JP4920675B2 - ニューロトリプシン阻害剤とその判定 - Google Patents
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Description
本発明は、水性緩衝液中においてニューロトリプシン、その変異体、またはニューロペプシンのプロテアーゼドメインを含む断片とアグリンを含むタンパク質またはペプチド、その変異体またはアグリンのα−またはβ−切断部位を含む断片とをインキュベーションして、そしてアグリンの切断量を測定することを特徴とする、ニューロトリプシンの触媒活性の測定方法と関連する。さらに、本発明は、水性緩衝液中において化合物をニューロトリプシン、その変異体、またはニューロトリプシンのプロテアーゼドメインを含む断片、およびアグリンを含むタンパク質またはペプチド、その変異体またはアグリンのα−またはβ−切断部位を含む断片と一緒にインキュベーションして、アグリンの切断量を測定することを特徴とする、化合物がニューロトリプシン阻害剤であるか否かの判定方法と関連する。
(式中、Hal1およびHal2は、互いに独立して、フッ素、塩素または臭素である)の化合物、およびその医薬的に許容されうる付加塩に関する。
本発明はニューロトリプシンの阻害によってプロシナプス活性(シナプス形成、シナプス分化、シナプスの組織化、シナプス保護、シナプス強化)が高められるとの事実に基づいている。ニューロトリプシン遺伝子は脊髄(実施例1)の運動ニューロンなどの中枢神経系の多くのニューロンで発現されており(Gschwend,T.P.ら、Molec.Cell Neurosci.9;207-219,1997; Wolfer,D.P.ら、Molec.Cell.Neurosci,18: 407-433,2001)、ニューロトリプシンタンパク質は、神経筋接合部の他、多くのCNSシナプス中に存在する(Molinari,F.ら、Science 298: 1779-1781,2002)。ニューロトリプシンはバランスの良いシナプス機能の発達および/または維持の大きな一因となっている。多量のニューロトリプシン(過剰発現)は、少な過ぎるシナプス結合と関連する。CNSニューロン内においてニューロトリプシンを過剰発現しているトランスジェニックマウスは、記憶や学習といった認知機能に非常に重要な2つの脳構造である大脳皮質と海馬状隆起におけるシナプス数の減少を示す。同様に、脊髄運動ニューロン内においてニューロトリプシンを過剰発現しているトランスジェニックマウスは、筋肉活動の神経制御を媒介するシナプスである神経筋接合(NMJ)の減少を示す。
(式中、Hal1およびHal2は、互いに独立して、フッ素、塩素または臭素、特に臭素である)の化合物およびその医薬的に許容されうる付加塩に関する。Hal1およびHal2の一方が臭素であり、他方が塩素またはフッ素である化合物、そしてその医薬的に許容されうる付加塩が好ましい。Hal1およびHal2が臭素である、式(1)の化合物の医薬的に許容されうる付加塩が特に好ましい。
実施例1:ニューロトリプシンは脊髄の運動ニューロンによって強発現される。
生体マウス脊髄の横断低温切片でのin situハイブリッドパタ−ンから、灰白質においてニューロトリプシンmRNAの細胞内での強発現が明らかになっている(Gschwend,T.P.ら、Molec.Cell Neurosci.9: 207-219,1997)。脊髄におけるニューロトリプシンの最も強い発現は、灰白質の前角内の運動ニューロンにおいて認められた。
