o al principio de los veintes, que en mujeres, quienes generalmente son afectadas en los veintes hasta principios de los treintas. Las personas con esquizofrenia con frecuencia sufren de síntomas aterrorizantes como escuchar voces internas que no son escuchadas por otros, o creen que otras personas están leyendo sus mentes, controlando sus pensamientos, o planeando dañarlos. Esos síntomas pueden volverlos temerosos y retraídos. Su voz y comportamiento pueden desorganizarse de modo que puedan ser incomprensibles o aterradores a otros. Los tratamientos actualmente disponibles para la esquizofrenia reducen el sufrimiento considerablemente, pero aproximadamente 2/3 de las personas afectadas por esquizofrenia requieren ayuda pública dentro de unos cuantos años después de la aparición. La mayoría de ellos son incapaces de regresar a trabajar o a la escuela y tienen poca o ninguna interacción social, la mayoría de las personas con esquizofrenia continúan padeciendo los síntomas a través de sus vidas. Se ha estimado que no más de uno de cinco individuos se recupera completamente. La esquizofrenia por lo tanto es uno de los problemas de salud pública más importantes en todo el mundo, y los costos a la sociedad se contabilizan en billones de dólares. El descubrimiento neurológico más consistente en la actualidad en los cerebros de los pacientes esquizofrénicos es una reducción del número de sinapsis en la materia gris del sistema nervioso central, la cual se refleja por una disminución en el volumen de neuropilos (el área sináptica) . No se observó evidencia de degeneración neuronal. Típicamente, el número de neuronas contadas por área de tejido está más incrementado, una observación explicada por una disminución selectiva en el número de sinapsis en el área neurópila entre las neuronas, mientras que el número de células neuronales somáticas permanece constante. El fenómeno ha sido reportado durante las dos últimas décadas por varios estudios independientes sobre material post mortem y se ha encontrado más extendido en la corteza prefrontal. La literatura que documenta esta observación ha sido cuidadosamente revisada por Selemon, L. D. y Goldman-Rakic, P.S. (Psychiatry 45:17-25, 1999). McGlashan, T.H. y Hoffman, R.E. (Arch. Gen. Psychiatry 57:637-648, 2000) resumieron las observaciones morfológicas, desarrollísticas, electrofisiológicas y metabólicas esenciales en la esquizofrenia a la luz de la hipótesis de "podado sináptico excesivo" y llegaron a la conclusión de que el "podado sináptico excesivo" o "conexión sináptica reducida de manera desarrollítica" es un modelo patofisiológico cada vez más atractivo de la esquizofrenia. Sobre la base de este modelo, la esquizofrenia surge de conexiones sinápticas reducidas de manera crítica como resultado de perturbaciones en el desarrollo de la sinaptogénesis durante la gestación y niñez primaria y/o podado sináptico excesivo durante la adolescencia. El modelo contribuye a la fenomelogía del trastorno, los estados sintomáticos, la aparición, los déficit neurodesarrollísticos, la ventana de deterioro, diferencias de sexo en la presentación clínica, curso determinado por la edad y aparición, y preservación del genotipo de la esquizofrenia y la población a pesar de la fecundidad fenotípica disminuida. Los mejoradores cognitivos son fármacos dirigidos a la prevención, mejora o tratamiento de déficit cognitivo tanto a nivel clínico como subclínico. Esos fármacos son benéficos para el tratamiento de dificultades de memoria de ancianos que no han progresado hacia la enfermedad de Alzheimer (daño cognitivo moderado) . Sin embargo, esos fármacos también son benéficos para la mejora de funciones cognitivas en pacientes con diagnostico establecido de enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades asociadas con demencia o para la mejora de las funciones cognitivas en la disfunción cognitiva postraumática, así como para la mejora del daño relacionado con la edad de las funciones cognitivas que son consideradas como un rasgo normal del proceso de envejecimiento. El daño cognitivo moderado es un concepto ampliamente citado en la investigación clínica sobre los trastornos cognitivos relacionados con la edad (Ritchie, K. y Touchon, J., The Lancet 355:225-228, 2000). Si se refiere generalmente a complicaciones subclínicas del funcionamiento de la memoria en ancianos, los cuales se juzgan tienen una alta probabilidad de evolucionar hacia la enfermedad de Alzheimer. La identificación de personas en riesgo potencial de demencia con vista a intervención terapéutica temprana es importante, debido a que puede disminuir la tensón tanto para el paciente como para la familia, minimizar el riesgo de accidentes, prolongar la autonomía, y quizá finalmente aún prevenir la aparición del proceso que conduce a la demencia en sí. El daño de las funciones cognitivas sin demencia es común entre los ancianos que es considerado por muchos como una característica inevitable del proceso de envejecimiento. No obstante, ha adquirido significado clínico debido a las dificultades que pueden tener los pacientes para llevar a cabo sus actividades diarias. Aunque la gama de daños observados en poblaciones sin demencia es extremadamente amplia, han sido propuestas varias marcas clínicas para describir esta saga del intervalo cognitivo normal. Una de las primeras fue el olvido senil. Estas características clínicas incluyen la incapacidad de recordar detalles menores, olvidar eventos remotos en oposición a los recientes, y problemas de conciencia de memoria. El término declinación cognitiva asociada con el envejecimiento se refiere a una amplia gama de funciones cognitivas (atención, memoria, aprendizaje, pensamiento, lenguaje y función visioespacial) , y es diagnosticada con referencia a normas para ancianos. La prescripción de mejoradores cognitivos puede prolongar la capacidad de los individuos afectados para llevar a cabo sus actividades diarias, y de este modo, prolongar su autonomía'. Otros trastornos asociados al menos en parte de los individuos afectados con daños cognitivos que pueden eventualmente conducir a la demencia incluyen enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, apoplejía y trauma en cabeza. La prescripción de fármacos mejoradores cognitivos también puede mejorar las funciones cognítivas en esos pacientes.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un método para medir la actividad catalítica de la neurotripsina, caracterizado porque la neurotripsina, una variante de la misma o un fragmento que comprende el dominio de proteasa de neurotripsina y una proteína o péptido que comprende agrin , una variante de la misma o un fragmento que comprende el sitio de escisión a o ß, se incuban juntos en una solución amortiguadora acuosa y se mide la cantidad de escisión de agrina. Además, la invención se relaciona con un método para determinar si un compuesto es un inhibidor de neurotripsina, caracterizado porque el compuesto es incubado junto con neurotripsina como una variante de la misma o un fragmento que comprende el dominio de proteasa de la neurotripsina y con una proteína o péptido que comprende agrina, una variante de la misma o un fragmento que comprende el sitio de escisión a o ß de la agrina, en una solución amortiguadora acuosa, y se mide la cantidad de agrina escindida. Adicionalmente, la invención se relaciona con inhibidores de neurotripsina encontrados por este método, en particular con compuestos de fórmula Donde Hal1 y Hal2 son, independientemente entre sí, flúor, cloro o bromo; y sales de adición farmacéuticamente aceptables de los mismos. La invención se relaciona además con el uso de esos inhibidores como medicamentos, en particular para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades causadas por deficiencia de sinapsis, por ejemplo atrofia de músculo esquelético, esquizofrenia y perturbación cognitiva, y con el uso de esos inhibidores para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de la atrofia de músculo esquelético, esquizofrenia, y perturbación cognitiva.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Estructura del dominio de neurotripsina (A): hNt: neurotripsina humana (B) : mNt : neurotripsina de ratón. La neurotripsina está compuesto de un dominio básico (PB) rico en prolina, un dominio de kringle (KR) , tres (mNt) o cuatro (hNt) dominios en cisteína receptores de depurador (SRCR1, SRCR2, SRCR3 y SRCR4), y un dominio de proteasa (PROT) .

Figura 2 : Escisión de la agrina mediada por neurotripsina: Análisis Western blot de la agrina de células HEK293 cotransfectadas con agrina y neurotripsina.

Las células HEK293T semiconfluentes fueron transfectadas transitoriamente con pcDNA3.1-neurotripsina o pcDNA3.1-agrina, o ambas. Las muestras fueron separadas por SDS-PAGE. La membrana fue incubada con un anticuerpo anti-agrina policlonal dirigido contra la porción C-terminal de la agrina, seguido por incubación con un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa. (Carril 1, Ag) Extractos de células con detergente que se transfectaron individualmente con agrina. (Carril 2, Ag + hNt) Extracto de células con detergente que se transfectaron dos veces con agrina y neurotripsina. Nótese que la agrina se redujo fuertemente. (Carril 3, Ag + hNt) Medio de cultivo de células que se transfectaron dobles con agrina y neurotripsina. Se detectó una banda de 100 kDa con el anticuerpo anti-agrina dirigido contra la porción C-terminal de la agrina. (Carril 4, Ag) Medio de cultivo de células que se transfectaron una sola vez con agrina. La producción de neurotripsina bajo todas las condiciones fue conformada después de resondear la mancha con anticuerpos anti-neurotripsina . El análisis del medio de cultivo reveló que la inmunorreactividad de la agrina se perdió del extracto celular de las células transfectadas dos veces que habían sido liberadas hacia el medio sobrenadante. No se detectaron señales en el medio sobrenadante de células HEK293T transfectadas con agrina y neurotipsina catalíticamente inactiva.

Figura 3: El patrón temporal de escisión de agrina in vivo coincide con el patrón temporal de la expresión de neurotripsina. Los homogeneizados de médulas espinales de ratón de diferentes edades fueron sometidos a SDS-PAGINA y análisis Western blot, y entonces sondeada o probados para neurotripsina y el fragmento C-terminal 100-kDa del agrina, usando los anticuerpos específicos SZ 177 contra la neurotripsina y R132 contra el fragmento C-terminal 100-k-Da de la agrina. ß-actina fue sondeada o probada como control para cantidades iguales de homogeneizado tisular en las diferentes muestras.

Figura 4 : La sobreexpresión transgénica de la neurotripsina en motoneuronas da como resultado un incremento en la escisión de agrina. Se sondearon y probaron manchas Western blot, de extractos de médula espinal con anticuerpos contra neurotripsina humana (hNt) y de ratón (mNt) así como con anticuerpos contra el fragmento C-terminal 100-k-Da de la agrina. Los resultados demuestran un incremento en la ocurrencia del fragmento C-terminal de 100-k-Da de la agrina de los ratones que sobreexpresan neurotripsina.

Figura 5 : La neurotripsina remueve la agrina de la unión neuromuscular (NMJ) . NMJ del diafragma de ratón inmunoteñidos para agrina y postnatal los días 0(P0), 4(P4) y 8(P8). En ratones transgénicos que expresan neurotripsina en motoneuronas, la agrina desaparece de la NMJ dentro de horas a días después de la aparición de la sobreexpresión. P4 : Estado de transición. Pérdida parcial de la agrina de NMJ. Las flechas apuntan hacia NMJ individuales bien formadas. Los asteriscos indican las NMJ parcialmente dispersas. P8 : pérdida casi completa de agrina de las NMJ. Las flechas apuntan a NMJ individuales bien formadas. Los asteriscos indican NMJ parcialmente dispersas.

Figura 6: La remoción de agrina dependiente de la neurotripsina de las NMJ es acompañada por dispersión del aparato postsináptico. Las NMJ del diafragma de los mismos ratones que en la Figura 7 teñidas para receptores de acetilcolina a-bungarotoxina (a-Btx) macada de manera fluorescente. Los receptores de acetilcolina desaparecen dentro de horas a días después de la aparición de la sobreexpresión, P : estado de transición. Pérdida parcial de NMJ. Las flechas apuntan a NMJ individuales bien formadas. Los asteriscos indican NMJ parcialmente dispersas. P8 : pérdida casi completa de NMJ. Las flechas apuntan a NMJ individuales bien formadas. Los asteriscos NMJ parcialmente dispersas.

Figura 7 : La fragmentación de NMJ en el músculo soleo de ratones que sobreexpresan Nt. (A-C) al tinción de a-Bungarotoxina (a-Btx) de NMJ de ratones naturales se muestra una estructura típica similar a la de un Pretzel. (D-F) la tinción con a-Btx de NMJ de ratones que sobreexpresan Nt muestran una fragmentación pronunciada del aparato postsináptico. (G-I) las NMJ de ratones transgénicos que sobreexpresan una forma catalíticamente inactiva de Nt (Neurotripsina Ser711 Ala) no están alteradas.

Figura 8 : Sección transversales a través del músculo soleo de ratones naturales y que sobreexpresan neurotripsina. (A) ratón natural (B) ratón que sobreexpresa neurotripsina. Comparados con los ratones naturales, los músculos de ratones que sobreexpresan Nt contienen menos fibras musculares. Las flechas (A) y (B) apuntan hacia una sola fibra muscular.

Figura 9: Cuantificación del número de sinopsis por volumen de tejido en el neuropilo del stra tum radia tum de la región CAÍ del hipocampo. En todos los animales de experimentación, el número de sinapsis por volumen de tejido puede ver terminado cortes por microscopía electrónica tomados del mismo lugar en el stra tum radia tum de la región CAÍ del hipocampo. Wt : natural; CMV-Cre: línea transgénica que expresa la recombinasa Cre bajo el control del promotor de CMV; 491(inact. Nt) : línea transgénica 491, que porta el transgen inactivo, que contiene un segmento sin sentido transcripcional; 494(inact. Nt) : línea transgénica 494, que porta el transgen inactivo, que contiene un segmento sin sentido transcripcional; DTG (Nt491/cre) : ratón transgénico doble derivado de la línea 491, en la cual el transgen de neurotripsina inactivo ha sido activado cruzando en la recombinasa Cre; DTG (Nt494/cre) : ratón transgénico doble derivado de la línea 494, en la cual el frangen de neurotripsina inactivo ha sido activado cruzando en la recombinasa Cre; **,p<0.01.

Figura 10: Columnas sobre las ramificaciones dendríticas secundarias de neuronas piramidales CAÍ. Las columnas sobre las ramificaciones dendrítricas secundarias de neuronas piramidales CAÍ de ratones naturales (A y B) y ratones transgénicos dobles que sobreexpresan neurotripsina (C y D) . Las células piramidales CAÍ fueron llenadas iontoforéticamente con bioctina durante estudios electrofisiológicos in vi tro y visualizadas usando la histoquímica de avidina-biotina-peroxidasa. Las dendritas de los ratones naturales tienen muchas columnas largas, bien desarrolladas (flechas grandes) ; además, también se encontraron muchas columnas de forma de cepillo, cortas (cabezas de flecha pequeñas) . Las dendritas de ratones que sobreexpresan neurotripsina (de la misma camada) están dominadas por columnas de forma de cepillo cortas (cabezas de flecha pequeñas) ; las columnas largas, bien desarrolladas (flechas grandes) son muy raras. La densidad de columna total (el número de columnas por unidad de longitud de dendritas) es notablemente menor en los ratones que sobreexpresan neurotripsina (C y D) .

Figura 11: Neurotripsina humana de longitud completa purificada. La SDS-PAGE seguida por tensión con plata (A) y análisis Western blotting (B) mostraron una sola banda de la neurotripsina humana de longitud completa (indicada por las flechas) migrando a una posición correspondiente a aproximadamente 75 kDA bajo condiciones no reductores. La inmunodetección (B) efectuada usando anticuerpo anti-neurotripsina . Las masas moleculares de los estándares (kDa) son indicadas en los márgenes de la izquierda.

Figura 12: Agrina-EGFP purificada. Agrina-EFGP modificada purificada, (indicada por las flechas) mostrada sobre gel de SDS teñido con plata (A) y sobre una mancha Western blot, detectada por anticuerpo dirigido contra la mitad C-terminal de la agrina (B) . Las masas moleculares de los estándares (kDa) se indican en los márgenes de la izquierda. Nótese que EGFP se usó únicamente como para ocupar un lugar en este plásmido recombinante que había sido modificado para que contenga únicamente el sitio de escisión a, pero no el sitio de escisión ß.

Figura 13: Fragmento de agrina-C45 purificado. (A) Gel de SDS-PAGE teñido con plata que muestra el fragmento de agrina-C45 purificado (indicado por las flechas) que migra por debajo de 50 kilodaltons. Los números indican los pesos moleculares del estándar de proteína más preciso (BIORAD) . (B) Análisis Western blot que detecta el fragmento de agrina-C45 purificado (indicado por las flechas) usando Strep Tactin para detectar la marca de strep tag C-terminal. Los números indican los pesos moleculares del estándar de proteína más preciso (BIORAD) .

Figura 14: Ensayo para la actividad de neurotripsina usando agrina-EGFP como sustrato. Para probar la actividad de la neurotripsina purificada sobre el sitio de escisión a, el sustrato que contiene únicamente el sitio de escisión ß (agrina-EGFP) fue incubado solo (-) y junto con neurotripsina (+) , y sometido a SDS-PAGE, seguido por análisis Western blotting usando un anticuerpo contra el fragmento de escisión C-terminal de la agrina (véase el Ejemplo 22). El carril 1 muestra la agrina-EGFP (indicada por la flecha marcada como Ag-EGFP) sin tratamiento con neurotripsina como control. El carril 2 muestra la agrina-EGFP (indicada por la flecha marcada como Ag-EGPF) y el fragmento C-terminal de aproximadamente 150 kDa generado por la actividad de la neurotripsina (indicada por la flecha marcada como Ag-CF) . Marcador de peso molecular en kDa (kilo dalton) .

Figura 15: Ensayo de la actividad de neurotripsina usando agrina C-45 como sustrato. Para probar la actividad de la neurotripsina purificada sobre el sitio de escisión ß de agrina, el sustrato que contiene únicamente el sitio de escisión ß (agrina-C45) fue incubado solo (-) y junto con neurotripsina (+) , y entonces sometido a SDS-PAGE. (A) Gel de SDS-PAGE teñido con plata que muestra 250 ng de agrina-C45 incubada en amortiguador de ensayo durante 3 horas sin neutropsina (-) y 250 ng de agrina C-45 incubada en amortiguador de ensayo durante 3 horas con la adición de neurotripsina ( + ) . Estándar de proteína de más precisión (BIORAD) mostrado a la izquierda, los números indican los pesos moleculares (kDa) . La agrina-C45 (indicada por la flecha) puede ser observada por debajo de 50 kDa. Los productos de escisión de agrina C45 se encontraron entre los 20 y 25 kDa (indicados por las flechas) . Ag-C45-NF: fragmento de escisión N-terminal de la agrina C-45; Ag-C45-CF: fragmento de escisión C-terminal de la agrina-C45. (B) Análisis Western blot de las mismas muestras que en (A) donde la agrina-C45 no escindida y el fragmento C-terminal escindido de la agrina-C45 se detectaron vía su marca con Strep C-terminal, usando Strep Tactin (IBA GMBH), Ag-C45-CF: fragmento de C-terminal de la agrina C-45 (indicada por la flecha) .

Figura 16: Ensayo de selección basado en análisis Western blot para inhibidores de neurotripsina con detección de anticuerpo de sustrato de agrina y el producto C-terminal.

La banda superior muestra la proteína agrina-EGFP (flecha marcada Ag-EGFP) con un peso molecular de entre 250 y 600 kDa usada como sustrato. La banda inferior muestra el fragmento C-terminal de la agrina-EGFP generada por la neurotripsina con una masa molecular de aproximadamente 150 kDa (flecha marcada como Ag-CF), la cual aparece con diferentes densidades, de acuerdo a la actividad inhibidora de las moléculas inhibidoras probadas No. 7, 47, 48, 49, 50 y 51. El histograma muestra las intensidades relativas (I) de la banda de 150 kDa (Ag-CF) generada por la escisión de agrina-EGFP mediada por neurotripsina, con el control positivo fijo al 100% y el control negativo fijo al 0%. Con trol negativo (-): únicamente agrina-EGFP sin neurotripsina. Control positivo (+) : agrina-EGFP con adición de neurotripsina. No. 7: N1-amidino-N4- (3, 5-dibromosaliciliden) -sulfanilamida No. 47: N1-amidinosulfanilamida de ácido 4-clorociclohex-4-en-l, 2-dicarboxílico No. 48: N1-amidino-N4 (4-dimetilaminobenciliden) -sulfanilamida No. 49: N1-amidino-N-benciliden-sulfanilamida No. 50: N^amidino-N4- (2, 4-diclorobenciliden) -sulfanilamida No. 51: N1-amidino-N4- (4-metoxibenciliden) -sulfanilamida Figura 17: Inhibición dependiente de la dosis de la actividad de la neurotripsina por el compuesto No. 7. (A) Detección por análisis Western blot del fragmento C-terminal de 150 kDa de la agrina (Ag-CF) generada por la escisión de agrina EGFP mediada por neurotripsina en dependencia de la concentración del compuesto No. 7, N1-amidino-N4- (3, 5-dibromosaliciliden) -sulfanilamida . Carril 1: Agrin-EGFP Carril 2: Agrina + neurotripsina de ratón Carril 3: Agrina + neurotripsina de ratón + 25 µM de compuesto No. 7. Carril 4: Agrina + neurotripsina de ratón + 37.5 µM de compuesto No. 7. Carril 5: Agrina + neurotripsina de ratón + 75 µM de compuesto No. 7. Carril 6: Agrina + neurotripsina de ratón + 75 µM de compuesto No. 7. Carril 7: Agrína + neurotripsina de ratón + 100 µM de compuesto No. 7. (B) Gráfica de los datos de intensidad (A) contra la concentración de inhibidor con una intensidad 1=100% para la agrina + neurotripsina de ratón sin adición de compuesto inhibidor No. 7.

Figuras 18-24: Pruebas específicas del compuesto No. 7 (N1-amidino-N4- (3, 5-dibromo-saliciliden) -sulfanilamida) : Sin inhibición de las proteasas probadas Xa, tripsina, tPA, trombina, urocinasa, calicreína y plasmita. Las gráficas muestran las velocidades de reacción iniciales (V ini) de las proteasas probas Xa (Figura 18), tripsina (Figura 19), tPA (Figura 20), trombina (Figura 21), urocinasa (Figura 22), calicreína (Figura 23), y plasmita (Figura 24) graficadas contra las concentraciones de sustrato (µm) en ausencia de (cuadros abiertos) y en presencia (triángulos abiertos) del compuesto No. 7. Como control positivo para la inhibición competitiva en las mediciones para tPA (Figura 20) y urocinasa (Figura 22) benzamidina (BA) y en los ensayos pora Xa (Figura 18) y plasmina (Figura 24) se agregaron para-aminobenzamidina (pABA) a las concentraciones indicadas (diamantes abiertos).

Descripción detallada de la invención La invención se basa en el hecho de que la inhibición de la neurotripsina permite mejorar las actividades prosinápticas (formación de sinapsis, diferenciación de sinapsis, organización de sinapsis, protección de sinapsis, reforzamiento de sinapsis). El gen de la neurotripsina es expresado en muchas neuronas del sistema nervioso central (Gschwend, T.P., et al., Molec. Cell Neurosci. 9:207-219, 1997; Wolfer, D.P. et al., Molec. Cell.

Neurosci. 18 :407-433, 2001), incluyendo las motoneuronas de la médula espinal (Ejemplo 1), y en la proteína neurotripsina se encuentra en muchas sinapsis del CNS (Molinari, F. et al., Science 298:1779-1781, 2002) así como en la unión neuromuscular. La neurotripsina juega un papel sustancial en el desarrollo y/o mantenimiento de una función sináptica bien equilibrada. Demasiada neurotripsina (sobreexpresión) se correlaciona con muy pocas conexiones sinápticas. Los ratones transgénicos que sobreexpresan neurotripsina en neuronas del CNS muestran número reducido de sinapsis en la corteza cerebral y el hipocampo, dos estructuras del cerebro que son altamente importantes para las funciones cognitivas, como la memoria y el aprendizaje. De igual modo, los ratones transgénicos que sobreexpresan neurotripsina en las motoneuronas espinales muestran una reducción en las uniones neuromusculares (NMJ) , las sinapsis que median el control neuronal de la actividad muscular. Las alteraciones en las uniones neuromusculares del diafragma de ratones transgénicos que sobreexpresan neurotripsina en motoneuronas se asemejan a aquéllas resultantes de la inactivación dirigida del gen de la agrina. La proteoglican agrina es un agente prosináptico (formador de sinapsis, diferenciador de sinapsis, organizador de sinapsis, protector de sinapsis, reforzador de sinapsis) bien caracterizado (Sanes, J. R. and Lichtman, J. , Nature Rev.

Neurosci. 2:791-805, 2001). Esta tiene una masa de proteína central de aproximadamente 220 kDa. La agrina existe en varios isoformos. Esos codifican para proteínas de la matriz extracelular secretadas y proteínas transmembranales tipo II que contienen un segmento citoplásmico N-terminal muy corto. La región de la agrina que contiene la actividad prosináptica se localiza en la porción C-terminal de la agrina, específicamente en el 3er dominio de laminina G (Bezakova, G. and Ruegg, M.A., Nature Rev. Molec. Cell Biol. 4:295-308, 2003). La agrina es un sustrato la neurotripsina (Ejemplo 2). La neurotripsina escinde a la agrina en dos sitios (Ejemplo 25) . Un sitio (llamado sitio a ) se localiza entre la arginina 995 (R995) y la alanina 996 (A996) . El otro sitio (llamado sitio ß) se localiza entre la lisina 1754 (K1754) y la serina 1755 (S1755) . El número del aminoácido se refiere a la agrina anclada a la membrana (variante de empalme A4B0) de la rata (NP_786930) . Sin embargo, tanto el sitio de escisión a como el sitio de escisión ß están bien conservados en la agrina de mamífero, incluyendo la agrina humana. La escisión de la agrina por la neurotripsina genera un fragmento de aproximadamente 100 kDa (kilo Dalton) que va de la A996 hasta la K1754 y un fragmento de aproximadamente 22 kDa que va de la S1755 hasta el C-terminal. La escisión de ambos sitios a y ß separa la actividad organizadora de sinapsis de la agrina de la porción N-terminal de la agrina. La escisión de la agrina también ocurre in vivo . En ratones naturales a silvestres, se encontró que el fragmento de 100 kda de la agrina ocurre de manera más abundante durante las primeras semanas posnatales, tiempo cuando la expresión desarrollística de la neurotripsina está en su pico (Ejemplo 3) . La abundancia del fragmento de 100 kDa de la agrina se incrementa notablemente en ratones transgénicos que sobreexpresan neurotripsina en las motoneuronas (Ejemplos 4 y 5) . La agrina es un sustrato natural de la neurotripsina tanto en los NMJ (Ejemplo 6) como en el CNS (Ejemplo 14). Al escindir la agrina, la neuroptripsina contrarresta la actividad prosinóptica de la agrina. El exceso de neurotripsina en la unión neuromuscular de ratones transgénicos controla la desaparición de las uniones neuromusculares preestablecidas dentro de menos de 3 días (Ejemplos 4, 5, 6 y 7). Esas observaciones califican a la neurotripsina como un agente desestabilizador de sinapsis o antisináptico. La coexistencia de agentes pro y antisinápticos apoya el concepto de que el circuito neuronal del sistema nervioso es un sistema dinámico más que de conexiones fijas. Un apareamiento equilibrado entre los factores prosinápticos y antisinápticos da como resultado la homeostasis. Los cambios adaptables que se requieren, por ejemplo, cuando se necesite cambiar la conexión sináptica para satisfacer necesidades alteradas, desvía el equilibrio entre las fuerzas prosinápticas y antisinápticas de manera controlada. Esta sutil interconexión fuertemente controlada entre las fuerzas pro y antisinápticas es vulnerable a la desregulación dando como resultado una homeostasis sináptica inapropiada o adaptación inapropiada de los requerimientos funcionales. Una enfermedad sináptica puede resultar cuando el grado de desregulación exceda un valor umbral. La afinación farmacéutica de la actividad de la neurotripsina proporciona un acceso sin precedente a la maquinaria reguladora de la función sináptica. La inhibición de la actividad proteolítica de la neurotripsina desviará el equilibrio sináptico hacia el reforzamiento de las actividades prosinápticas a expensas de las actividades antisinápticas y de este modo hacia el incremento del número y/o el tamaño y/o la fuerza de la sinapsis. Experimentos con ratones transgénicos que sobreexpresan neurotripsina en motoneuronas espinales muestran una correlación entre la atrofia del músculo esquelético (Ejemplos 8 y 10) y deterioro de las conexiones sinápticas (Ejemplo 9) . Los inhibidores de neurotripsina contraequilibrarán el resultado del exceso de neurotripsina y permitirán el tratamiento y/o profilaxis de la atrofia de músculo esquelético causada por la pérdida de conexiones sinápticas, por ejemplo atrofia del músculo esquelético en pacientes ancianos. En líneas de ratón transgénico que sobreexpresan neurotripsina en motoneuronas, se observó una extraña atrofia de músculos esqueléticos que se debe principalmente a una reducción notable en el número de fibras musculares (Ejemplo 10). Una evaluación cuantitativa del efecto de la producción excesiva de neurotripsina por motoneuronas se da en la Tabla 1. Los niveles excesivos de neurotripsina producida por motoneuronas da como resultado una reducción en el número de fibras musculares de músculo soleo en ratones adultos que va del 18 al 48% dependiendo del nivel de sobreexpresión de neurotripsina. Debido a que la sobreexpresión de neurotripsina se restringió a las motoneuronas (para detalles experimentales véase el Ejemplo 4), esos resultados indican que la neurotripsina expresada por motoneuronas actúa localmente vía la unión neuromuscular sobre la fibra muscular blanco. Este efecto de atrofia local depende estrictamente de la actividad proteolítica de la neurotripsina, puesto que los músculos de ratones que sobreexpresan una forma catalíticamente inactiva de la neurotripsina exhiben números anormales de fibra. Los ratones que sobreexpresan neurotripsina en motoneuronas exhiben una fragmentación significativamente mayor sobre las uniones neuromusculares (Ejemplo 9) . La fragmentación combinada con una disminución en el número de fibras es un rasgo característico observado en músculos esqueléticos de humanos y animales viejos. Como se mencionó anteriormente, el deterioro de la unión neuromuscular y la pérdida de fibras musculares no son producidos por la sobreexpresión de neurotripsina catalíticamente inactiva. Esto caracteriza a la neurotripsina derivada de motoneuronas como un factor que reduce la inervación de fibras musculares y finalmente causa su pérdida. Se tiene la hipótesis de que agentes con una actividad inhibidora de inervación juegan un papel durante la etapa de la eliminación de la sinapsis desarrollística, tanto en la unión neuromuscular como en el sistema nervioso central. Es posible que una actividad reductora de sinapsis persista a través de la vida adulta y juegue un papel en el mantenimiento de un equilibrio entre los elementos presinápticos y postsinápticos . El patrón temporal de la expresión de neurotripsina apoya esta posibilidad, puesto que alcanza un pico durante el periodo de la eliminación de la sinapsis desarrollística (primeras dos semanas postnatales en ratones y ratas) y posteriormente permanece expresada a un nivel menor durante la vida adulta. La sobreexpresión de neurotripsina en motoneuronas de ratones transgénicos da como resultado una degradación de la unión muscular (Ejemplo 7). El análisis sistemático del papel de la neurotripsina para el mantenimiento de la unión neuromuscular en diferentes tipos de músculos, incluyendo el diafragma y el músculo soleo, revela que la sobreexpresión de neurotripsina en motoneuronas reduce el tamaño en la unión muscular. La fuerte sobreexpresión de neurotripsina en motoneuronas da como resultado una dispersión completa de las uniones neuromusculares previamente establecidas. Como consecuencia del efecto degradante de la sinapsis de la neurotripsina, los nervios motores se quedan sin una especialización postsináptica y/o con una especialización prosináptica reducida estructural y funcionalmente, comenzando a crecer más allá del sitio de las NMJ previas. Esos nervios ahora creciendo sobre la superficie de la fibra muscular establecen pequeñas sinapsis ectópicas que parecen inmaduras tras la inspección por microscopía electrónica, como se concluye de la ausencia de pliegues secundarias en la membrana postsináptica. La sobreexpresión de neurotripsina en motoneuronas de ratones transgénicos da como resultado la escisión de la proteoglino agrina (Ejemplo 5) . Como consecuencia, la porción C-terminal de la agrina desaparece de las NMJ (Ejemplo 6) . La región de agrina que contiene la actividad que conserva NMJ y promueve NMJ de la agrina se localiza en la porción C-terminal de la agrina, específicamente en el tercer dominio de laminina G (Bezakova, G., Nature Reviews Molecular C'ell Biology 4: 295-308, 2003). Por lo tanto, la remoción del dominio C-terminal de la agrina deja a las NMJ desprotegidas del llamado factor de dispersión, y las NMJ decaen y desaparecen dentro de días. La sobrerregulación de la neurotripsina en motoneuronas al momento cuando el promotor Thy-1 comienza a activar la expresión del transgen de la neurotripsina (2-5 días después del nacimiento) , da como resultado la desaparición de agrina de las NMJ dentro de un periodo de días (Ejemplo 6) . Inmediatamente después de la desaparición de la agrina, el receptor de acetilcolina presináptico desaparece también (Ejemplo 7). En resumen, esas observaciones indican una cadena de eventos que comienza con la sobrerregulación de la neurotripsina en las motoneuronas. La neurotripsina excesiva a su vez, escinde la agrina en las NMJ y remueve la porción C-terminal de la agrina de las NMJ. Debido a que la porción C-terminal contiene el sitio activo de la capacidad protectora de NMJ y promotora de NMJ, las NMJ quedan sin protección contra el factor de dispersión y a su vez se degrada. La observación de una reducción notable del número de fibras nerviosas en músculos esqueléticos de ratones que sobreexpresan neurotripsina selectivamente en motoneuronas indica que la neurotripsina está casualmente relacionada con el deterioro de la placa final dando como resultado la desnervación seguido por atrofia y finalmente la pérdida de fibras musculares desnervadas. Esas observaciones concuerdan con las observaciones hechas en uniones musculares y neuromusculares de humanos y animales con atrofia muscular esquelética dependiente de la edad. En una situación, donde ocurre pérdida de fibra muscular dependiente de la edad debido a la acción convergente de factores múltiples, la inhibición controlada y parcial sutil de la neurotripsina puede interrumpir el proceso de deterioro de la placa final, desnervación y pérdida de fibra muscular. Por lo tanto, se espera que la inhibición de la neurotripsina tenga un efecto benéfico sobre la desnervación de la fibra muscular dependiente de la edad, pérdida de fibra muscular y atrofia del músculo esquelético. La atrofia del músculo esquelético es acompañada por una pérdida sustancial de fuerza muscular y juega un papel principal en la patogénesis de la debilidad y daño funcional que ocurre con el envejecimiento progresivo. La debilidad de las extremidades inferiores ha sido implicada en un número de daños funcionales, como dificultades en levantarse de una silla o dejar la cama, baja velocidad al andar y otros movimientos, y dificultades para mantener el equilibrio, dando como resultado caídas y lesiones. La pérdida de fibra de músculo esquelético tiene un efecto negativo sobre la fuerza absoluta que un músculo puede desarrollar y la velocidad con la cual un músculo puede desarrollar fuerza. El incremento de la edad está asociado con una disminución progresiva de la velocidad metabólica, lo cual a su vez tiene consecuencias metabólicas sustanciales, incluyendo una tolerancia reducida contra el calor y el frío, así como un incremento en la propensidad desarrollar obesidad. Los músculos esqueléticos comprenden aproximadamente el 40% de la masa corporal libre de grasa y juegan un papel homeostático importante en el metabolismo del cuerpo. Por lo tanto, una reducción de la masa de músculo esquelético con el incremento de la edad es una contribución mayor a una velocidad metabólica disminuida. Prevenir la pérdida progresiva de fibra, la inhibición de la neurotripsina actúa contra esas consecuencias metabólicas y fisiológicas . La pérdida progresiva de masa de músculo esquelético y fuerza con la edad ha sido reconocida como una contribución mayor a la reducción gradual de la reducción ósea observada con el incremento de la edad. Por el contrario, es bien sabido que' las fuerzas ejercidas sobre los huesos por la actividad muscular estimulan la formación de hueso. De este modo, las fuerzas generadas por la contracción muscular son un determinante importante de la calidad ósea. La prevención de la pérdida de fibra muscular por la inhibición de la actividad de la neurotripsina periférica puede por lo tanto evitar o limitar los efectos adversos sobre la calidad del músculo esquelético y antagonizar indirectamente el progreso de la osteoporosis. También pueden esperarse efectos benéficos de la inhibición de la neurotripsina para atrofias de músculo esquelético que ocurran en numerosas situaciones clínicas en las cuales el debilitamiento es un problema acompañante, incluyendo el cáncer, SIDA y sepsis. La neurotripsina también tiene una función anti-sináptica en el sistema nervios central (SNC) el ARNm de la neurotripsina es expresado por neuronas de la materia gris del SNC (Gschwend, T.P., et al, Molec. Cell Neurosci. 9: 207-219, 1997) y la proteína neurotripsina es abundante en las regiones ricas en sinapsis en muchas áreas del cerebro. Particularmente altas de proteína neurotripsina se encuentran en regiones ricas en sinapsis de la corteza cerebral, el hipocampo, y las amígdalas. Sin embargo, otras regiones ricas en sinapsis también exhiben expresión abundante de neurotripsina. Una amplificación mayor de la proteína neurotripsina se encuentra en la membrana de la termina presináptica, en particular el área de la membrana que reviste la hendidura sináptica (Molinari, F. et al., Science 298: 1779-1781, 2002). La inmunotinción más intensiva de la neurotripsina se encuentra sobre las zonas activas sinápticas de la terminal presináptica. Ocasionalmente, la inmunorreactividad de la neurotripsina también es observada con vesículas de la terminal presináptica. Es digno de hacer notar, sin embargo, que la mayoría de las vesículas prosinápticas están desprovistas de inmunorreactividad de neurotripsina. Evidencia independiente para la localización sináptica de la neurotripsina es obtenida por un método bioquímico, es decir, por el análisis de sinaptosomas. La localización inmunocitoquímica de la neurotripsina en la membrana en la zona activa presináptica es idéntica en humanos y ratones. En resumen, los resultados indican que la neurotripsina se localiza en la terminal presináptica, en particular en la membrana presináptica que reviste a la hendidura sináptica en la zona activa presináptica. Por su localización en la sinapsis, en particular la zona activa presináptica, la neurotripsina se sitúa en una posición estratégica para controlar la estructura en función sináptica. El papel de neurotripsina como moduladora de la estructura y función sináptica, en particular su función como agente antisináptico en el SNC, es demostrado por experimentos con ratones transgénicos que sobreexpresan neurotripsina en las neuronas del SNC (Ejemplo 11) . Cantidades excesivas de neurotripsina producida por las neuronas de SNC producen una reducción significativa del número y tamaño de la sinapsis en el SNC. La evidencia de cambios estructurales se encuentra con métodos morfológicos y electrofisiológicos. El conteo de sinapsis en las regiones neuropílicas muestra una reducción en el número de sinapsis por área (Ejemplo 12) . La inspección de las columnas dendríticas a lo largo de las dendritas llenas de tinte muestra una reducción en el tamaño y número de columnas en ratones que sobreexpresan neurotripsina (Ejemplo 13) . Esos resultados concuerdan mutuamente, debido a los muchos extremos de sinapsis sobre las columnas dendríticas. Por lo tanto, menos sinapsis y menos columnas dendríticas representan dos lecturas del mismo fenómeno. Tomadas juntas, esas observaciones demuestran claramente la función antisináptica de la neurotripsina. También en el SNC, la neurotripsina media la escisión de agrina (Ejemplos 14 y 15) . La proteoglican agrina está presente tanto en la unión neuromuscular (Sanes, J.R. and Lichtman, J. , Nat. Rev. Neurosci. 2: 791-805, 2001) y como en la sinapsis del sistema nervioso central (Simita, M.A. and Hilgenberg, L.G., Neuroreport 13: 1485-1495, 2002, Kroger, S. and Schroder, J.E., News Physiol Sci. 17: 207-212, 2002) . En los homogeneizados de SNC de ratones naturales, se encontró que el fragmento de 100-k-Da de la agrina ocurre más abundantemente durante las primeras semanas postnatales, momento cuando la expresión desarrollística de la neurotripsina está en su pico (Ejemplo 14). La abundancia del fragmento de 100-k-Da de la agrina se incrementa notablemente en ratones transgénicos que sobreexpresan la neurotripsina en neuronas del SNC (Ejemplo 15) . En presencia de neurotripsina que ha sido inactivada por reemplazo de la serina del sitio activo por una alanina no ocurre escisión de la agrina. De este modo, la actividad proteolítica de la neurotripsina media claramente la escisión de la agrina y la generación del fragmento de 100-k-Da de la agrina en el SNC. La forma de la agrina usada en esos experimentos es la forma anclada a la membrana. Esta forma ligada N-terminalmente de la agrina se encuentra predominantemente en el sistema nervioso central y se ha reportado que controla la diferenciación en la sinapsis en el SNC (Bose, C.M. et al., J. Neurosci, 20: 9086-9095, 2000). En resumen, la neurotripsina tiene una función antisináptica no únicamente en las NMJ, sino también en el SNC. Demasiada neurotripsina (sobreexpresión) se correlaciona con unas cuantas conexiones sinápticas en la corteza cerebral y en el hipocampo, dos estructuras del cerebro que son altamente importantes para las funciones cognitivas, como la memoria y el aprendizaje. La proteoglican agrina organizadora de sinapsis es también un sustrato fisiológico de la neurotripsina en el SNC. Al escindir la agrina, la neurotripsina contrarresta la actividad prosináptica de la agrina. Actividades prosinápticas (por ejemplo Agrina) ?-»?-»??-»?-»-»->-»- -» «- <— <- <- «- «- — <— <— «- «- <<— «— <— Actividades antisinápt-icas (por ejemplo Neurotripsina) La coexistencia e interacción del agente prosináptico agrina y el agente antisináptico neurotripsina en el SNC apoya el concepto de que el circuito neuronal del circuito nervioso es dinámico más que un sistema de conexiones físicas. La homeostasis es mantenida por un apareamiento equilibrado entre los factores prosinápticos y antisinápticos. Cuando se requieren cambios adaptables, por ejemplo, cuando el circuito necesita cambiar a memorias de almacenamiento, el equilibrio entre las fuerzas prosinápticas y antisinápticas se desvía o cambia de manera controlada. Cuando es logrado el cambio en el circuito, se reestablece el equilibrio entre las fuerzas prosináptica y antisináptica. La interconexión sutil, fuertemente controlada entre las fuerzas pro y antisinápticas son vulnerables a la desregulación, dando como resultado una homeostasis sináptica inapropiada o adaptación inapropiada a los requerimientos funcionales. Una enfermedad sináptica puede resultar cuando el grado de desregular exceda un valor umbral. La afinación farmacéutica de la actividad de la neurotripsina proporciona un acceso sin precedentes a la máquina reguladora de la función sináptica. La inhibición de la actividad proteolítica de la neurotripsina da como resultado un periodo de vida más prolongado, y por lo tanto, un incremento en la concentración de la agrina. Debido a este enlace entre la neurotripsina y la agrina la actividad antisináptica, inducida por la inhibición de la neurotripsina, refuerza la actividad prosináptica de la agrina. Como consecuencia, el equilibrio ser desvía hacia la mejora de la actividad prosináptica dando como resultado un incremento del número, tamaño y fuerza de la sinapsis.