アグリンに対するニューロトリプシンのタンパク質分解作用が、HEK293T細胞内での2つのタンパク質の同時発現によって試験された。マウスニューロトリプシンのコード配列を含む2310bpのKpnI−HindIII断片を真核発現ベクターpcDNA3.1(−)(Invitrogen)のKpnIとHindIIIにクロ−ニングした。スプライス変異体Y4とZ8を含む膜貫通アイソフォ−ムに存在しているラットアグリンをコードするcDNAクロ−ン(Rupp,F.ら、Neuron 6: 811-823,1991; GenBank Nr.M64780)をKpnIおよびEcoRIを介してpcDNA3(Invitrogen)のポリリンカ−に挿入した。HEK293T細胞は、10%CO2の加湿空気中で37℃のDMEM/10% FCS中で培養した。トランスフェクションでは、3cm皿内に置かれたガラスカバーガラス上のDMEM/10% FCS 3mlに細胞を播種した。播種の翌日、40〜60%のコンフルエンスの細胞に、リン酸カルシウム沈殿を使用して、ニューロトリプシンとアグリン(それぞれ5μgDNA)をコードするcDNAを一過性にトランスフェクションさせた。トランスフェクションから4時間後、培地を慎重に取り除き、3mlの新しいDMEM/10%FCSと交換した。
インビボでのアグリンの切断を試験するために、アグリンのNtおよびC末端の100kDa断片に対する特異的抗体を使用したウェスタンブロットによって発育中マウスおよび成体マウスの脊髄ホモジネ−トを分析した。3、6、12カ月齢のマウスの他、生後4、7、9、10、15、25日目のマウス脊髄から組織ホモジネ−トを調製した。図3に示されるように、Ntは生後3週間目まで最も強く発現しており、7〜10日目に発現レベルが最高になる。アグリンのC末端部分に対する抗体を用いたウェスタンブロットでは、非常によく似た時間的パターンが明らかとなり、ニューロトリプシンによるアグリンの切断がインビボでも起こることを示している。
ニューロトリプシンをThy−1遺伝子のプロモーターの制御下で過剰発現させた。Thy−1遺伝子はマウスの神経系ニューロンにおいて比較的遅くに発現する(場所に応じて、生後4−10日目;Gordon,J.W.ら、Cell 50: 445-452,1987)。したがって、Thy−1プロモーターの制御下にあるニューロトリプシンの発現によって、過剰量のニューロトリプシンの存在がそれ以前の発育段階を混乱させないようになっている。
組織ホモジネ−トを、ヒトニューロトリプシン(hNt)またはマウスニューロトリプシン(mNt)のいずれかを過剰発現している生体マウスの脊髄から調製した。これらのマウスは、不活性型トランス遺伝子を有するマウス(mNtでは497、489、533系統、hNtでは493、494系統)と運動ニューロン特異的HB9プロモーターの制御下でCreレコンビナ−ゼを発現するマウスを交配することで得られた。野生型マウスを対照に使用した。脊髄ホモジネ−トをSDS−PAGEおよびウェスタンブロットにかけた。ウェスタンブロットでは、アグリンのC末端100kDa断片の他、hNtおよびmNtに対する抗体をプロ−ブに用いた。図4に示されるように、アグリンのC末端の100kDa断片は、ニューロトリプシンを過剰発現しているトランスジェニックマウスにおいて強く増加していた。アグリンのC末端の100kDa断片の増量は、異なるトランスジェニックマウス系統での過剰発現のレベルで良好な相関関係にあった。ヒトとマウスのNtは、アグリンに対して同じタンパク質分解作用を示した。これらの結果は、ニューロトリプシンがインビボで濃度依存的にアグリンを切断することを示している。
脊髄運動ニューロン内のニューロトリプシン(Nt)のトランスジェニック過剰発現の効果は、神経筋接合部(NMJ)の免疫組織学的分析によって検討された。トランスジェニックNtの発現を促進させるために使用されたThy−1プロモーターが出生後の第一週中に活性化することが判明しているため(部位によって多少変動する)、出生後の第一週が特に重要であった。この分析では、NMJの表面局在によって横隔膜の筋肉が該比較分析の優れたモデルとなるため、横隔膜が使用された。アグリンのC末端100kDa断片に対するアフィニティー精製済み抗体を使用した免疫組織学的染色によってアグリンを可視化した。