Actividad prosináptica mantenida o mejorada Actividad antisináptica reducida El concepto de afinación de la sinapsis al reducir al actividad antisináptica de la neurotripsina y, por lo tanto, mejorar las actividades prosinápticas a expensas de las actividades antisinápticas, ofrece una amplia gama de aplicaciones en la gama de las funciones cerebrales cognitivas perturbadas. En particular, la inhibición de la neurotripsina es benéfica y enfermedades y situaciones subclínicas donde la formación de sinapsis y el incremento del tamaño y la fuerza de las sinapsis existentes es necesaria.

La inhibición de la neurotripsina es útil en el tratamiento de la esquizofrenia. El exceso de neurotripsina en la sinapsis activa o dirige el corte sináptico, y de este modo, genera un fenotipo sináptico está de acuerdo con el fenotipo sináptico encontrado en el cerebro de pacientes con esquizofrenia. Esta observación experimental califica a la neurotripsina como uno de los factores que activan el corte sináptico. En una situación, donde ocurre corte sináptico excesivo debido a la acción convergente de factores que promueven cortes múltiples, la inhibición controlada es útil parcial de la neurotripsina disminuye el activamiento del corte sináptico. Esto permite una recuperación del "fenotipo sináptico esquizofrénico" y da como resultado el alivio de los síntomas esquizofrénicos. La reducción del número de sinapsis en el CNS de ratones que sobreexpresan neurotripsina indica que la inhibición de la neurotripsina da como resultado un menor grado de corte sináptico, y de este modo, incremento del número sináptico conectividad y comunicación neuronal mejorada. Los compuestos de acuerdo a la invención que inhiben la función enzimática de la neurotripsina son, por lo tanto, útiles para revertir las alteraciones sinápticas en la esquizofrenia y reestablecer la estructura y función sináptica normal, y, de este modo, detener o acortar los episodios esquizofrénicos y proteger contra nuevos episodios.

La inhibición de la neurotripsina también apoya la mejora cognitiva en el daño cognitivo moderado y otros estados clínicos y subclínicos con funciones cognitivas reducidas. Se ha encontrado que el daño cognitivo moderado, así como otros estados clínicos y subclínicos de las funciones cognitivas dañadas se asocian con evidencias de atrofia del tejido cerebral en varias áreas del CNS. La reducción del número de sinapsis en el CNS de ratones que sobreexpresan neurotripsina indica que la inhibición de la neurotripsina da como resultado un incremento en números sinápticos y mejor conductividad y comunicación neuronal. Los compuestos de acuerdo a la invención que inhiben la función enzimática de la neurotripsina son, por lo tanto, útiles para revertir las alteraciones sinápticas en todos los trastornos clínicos y subclínicos en los cuales está implicado un número reducido de sinapsis o una función reducida de la sinapsis, y en el reestablecimiento de la estructura y función sináptica normal. Por esto, la inhibición farmacéutica de la neurotripsina puede mejorar las funciones cognitivas en diferentes estados con funciones cognitivas reducidas de origen heterogéneo. Sobre la base de esos hechos, la invención se relaciona además con el uso de inhibidores de neurotripsina de fórmula (1) como se describió anteriormente y más adelante para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades causadas por deficiencia de sinapsis, por ejemplo, atrofia del músculo esquelético, esquizofrenia y perturbación cognitiva. La atrofia del músculo esquelético a ser tratada es en particular la llamada sarcopenia, es decir la atrofia del músculo esquelético debido a la edad, atrofia del músculo esquelético acompañada por osteoporosis y atrofia del músculo esquelético debido a debilitamiento muscular asociado con una enfermedad severa, como el cáncer, SIDA y sepsis, o también atrofia del músculo esquelético como consecuencia de la inmovilización y/o reposo en cama debido a una lesión severa o enfermedad severa. La esquizofrenia a ser tratada es un trastorno en todo el campo de la esquizofrenia como trastornos similares a la esquizofrenia, que comprenden a la esquizofrenia crónica, trastornos esquizoafectivos crónicos, trastornos no específicos, esquizofrenia aguda y crónica de varias sintomatologías, como por ejemplo esquizofrenia "kraepelínica", no remitente, severa, o el prototipo DSM-II-R de trastornos similares a la esquizofrenia, trastornos esquizofrénicos episódicos, trastornos desilusionados similares a la esquizofrenia, trastornos de personalidad similares a la esquizofrenia, como por ejemplo trastornos de personalidad similares a la esquizofrenia con sintomatología moderada, trastornos de personalidad esquizofrénicos, las formas latentes de trastornos esquizofrénicos o similares a la esquizofrenia, y trastornos psicóticos no orgánicos.

Además, los inhibidores de neurotripsina como se describe aquí pueden ser usados como mejoradotes cognitivos, para mejorar el desempeño del cerebro y para aliviar funciones de aprendizaje y memoria. Las deficiencias cognitivas a ser tratadas son daño cognitivo moderado, por ejemplo en una etapa inicial potencial de la enfermedad de Alzheimer, daño de la función cognitiva sin demencia en ancianos, y daño de las funciones cognitivas en pacientes con enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, apoplejía, y trauma de cabeza. De igual modo la invención se relaciona con el uso de esos inhibidores de fórmula (1) para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades causadas por deficiencia de sinapsis, por ejemplo, atrofia de músculo esquelético, esquizofrenia y perturbación cognitiva. Además, la invención se relaciona con el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades causadas por deficiencia de sinapsis, por ejemplo atrofia de músculo esquelético, esquizofrenia y perturbación cognitiva, el cual comprende administrar un compuesto de fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad efectiva contra la enfermedad, a un animal de sangre caliente que requiere ese tratamiento. Los compuestos de fórmula (1) pueden ser administrados como tal o especialmente en forma de composiciones farmacéuticas, profiláctica o terapéuticamente, preferiblemente una cantidad efectiva contra las enfermedades, a un animal de sangre caliente, por ejemplo un humano, que requiere ese tratamiento. En el caso de un individuo que tenga un peso corporal de aproximadamente 70 kg al dosis diaria administrada es de aproximadamente 0.05 g hasta aproximadamente 5 g, de manera preferible de aproximadamente 0.25 g hasta aproximadamente 1.5 g de un compuesto de la presente invención. La neurotripsina está compuesta de un dominio básico rico en prolina (PB) , un dominio de kringle (KR) , tres (neurotripsina de ratón, mNT) o cuatro (neurotripsina humana, hNT) dominios ricos en cisteína de receptor de depurador (SRCR1, SRCR2, SRCR3 y SRCR4) y un dominio de proteasa (PROT) (Figura 1) . El sitio de activación de zimógeno (ZA) representa un sitio de escisión en el N-terminal del dominio de proteasa de la neurotripsina. La escisión proteolítica en el sitio de ZA convierte la proteína neurotripsina de una forma catalíticamente inactiva a una catalíticamente activa. Mediante esta escisión, se generan un fragmento de aproximadamente 55 kDa, que comprende la región no catalítica, y un fragmento de aproximadamente 30 kDa, que comprende el dominio de proteasa en el caso de la neurotripsina de ratón. En el caso de la neurotripsina humana, los fragmentos generados tienen un peso molecular de 67 kDa y 30 kDa, respectivamente.

El análisis bioquímico de la neurotripsina humana y la búsqueda de inhibidores de neurotripsina requiere cantidades de proteína en el intervalo de miligramos a gramos. Han sido probados varios sistemas de expresión eucarióticos para la producción y secreción óptimas de neurotripsina, incluyendo la expresión estable en células de mieloma de ratón, expresión mediada por baculovirus en células de insecto, y expresión transgénica en células de riñon embriónico humano (HEK) , expresión transitoria en células de ovario de hámster chino (CHO) y expresión estable en Picchia pas toris . Esos sistemas tienen la ventaja de que pueden ser adaptados fácilmente a condiciones libres de suero para conducir la cantidad de proteínas contaminantes en el sobrenadante y para establecer una producción a gran escala. La expresión de la neurotripsina puede ser lograda en todos esos sistema de expresión. Sin embargo, la producción y secreción más eficiente de la neurotripsina se obtiene en células de mieloma, como se describe en los ejemplos 16 y 17. La expresión en células eucarióticas puede, de manera alternativa, ser lograda con una variedad de vectores de expresión eucarióticos (comercialmente disponibles o producidos en sí) . De igual modo, puede ser usada una variedad de líneas de células eucarióticas, incluyendo células HEK293T y HEK293-EBNA, células COS, células CHO, células HeLa, células H9, células de Jurkat, células NIH3T3, células C127, células CVl y células Sf. La producción de neurotripsina también puede basarse en líneas celulares de mamífero que exhiben expresión endógena de neurotripsina. La expresión de neurotripsina humana endógena ha sido observada a nivel de ARN en la línea de los mastocitos humanos HMC-1 (Poorafshar, M. and Hellman, L., Eur. J. Biochem. 261: 244-250, 1999). La línea células HMC-1 representa una fuente natural propiamente procesada, y por lo tanto, muy probable para la neurotripsina humana activa. Esas fibras pueden crecer en cultivo en suspensión y expresar constitutivamente neurotripsina humana. La proteína expresada de las células HMC-1 puede ser detectada como una banda de 97 kDa por anticuerpos policlonal específico dirigido contra el dominio de kringle en experimentos Wester blot. Para la purificación de la proteína estándar neurotripsina se aplicaron procedimientos de purificación (Ejemplo 18 y 19) . Preferiblemente, se usaron purificación por afinidad sobre una columna de heparina, entonces una columnas de interacción hidrofóbica y una columna de cromatografía de quelato de metal inmovilizado. La proteína eludía se purificó entonces adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico sobre una columna Mono S. Dependiendo de los requerimientos experimentales, también son útiles pasos cromatográficos adicionales o alternativos sobre columnas de intercambio iónico (DEAE o Mono Q) o filtración en gel para la purificación de la neurotripsina. La invención se relaciona con un método para medir la actividad catalítica de la neurotripsina, caracterizado porque la neurotripsina, una variante de la misma o un fragmento que comprende el dominio de proteasa de neurotripsina, y una proteína o péptido que comprende agrina, una variante de la misma o un fragmento que comprende el sitio de escisión a o el sitio de escisión ß de la agrina (Ejemplos 20 y 21) se incubaron juntos en una solución amortiguadora acuosa, y se midió la cantidad de escisión de la agrina (Ejemplo 24). Como se usa aquí, "una proteína o péptido que comprende agrina, una variante de la misma o un fragmento" significa una agrina de humano u otro mamífero o ave, una proteína de fusión de esa agrina con uno o más de dos o tres, péptidos o proteínas, en particular con una proteína marcada, por ejemplo con una proteína fluorescente verde (GFP) , con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) o también con un péptido marcador corto como 8x histidina, una variante de agrina donde uno o más, por ejemplo uno, dos, tres o cuatro, aminoácidos se suprimieron o reemplazaron con aminoácidos diferentes, una proteína de fusión como una variante de agrina como se definió aquí anteriormente, o un fragmento de agrina que comprenden al menos seis, al menos ocho aminoácidos de agrina, por ejemplo de entre 8 y 20 o entre 400 y 600 aminoácidos de agrina, como tales o fusionados a un péptido o proteína marcadora, y donde la variante de agrina o fragmento de agrina retiene el sitio de escisión a , el sitio de escisión ß o escinde ambos sitios, en particular donde el fragmento de agrina comprende la secuencia de consenso del sitio de escisión a y/o el sitio de escisión ß como se define aquí más adelante. Esa "proteína o péptido que comprende agrina o una variante de la misma o un fragmento" puede contener marcadores no peptídicos adicionales, por ejemplo para su detección espectroscópica, como se describió aquí anteriormente . En particular, el método para medir la actividad catalítica de la neurotripsina se relaciona con el uso de la neurotripsina humana de longitud completa de otro mamífero o ave o el dominio de proteasa de la neurotripsina, y la agrina de longitud completa o un fragmento de la misma, por ejemplo una variante modificada de la agrina unida a la membrana, por ejemplo la agrina-EGFP de la secuencia SEQ ID NO: 9, o por ejemplo el fragmento de agrina C-terminal, la agrina-C45 de la secuencia SEQ ID NO: 12. Las condiciones de reacción particularmente preferidas para medir la actividad catalítica de la neurotripsina son una solución amortiguadora entre pH 1 y pH 8 que comprende iones Ca2+, por ejemplo una solución amortiguadora de MOPS 10 mM, pH 7.5, o también Tris-HCl 50-100 mM, incluyendo NaCl 100-200 mM, CaCl2 1-20 mM, en particular CaCl2 2-5 mM, y opcionalmente hasta 0.5% de polietilen glicol, por ejemplo polietilen glicol 6000, la temperatura de reacción entre 20°C y 40°C, por ejemplo alrededor de 25°C, y un tiempo de reacción entre 1 y 48 horas, por ejemplo entre 2 y 16 horas, por ejemplo alrededor de 3 horas. La neurotripsina es usada a una concentración que da como resultado la escisión de aproximadamente el 80% del sustrato dentro de 3 horas. La concentración preferida de la neurotripsina es de 0.1 a 10 nM, por ejemplo de alrededor de 1 nM, y la agrina a una concentración de 10 veces a 5000 veces la concentración de neurotripsina, por ejemplo 1000 veces esa concentración. La longitud del sustrato derivado de agrina puede variar de la agrina de longitud completa a un péptido pequeño que incluya al menos uno de los sitios de escisión para la neurotripsina. La neurotripsina escinde a la agrina en dos sitios conservados evolutivamente distintos (Ejemplo 25) . La secuencia de aminoácidos de consenso que comprende el primer sitio de escisión (sitio de escisión a) es... P-P/A-I/V-E-R-A-S/T-C-Y... , donde la escisión ocurre entre los residuos R995 y A996. La secuencia de aminoácidos de consenso que comprende el segundo sitio de escisión (sitio de escisión ß ) es... G/A-L/I/T-I/V-E-K-S-V/A-G... , donde la escisión ocurre entre los residuos K1754 y S1755.

El ensayo mide la liberación de una proteína o fragmento de péptido de la proteína o péptido del sustrato. Si es usado un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos inmediatamente N-terminal del sitio de escisión a o ß en conjunto con un sustrato cromogénico o fluorogénico que esté ligado covalentemente al C-terminal del péptido, se mide el sustrato cromogénico o fluorogénico liberado. También pueden ser usados sustratos peptídicos cortos que abarquen sobre el sitio de escisión a o ß para medir la actividad proteolítica de la neurotripsina por el método de secuenciamiento de fluorescencia (Le Bonniec, B.F. et al., Biochemistry 35: 7114-7122, 1996). La detección de los productos de escisión de los sustratos de proteína que contienen los sitios de escisión a o ß se efectúa con anticuerpos específicos contra uno u otro de los fragmentos generados por la actividad proteolítica de la neurotripcina (ejemplos 22 y 23) o acoplando una marca fluorescente, cromogénica a uno u otro extremo de la agrina o fragmento de agrina. Para la detección de los productos de la escisión es aplicable cualquier método de detección de proteínas o péptidos y sus productos de escisión. Por ejemplo, la escisión de la agrina de longitud completa y fragmentos grandes de agrina (más grandes de aproximadamente 10 kDa) es detectada por SDS-PAGE seguida por análisis Western blot o visualización directa en el gel usando proteínas marcadas de manera fluorescente o de otro modo por la aparición de fragmentos más pequeños a expensas del sustrato inicial. Los fragmentos más pequeños de agrina (más pequeños de aproximadamente 10 kDa) pueden ser inmovilizados por su unión a una superficie de plástico o una perla, y la escisión visualizada por la solubilización de un fragmento que puede ser detectado por reconocimiento específico por un anticuerpo o por medio de un compuesto fluorescente o detectable de otro modo (Patel, D. et al., BioTechniques 31: 1194-1203, 2001) . Un sustrato derivado de agrina para estudiar la escisión de la agrina por la neurotripsina en el sitio de escisión es, por ejemplo, una agrina-EGFP modificada basada en la forma transmembranal de la agrina. Una forma soluble de esta molécula es generada por el reemplazo de la parte transmembranal por la secuencia peptídico señal de secreción de la calsintenina-1 y una marca de 8 x histidina. Esta proteína puede ser purificada de sobrenadantes de cultivo celular usando cromatografía de afinidad de metal. Para suprimir el sitio de escisión ß, el dominio LG3 y la espira que conecta al dominio EGF4 y el dominio LG3 que contiene el sitio ß son reemplazados por una EGFP u otro dominio de proteína conectado por enlazante corte (véase el Ejemplo 20). Las concentraciones de trabajo útiles para un ensayo de actividad de neurotripsina son de nanomolares bajas hasta micromolares, por ejemplo 1 nm hasta lOµm. Este sustrato de proteína y su producto de escisión pueden ser medidos usando ensayos Western blot, usando anticuerpos que detecten el producto de la escisión C-terminal de la agrina y sea generado en la escisión por el sitio de escisión a (Ejemplo 22) o en ensayos de ELISA, uniendo la proteína vía su marca de poli-histidina N-terminal y verificando la liberación del fragmento C-terminal vía anticuerpos apropiados (Ejemplo 22) o midiendo la fluorescencia liberada de la porción EGFP en un lector de placas. Otro sustrato derivado de la agrina para verificar la actividad proteolítica de la neurotripsina consiste de un fragmento de agrina C-terminal de aproximadamente 45 kDa que comprende el sitio de escisión ß de la agrina. Este consiste de los dominios LG2-EGF4 y LG3 de la agrina que contienen el sitio de escisión ß entre los dominios EGF4 y LG3. Para producir la proteína en forma secretada en cultivos celulares, el péptido señal de secreción de calsintenina-1 humana se fusiona N-terminalmente, seguido por una marca de 8 x histidina para facilitar la purificación y la unión a placas de Ni-NTA. Para la detección y purificación adicional puede agregarse un Streptag II C-terminal. Este sustrato (véase el Ejemplo 21) es adecuado para mediciones de actividad de neurotripsina de concentraciones nanomolares bajas a micromolares, por ejemplo de 1 nm a lOµ. La actividad de la neurotripsina puede ser verificada tiñendo el sustrato no escindido y los productos de escisión por tintes de proteína, como el azul de Coomassie o Sypro Ruby, o vía la detección por análisis Western blot del C-terminal del producto de la escisión usando StrepTactin (IBA, Gottingen) o un anticuerpo adecuado que detecte el domino LG3 (véase el Ejemplo 23) . Los constructos adicionales que contienen una marca de EGFP o SNAP-Tag (Covalys) marcados con tintes apropiados u otras proteínas que den señales pueden ser usados para ensayos de alto rendimiento en pruebas de placa que detecten la liberación de fluorescencia tras la escisión de neurotripsina, por unión de la parte de N-terminal del sustrato de proteína en la placa de Ni-NTA o perlas de Ni-NTA (véase por ejemplo: Patel, D., Bio Thechniques 31 :_1194-1203, 2001) . Los sustratos proteolíticos cromogénicos típicamente tienen péptidos naturales o artificiales compuestos de 3 a 5 aminoácidos naturales o artificiales. Ellos pueden ser protegidos N-terminalmente para reducir la degradación indeseable por aminopeptidasas. Sobre sus C-terminales, ellos son modificados de modo que sea liberado un grupo cromogénico o fluorogénico tras la escisión del enlace amida. La detección depende del tipo de grupo saliente y puede ir de la luz de la región UV a la visible. Otros producen una señal fluorescente. La mayoría de los grupos comúnmente usados son la p-nitroanilina (pNA) , la cual absorbe luz de longitud de onda de 405 nm (Nall, T.A. et al., J. Biol. Chem. 279: 48535-48542, 2004), y las 4-amino-4-metilcoumarina fluorogénica (AMC) con una longitud de onda de excitación de 342 nm y una longitud de onda de emisión de 440 nm (Niyomrattanakit, P. et al., J. Virol, 78: 13708-13716, 2004). Para la detección de la actividad de la neurotripsina puede ser usado un péptido corto IER-pNA a una concentración de 20-50 µm en amortiguador de ensayo (NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, 0.1% de PEG 6000, MOPS 20 mM, pH 7.5) de 25 a 37°C. Tras la escisión de la neurotripsina a una concentración de 1-5 mM, un incremento de la intensidad de la señal a 410 mM puede ser seguido en un espectofotómetro. Los sustratos de FRET son ampliamente usados en ensayos proteolíticos debido a que ofrecen un ensayo homogéneo y sensible fácilmente adaptado para la selección de alto rendimiento (HTS) . El método es particularmente útil para seleccionar bibliotecas de compuestos orgánicos para inhibidores competitivos de neurotripsina en un escenario de ensayo de alto rendimiento. En un ensayo FRET, el sustrato peptídico es sintetizado con dos fluoróforos, un donador fluorescente (ácido orto-aminobenzoico, "Abz") y un receptor de extinción (etilen-diamin-2, 4-dinitrofenilo, "ED-DNP"). La distancia entre esos dos grupos ha sido seleccionada de modo que tras la excitación con luz, la energía fluorescente del donador (Abz) sea extinguida significativamente por el receptor (ED-DNP) a través de un fenómeno mecánico cuántico conocido como transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), la cual ocurre sin la emisión de luz. Tras la escisión del péptido del sustrato por la proteasa, el fluorófero se separa del grupo de extinción, reestableciendo la fluorescencia total producida del donador. El incremento de la fluorescencia en un factor de 7-100 se relaciona linealmente con la velocidad de proteólisis (Le Bonniec, B.F. et al., Biochemistry 35: 7114-7122, 1996). Un sustrato de FRET basado en agrina útil para detectar la actividad de la neurotripsina es un nonapéptido con la secuencia de aminoácidos Abz-PERASCY-ED-DNP, que contiene el sitio de reconocimiento de neurotripsina de la agrina a (Jerini AG, Berlín Alemania) . El sitio de escisión putativo se localiza entre los aminoácidos cuatro (R) y cinco (A) del sustrato. Tras la escisión del péptido a una concentración de 1-40 µM por neurotripsina 1-10 nM en amortiguador de ensayo (NaCl 150 mM, CaCl2 5mM, 0.1% de PEG 6000, MOPS 20 mM, pH 7.5) de 25 a 37°C, la actividad puede ser detectada espectrofluorométricamente debido al incremento de la intensidad de la señal a una longitud de onda de excitación de 320 nm y una longitud de onda de emisión de 430 nm en un espectrofotómetro de fluorescencia. Otro sustrato de FRET se basa en dos proteínas fluorescentes, proteína fluorescente 100 (CFP) y proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) . Entre las dos proteínas un enlazante de 16 aminoácidos, que contiene la secuencia de reconocimiento de neurotripsina a (PIERASCY) y los 4 aminoácidos separadores, se introduce una secuencia de reconocimiento de la neurotripsina en dirección 5' y en dirección 3' secuencia enlazante: GAGSPIERASCYGSST) . De manera alternativa, también puede ser usada la secuencia de aminoácidos correspondiente que flanquea al sitio de escisión a. La escisión de la secuencia enlazante sensible por neurotripsina separa los dos fluoróforos y da como resultado la pérdida de transferencia de energía. La recolección de datos es efectuada en un amortiguador de ensayo (NaCl 150 mM, CaCl2 5mM, 0.1% de PEG 6000, MOPS 20 mM, pH 7.5) de 25 a 37°C, usando neurotripsina 1-10 nM y 0.1-1 µM de sustrato. De este modo, la hidrólisis del sustrato puede ser evaluada por la medición del incremento de la intensidad de fluorescencia del donador (Em. 485 nm) y simultáneamente la disminución de la fluorescencia del receptor (Em. 528 nm) después de la excitación 400-450 nm (Pollock, B.A. et al., Trenes in Cell Biol. 9: 57-60, 1999) . La invención se relaciona además con un método para determinar si un compuesto es un inhibidor de neurotripsina, caracterizado porque el compuesto es incubado junto con neurotripsina, en particular neurotripsina humana, una variante de la misma o un fragmento que comprende el dominio de proteasa y con una proteína o péptido que comprende agrina, una variante de la misma o un fragmento que comprende el sitio de escisión a o el sitio de escisión ß de la agrina, en una solución amortiguadora acuosa, y se mide la cantidad de escisión de la agrina. En particular, el método para determinar si un compuesto es un inhibidor de neurotripsina se relaciona con el uso de neurotripsina humana de longitud completa o el dominio de proteasa de la neurotripsina humana de longitud completa o el dominio de proteasa de la neurotripsina humana, y la agrina de longitud completa o un fragmento de la misma, por ejemplo, una variante modificada de la agrina unida a la membrana, por ejemplo, la agrina EGFP o la secuencia SEC ID NO: 9 o por ejemplo, el fragmento de agrina C-terminal, la agrina C-45, la secuencia SEC ID NO: 12. Los inhibidores de neurotripsina se encuentran usando el ensayo de la actividad proteolítica de la neurotripsina (Ejemplo 24) y probando el efecto reductor de la actividad de un compuesto candidato (Ejemplos 26 y 27). Para medir la actividad proteolítica de la neurotripsina, la neurotripsina purificada (Ejemplos 18 y 19}) y la agrina purificada, o un fragmento purificado de agrina que contiene al menos un sitio de escisión (Ejemplo 20 y 21), son incubados juntos con un compuesto a ser probado bajo condiciones apropiadas. Al final del periodo de incubación, los productos de la escisión que han sido generados por la actividad proteolítica de la neurotripsina son medidos. Mediante la comparación de la cantidad del producto de escisión generado en reacciones que contienen inhibidores de neurotripsina potenciales con una reacción control sin la adición de compuestos orgánicos se determinan los efectos inhibidores de los compuestos (Ejemplo 27) . La dependencia de la dosis de la actividad inhibidora de un compuesto encontrado como un inhibidor de la neurotripsina se determina como se describe en el Ejemplo 28. La especificidad de un compuesto encontrado como inhibidor de neurotripsina es investigado probando su actividad inhibidora sobre otras serinas proteasas como se describe en el Ejemplo 29. Las condiciones de reacción particularmente preferidas para determinar si un compuesto es un inhibidor de neurotripsina son una solución amortiguadora de aproximadamente pH 7 que comprende iones Ca2+, por ejemplo NaCl 100-200 mM, CaCl2 5-20 mM, MOPS 20 mM, pH 7.5 y opcionalmente hasta 0.5% de polietilen glicol, con una temperatura de reacción entre 20°C y 40°C, por ejemplo alrededor de 25°C, y un tiempo de reacción de entre 1 y 48 horas, por ejemplo 3 horas. La concentración preferida de la neurotripsina es de 0.1 a 10 mM, por ejemplo, alrededor de 1 nM, y agrina en una concentración de 10 veces a 5000 veces la concentración de la neurotripsina, por ejemplo 1000 esa concentración. El compuesto a ser probado es agregado en concentraciones crecientes, preferiblemente en concentraciones entre 0.001 y 500 µM. El DMSO puede ser agregado hasta 30% para mejorar la solubilidad de los compuestos a ser probados. La invención se relaciona además con métodos para detectar la actividad de la neurotripsina y el efecto inhibidor sobre la neurotripsina de compuestos orgánicos de molécula pequeña en sistemas de selección de alto rendimiento (HTS) de tal forma que la neurotripsina como una variante de la misma o un fragmento que comprende el dominio de proteasa de la neurotripsina y una proteína o péptido que comprenda agrina, una variante de la misma o un fragmento que comprenda la secuencia del sitio de escisión a o el sitio de escisión ß de la agrina, o cualquier otra proteína que comprenda una secuencia homologa a la secuencia del sitio de escisión a o ß de la agrina, se incuban juntas en una solución amortiguadora acuosa y la cantidad del producto de escisión se mida en proteasas adecuadas para la HTS. En particular, todos los métodos descritos anteriormente que se refieren a métodos para medir la actividad catalítica de la neurotripsina también podrían ser usados en ensayo multiplaca o manchas puntuales con métodos apropiados para una lectura de HTS. Los sustratos peptídicos pequeños que contienen el sitio de escisión a o el sitio de escisión ß con grupos salientes cromogénicos o fluorogénicos C-terminales pueden ser leídos fácilmente en un lector multiplaca midiendo el incremento de la fluorescencia o absorción de longitudes de onda apropiadas. Este método también puede ser aplicado a sustratos de proteína con marcas de afinidad N-terminales o C-terminales, por ejemplo una marca de polihistidina o marcas de Streptag II, y proteínas o dominios de proteína que den señales fusionados C-terminal o N-terminalmente, por ejemplo proteínas fluorescentes, o proteínas que puedan ser marcadas con cromóforos u fluoróforos, o aún enzimas que catalicen reacciones cromogénicas o fluorogénicas como la ß-galactosidasa u otras, fijando una parte de la proteína al sustrato del pozo y detectando la generación de fluorescencia o absorción o actividad enzimática en el sobrenadante del pozo a longitudes de onda apropiadas. La generación de los productos de escisión tras la actividad de la neurotripsina en un HTS también puede ser verificada en aplicaciones de ELISA detectando la cantidad de productos de escisión en el sobrenadante de pozos recubiertos con sustratos de proteína adecuados para la escisión de neurotripsina o la cantidad residual de sustrato no escindido con anticuerpos apropiados ligados a enzimas o grupos que den señales (Gutiérrez, O.A, et al., Anal. Biochem. 307: 18-24, 2002). La invención se relaciona además con otros ensayos sin placa adecuados para la detección similar de la HTS de productos de escisión de sustratos de péptidos pequeños o sustratos de proteína de cualquier tipo descrito con métodos como la CLAP (Betageri, R. et al., J. Biochem. Biophys. Methods 27: 191-197, 1993), FPLC, espectrometría de masas (Mathur, S. et al., J. Biomol. Screen. 8: 136-148, 2003), SELDI (Cyphergen) u otras aplicaciones relacionadas. Adicionalmente, la invención se relaciona con inhibidores de neurotripsina encontrados por este método, en particular con compuestos de fórmula Donde Hal1 y Hal2 son, independientemente entre sí, flúor, cloro o bromo; en particular bromo; y sales de adición farmacéuticamente aceptables de los mismos. Preferidos también son los compuestos donde Hal1 y Hal2 es bromo y el otro es cloro o flúor, y sales de adición farmacéuticamente aceptables de los mismos. Particularmente preferidas son las sales de adición farmacéuticamente aceptables de un compuesto de fórmula (1) donde Hal1 y Hal2 son bromo.

Esas sales farmacéuticamente aceptables se forman, por ejemplo, con ácidos orgánicos o inorgánicos. Los ácidos inorgánicos adecuados son, por ejemplo, ácidos halogenados, como el ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico. Los ácidos orgánicos adecuados son, por ejemplo, los ácidos carboxílicos, fosfónicos, sulfónicos, o sulfámicos, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido aceláico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, como el ácido glutámico o ácido aspártico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido ciclohexancarboxílico, ácido adamantancarboxílico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido cinámico, ácido metan o etansulfónico, ácido 2-hidroxietansulfónico, ácido etanl, 2-dísulfónico, ácido bencensulfónico, ácido 2-naftalen sulfónico, ácido 1,5-naftalen disulfónico, ácido 2-, 3- p 4-metilbencensulfónico, ácido metilsulfúrico, ácido etilsulfúrico, ácido dodecilsulfúrico, ácido N-ciclohexilsulfámico, ácido N-metilo, N-etil, o N-propil-sulfámico, u otros ácidos protónicos orgánicos, como el ácido ascórbico . Para propósitos de aislamiento o purificación también es posible usar sales farmacéuticamente no aceptables, por ejemplo picratos o percloratos. Para uso terapéutico, únicamente se emplean sales farmacéuticamente aceptables o compuestos libres (donde sea aplicable en forma de preparaciones farmacéuticas) y esas son por lo tanto preferidas . Los compuestos de fórmula (1) son preparados por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por condensación de una amina de fórmula (2) o un precursor de la misma, donde la función amidina está en forma protegida o presente como un grupo funcional fácilmente transformado en una función amidina, con un aldehido de fórmula (3), y el grupo de protección opcional es escindido después de la reacción de condensación o el grupo funcional es transformado en la función amidina.

En particular, la invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de fórmula (1) como se describió aquí anteriormente, y con el uso de compuestos de fórmula (1) como medicamentos. La presente invención se relaciona también con composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (1) como ingrediente activo y que pueden ser usados especialmente en el tratamiento de las enfermedades mencionadas. Las composiciones para administrar enteral, como la administración nasal, bucal, rectal o, especialmente oral, y para la administración parenteral, como la administración intravenosa, intramuscular o subcutánea, a animales de sangre caliente, especialmente humanos, son las preferidas. Las composiciones comprenden el ingrediente activo solo, o preferiblemente, junto con un soporte farmacéuticamente aceptable. La dosis del ingrediente activo depende de la enfermedad a ser tratada y de la especie, su edad, peso y condición individual, los datos farmacocinéticos individuales y el modo de administración. Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 95% de ingrediente activo, y son, por ejemplo, tabletas recubiertas o no recubiertas, ampolletas, frascos, supositorios o cápsulas; o ungüentos, cremas, pastas, espumas, pinturas, gotas, rocíos, dispersiones, etc. Los ejemplos son cápsulas que contienen de aproximadamente 0.05 g hasta aproximadamente 1.0 g de ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son preparadas en una forma conocida per se, por ejemplo, por medio de los procesos de mezclado, granulación, recubrimiento, disolución o liofilización convencionales . Se da preferencia al uso de soluciones del ingrediente activo, y también suspensiones o dispersiones, especialmente soluciones acuosas isotónicas, dispersiones o suspensiones las cuales, por ejemplo en el caso de las composiciones liofilizadas que comprenden el ingrediente activo solo o junto con un soporte, por ejemplo manitol, pueden ser reconstituidas antes de su uso. Las composiciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo preservativos, estabilizadores, agentes humectantes y/o emulsificantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o amortiguadores y se preparan en una forma conocida per se, por ejemplo por medio de los procesos de disolución y liofilización convencionales. Las soluciones o suspensiones pueden comprender agentes que incrementen la viscosidad, típicamente carboximetilcelulosa sódica, carboximetil celulosa, dextrano, polivinilpirrolidona o gelatinas, o también solubilizantes, por ejemplo Tween® (monooleato de polioxietilen (20) sorbitan) . Las suspensiones en aceite comprenden como un componente oleoso los aceites vegetales, sintéticos o semisintéticos comunes para propósitos de inyección. Los soportes adecuados son especialmente cargas, como azúcares, por ejemplo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos de calcio, por ejemplo fosfato tricálcico o fosfato ácido de calcio, y también aglutinantes, como almidones, por ejemplo almidón de maíz, trigo, arroz o papa, metilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona, y/o si se desea, desintegradotes, como los almidones mencionados anteriormente, también carboximetilalmidón, polivinilpirrolidona reticulada, ácido algínico y sales de los mismos, como el alginato de sodio. Los excipientes adicionales son especialmente acondicionadores de flujo y lubricantes, por ejemplo ácido silícico, talco, ácido esteárico o sales de los mismos, como el estearato de magnesio o calcio, y/o polietilenglicol o derivados de los mismos. Los núcleos de tabletas pueden ser provistos con recubrimientos adecuados, opcionalmente entéricos, conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas para administración oral también incluyen cápsulas duras que consisten de gelatina, y también cápsulas selladas, blandas consistentes de gelatina y un plastificante, como el glicerol o sorbitol. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal son, por ejemplo, supositorios que consisten de una combinación del ingrediente activo y una base de supositorio. Las bases para supositorio adecuadas son, por ejemplo, triglicéridos naturales o sintéticos, hidrocarburos de parafina, polietilen glicoles o alcanoles superiores.

Ejemplos Ejemplo 1 : La neurotripsina es expresada fuertemente por motoneuronas de la médula espinal. El patrón de hibridación in si tu sobre criocortes transversales de médula espinal de ratones adulto reveló una fuerte expresión celular del ARNm de neurotripsina en la materia gris (Gschwend, T.P., et al., Molec, Cell Neurosci. 9:207-219, 1997). La expresión más fuerte de neurotripsina en la médula espina fue encontrada en las motoneuronas en el cuerno ventral de la materia gris. Para la localización inmunohistoquímica de la proteína neurotripsina en la médula espina se generaron anticuerpos contra el dominio catalítico de la neurotripsina.

Para generar el antígeno para la inmunización, se produjo el dominio catalítico de la neurotripsina humana, que contiene una marca de His en el C-terminal en E. coli , purificado sobre una columna de Ni-NTA, y se replegó. Se usaron porciones de 50 µg para la inmunización de una cabra (inmunizaciones primarias en adyuvantes de Freund completo e inyecciones de refuerzo en adyuvantes de Freund completos) .

Del suero inmune, se aisló IgG por cromatografía de afinidad sobre proteína G inmunizada. La IgG purificada por afinidad se obtuvo por cromatografía de afinidad sobre el dominio proteolítico inmovilizado de la neurotripsina. Ratones adultos (de 2 meses de edad) fueron anestesiados profundamente con pentobarbital sódico (80 mg/kg, Abbot) y prefundidos transcardiacamente con 10 ml de NaCl al 0.9%, seguido por 150 ml de fijador que contenía 4% de paraformaldehído (Merck), 0.05% de glutaraldehído (Merck), y 0.2% de ácido pícrico (BDH) en amortiguador de fosfato 0.1 M, pH 7.4 (PB) . Se hicieron cortes coronarios de cerebro sobre un microtomo vibrante a 60 µm. Para mejorar la penetración de los inmunorreactivos, los cortes fueron equilibrados en sucrosa al 30% en pB, congelado rápidamente en nitrógeno líquido y entonces descongelados en PB y pretratados con Triton-XlOO al 0.3% durante 10 min. Después de la preincubación en suero de cabra normal al 20% (NGS: Vector Labs, Servion, Suiza) en solución salina amortiguada con Tris 0.05 M (TBS; pH 7.4) durante 45 minutos a temperatura ambiente (TA) , los cortes fueron incubados durante 36-48 h a 4°C con el anticuerpo primario contra neurotripsina (1 µg/ml) . Para la microscopía simple con inmunoperoxidasa, los cortes fueron incubados en anti-lgG de conejo de cabra biotinilado (1:200, Vector Labs) durante 12 h a 4°C seguido por 3 h de incubación en un complejo de avidina-biotina-peroxidasa (Élite ABC; 1:100, Vecrtor Labs) a TA. Los sitios antigénicos fueron visualizados por incubación en 3, 3' -diaminobencidina (Sigma: 0.05% en TBS, pH 7.6) en presencia de 0.004% de H202. Los cortes fueron montados sobre portaobjetos gelatinizados, secados con aire, deshidratados y cubiertos con cubreobjetos en Entelan (Merck) . El patrón de tensión inmunohistoquímica detectado de esta forma sobre cortes transversales de médula espinal de ratones adultos reveló fuertes señales de la presencia de neurotripsina en la materia gris. El nivel de expresión más fuerte se encontró en las motoneuronas del cuerpo ventral. Los cortes control tratados con el mismo procedimiento, pero con la omisión del primer y segundo cuerpos, no mostraron ninguna tinción. En conclusión, esos experimentos demuestran claramente que la neurotripsina es expresada fuertemente en la materia gris de la médula espinal. Una expresión particularmente fuerte se encuentra en las motoneuronas, las cuales se localizan en el cuerno ventral y se enervan hacia los músculos esqueléticos.