図5に示すように、トランス遺伝子の活性化前の時間点であるP0でのアグリンの免疫反応性は野生型マウスとトランスジェニックマウスで同じである(図5:P0)。いずれの場合でも、アグリンの免疫反応性は、図6に示す同じ筋肉でのNMJのα−Btxシグナルと明らかに一致する。P8では、野生型マウスと比較した場合のアグリンの免疫反応性の顕著な減少が、Nt過剰発現マウスの横隔膜のNMJにおいて認められる(図5:P8)。年齢を一致させた野生型マウスにおいてアグリン陽性NMJが密集した運動終板バンドは、ごく少数の大きなNMJ様アグリン陽性構造物を示すのみである。P4マウスにおけるアグリンの免疫反応性は、十分に保存されたNMJから残留NMJを反映する小さい構造物まで変動する、可変サイズの構造物の混在パタ−ンを特徴とする遷移段階を示す(図5:P4)。図5のアグリンの免疫反応性構造の大部分が、図6のα−Btx陽性構造と厳密に一致した。一方、Nt過剰発現マウスでの遷移状態のシナプスの相当な割合において、アグリンシグナルとα−Btxシグナルの比率はP0よりも小さかった(実施例7参照)。
運動ニューロンにおけるニューロトリプシン(Nt)過剰発現の効果と、その後のNMJからのアグリンの除去が、シナプス後装置の可視化によって検討された。蛍光α−ブンガロトキシン(α−Btx)でアセチルコリン受容体を染色することでシナプス後装置を可視化した。図6に示すように、Nt過剰発現(Nt)マウスと野生型(wt)マウスとの比較において、シナプス後装置は出生時(出生後の0日目、P0)には十分に確立されている。出生後の第一週目の終わり(P8)に、Nt過剰発現マウスにおいてNMJのシナプス後装置の大半が実質的に消失した。NMJが野生型マウスにおいて高密度で認められる場合、少数の残留NMJだけがいわゆる運動終板バンド内で認識できる。生後発育4日目(P4)に、依然として十分に形成されているNMJと部分的に溶解したNMJの混合物で構成された不均一パタ−ンが認められる。野生型マウスと比較した場合でのトランスジェニックマウスの運動終板バンド内でのNMJ密度の低下は、この段階のNt過剰発現マウスにおいてNMJの一部が既に完全に消失していることを示唆する。
コンディショナルなNtトランス遺伝子を有するマウス(実施例4に記載)をHB9プロモーターの制御下でCreレコンビナ−ゼを発現しているマウスと交配することにより、運動ニューロンにおいてNtを過剰発現するトランスジェニックマウスを作成した。HB9プロモーターは脊髄運動ニューロンにおいてCreレコンビナーゼの過剰発現を促進させて、ひいては転写停止部分の切出しによって運動ニューロンにおいて不活性型Thy1−Ntトランス遺伝子を活性化させる。該交配に由来するダブルトランスジェニックマウスは、運動上の表現型を示す。それらは不安定な足どりと小さな歩幅でゆっくりと歩く。それらは相当な筋力低下も示す。
Nt過剰発現トランスジェニックマウスと同年齢(若年成体)の野生型マウスの神経筋接合部の比較によって、Nt過剰発現マウスのNMJの顕著な断片化が明らかになった。野生型マウスにおいて出生後3週目までに発生するNMJの典型的プレッツェル構造は、Nt過剰発現マウスでは認められない(図7D、EおよびF)。Nt過剰発現マウスのNMJは、それらの標的筋繊維の表面のほぼ同じ領域を占めるが、それらのシナプス前接触の他、それらのシナプス後接触は隣接組織を形成せず、多数の小さな接触部位に分断される。Nt過剰発現マウスで観察されるNMJの断片化は、高齢者において見られる筋肉萎縮の一形態であるサルコペニアを患う高齢者のNMJでも認められる。
運動ニューロンにおいてNtを過剰発現している若年成体マウスの筋肉の筋繊維数を分析した。個々の筋肉(例えば、ヒラメ筋)を分離して、筋肉中心部を通る筋肉の長軸と垂直に交わるように組織切片を作成した。切片をヘマトキシリンエオシン染色して、繊維を数えた。図8は野生型マウス(図8A)とNt過剰発現マウス(図8B)のヒラメ筋の比較を示す。Nt過剰発現マウスの筋肉は野生型マウスの筋肉よりもかなり薄く、筋繊維数は著しく減少している。異なる4系統のNt過剰発現マウス(表1)のヒラメ筋の筋繊維を数えた。
実施例4の手順に従って、ニューロトリプシンのコンディショナルな過剰発現のためのトランスジェニックマウスを得た。これらのマウスを、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御下でCreレコンビナーゼを発現するヘテロ接合マウスと交配させた。CMVプロモーターはインビボで連続的に活性であり、ひいてはCreレコンビナ−ゼは常に2つのloxP配列において組換えを促進させる。この手順によって、転写停止配列が不活性型トランス遺伝子から取り除かれて、ニューロトリプシンcDNAの転写を可能にする。PCRおよびサザンブロットハイブリダイゼーションによる遺伝子型決定を実施例4と同様に実施した。同様に、ニューロトリプシンの活性部位セリン(セリン711)をアラニンに変えることで、Thy−1プロモーターの下で触媒活性のないニューロトリプシンを過剰発現しているトランスジェニックマウスを作成した。
シナプスに富む領域の組織容量当たりのシナプス数を定量して、シナプス(シナプス前軸索終末の領域、シナプス後脊柱の領域を含む)の大きさのパラメータ、そしてシナプスの長さ(シナプス前および後メンブレンの付着の長さで測定)を測定するために、2つの無関係な系統のニューロトリプシン過剰発現マウス(Nt491/creおよびNt494/cre)および数系統の対照マウス(野生型マウス、CMV−Creマウス、不活性型ニューロトリプシントランス遺伝子Nt491−inact.NtおよびNt494−inact.Ntを有するトランスジェニック親系統)を検討した。28日齢のマウスをMetiofane(シェリング・プラウ)で深く麻酔して、0.9%塩化ナトリウム、次に0.1Mリン酸緩衝液(PB)pH7.4中の2%パラホルムアルデヒドおよび1%グルタルアルデヒドから成る固定剤を心臓にかん流させた。脳を頭骨から取り出して、ビブラトームで100μm厚の連続切片を作成した。切片をPB中1%四酸化オスミウムで後固定させて、2%酢酸ウラニル処理して、エタノールと酸化プロピレンで脱水させ、Durcupan ACM樹脂(Fluka)に包埋した。電子顕微鏡分析のために、前内尾レベルのブレグマ−2mm、そして内外側方向1.5mmの海馬CA1領域を含む切片をさらに薄い切片にした。シナプス試料の採取手順は、開始倍率27,500倍で、互いの間隔が最低50μmの3つの非隣接領域からの海馬CA1領域における放線層の神経網の15〜23のEM試料から成り立った。最終倍率80,000倍で電子顕微鏡写真をプリントし、これらは90〜135μm2の組織を描写した。シナプスは、シナプス前プロファイルが分化膜と隣接する少なくとも3つのシナプス小胞を含む、シナプス前/後プロファイルの2つの併置された肥膜と定義された。超微細構造的基準に従って、シナプスは軸索樹状突起間シナプスと軸索棘状(axospinous)シナプスに分類された。樹状突起幹(dendritic shaft)は、それらの大きさと、ミトコンドリアおよび微小管の有無によって識別した。樹状突起棘(dendritic spine)の直径は小さく、ミトコンドリアと微小管に欠けており、棘器(spine apparatus)を時折含んでいた。軸索樹状突起間シナプスは全てのサンプルにおいてわずかな割合を占めており、したがってさらなる統計的推定からは除外した。除外ラインに触れているものを除いて、各顕微鏡写真において全ての軸索棘状シナプスを数えた。Magnetic Tablet(Kurta)およびMacstereology2.8(Ranfurly Microsystems)分析プログラムを使用して、軸索終末およびシナプス後脊柱の断面積と全ての軸索棘状シナプスのシナプス接合部の長さをプリントから直接測定した。シナプス数の密度は、粒径分布法および式Nv=NA/d(NAは単位面積当たりのシナプスプロファイル数、dはシナプス接合部の平均長;DeFelipe, J.ら、Cereb.Cortex 9: 722-732,1999)を利用して得られた。