Ejemplo 2: La neurotripsina escinde a la agrina. El efecto proteolítico de la neurotripsina contra la agrina fue probado por la coexpresión de las dos proteínas en células HEK293T. Un fragmento de Kpnl-HindIII de 2310 pb que comprende la secuencia de codificación de neurotripsina de ratón fue clonado en el vector de expresión eucariótico pcDNA3.1(-) (Invitrogen) vía Kpnl y Hindi. Se insertó un clon de ADNc que codifica para la agrina de rata (Rupp, F. et asi., Neuron 6:811-823, 1991; GenBank Nr. M64780) que consiste del isoformo transmembranal que contiene las variantes de empalme Y4 y Z8 en el polienlazante de pcDNA3 (Invitrogen) vía Kpnl y EcoRI . Las células HEK293T fueron cultivadas en DMEM/10% de FCS a 37 °C en aire humidificado con 10% de C02. Para la transfección, las células fueron sembradas en 3 ml de DMEM/10% de FCS sobre cubreobjetos de vidrio colocados en un disco de 3 cm. El día después de la siembra, a una confluencia del 40-60, las células fueron transfectadas transitoriamente con ADNc que codifica par ala neurotripsina y agrina (5µg de ADN cada una) usando precipitación con fosfato de calcio. 4 h después de las transfecciones, el medio fue removido cuidadosamente y reemplazado por 3 ml de DMEM/10% de FCS fresco. El desvanecimiento de la agrina cuando es coexpresada con neurotripsina fue analizado por análisis Western blot. Cuarenta y ocho h después de la transfección, las células fueron lavadas con PBS y lisadas mediante la adición de 250 µl de amortiguador (Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Tritón X-100, coctel inhibidor de proteasa). El extracto fue incubado a 4°C durante 20 min y entonces centrifugado durante 20 min con 15000 x g a 4°C. El sobrenadante fue recolectado. Después de la determinación de la concentración de proteína, el sobrenadante fue mezclado con 5x de amortiguador de carga de Laemmli, hervido durante 3 min, centrifugado y usado para el análisis. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE, usando 7.5% de archilamida. Después de la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa. La calidad de la transferencia fue verificada por tinción de Ponceau S. La membrana fue entonces bloqueada con TBS que contenía 0.1% de Tween-20 y 5% de reactivo de bloqueo (p/v) (Amersham) . Todos los pasos posteriores se efectuaron en TBS con 0.1% de Tween 20. La membrana fue incubada con el anticuerpo primario (SZ177, 1:1000; AGR540, 1:1000; K-17, un anticuerpo anti-agrina policlonal (Santa Cruz), 1.1000) durante 60 min. Después de un lavado extenso, la membrana fue incubada con anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa durante 45 min. La detección se efectuó con ChemiGlow (Alpha Innotech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las imágenes se tomaron con una Chemilmager (Alpha Innotech) . La agrina fue identificada claramente en los extractos con detergente de trasfectantes individuales (Figura 2, carril 1). En los extractos de transfectantes dobles, la agrina se redujo fuertemente (Figura 2, carril 2). No se encontró señal de la agrina en células transfectadas con vector vacío. La producción de neurotripsina bajo todas esas condiciones fue confirmada después de sondear la mancha con anticuerpos anti-neurotripsina . El análisis de medio de cultivo de esas diferentes condiciones reveló que la inmunorreactividad que se perdió del extracto celular de las células doblemente tranfectadas había sido liberada hacia el medio sobrenadante. En 200 µml de medio de cultivo de células HEK293T transfectadas doblemente se detectó una banda de 100 kDa con el anticuerpo anti-agrina (Figura 2, carril 3). Esta señal no fue encontrada en el medio de las transfectantes individuales (Figura 2, carril 4). De igual modo, no se detectó señal en el medio de las células HEK293T transfectadas con agrina y neurotripsina catalíticamente inactiva . En resumen, los resultados indican que (1) la neurotripsina producida en células HEK293T tiene actividad catalítica, que (2) la agrina, un componente presente extracelularmente de la unión neuromuscular y la sinapsis del sistema nervioso central, puede ser escindida por proteólisis dependiente de la neurotripsina, y (3) esta escisión dependiente de la neurotripsina conduce a la formación de una forma truncada y liberada de la agrina. La parte liberada de la agrina tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 100 kDa. Debido a que los anticuerpos usados para la detección de la agrina estaban dirigidos contra los epítopes en la parte C-terminal de la agrina, el fragmento solubilizado comprende el lado C-terminal de la agrina.

Ejemplo 3: La escisión de la agrina in vivo coincide con la expresión de la neurotripsina en la médula espinal durante el desarrollo neural. Para probar la escisión de la agrina in vivo, se analizaron homogenizados de médula espinal de ratones en desarrollo y adultos por análisis Western blot usando anticuerpos específicos para Nt y el fragmento C-terminal de 100 kDa de la agrina. Se prepararon homogenizados de tejido de las médulas espinales de ratones a los días 4, 7, 9, 10, 15 y 25 posnatales, así como de ratones de 3, 6, y 12 meses de edad. Como se muestra en la Figura 3, el Nt se expresó más fuertemente en las primeras tres semanas posnatales, con un nivel de expresión más alto entre los días 7 y 10. El análisis Western blot con anticuerpos contra la porción C-terminal de la agrina reveló un patrón temporal altamente similar, que indica que la escisión de la agrina por la neurotripsina también ocurre in vivo.

Ejemplo 4_ Sobreexpresión selectiva de neurotripsina en motoneuronas usando la tecnología de ratones transgénicos . La neurotripsina se sobreexpresó bajo el control del promotor del gen de Thy-1. El Thy-1 se expresó en las neuronas del sistema nervioso del ratón de manera relativamente tardía (días postnatales 4-10 dependiendo de la ubicación; Gordon, J.W. et al., Cell 50: 445-452, 1987). Por lo tanto, la expresión de la neurotripsina bajo el control del promotor de Thy-1 asegura que las etapas desarrollísticas iniciales no sean perturbadas por la presencia de cantidades excesivas de neurotripsina. Los ratones que sobreexpresan neurotripsina fueron generados en frangen condicional que requirió activación. Para este propósito, se introdujo una secuencia sin sentido transcripcional removible flanqueada por sitios loxP antes del ADNc de neurotripsina. De este modo, la secuencia sin sentido pudo ser removida con el sistema de recombinación de recombinasa/loxP (Sauer B. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 85: 5166-5170, 1988). La proteína Cre (Recombinasa Cre) es codificada por el bacteriófago Pl de E.coli y promueve eficiente la recombinación tanto intra como intermolecular del ADN. La recombinación ocurre en un sitio específico formado loxP (Hamilton, D.L. and Abremski, K., J. Mol. Biol. 178: 481-486, 1984). Este rasgo característico de la recombinasa Cre permite la supresión e inserción de cadenas de ADN denotadas específicamente entre la secuencia loxP. Puede ser usado para generar mutaciones generadas específicas in vivo (Chen S. et al. Cell 51: 7-19, 1987). Los ratones que contienen el constructo para la sobreexpresión de neurotripsina condicional fueron cruzados con ratones heterocigóticos que contenían ADN de recombinasa Cre en el gen para el factor de trascripción HB9 para generar ratones que sobreexpresan neurotripsina activa en las motoneuronas. El promotor HB9 es activo in vivo durante la especificación de la motoneurona, y, de este modo, todas las motoneuronas expresan recombinasa Cre derivada de HB9, dando como resultado la remoción de la secuencia sin sentido transcripcional del transgen inactivo. Los ratones transgénicos fueron genotipificados por PCR. El ADN de la PCR fue extraído de la cola del ratón. La posición de los cebadores de PCR fue elegida de modo que se evitara la detección del gen de neurotripsina murino nativo. El cebador 3' correspondió a una secuencia de ADN dentro del promotor de Thy-1 y el cebador 5' a la secuencia dentro del ADNc de neurotripsina. Este fragmento de ADN es único para el transgen de neurotripsina. Los cebadores de la detección del inserto de Cre fueron ambos equivalentes a las secuencias de ADN derivadas de dentro del gen de Cre, debido a que Cre usualmente no existe en ratones. Por este procedimiento, se crearon tres líneas de ratón que sobreexpresan la neurotripsina humana y cuatro líneas que sobreexpresan la neurotripsina de ratón. La expresión del transgen fue verificada a nivel del ARNm por análisis Northem blotting e hibridación ín sí tu y a nivel de proteína por análisis Western blotting. Una sobreexpresión típica fue del orden de 2- a 10 veces.

La dependencia de la alteración mediada por la neurotripsina sobre su dominio catalítico fue verificado generando ratones transgénicos que sobreexpresan la forma catalíticamente inactiva de la neurotripsina bajo el mismo, es decir el promotor Thy-1. La neurotripsina inactiva puede ser generada fácilmente haciendo notar el sitio activo esencial de la serina 711 (correspondiente a la serina 195 de la quimiotripsina) a una alanina. Debido a que en todas las serinas proteasas, el sitio activo de la serina está implicado en un intermedio covalente de la reacción proteolítica, su mutación da como resultado una pérdida completa de lá función catalítica. Los ratones transgénicos que sobreexpresan la forma inactiva de la neurotripsina estuvieron sanos y no exhibieron ninguna anormalidad.

Ejemplo 5: La sobreexpresión transgénica de la neurotripsina mejora la escisión de la agrina in vivo . Se prepararon homogenizados de tejido de las médulas espinales de ratones adultos que sobreexpresan neurotripsina humana (hNt) o neurotripsinas de ratón (mNt) . Esos ratones fueron obtenidos cruzando ratones con los transgenes inactivos (líneas 497, 489 y 533 para mNt y líneas 493 y 494 para hNt) con ratones que expresan recombinasa Cre bajo el control del promotor HB9 específico de motoneuronas. Se usaron ratones naturales como controles. Los homogenizados de médula espinal fueron sometidos a SDS-PAGE y Western blotting. Los análisis Western blots fueron probados con anticuerpos contra hNt y MNt, así como el fragmento C-terminal 100-k-Da de la agrina. Como se muestra en la Figura 4, el fragmento C-terminal de 100-k-Da de la agrina se incrementó fuertemente en los ratones transgénicos que sobreexpresan neurotripsina. El incremento de la cantidad del fragmento C-terminal de 100-k-Da de la agrina se correlacionó bien con el nivel de sobreexpresión de las diferentes líneas de ratones transgénicos. La Nt humana y de ratón mostró el mismo efecto proteolítico sobre la agrina. Esos resultados indican que la neurotripsina escinde a la agrina in vi vo en una forma dependiente de la concentración.

Ejemplo 6: La sobreexpresión transgénica de la neurotripsina en las motoneuronas da como resultado la remoción de la agrina de la NMJ dentro de horas a días. Se investigó el efecto de la sobreexpresión transgénica de la neurotripsina (Nt) en motoneuronas espinales por análisis inmunohistológico de la unión neuromuscular (NMJ) . De interés particular fue la primera semana postnatal, debido a que se sabe que el promotor de Thy-1 usado para activar la expresión de Nt transgénica se vuelve activo durante la primera semana postnatal (con alguna variación dependiendo de la ubicación) . Para este análisis, se usó el diafragma debido a que la ubicación superficial de de las NMJ hace éste músculo un excelente modelo para esos análisis comparativos. La visualización de la agrina se efectuó por tinción inmunohistológica usando anticuerpos purificados por afinidad contra el fragmento C-terminal de 100-kDa de la agrina. Como se demuestra en la Figura 5, la inmunorreactividad de la agrina a PO, punto en el tiempo antes de la aparición de la actividad cien del transgen es idéntica en ratones naturales y transgénicos (Fig. 5: PO) . En ambos casos, la inmunorreactividad de la agrina claramente se equipara a las señales de a-Btx de las NMJ mostradas en la Figura 6 para los mismos músculos. A P8, se encontró una extraña reducción de la inmunorreactividad de la agrina en las NMJ del diafragma sobre ratones que sobreexpresan Nt, cuando se comparó con los ratones naturales (Fig. 5: P8). La banda de la placa final, la cual está densamente poblada con NMJ positivas a la agrina en ratones naturales de edad equiparable, muestra solo muy pocas estructuras positivas a la agrina similares a NMJ grandes. La inmunorreactividad de la agrina de ratón P4 muestra una etapa de transición, característica con un patrón mezclado con estructuras de tamaño variable, que varían de NMJ bien conservadas a estructuras pequeñas que reflejan residuos de NMJ (Figura 5: P8). La mayoría de las estructuras inmunorreactivas de agrina en la Figura 5 fueron exactamente equiparables a las estructuras positivas a a-Btx de la Figura 6. Sin embargo, en una porción sustancial de la sinapsis en estado de transición en los ratones que sobreexpresan Nt, la relación entre la señal de agrina y la señal de a-Btx fue más pequeña que a PO (Véase la Figura 7) . Esos resultados demuestran que la neurotripsina escinde a la agrina in vivo en la NMJ y que la porción C-terminal de la agrina desaparece de las NMJ dentro de horas a días después de la escisión dependiendo de la neurotripsina. Esto es particularmente notable debido a que la porción C-terminal contiene el dominio responsable de la actividad prosináptica de la agrina.

Ejemplo 7: La remoción de la agrina inducida por la neurotripsina de la NMJ da como resultado la dispersión de la NMJ dentro de horas a días. Se investigó el efecto de la sobreexpresión de neurotripsina (Nt) en motoneuronas y la remoción posterior de la agrina de las NMJ mediante la visualización del aparato postsináptico . La visualización del aparato postsináptico fue efectuado tiñendo los receptores de acetilcolina con a-bungarotoxina (a-Btx) fluorescente. Como se muestra en la Figura 6 en una comparación de los ratones que sobreexpresan Nt (Nt) con ratones naturales (wt), el aparato postsinátpico está bien establecido al nacimiento (día postnatal 0, PO). Al final de la primera semana postnatal (P8), la mayoría de los aparatos postsináticos de las NMJ han desaparecido virtualmente en los ratones que sobreexpresan Nt. Solo una cuantas NMJ residuales pueden ser producidas dentro de la llamada banda de la placa final, donde las NMJ se encuentran en una alta densidad en los ratones naturales. Al cuarto día de desarrollo postnatal (P4), se encontró un patrón heterogéneo de una mezcla de NMJ aún bien formadas y NMJ parcialmente disueltas. La reducción en la densidad en las NMJ dentro de la banda de la placa final de los ratones transgénicos cuando se comparó con los ratones naturales sugiere que una porción de las NMJ ya había desaparecido completamente en los ratones que sobreexpresan Nt en esta etapa. La NMJ en estado de transición se caracterizan por la ausencia de al menos una presencia fuertemente reducida de agrina dentro de la estructura decorada ?-Btx. Esas NMJ en estado de transición se encuentran exclusivamente en ratones que sobreexpresan Nt. En ratones naturales, en contraste con los ratones que sobreexpresan Nt, la inmunotinción para la agrina se equipara siempre bien con la tinción con a-Btx de los receptores de acetilcolina del aparato postsináptico. En resumen, esos experimentos demuestran que una expresión elevada de Nt en las motoneuronas da como resultado la dispersión de NMJ ya establecidas. La dispersión de las NMJ sigue a la desregulación transgénica de Nt con un retraso corto (que se estima dura unas cuantas horas y unos cuantos días) . El análisis de la sinapsis en estado de transición demuestra que la dispersión del aparato de postsináptico sigue la escisión de la agrina y la remoción del fragmento C-terminal de 100-kDa de la agrina de la NMJ. Esto indica que la Nt juega un papel antisináptico en la NMJ contrarrestando el papel postsináptico de la agrina. Si la función antisináptica es aumentada excesivamente por una fuerte sobreexpresión de la neurotripsina en las motoneuronas, el agente prosináptico de la agrina es abrumado, y de este modo, la NMJ se desmonta.

Ejemplo 8: Los ratones adultos con expresión elevada de neurotripsina de las motoneuronas de la médula espinal exhiben un fenotipo neuromuscular pronunciado con disminución de la fuerza muscular. Los ratones transgénicos que sobreexpresan Nt en las motoneuronas fueron generados cruzando ratones que portan el transgen de Nt condicional (descrito en el Ejemplo 4) con ratones que expresan recombinasa Cre bajo el control del promotor de HB9. El promotor de HB9 controla la sobreexpresión de la recombinasa Cre en motoneuronas espinales, y de este modo activa al transgen de Thyl-Nt en motoneuronas por la escisión del segmento sin sentido transcripcional. Los ratones transgénicos dobles derivados de ese cruce exhiben un fenotipo motor. Ellos caminan lentamente, con un andar inseguro y pocos pasos. También muestran una fuerza muscular considerablemente reducida. En resumen, la sobreexpresión de Nt en las motoneuronas da como resultado un fenotipo motor periférico, caracterizado principalmente por una fuerza reducida de los músculos esqueléticos.

Ejemplo 9: Las uniones neuromusculares de ratones adultos con expresión elevada de neurotripsina exhiben una fragmentación pronunciada del aparato pre y postsináptico. La comparación de las uniones neuromusculares de ratones transgénicos que sobreexpresan Nt y ratones naturales de la misma edad (adultos jóvenes) reveló una fragmentación notable de las NMJ de los ratones que sobreexpresan Nt. La estructura de Prezel típica de las NMJ que se desarrollan en las primeras tres semanas postnatales en ratones naturales no se encuentran en los ratones que sobreexpresan Nt (Fig. 7 D, E y F) . Aunque las NMJ de los ratones que sobreexpresan Nt ocupan aproximadamente la misma área sobre la superficie de sus fibras musculares blanco, sus contactos postsinápticos así como presinápticos no forman una estructura contigua, sino que se rompen en numerosos sitios de contacto pequeños. La fragmentación de las NMJ observada en ratones que sobreexpresan Nt también se encontró en NMJ de viejos que sufren de sarcopenia, una forma de atrofia muscular encontrada en humanos en edad vieja. En resumen, la producción elevada de neurotripsina en las motoneuronas da como resultado una fragmentación de las NMJ que se asemeja estrechamente a la fragmentación de las NMJ que se reportan de estudios de humanos que padecen de sarcopenia.

Ejemplo 10: Los músculos de ratones adultos con expresión elevada de neurotripsina tienen un número significativamente reducido de fibras musculares. Los músculos de ratones adultos jóvenes que sobreexpresan Nt en motoneuronas fueron analizados con respecto al número de fibras musculares. Los músculos individuales, por ejemplo, el músculo soleo, fueron aislados y se hicieron cortes de tejido perpendiculares al eje longitudinal del músculo a través del segmento medio del músculo. Los cortes fueron teñidos con Hematoxilona-Eosina y fueron contadas las fibras. La Figura 8 muestra una comparación de un músculo soleo de un ratón natural (Figura 8A) y un ratón que sobreexpresa Nt (Figura 8B) . El músculo del ratón que sobreexpresa Nt es considerablemente más delgado que el músculo del ratón natural y tiene un número notablemente menor de fibras musculares. Se encontró el número de fibras musculares en el músculo soleo de cuatro diferentes líneas de ratones que sobreexpresan Nt (Tabla 1) .

Tabla 1 : Número de fibras musculares Todos los resultados revelaron una reducción notable en el número de fibras en los ratones que sobreexpresan Nt de las cuatro líneas de ratones transgénicos independientes . En resumen, la cuantificación del número de fibras en ratones demuestra que la Nt elevada en las motoneuronas da como resultado una reducción significativa del número de fibras musculares.

Ejemplo 11: Sobreexpresión de neurotripsina y neuronas de SNC de ratones transgénicos. De acuerdo al procedimiento del Ejemplo 4 se obtuvieron ratones transgénicos para la sobreexpresión condicional de neurotripsina. Esos ratones fueron cruzados con ratones heterocigóticos que expresan la recombinasa Cre bajo el control del promotor de citomegalovirus (CMV) . El promotor de CMV es continuamente activo in vivo, y por lo tanto la recombinasa Cre promueve la recombinación en las dos secuencias de loxP en todo momento. Este procedimiento remueve la secuencia sin sentido transcripcional del transgen inactivo y permite la transcripción del ADNc de neurotripsina. La genotipificación por PCR e hibridación Southern blot se efectuó como en el Ejemplo 4. De manera similar, los ratones transgénicos que sobreexpresan una forma catalíticamente inactiva de la neurotripsina bajo el promotor de Thy-1 fueron generadas haciendo mutar la serina del sitio activo (Serina 711) de la neurotripsina a alanina.

Ejemplo 12: Los niveles incrementados de neurotripsina en neuronas del SNC da como resultado una reducción en el número de sinapsis. Para cuantificar el número de sinapsis por volumen de tejido de región rica en sinapsis, y para medir los parámetros de tamaño de la sinapsis (incluyendo el área de las terminales axónicas presinápticas, el área de las columnas presinápticas, y la longitud de la sinapsis (de acuerdo a lo medido por la longitud de la aposición de las membranas pre y postsinápticas) , se investigaron dos líneas independientes de ratones que sobreexpresan neurotripsina (Nt491/cre y Nt494/cre) y varias líneas de ratones control (ratones naturales, ratones CMV-Cre, y líneas madres transgénicas que contienen el transgen de neurotripsina inactivo Nt491-inact . Nt y Nt494-inact . Nt) . Los ratones fueron anestesiados profundamente a la edad de 28 días con metiofane (Schering-Plough) y perfundidos a través del corazón con cloruro de sodio al 0.9% con fijador consistente de 2% de paraformaldehído, y 1% de glutaraldehído en amortiguador de fosfato (PB) 0.1 M, pH 7.4. Los cerebros fueron removidos del cráneo y cortados en cortes en serie de 100 µm de espesor con un vibratomo. Las secciones fueron fijadas posteriormente en tetróxido de osmio al 1% en PB, tratados con acetato de uranilo al 2%, deshidratados en etanol y óxido de propileno e incluidos en resina Durcupan ACM (Fluka) . Para el análisis por microscopía electrónica los cortes que contienen la región CAÍ del hipocampo a nivel arteriocaudal se hicieron cortes ultrafinos Bregma-2 mm y medio lateralmente de 1.5 mm. El procedimiento de muestreo sináptico consistió de 15 a 23 muestras de EM del neuropilo del stra tum radia tum de la región CAÍ hipocámpica de tres áreas contiguas con una distancia de al menos 50 µm entre cada una a una amplificación inicial de 27500 veces. Las micrografías electrónicas fueron impresas a una amplificación final de 80000 veces la cual representó de 90 a 135 µm2 del tejido. Una sinapsis fue definida como dos membranas gruesas opuestas de un perfil presináptico y postsináptico, con el perfil presináptico conteniendo al menos 3 vesículas sinápticas asociadas cerca con las membranas diferenciadas. Las sinapsis fueron clasificadas en sinapsis axodendrítica y axoespinosa de acuerdo al criterio ultraestructural . Los ejes dendríticos fueron identificados por su tamaño y la presencia de mitocondrias y microtúbulos. Las espinas o columnas dendríticas fueron de diámetro más pequeño, carecieron de mitocondrias y microtúbulos, y ocasionalmente contenían un aparato espinal. Las sinapsis axodendríticas comprendieron una porción insignificantemente pequeña en todas las muestras y por lo tanto se excluyeron de la estimación estadística adicional. Todas las sinapsis axoespinosas fueron contadas en cada micrografía con la excepción de aquéllas que tocaban las líneas de exclusión. Las áreas de sección transversal de las terminales axonales y las espinas o columnas postsinápticas y las longitudes de las uniones sinápticas de todas las sinapsis axoespinosas fueron medidas directamente de las impresiones usando una tableta magnética (Kurta) y el programa de análisis Macstereology 2.8 (Ranfurly Microsystems). La densidad numérica de la sinapsis se obtuvo usando el método de frecuencia de tamaño y la fórmula Nv = NA/d (donde NA es el número de perfiles sinápticos por área unitaria y d es la longitud promedio de las uniones sinápticas; DeFelipe, J., et al., Cereb. Cortex 9:722-732, 1999) . Se contó el número de sinapsis por mm3. Los resultados se muestran en la Figura 9. El número de sinapsis por mm3 se redujo significativamente en los ratones que sobreexpresan neurotripsina. En contraste, los números de sinapsis en ratones control, es decir las líneas madre usadas para la generación de ratones que sobreexpresan neurotripsina transgénicos dobles (DTG) (491-inact .Nt, 494-inact.Nt y CMV-Cre) fueron los mismos que en los ratones naturales. Por lo tanto, esos resultados indican una reducción significativa de sinapsis en los ratones que sobreexpresan neurotripsina.

Ejemplo 13: Los niveles incrementados de neurotripsina en neuronas del SNC dan como resultado un número reducido de espinas o columnas dendríticas (elementos postsinápticos) . Se cortaron rebanadas hipocámpicas parasagitales (300 µm) de ratones que sobreexpresan neurotripsina y naturales de 17 a 32 días de edad usando una cuchilla rasadora de acero inoxidable (Electron Microscopy Sciences) y transfirieron a una cámara de incubación llena con ACSF a 34 °C y oxigenado y se incubaron durante 1 hora, para proporcionar tiempo suficiente para que el tejido cerebral se recuperara del daño del corte. Posteriormente, las rebanadas fueron mantenidas a temperatura ambiente hasta que se usaron posteriormente en los experimentos. Para el registro de la pinza del parche de célula completa las rebanadas fueron colocadas en una cámara sumergida estándar también superfundida con ACSF. Las neuronas individuales fueron visualizadas con un microscopio Axioscope (Zeiss) equipado con dispositivos ópticos de contraste de interferencia diferencial que usan iluminación infrarroja. La cámara experimental fue mantenida a 35-36°C, la cual es cercana a la temperatura fisiológica. La velocidad de flujo del ACSF a través de la cámara fue de entre 1 y 2 ml por minuto. El ASCF fue oxigenado por oxicarburo antes de entrar a la cámara de registro. Los registros se efectuaron usando una pipeta de registro de célula completa (3-5 MO) , extraída sobre el extractor de Flaming/Brown y llenada con la misma solución que en la cámara. Para la reconstrucción morfológica las neuronas fueron inyectadas con una solución de KOH 115 mM, K-gluconato 20 mM, KCl 10 mM, HEPES 10 mM (amortiguador de Good) , fosfo-creatina 10 mM, ATP-Mg 4 mM, GTP 0.3 mM, y biotina 13.4 mM. Cada rebanada con una célula piramidal CAÍ marcada con biocitina fue colocada entre dos piezas de papel filtro Millipore para mantener la plana durante la fijación durante 2-3 horas a temperatura ambiente por inmersión en fijador que contenía 1% de glutaraldehído, 2% de paraformaldehído y aproximadamente 0.2% de ácido pícrico en amortiguador de fosfato (PB) 0.1 M, pH 7.4. Las rebanadas fueron almacenadas en paraformaldehído en 0.5% en PB a 4°C. Después de varios lavados en PB, las rebanadas fueron tratadas con peróxido de hidrógeno al 2% durante 15 min y entonces preincubadas en suero de cabra normal al 20% en solución salina amortiguada con Tris 0.05 M (pH 7.4) que contenía 0.5% Tritón X-100 (TBST) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente fueron sometidas a incubación durante la noche en el reactivo Vectastain Élite ABC (avidina-biotina-peroxidasa) (1:100; Vector Labs) en TBST a 4°C. Después de 5 lavados de 15 minutos en TBST y amortiguador de Tris (TB, pH 7.6), las células que contenían biotina fueron visualizadas por incubación en 3,3'-diaminobencidina (0.05% en TB) en presencia de 0.0048% de H202. La reacción fue detenida por varios lavados en TB. Los cortes fueron montados sobre el portaobjetos y cubreobjetos en Mowiol (Hoechst) . Como se demuestra en la Figura 10, las neuronas piramidales hipocámpicas CAÍ de ratones transgénicos que sobreexpresan Nt en neuronas del SNC exhibieron una reducción notable tanto en el número como en el tamaño de las espinas o columnas dendríticas. Debido a que las espinas o columnas dendríticas representan el lado postsináptico de la sinapsis en esas neuronas, esos resultados confirman una reducción en el número de sinapsis en los . ratones que sobreexpresan neurotripsina por un método independiente.

Ejemplo 14: La escisión de la agrina in vivo también ocurre en el SNC y coincide con la expresión de neurotripsina en neuronas del SNC. Para probar la escisión de la agrina en el SNC in vivo, se analizaron homogenizados de cerebro en ratones adultos y en desarrollo por análisis Western blot usando anticuerpos específicos para Nt y el fragmento C-terminal de 100 kDa de la agrina. Los homogenizados de tejido fueron preparados de médulas espinales de ratones los días postnatales 4, 7, 9, 10, 15 y 25, así como de ratones de 3, 6 y 12 meses de edad. Se encontró que la Nt es expresada más fuerte en las primeras tres semanas postnatales, con los niveles de expresión más altos entre los días 7 y 10. El análisis Western blot con anticuerpos contra la porción C-terminal de la agrina reveló un patrón temporal altamente similar, indicando que la escisión de la agrina por la neurotripsina también ocurre in vivo en el SNC.

Ejemplo 15: La sobreexpresión transgénica de neurotripsina en neuronas de CNS mejora la escisión de la agrina in vivo . Se prepararon homogenizados de tejido del cerebro de ratones adultos que sobreexpresan neurotripsina humana (hNt) o neurotripsina de ratón (mNt) generados cruzando ratones que contienen los transgenes inactivos (líneas 497, 498 y 533 para mNt y líneas 493 y 494 para hNt) con ratones que expresan recombinasa Cre bajo el control del promotor de CMV y, para comparación, ratones naturales. Los homogenizados de cerebro fueron sometidos a SDS-PAGE y análisis Western blotting. Las manchas Western fueron sondeadas con anticuerpos contra hNt y mNt, así como el fragmento C-terminal de 100-kDa de la agrina. Se encontró que el fragmento terminal de C-terminal de 100-kDa de la agrina se incrementó fuertemente en los ratones transgénicos que sobreexpresan neurotripsina. El incremento en la cantidad del fragmento de C-terminal de 100-kDa de la agrina se correlacionó bien con el nivel de sobreexpresión de las diferentes líneas de ratones transgénicos. La Nt humana y de ratón mostró el mismo efecto proteolítico sobre la agrina. Esos resultados indican que la Nt escinde a la agrina en el CNS in vivo en una forma dependiente de la concentración.

Ejemplo 16: Producción de la neurotripsina recombinante La neurotripsina es una proteína multidominio secretada con una longitud de 875 aminoácidos y un tamaño estimado de 97 kDa para la neurotripsina humana y 761 aminoácidos y un tamaño de 85 kDa para la neurotripsina de ratón (Fig. 1, A y B) . La expresión de esta serina proteasa como proteína activa depende del pliegue apropiado y de manera muy probable de las modificaciones postraslacionales, por ejemplo la N-glicosilación que ha sido propuesta en dos sitios en el caso de la humana y 3 sitios para la proteína de ratón (Gschwend, T.P. et al., Mol. Cell. Neurosci. 9: 207-219, 1997; Proba, K. et al., Biochim. Biophys. Acta 1396: 143-147, 1998). Además, la neurotripsina contiene un péptido señal que dirige la proteína al retículo endoplásmico desde donde se secreta. La neurotripsina no es una proteína membranal integral puesto que carece de un dominio transmembranal de acuerdo a lo determinado por la gráfica de hidrofobicidad (Kyte, J. and Doolittle, R.F., J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982). El sitio de activación de zimógeno de la neurotripsina muestra alta similitud con el de tPA (activador de plasminógeno tipo tisular; Tate, K.M. et al., Biochemistry 26: 338-343, 1987). La escisión en este sitio por una proteasa conduce a los dos fragmentos, uno que contiene dos dominios no catalíticos con un peso molecular aparente de aproximadamente 55 kDa (para la neurotripsina de ratón) o aproximadamente 67 kDa (para la neurotripsina humana) y uno que contiene únicamente el dominio de proteasa con aproximadamente 30 kDa. Produccción de neurotripsina en células de mieloma . Para la transfección estable de células de mieloma en la región codificadora de la neurotripsina de ratón y humano fueron insertados en un vector diseñado especialmente (Traunecker et al., Biotechnol. 9:109-113, 1991). La expresión por este vector es controlada por un promotor y mejorador de Ig c. El extremo 3' del transcripto de interés es empalmado sobre un exón que codifica para el dominio constante de Ig para imitar los transcriptos de Ig estables. El vector contiene un gen de histidinol deshidrogenasa que permite la producción de transfectantes estables en presencia de L-histidinol . El L-histidinol es un precursor de la L-histamina y un inhibidor de la síntesis de proteína. El vector ha sido transfectado de manera estable en la línea celular de mieloma de ratón J558L (ECACC #88032902; Colección Europea de Cultivos Celulares) para la producción de neurotripsina recombinante. Otras líneas adecuadas para la transfección estable por fusión protoplástica o electroporación incluye la P3-X63Ag8.653 de ratón, Sp2/0-Agl4 de ratón, NSO de ratón, y YB2/0 de rata (Gillies et al., Biotechnology 7:799-804, 1989; Nakatani et al., Biotechnology 7:805-810, 1989; Bebbington et al., Biotechnology 10:169-175, 1992; Shitara et al., J. Immunol. Meth. 167:271-278, 1994). La transfección estable de células J558L puede ser lograda usando electroporación. Se mezcla un total de 106 células con 10 µg de vector linealizado o superenrollado en PBS en una cubeta de 1 cm. La electroporación es efectuada usando un Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad Chemical División) con un impulso de 960°F y 170-230 V. Las células son transfectadas a 50 ml de DMEM con un contenido de 10% de FCS y cultivadas sobre cinco placas de 96 pozos agregando 100 µl/ pozo usando un pipetero multicanal. La transfección de liposoma de células de J558L es efectuada usando lipofectamina y reactivo PLUS (Invitrogen). 1 x 107 células de mieloma son centrifugadas a 500 x g durante 3 minutos y lavadas una vez con medio de DMEM libre de suero. Después de una segunda centrifugación las células son resuspendidas en 3 ml de medio DMEM libre de suero. Para la transfección se mezclan 40 µg de ADN plasmídico que codifica para la neurotripsina con 320 µl de DMEM libre de suero y 80 µl de reactivo PLUS (Invitrogen). Después de la incubación de 15 min a ' TA se agrega el reactivo de transfección de 60 µl de lipofectamina premezclado con 340 µl de DMEM libre de suero a la reacción y se incuba durante 15 min a TA. Se agrega un ml de DMEM libre de suero a la mezcla de ADN de liposoma antes de la adición de las células J558L. Las células transfectadas son incubadas en un disco de cultivo tisular de 6 cm a 37°C con 10% de C02. Después de 4 h las células son diluidas en 45 ml de DMEM con un contenido de 10% de FCS y cultivadas en cinco placas de 96 pozos agregando 100 µl/pozo usando un pipetero multicanal. Para la preparación de los protoplastos el patrón de glicerol de una clona de E. coli cepa 803 que contiene el vector de expresión de mamífero es sembrado sobre una placa de agar LB/ampicilina y se hace crecer durante la noche a 37°C (cepa 803 disponible de una ATCC #35581) . Una sola colonia es inoculada en 2 ml de medios LB precalentados (37 °C) que contienen 50 µg/ml de ampicilina. Después de agitar 4 h a 250 rpm y 37°C se transfieren 100 µl del cultivo a 100 ml de medio fresco. Después de que el cultivo alcanza una densidad óptica de aproximadamente 0.6 (DO a 600 nm) , se agrega cloramfenicol a una concentración final de 120 µg/ml y se deja crecer durante la noche a 250 rpm y 37°C. Los plásmidos que contienen el origen de replicación colEl pueden ser amplificados en presencia de cloramfenicol (Hershfield et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 71, 4355-3459, 1974). El cultivo nocturno es centrifugado a 2500 x g durante 10 min a 4°C. El sedimento es resuspendido en 2.5 ml de sucrosa al 20% (p/v) enfriada con hielo en Tris-HCl de 50 mM, pH 8.0. Se agregan 500 µl de lisozima 1 mg/ml enfriada con hielo en Tris-HCl 250 mM, pH 8.0, antes de la incubación sobre hielo durante 5 min. Después de la adición de 1 ml de EDTA 250 mM enfriado en hielo, pH 8.0, e incubar sobre hielo durante 5 min, se agrega 1 ml de Tris-HCl de 50 mM enfriado en hielo, pH 8.0, y la preparación de protoplasto incubada a TA durante 10 min. Durante este periodo de incubación, puede ser observada la formación de protoplastos esféricos de bacterias usualmente en forma de bastoncillos usando un microscopio con una amplificación de 1000 x. Aproximadamente 90% de los protoplastos se formarán al final del periodo de incubación. A la suspensión de protoplastos se agregan 20 ml de DMEM suplementado con 10% (w/v) de sucrosa, 10 mM de MgCl2 y 40 µl de DNasal 10 mg/ml. Después de incubar durante 15 min a TA la preparación protoplástica es centrifugada a 2500 x g durante 30 min a TA. En las células de mieloma J558L son preparadas para la fusión. Las células de mieloma se hicieron crecer en DMEM suplementado con 10% (v/v) de FCS y deberán alcanzar una alta densidad celular de aproximadamente 1 x 106 células/ml el día de la transfección. Para la fusión protoplástica se centrifugaron 5 x 106 células a 500 x g durante 10 min a TA. Las células son resuspendidas en 5 ml de DMEM prelavado (37°C) y colocada lentamente sobre la parte superior del sedimento protoplástico después de la última centrifugación. Para mezclar los protoplastos y las células de mieloma el tubo es centrifugado a 500 x g durante 10 min a TA. Después de la remoción del sobrenadante las células son mezcladas agitando el tubo. Para la fusión se agregan 2 ml de PEG 1500 en DMEM suplementado con 10% de DMSO y el sedimento es resuspendido pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Aproximadamente de 1 a 2 min después de la adición de la solución de PEG, se agregan 10 ml de DMEM precalentado suplementado con 10% (v/v) de FCS (37°C) . Las células son centrifugadas a 500 x g durante 10 min a TA. Los sobrenadantes son removidos por aspiración y el sedimento resuspendido en 50 ml de DMEM precalentado suplementado con 10% (v/v) de FCS y 100 µl de kanamicina 50 mg/ml. Finalmente, las células son cultivadas en cinco placas de cultivo tisular de 96 pozos agregando 100 µl/pozo usando un pipeteador multicanal. Para la selección de las células transfectadas se agregó L-histidinol en una concentración final de 5 mM después de 48 h. Únicamente las células de mieloma transfectadas sobrevivirán con el tratamiento con el L-histidinol. Las clonas son visibles de aproximadamente de 12 a 14 días después de haber comenzado la selección. En promedio se obtienen de 40 a 50 clonas por fusión protoplástica en la transfección liposomal. Todas las clonas fueron analizadas por la expresión por análisis Western blot por anticuerpos específicos para neurotripsina. Aunque la mayoría de las clonas de célula de mieloma no o solo expresan cantidades moderadas de neurotripsina, un porcentaje pequeño de 5-10% reveló un nivel de expresión muy alto. Las clonas con un alto nivel de expresión fueron subclonadas durante 3 rondas de diluciones celulares individuales para asegurar la estabilidad de la expresión de neurotripsina. De las clonas de expresión estable se recolectaron los extractos y sobrenadantes y se separaron sobre PAGE con SDS al 10%. Las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa. La detección de la neurotripsina se efectuó con anticuerpo específico para neurotripsina que reconoce el segmento no catalítico y un anticuerpo anti-conejo de cabra secundario acoplado a peroxidasa o un anticuerpo específico de neurotripsina que reconoce el dominio de proteása y un anticuerpo anticabra de conejo acoplado a peroxidasa. Aunque la neurotripsina de longitud completa es detectada predominantemente en el extracto celular, la banda de 65 kDa correspondiente al fragmento no catalítico y la banda de 30 KDa del dominio proteolítico son detectadas en el sobrenadante.

Ejemplo 17: Producción a escala intermedia de neurotripsina . La fuente de neurotripsina usada fue un sobrenadante de cultivo celular condicionado resultante del cultivo de una línea celular de mieloma que expresa neurotripsina. Esas células han sido adaptadas para crecer en un medio libre de suero (Stoll, T.S. et al., J. Biotechnol. 45: 111-123, 1996; Ackermann, G.E. and Fent, K. , Marine Environmental Research 46: 363-367, 1998) en el fermentador de TechnoMouse (Integra Biosciences). Partiendo de un medio compuesto de DMEM (Gibco, No. 41966-029) que contiene glutamina 2 mM y 10% de FCS, las células fueron adaptadas gradualmente para crecer con este medio con 1% de FCS. La adaptación fue efectuada en placas de 24 pozos y el medio fue intercambiado a aproximadamente cada segundo día. Cuando las células alcanzaron la confluencia, fueron separadas a otro pozo. Durante todo el procedimiento, las células fueron mantenidas a una densidad cercana a la confluencia. Las células adaptadas que crecieron bien en DMEM que contenía 1% de FCS fueron entonces transferidas al medio HL-1 libre de suero, pero que contenía proteína (Bio-Whittacker, No. 77201) suplementado con 0.5% de FCS. En el medio HL-1 las células fueron entonces adaptadas gradualmente para crecer en medio HL-1 únicamente (sin FCS) . Para adaptar las células al medio TurboDoma libre de proteína (Cell Culture Technologies GmbH, Zurich, No. THP) el medio HL-1 fue intercambiado gradualmente por el TurboDoma. Los pasos de adaptación para el medio HL-1 a TurboDoma fueron efectuados de manera análoga a la reducción de FCS.

Ejemplo 18: Purificación de neurotripsina de longitud completa. 20 litros de sobrenadante del ejemplo precedente fueron filtrados a través de un filtro óptico polygard CR de 1 µm (Millipore) y concentrados a 5 litros por filtración en flujo transversal (SKAN AG) . Croma tografía de afinidad con Heparina . Se agregó NaCl al sobrenadante concentrado para alcanzar una concentración final de 0.3 M antes de cargar éste sobre una columna de heparina de 120 ml (columna Heparin sepharose 6 Fast Flow XK 50/20; Amersham Biosciences). La columna fue equilibrada con MOPS 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7.2 (amortiguador A) . La mezcla fue cargada sobre una columna a una velocidad de flujo de 1 ml/min a 20°C sobre un Purificador Aekta Purifier (Amersham Biosciences Europe GmbH) . La columna fue lavada con cuatro volúmenes de columna (CV) de amortiguador A. Las proteínas unidas fueron eluidas por un gradiente en MOPS 20 mM, NaCl 1 M, pH 7.2 (amortiguador B) . El gradiente fue el siguiente: En 1 CV de 0% de B a 43% de B, 3 CV a 43% de B, en 2 CV de 43 a 100% de B, y 3 CV a 100% de B. La neurotripsina comienza a fluir en una concentración de cloruro de sodio de 450 mM. Las fracciones de elución que contenía neurotripsina (proteína de longitud completa y dominio de proteasa) fueron reunidas, divididas en alícuotas y almacenadas a -20°C. Croma tografía de interacción hidrofóbica . Esta se llevó a cabo sobre una matriz polimérica sustituida con butilo (Butyl sepharose 4 Fast Flow, Amersham Biosciences Europe GmbH) . Para ajustar la muestra en las condiciones de carga, se agregó lentamente cloruro de' sodio bajo agitación constante. Después de ajustar la concentración de cloruro de sodio, la muestra fue centrifugada en una centrífuga Sorvall RC-5B de 30 min a 12000 rpm en un rotor SS34 a 4°C. El sobrenadante fue cargado a una velocidad de flujo de 1 ml/min sobre una columna de 25 ml equilibrada (MOPS 20 mM, cloruro de sodio a 1.5 M, pH 7.2) sobre un sistema de cromatografía Aekta Purifier (Amersham Biosciences Europe GmbH) a 20°C. Las proteínas unidas fueron eluidas aplicando un gradiente lineal de concentración decreciente de cloruro de sodio (1.5 M-0.05 M) en MOPS 20 mM, pH 7.2, a 1 ml/min. La neurotripsina de longitud completa comienza a eluir a una concentración de cloruro de sodio de 900 mM. La proteína de longitud completa que contiene las fracciones de elución fue reunida, y almacenada a -20°C. Croma tografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC) . Se acoplaron iones Cu2+ a sefarosa (Chelating Sepharose Fast Flow, Amersham Biosciences Europe GmbH) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se agregó cloruro de sodio sólido a la muestra para incrementar la concentración a más de 0.5 M. La muestra fue centrifugada posteriormente en una centrífuga Sorvall RC-5B durante 30 min a 12000 rpm en un rotor SS34 a 29°C. El sobrenadante resultante fue aplicado a 1 ml de columna de cobre y sefarosa a una velocidad de flujo de 1 ml/min en un sistema de cromatografía Ettan (Amersham Biosciences Europe GmbH) a 4°C. Las proteínas fueron eluidas con un gradiente de imidazol de 10-250 mM e MOPS 20 mM, cloruro de sodio a 0.5 M, pH 7.2. El gradiente fue el siguiente: En 15 CV de 0% de B a 10% de B, en 5 CV de 10% de B a 100% de B, y 10 CV a 100% de B. la neurotripsina de longitud completa comienza a fluir a 150 mM de imidazol. Las fracciones que contienen neurotripsina de longitud completa fueron reunidas y almacenadas a 4°C. Croma tografía de in tercambio iónico . Para la cromatografía de intercambio iónica, la muestra fue diluida a 2.5 veces a una concentración de cloruro de sodio final a 0.2 M, y centrifugada en una centrífuga Sorvall RC-5B durante 30 min a 12000 rpm en un rotor SS34 a 4°C. El sobrenadante limpio fue aplicado a una velocidad de flujo de 0.1 ml/min sobre una columna MonoS PC 1.6/5 (Amersham Biosciences Europe GmbH) equilibrada con MOPS 20 mM, NaCl de 200 mM, pH 7.2. Las proteínas unidas fueron eluidas por un gradiente lineal de cloruro de sodio (0.05 M-l M) . La neurotripsina de longitud completa comienza a eluir a cloruro de sodio a 300 mM. Las reacciones que contiene el dominio de proteasa fueron eluidas y almacenadas a 20°C. En esta forma es producida la neurotripsina de longitud completa en forma electroforéticamente pura. La Figura 11 muestra la neurotripsina de longitud completa purificada, como es visualizada por la tinción de plata sobre un gel de SDS-PAGE gel (A) , y, es visualizada por inmunotinción usando un anticuerpo específico para neurotripsina en una análisis Western blot (B) .

Ejemplo 19: Purificación del dominio de proteasa de la neurotripsina. Las fracciones de cromatografía de afinidad con heparina del ejemplo anterior que contienen la proteína de longitud completa y el dominio de proteasa fueron sometidas a cromatografía de interacción hidrofóbica como anteriormente. El sobrenadante de la solución centrifugada fue cargado a una velocidad de flujo de 1 ml/min sobre una columna de 12 ml equilibrada (MOPS 20 mM, cloruro de sodio 1.75 M, pH 7.2). Las proteínas unidas fueron eluidas aplicando un gradiente lineal de concentración decreciente de cloruro de sodio (1.75 M-0.05 M) en MOPS 20 mM, pH 7.2, a 1 ml/min. El dominio de proteasa se comienza a eluir a una concentración de cloruro de sodio a 1 M. Las fracciones que contienen el dominio de proteasa fueron reunidas y almacenadas a -20°C. Se efectuó la IMAC (Cromatografía de afinidad con metal inmovilizado) como para la Nt de longitud completa. La cromatografía de intercambio iónico se efectuó como para la Nt de longitud completa. De esta manera, el dominio catalítico aislado de la neurotripsina se produjo en forma electroforéticamente pura.

Ejemplo 20: Clonación, expresión y purificación de una proteína de agrina modificada adecuada como sustrato que contiene el sitio de escisión a, pero no el sitio de escisión ß . El pcDNA-Agrina SN Y4Z19 codifica para la forma de la agrina unida a la membrana. Primero, se construyó una variante de agrina soluble, secretada, usando los cebadores 5'-AAAGTTAAGAAACCTGGAATCCACTTCACACCAGC-3' (SEQ ID NO: 1) introduciendo un sitio de Hpal y 5'- AAAAGCGGCCGCTCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGGGAGTGGGGCAGGGTCTTAG-3' (SEQ ID NO: 2) introduciendo un sitio de Nol i. El producto de la PCR resultante fue cortado con Hpal y Nol i y clonado en un vector pEAK8 que contiene la secuencia que codifica para la calsintenina-1 humana cortada con las mismas endonucleasas de restricción. Previamente, había sido removido un sitio de Hpa l adicional en el vector usando una estrategia de cambio rápido (Stratagene) . El plásmido recombinante resultante codifica para una agrina secretada con la secuencia señal de la calsintenina-1 humana la cual es escindida durante la traducción. Sobre la base de este plásmido recombinante se agregó una marca de 8 x His N-terminal clonando el producto de la PCR con los cebadores 5'-AAAAGTTAACCATCACCATCATCACCATCACCATAAACCTGGAATCCACTTCACACCAG-3' (SEQ ID NO: 3) y 5' -TTTATCATGACACAGTCGTTTTCATAG-3' (SEQ ID NO: 4) usando los sitios Hpal y BspHI en el gen de la agrina. En un tercer paso el dominio LG3 en el C-terminal fue reemplazado por EGFP PCR de SOE con los cebadores 5'-GCTGGATATCAACAATCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 5) Y 5'-GGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGAGCCAACTAGCCCCTGTTCGCAGTGC-3' (SEQ, ID NO: 6) con el plásmido recombinante descrito anteriormente como molde o patrón y 5'-GGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGAGCCAACTAGCCCCTGTTCGCAGTGC-3' (SEQ ID NO: 7) y 5'- GGCTGCGGCCGCTCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGTTATCTAGATCCGGTGGATC-3' (SEQ ID NO: 8) con pEGFP como un molde o patrón. Los fragmentos de la PCR resultantes fueron combinados en PCR de SOE y clonados vía el sitio EcoRV y Notl en el vector de corte idéntico. La proteína secretada resultante tiene la secuencia SEQ ID NO: 9. Las células HEK 293T fueron transfectadas con el constructo o plásmido recombinante de agrina-EGFP modificado y se hicieron crecer en medio DMEM suplementado con 10% de FSC y cultivadas durante 6 horas. El medio fue intercambiado a DMEM sin FCS e incubado durante 50 h a 37 °C. Se centrifugaron 200 ml de sobrenadante (4°C, 30 min GS3, 5000 rpm) para obtener el reborde de las células y material insoluble. La solución clara fue dializada dos veces después de una dilución 1:25 contra Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, 0.1% de PEG 6000, pH 8.0, a 4°C durante la noche. Después de la filtración, (tamaño de poro de 0.45 µm) la solución fue sometida a purificación adicional por cromatografía. Croma tografía IMAC. Después de equilibrar con 5 CV de Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8.0, la muestra de proteína fue cargada a 10 ml/min. La columna fue lavada con 10 CV de Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8.0. Para la elución se usó un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en amortiguador de lavado dentro de 25 CV. La agrina-EGFP eluyó a 20-50 mM de imidazol. Las fracciones que contenían la proteína deseada de acuerdo a lo determinado por el análisis Western blotting y SDS-PAGE fueron reunidas y diluidas 1:125, y dializadas contra Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, 0.1% de PEG 6000, pH 8.0, a 4°C durante la noche. Croma tografía de intercambio aniónico . Después de cargar el dializado, la columna POROS HQ20 de 8 ml fue lavada con 2 CV de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8.0. La elución fue con un gradiente de cloruro de sodio y 150 - 2000 mM en amortiguador de lavado. La agrina-EGFP eluyó a una concentración de cloruro de sodio de aproximadamente 900-1100 mM. Las fracciones que contenían la proteína deseada de acuerdo a lo determinado por análisis Western biotting y SDS-PAGE fueron reunidas, diluidas 1:25, y dializadas contra Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, 0.1% de PEG 6000, pH 8.0 a 4°C durante la noche. La neurotripsina resultante fue 90% pura y adecuada para los ensayos de actividad in vi tro . La proteína fue congelada en nitrógeno líquido y almacenada a -20°C. La proteína de fusión agrina-EGFP generada de esta manera contiene el sitio de escisión a pero no el sitio de escisión ß . La agrina-EGFP tiene una masa molecular mayor de 250 kDa. La escisión de la proteína de fusión agrina-EGFP por la neurotripsina genera un fragmento C-terminal de aproximadamente 150 kDa. La Figura 12 muestra la proteína de fusión agrina-EGFP purificada, como es visualizada por la tinción de plata sobre gel de SDS-PAGE (A) , y como es visualizada por inmunotinción usando un anticuerpo contra la mitad C-terminal de la agrina (Ejemplo 22) en un análisis Western blot (B) . Nótese que la EGFP no es esencial para la aplicación descrita, sino que representa un reemplazo. El reemplazo de EGFP por otra proteína o el uso de agrina de longitud completa que mutó en el sitio de escisión a son alternativas equivalentes al producto descrito.

Ejemplo 21: Clonación, expresión y purificación de un fragmento de agrina C-terminal pequeño (agrina-C45) adecuado como sustrato que contiene el sitio de escisión , pero no el sitio de escisión ß . Usando los cebadores 5'-GCGAGTTAACCACCATCACCATCACCATCACCATGGAAGCCTGGCTGACTTTAATGGCTTC TCCTACC-3' (SEQ ID NO: 10) introduciendo el sitio Hpal (HisBNterm) y 5' - ACCTGCGGCCGCTCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGCCAGAGCCAGAGCCGGG AGTGGGGCAGGGTCTTAGCTC-3' (SEQ ID NO: 11) introduciendo un sitio Notl (BStreplink) y pcDNA3.1-AgrinYOZO como molde o patrón se amplificó el fragmento de ADN que codifica para los dos últimos dominios de LG y el último dominio similar a EGF de la agrina. Usando esta estrategia, se insertaron secuencias de ADN que codifican para una marca de 8xHis N-terminal y una marca de Strep C-terminal. El producto de la PCR resultante fue escindido con las enzimas de restricción Notl y Hpal (negrillas en las secuencias cebadoras) y clonado en vector pEAK8 que tiene la secuencia que codifica para el péptido señal de la calsintenina-1 humana cortada con las mismas enzimas de restricción. El plásmido recombinante resultante pEAK8-C45agrina contiene la región codificadora de la secuencia señal de la calsintenina-1 humana como una señal de secreción para la agrina C45. La clonación se efectuó en E. coli al igual que la amplificación del plásmido. Para la expresión las células HEK 293T fueron transfectadas usando el método de fosfato de calcio. Durante la expresión en células HEK 293T el péptido señal es escindido. La proteína secretada resultante tiene la secuencia (SEQ ID NO: 12) . Las células HEK 293T fueron cultivadas hasta 80% de confluencia en placas de cultivo de 7 x 500 cm2 (CORNING) con 100 ml de medio DMEM (GIBCO) suplementado con 10% de FCS cada una. Para la transfección se equilibraron 35 ml de CaCl2 500 mM y 35 ml de amortiguador HBS (HEPES 50 mM, NaCl 140 mM, Na2HP04, pH 7.1) a TA. Se agregaron dos mg de pEAK8-agrina-C45 DNA a la solución de CaCl2 y se mezclaron con amortiguador HBS. La mezcla de transfección fue incubada a TA durante 30 min. Para la transfección de 500 cm2 de células HEK se agregaron por goteo 10 ml de mezcla de transfección al cultivo y se incubó durante 4 h a 37 °C en el incubador a 37 °C. La mezcla de transfección fue entonces removida lavando una vez con PBS y adición de DMEM sin FCS. Después de 60 h el medio acondicionado fue cosechado y filtrado usando un filtro Steritop 0.22 µm (MILLIPORE) . El sobrenadante fue sometido directamente a purificación por IMAC usando una columna de NI-NTA (POROS de 8 ml) sobre un sistema de cromatografía de perfusión BioCAD (Perseptive Biosystems) después de ajustar el pH de la solución a pH 8.5 con amortiguador de Tris ÍM pH 8.5. El medio acondicionado fue cargado con una velocidad de flujo de 10 ml/min, la columna fue lavada con 20 CV de Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, pH 8.0. Para elución se usó un gradiente lineal de 0 a 1 M de imidazol en amortiguador de lavado para 10 CV. Las fracciones que contenían el fragmento de agrina-C45 puro fueron reunidas y el amortiguador fue intercambiado con la columna de NAP 25 (Pharmacia) en Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM, 0.1% de PEG 6000, pH 8.0. La proteína purificada fue congelada en nitrógeno líquido y almacenada a -20°C. El fragmento de agrina purificado con este procedimiento es adecuado como un sustrato para la neurotripsina. El fragmento de agrina-C45 generado de esta manera contiene el sitio de escisión ß, pero no el sitio de escisión a . La agrina-C45 tiene una masa molecular de aproximadamente 45 kDa. La escisión de la proteína agrina-C45 por la neurotripsina genera un fragmento N-terminal de aproximadamente 23 kDa y un fragmento C-terminal de aproximadamente 22 kDa. La Figura 13 muestra la proteína agrina-C45 purificada, de acuerdo a lo visualizado por la tinción de plata por un gel de SDS-PAGE (A) , y visualizada por la tinción de su marca de Strep C-terminal usando StrepTactin en un análisis Western blot (B) .

Ejemplo 22: Generación de un anticuerpo policlonal contra la mitad C-terminal de la agrina de rata. Se hicieron crecer células HEK 293T hasta el 80% de confluencia en matraces de cultivo tisular de 16 x 150 cm2. Cada matraz fue usado para inocular placas de 4 x 500 cm2. Las placas de 500 cm2 contenían .80 ml de medio de cultivo y fueron recubiertas con poli-L-lisina. Las células crecieron hasta una confluencia de 60-80% dentro de dos días. Las células fueron transfectadas con el método de fosfato de calcio, con 1 µg de cada uno de pcDNA-agrinaY4Z8 y pcDNA-hNT por ml de medio de cultivo (DMEM/10%FCS) . El medio fue cambiado a DMEM sin FCS la siguiente mañana. Las células crecieron durante 4 días a 37°C/10% de C02. El sobrenadante fue cosechado, centrifugado durante 30 min a 3000 rpm a 4°C y filtrado (tamaño de poro de 0.45 µm) a TA. El pH del filtrado se fijó en 7.0 con amortiguador de HEPES 1 M, pero sin exceder una concentración final de 20 mM. Este fue cargado a 1 ml/min sobre una columna de heparina (17 ml de heparina sepharose; capacidad de aproximadamente 2 mg/ml de matriz de gel) . La columna fue equilibrada con 5 CV de HEPES 20 mM, NaCl de 80 mM, pH 7.5, y lavada con 2CV de HEPES 20 mM, NaCl 80 mM, pH 7.5. Las proteínas unidas fueron eluidas con un gradiente lineal sobre 8 CV de NaCl 80 - 1000 mM en HEPES 20 mM, pH 7.5. El fragmento de 100-kDa eluyó a aproximadamente 400 - 600 mM NaCl. Las fracciones que contenían la proteína blanco fueron reunidas, de acuerdo a lo verificado por SDS-PAGE y análisis Western blot. Las fracciones reunidas fueron dializadas durante la noche a 4°C contra HEPES 20 mM, pH 7.5 1:100, de modo que la concentración de NaCl se redujo a menos de 5 mM. El dializado fue centrifugado durante 30 min con 12000 rpm a 4°C y cargado sobre una columna MonoQ (7.8 ml de columna HQ POROS, capacidad: 10-20 mg/ml de matriz) equilibrada con Tris 20 mM, pH 8.0. Las proteínas unidas fueron eluidas con un gradiente lineal de 20 CV de NaCl 0-1000 mM en Tris 20 mM, pH 8.0. El fragmento de 100-kDa eluyó a 100-200 mM de NaCl. Las fracciones que contenían la proteína blanco, de acuerdo a lo determinado por SDS-PAGE y análisis western blot fueron reunidas. Inmunización . La proteína purificada fue congelada rápidamente sumergiendo en un tubo lleno con nitrógeno líquido y almacenada a -80°C. Los conejos fueron inmunizados usando porciones de 50 µg de la proteína con procedimientos estándar. Los anticuerpos resultantes son adecuados para la detección de agrina de longitud completa, así como fragmentos de agrina que contiene la parte C-terminal de la agrina, específicamente, fragmentos de agrina que contienen la parte de agrina situada entre los sitios de escisión a y ß .

Ejemplo 23: Generación de anticuerpo policlonal contra el dominio LG3 de agrina de rata Se cultivaron células HEK 293T hasta una confluencia del 80% en placas de cultivo 5 x 500 cm2 (CORNING) en 100 ml de DMEM (GIBCO) suplementado con 10% de FCS cada uno. Para la transfección se suplementaron 25 ml de CaCI2 500 mM y 25 ml de amortiguador HBS (HEPES 50 mM, NaCl 140 mM, Na2HP04 1.5 mM, pH 7.1) con 1.5 mg de ADN de pEAK8-agrina-C45 y 15 µg de ADN de pcDNA-hNT. La mezcla de transfección fue incubada a TA durante 45 min. Para la transfección de 500 cm2 de células HEK se agregaron por goteo 10 ml de mezcla de transfección al cultivo y se incubó durante 4 h a 37°C. La mezcla de transfección fue removida lavando tres veces con PBS y adición de medio de DMEM sin FCS. Después de 60 h el medio acondicionado fue cosechado y filtrado usando un filtro Steritop de 0.22 µm (MILLIPORE) . Cotransfectando las células con pcDNA-hNT se escindió el fragmento de agrina-C45 y se liberó el dominio LG3 de la agrina de rata. Para obtener el borde de los contaminantes mayores el medio acondicionado fue diluido 1:10 y dializado 5 veces contra Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0, y sometido a cromatografía de intercambio iónico. El medio dializado fue cargado a 10 ml/min sobre una columna MonoQ de 4 ml (empacada automáticamente con Uno Sphere MonoQ material de BioRAD, 2 x 4 cm) conectada a un sistema de cromatografía BioCAD (Perseptive Biosystems) . La columna fue lavada con 20 CV de Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0. Se usó un gradiente de NaCl 50 mM a NaCl 2000 mM en Tris-HCl de 50 mM, pH 8.0, para la elución. (Este primer paso puede ser reemplazado opcionalmente por una cromatografía de afinidad con metal usando una columna de sepharose quelada con Ni2+) . Las proteínas deseadas fueron encontradas en el flujo a través de la fracción y sometidas directamente a cromatografía de afinidad usando una columna de StrepTactin de 10 ml previamente equilibrada con Tris-HCl de 50 mM, NaCl de 150 mM, pH 8.0. Después de la unión de las proteínas a flujo por gravedad, la columna fue lavada con 10 CV de amortiguador de equilibrio. La elución fue efectuada usando 6 veces 0.5 CV del amortiguador de equilibrio suplementado con destiobiotina 2.5 mM. La elución fue analizada usando SDS-PAGE y las fracciones que contenían el fragmento de agrina-C45 y el dominio de LG3 fueron concentradas usando concentradores Centriprep 10.000 (MILLIPORE) a un volumen de 200 µl. El concentrado resultante fue cargado sobre la columna de filtración en gel Superdex S75 (Amersham Pharmacia, 1.6 x 30). La cromatografía fue efectuada con una velocidad de flujo de 0.3 ml/min usando Tris-HCl 50 mM, 250 mM NaCl, pH 8.0. La elución fue analizada usando SDS-PAGE, las fracciones que contenían el dominio LG3 puro fueron reunidas y congeladas en nitrógeno líquido. Inmuni za ción . Para generar anticuerpos policlonales contra el dominio LG3 de la agrina se usaron fragmentos de 50 µg para inmunizar ratones. El anticuerpo resultante es útil para la detección de agrina de longitud completa, así, para la detección de fragmentos de agrina que contienen el dominio LG3 de la agrina.

Ejemplo 24: Ensayo para la actividad proteolítica de la neurotripsina. La medición de la actividad de la neurotripsina se efectuó en NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, 0.1% de PEG, y MOPS 20 mM, pH 7.5 en tubos de baja unión de proteína (Eppendorf). Las mediciones de la actividad de la neurotripsina también pueden ser efectuadas usando el mismo amortiguador incluyendo hasta 30% de DMSO. La neurotripsina humana es usada en una concentración que da como resultado la escisión de aproximadamente el 80% del sustrato dentro de 3 horas. Como sustrato, se usaron 0.1-1 µM de agrina-EGFP o 0.1 - 3 µM de agrina-C45. La mezcla de reacción se incubó durante 3 horas a 37 °C. La reacción se detuvo entonces mediante la adición de amortiguador de muestreo de SDS-PAGE convencional y calentando a 70°C durante 5 min. Los productos de escisión generados son inspeccionados después de la SDS- PAGE. La Figura 14 da un ejemplo de un ensayo que usa agrina-EGFP modificada como sustrato y un anticuerpo contra la porción C-terminal de la agrina para la detección del producto de la escisión C-terminal de la agrina-EGFP después de la SDS-PAGE y el análisis Western blot. La Figura 15 da un ejemplo de un ensayo que usa agrina-C45 como sustrato. En este caso, se usó Streptactin (IBA GmbH) para la detección del producto de escisión C-terminal. Los anticuerpos contra el dominio LG3 de la agrina (generados como se describió en el Ejemplo 23) también pueden ser usados para este propósito. De manera alternativa, los geles de SDS-PAGE son teñidos con métodos de tinción de proteína convencionales, como la tinción de plata (Figura 15A) , azul brillante de Coomassie, o, para cuantificación, con rubí Sypro (BioRad) .

Ejemplo 25: Determinación de los sitios de escisión para la neurotripsina dentro de la agrina: sitios de escisión a y ß. Para determinar la posición exacta de la escisión del sitio de escisión a se coexpresó una variante de la agrina unida a la membrana con neurotripsina humana en células HEK293T. El producto de la escisión de 100-kDa resultante que apareció en el sobrenadante de cultivo, fue purificado (véase el Ejemplo 22) y secuenciado N-terminalmente por degradación de Edman en un Secuenciador Procise 492 cLC (Applied Biosystems). La secuencia determinada fue ASXYNSPLGXXSGDK donde X significa residuos de cisteína. De esto puede concluirse que la escisión ocurre en la extensión de la secuencia VVTHGPPIERASCYNSPLGCCSDK después de la arginina en la posición 995. Las alineaciones de secuencia de las diferentes secuencias de agrina de mamífero y la secuencia de agrina del pollo (Gallus gallus) indican un alto grado de conservación evolutiva de los aminoácidos que flanquean al sitio de escisión a de la agrina.

Los 5 aminoácidos sobre el N-terminal y los 4 aminoácidos sobre el lado C-terminal del sitio de escisión a de la agrina (el sitio de escisión a de la agrina se localiza entre la Arginina 995 y la Alanina 996) define la secuencia de consenso P-P/A-l/V-E-R-A-S/T-C-Y para el sitio de escisión a de la agrina. Para la determinación de la posición exacta de la escisión del sitio de escisión ß, la agrina C45 fue coexpresada con neurotripsina humana en células HEK293T. El producto de escisión de 21-kDa resultante fue purificado (véase el Ejemplo 23) y secuenciado N-terminalmente. La secuencia resultante fue SVGDLETLAF. Esta secuencia se encuentra en la extensión GLVEKSVGDLETLAFDGRT. De esto puede concluirse que la agrina es escindida por la neurotripsina después de la lisina en la posición 1754 entre los dominios EGF4 y LG3. Las alineaciones de secuencia de varias secuencias de agrina de mamífero y las secuencia de agrina de pollo (Gallus gallus) indican un alto grado de conservación evolutiva de los aminoácidos que flanquean al sitio de escisión ß de la agrina.

Los 5 aminoácidos sobre el N-terminal y los 4 aminoácidos sobre el lado C-terminal del sitio de escisión ß de la agrina (el sitio de escisión ß de la agrina se localiza entre la Lisina 1754 y la Serina 1755) definen la secuencia de consenso G/A-L/1/T-V/l-E-K-S-V/A-G para el sitio de escisión ß de la agrina.

Los resultados descritos anteriormente pudieron ser confirmados usando ensayos de actividad in vi tro con neurotripsina humana purificada y variantes de sustrato de agrina purificados transfiriendo los productos de escisión resultantes sobre una membrana de PVDF y el secuenciamiento N-terminal subsecuente. En resumen, la agrina es escindida por la neurotripsina en dos posiciones. El primer sitio de escisión (sitio de escisión a) se encuentra en la posición R995-A996 (contando desde el número de acceso NP 786930, agrina de rata) , es decir que la escisión ocurre C-terminalmente en la agrina en la extensión de la secuencia PPIERASCY de la agrina de la rata (Rattus norvegicus) entre el segmento rico en serina-treonina y el dominio de SEA. La comparación de las secuencias de mamífero y ave que flanquean al sitio de escisión a de la agrina define la secuencia de consenso P-P/A-l/V-E-R-A-S/T-C-Y para el sitio de escisión a de la agrina, donde la escisión por la neurotripsina ocurre C-terminalmente del residuo de arginina (R) . La segunda escisión (sitio de escisión ß) se localiza en la posición K1754-S1755 (contando desde el número de acceso NP 786930, en la agrina de rata) , es decir, que la escisión ocurre C-terminalmente de la lisina en el contexto de la secuencia LVEKSVGD en el segmento que conecta a los dominios EGF4 y LG3 de la agrina. La comparación de las secuencias de mamífero y llave que flanquean al sitio de escisión ß de la agrina define la secuencia de consenso G/A-L/1/T-V/l-E-K-S-V/A-G del sitio de escisión ß de la agrina, donde la escisión por la neurotripsina ocurre C-terminalmente del residuo de Lisina (K) .

Ejemplo 26: Preparación de compuestos de molécula pequeña para el ensayo de inhibición. Los compuestos fueron disueltos en DMSO hasta la concentración final de 10 mM. Para el ensayo la solución de DMSO fue diluida con MOPS 10 mM, pH 7.5, hasta una concentración de 500 µM y 5% de DMSO (dilución 1:20). El material insoluble y precipitado fue removido por centrifugación (15 min, 16 krcf, TA) . El sobrenadante claro fue usado para el ensayo de inhibición, como se describe en el Ejemplo 27.

Ejemplo 27: Ensayo para determinar la actividad inhibidora de compuestos de molécula pequeña sobre la neurotripsina . La actividad inhibidora de los compuestos de molécula pequeña sobre la actividad catalítica de la neurotripsina se mide en NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, 5% de DMSO, 0.1% de PEG 6000, y MOPS 20 mM, pH 7.5 en 0.5 ml de tubos Eppendorf de baja proteína en un volumen total de 15 µM. Se usaron versiones truncadas catalíticamente activas o neurotripsina humana o murina a una concentración que dio como resultado la escisión del 80% de un sustrato dentro de 3 horas. Como un sustrato, se usó agrina soluble modificada, por ejemplo, 0.1-1 µM de agrina EGFP (Ejemplo 20) o 0.1-3 µM de agrina C45 modificada (Ejemplo 21). Se agregó solución en inhibidora en MOPS 10 mM, pH 7.5, que contenía 5% de DMSO a una concentración final de 25 ó 150 µM. La mezcla de reacción es incubada durante 3 h a 37°C. El DMSO a 5% en la mezcla de reacción se requiere para mantener la solubilidad de los inhibidores de compuestos inorgánicos pequeños. La reacción comenzó por la adición del sustrato o la enzima. Al final del periodo de incubación, la reacción se detuvo por la adición por amortiguador de muestreo de SDS-PAGE convencional y calentando a 70°C durante 5 min. La muestra digerida se separó por SDS-PAGE y se inspeccionó después de la visualización del sustrato. Una forma de visualización del sustrato es el análisis Western blotting. Para el análisis, las proteínas son transferidas sobre membranas de nitrocelulosa. De las intensidades del fragmento de digestión de 150-kDa generado por la escisión de la agrina-EGFP o el fragmento de digestión de 22-kDa generado por la escisión de la agrina C45, se estimaron las actividades inhibidoras de los compuestos de molécula pequeña seleccionados. La Figura 16 muestra un resultado típico de la selección de inhibidor por análisis Western blot con un ensayo usando agrina-EGFP como un sustrato y un anticuerpo contra la porción C-terminal de la agrina para la detección. Se midió la intensidad de los fragmentos 150-kDa de la agrina-EGFP generado o la escisión mediada por neurotripsina en presencia de los compuestos inhibidores putativos (Figura 16 A) y se graficaron las intensidades relativas (Figura 16 B) .

El compuesto No. 7 (número de identificación 1672-3440 de ChemDiv, San Diego, CA, USA, N^amidino-N4- (3, 5-dibromosaliciliden) -sulfanilamida, nombre IUPAC: amino{[(4-{ [ (ÍE) - (3, 5-dibromo-2-hidroxifenil) metilen] amino} fenil) sulfonil] amino }metaniminio) se encontró que tiene una actividad inhibidora significativa sobre la neurotripsina. De manera alternativa, la visualización y cuantificación de la muestra digerida se logró directamente en el gel tiñendo con métodos de tinción de proteína convencionales, como la tinción de plata, tinción con azul brillante de Coomasíe, o, para -la cuantificación, por tinción con rubí Sypro (BioRad) .

Ejemplo 28: Dependencia de la dosis del compuesto inhibidor No. 7, N' -amidino-N'- (3, 5-dibromosaliciliden) -sulfanilamida. Se probaron diferentes concentraciones de compuesto No. 7 de 0 a 200 µm con el ensayo descrito en el Ejemplo 27 con agrina-EGFP modificada como sustrato. El producto generado fue detectado por análisis Western blot (Figura 17A) y cuantificado (Figura 17B) . La cantidad semimáxima del producto comparado con la reacción sin compuesto No. 7 se encontró en la concentración de aproximadamente 60 µm, de este modo el valor de la CI50 para el compuesto No. 7 está en el intervalo de aproximadamente 60 µm.

Ejemplo 29: Determinación de la especificidad de la inhibición de la neurotropsina por el compuesto No. 7, N'-amidino-N4- (3, 5-dibromosaliciliden) -sulfanilamida . Para verificar la especificidad de un compuesto que se encontró tiene un efecto inhibidor sobre la neurotripsina humana, se efectuaron mediciones cinéticas enzimáticas estándar con un conjunto de serina proteasas comunes. Se usó un ensayo fotométrico estándar con profesas comercialmente disponibles y sustratos de péptido pequeño acoplados a para-nitroanilida. Proteasas : Factor Xa activado de plasma bovino (6.1 mg de proteína/ml; Sigma Aldrich Chemie GmbH, D-89552 Steinheim, Alemania) . Tripsina de páncreas de cerdo (16099 U/mg; Fluka Chemie AG, CH-9471 Buchs, Suiza) . tPA: Actilyse (10 mg; Dr. Karl Thomae GmbH, Birkendorfer Stra e 65, D-88397 Biberach, Alemania) Trombina de plasma bovino (50 NIH/mg, Merck, D-64271 Darmstadt, Alemania) . Urocinasa HS medac (100000 I.E., medac Gesellschaft für klinische Spezialpráparate mbH, D-22880 Wedel, Alemania) . Kalicreina de páncreas porcino (43 U/mg de sólido; Sigma Aldrich Chemie GmbH) . Plasmina de plasma humano (3.2 U/mg de sólido; Sigma Aldrich Chemie GmbH) .

Sustra tos Bz-IEGR-pNA: S-2222, Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA, 1-20128 Milano, Italia. Bz-FVR-pNA: N-Benzoil-Phe-Val-Arg-p-nitroanilida HCl, Bachem AG, CH-4416 Bubendorf, Suiza. IPR-pNA': S-2288, Chromogeniz-Instrumentation Laboratory SpA. Bz-VGR-pNA: N-Benzoil-Val-Gly-Arg-p-nitroanilida, Sigma Aldrich Chemie GmbH. N-Tosyl-GPK-pNA: N-Tosil-Gly-Pro-Lys-p-nitroanilida, #90178, Fluka Chemie AG.

Condiciones de ensayo El ensayo fue efectuado en Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, 5% de DMSO, 0.1% de PEG 6000, pH 8.0, con la cantidad apropiada de proteasa para medir las velocidades iniciales y cantidades variables de sustratos de péptido-p-nitroanilina en un intervalo más pequeño de 0.1 veces KM. Para estudios de inhibición se usaron 100 µM de compuesto No. 7. Las mediciones se efectuaron a 25°C en un espectrofotómetro Cary 50 (VARÍAN) . Las velocidades iniciales fueron determinadas usando varias concentraciones de sustrato por debajo de 0.1 veces la KM para estar en el intervalo de dependencia directa de la velocidad inicial de la concentración de sustrato. Las velocidades iniciales fueron graficadas contra concentraciones de sustrato en ausencia o presencia del inhibidor candidato No. 7. El compuesto fue usado en una concentración de 100 µM.

Ninguna de las enzimas investigadas mostró una inhibición significativa por el compuesto No. 7 a una concentración de 100 µM. Las Figuras 18-24 muestran los resultados de las mediciones cinéticas enzimáticas en presencia y ausencia del compuesto No. 7 para el factor Xa, tipsina, tPA, trombina, urocinasa, calicreina y plasmina.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para determinar si un compuesto es un inhibidor de neurotripsina, caracterizado porque el compuesto es incubado junto con neurotripsina, una variante de la misma o un fragmento que comprende el dominio de proteasa de la neurotripsina y con una proteína o péptido que comprende agrina, una variante de la misma y un fragmento que comprende el sitio de escisión a o ß de la agrina, en una solución amortiguadora acuosa, y se mide la cantidad de escisión de la agrina. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se usa neurotripsina humana, una variante de la misma o un fragmento que comprende el dominio de proteasa de la neurotripsina humana. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se usa neurotripsina humana de longitud completa. . El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque usa un fragmento que comprende el dominio de proteasa de la neurotripsina humana. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la proteína o péptido que comprende agrina, una variante de la misma o un fragmento es una proteína de fusión con una proteína o péptido marcador. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la proteína o péptido que comprende agrina, una variante de la misma o un fragmento que contiene un marcador no peptídico para la detección espectroscópica. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se usa una proteína o péptido que comprende agrina de longitud completa. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se usa una proteína o péptido que comprende un fragmento agrina que comprende el sitio de escisión a o el sitio de escisión ß . 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el fragmento de agrina es un fragmento que comprende al menos 6 aminoácidos que retienen el sitio de escisión a y/o el sitio de escisión ß . 10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el fragmento de agrina es un fragmento que comprende al menos 8 aminoácidos de la secuencia de consenso del sitio de escisión a . 11. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el fragmento de agrina es un fragmento que comprende al menos 8 aminoácidos de la secuencia de consenso del sitio de escisión ß. 12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque es usado un fragmento de agrina C-terminal C45. 13. Un método para medir la actividad catalítica de la neurotripsina, caracterizado porque la neurotripsina, una variante de la misma o un fragmento que comprende el dominio de proteasa es incubado con una proteína o péptido que comprende agrina, una variante de la misma o un fragmento que comprende el sitio de escisión a o ß de la agrina, en una solución amortiguadora acuosa, y se mide la cantidad de escisión de agrina. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la proteína o péptido que comprende agrina, una variante de la misma o un fragmento es una proteína de fusión o una proteína o péptido marcador. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque la proteína o péptido que comprende agrina, una variante de la misma o un fragmento contiene un marcador no peptídico para la detección espectroscópica. 16. El compuesto de fórmula (1) caracterizado porque Hal1 Hal' son, independientemente entre sí, flúor, cloro o bromo; y sales de adición farmacéuticamente aceptables del mismo. 17. El compuesto de conformidad con la reivindicación 16 de fórmula (1), caracterizado porque Hal1 y Hal2 son bromo; y sales de adición farmacéuticamente aceptables del mismo. 18. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto de fórmula (1) de conformidad con la reivindicación 16 ó 17 y un soporte farmacéutico. 19. El compuesto de fórmula (1), de conformidad con la reivindicación 16 ó 17 para usare como medicamento. 20. El uso de un compuesto de fórmula (1) de conformidad con la reivindicación 16 ó 17 para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades causadas por deficiencia de sinapsis. 21. El uso de conformidad con la reivindicación 20 para el tratamiento y/o profilaxis de atrofia músculo esquelético. 22. El uso de conformidad con la reivindicación 20 para el tratamiento y/o profilaxis de la esquizofrenia. 23. El uso de conformidad con la reivindicación 20 para el tratamiento y/o profilaxis de disturbancia cognitiva. 24. El uso de un compuesto de fórmula (1) de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades causadas por la deficiencia de sinapsis.