ステンレス製剃刀(Electron Microscopy Sciences)を使用して17−32日齢のニューロトリプシン過剰発現マウスと野生型マウスの海馬の傍矢状切片(300μm)を作成して、脳組織が切断による傷害から回復するための十分な時間を与えるために、34℃に保温した含酸素ACSFで満たされたインキュベーション槽に移して1時間培養した。その後、後の実験で使用されるまで切片を室温に保った。
CNS内でのアグリンの切断をインビボで試験するために、NtおよびアグリンのC末端100kDa断片に特異的な抗体を使用したウェスタンブロットによって、発育中マウスおよび成体マウスの脳ホモジネートを分析した。出生後3、6、12カ月のマウスの他、出生後4、7、9、10、15、25日目のマウス脊髄から組織ホモジネートを調製した。Ntは出生後3週目までに強く発現しており、7−10日目の発現が最も高いことが認められた。アグリンのC末端部分に対する抗体を用いたウェスタンブロットによって、よく似た時間的パターンが明らかにされており、CNS内においてニューロトリプシンによるアグリン切断がインビボでも起こることを示している。
不活性型トランス遺伝子(mNtでは497、498、533系統、hNtでは493、494系統)を有するマウスと、CMVプロモーターの制御下でCreレコンビナーゼを発現しているマウスとを交配させて作成したヒトニューロトリプシン(hNt)またはマウスニューロトリプシン(mNt)のいずれかを過剰発現している生体マウス、そして比較のための野生型マウスの脳から組織ホモジネートを調製した。脳ホモジネートをSDS−PAGEとウェスタンブロットにかけた。ウェスタンブロットでは、アグリンのC末端100kDa断片の他、hNtまたはmNtに対する抗体をプローブとして用いた。アグリンのC末端100kDa断片が、ニューロトリプシンを過剰発現しているトランスジェニックマウスにおいて強く増加していることが認められた。アグリンのC末端100kDa断片の増量は、様々なトランスジェニックマウス系統における過剰発現レベルと良好な相関関係にあった。ヒト/マウスのNtは、アグリンに対して同じタンパク分解作用を示した。これらの結果は、NtがCNS内においてインビボで濃度依存的にアグリンを切断することを示す。
ニューロトリプシンは分泌型のマルチドメインタンパク質であり、ヒトニューロトリプシンでは875個のアミノ酸長、推定サイズは97kDa、マウスニューロトリプシンでは761個のアミノ酸長、推定サイズ85kDaである(図1A、B)。活性型タンパク質としてのこのセリンプロテアーゼの発現は、適切な折り畳みに左右され、翻訳後変性(例えば、ヒトのタンパク質では2つの部位、マウスのタンパク質では3つの部位について示されるN−グリコシル化)を受ける可能性が非常に高い(Gschwend,T.P.ら、Mol.Cell.Neurosci.9: 207-219,1997; Proba,K.ら、Biochim.Biophys.Acta 1396: 143-147,1998)。また、ニューロトリプシンはシグナルペプチドを含み、タンパク質を分泌場所から小胞体に導く。疎水性プロットによって決定される膜貫通領域が欠けているため、ニューロトリプシンは内在性膜タンパクではない(Kyte,J. and Doolittle,R.F., J. Mol.Biol.157: 105-132,1982)。ニューロトリプシンのチモーゲン活性化部位は、tPAのものと高い類似性を示す(組織型プラスミノーゲン活性化因子;Tate,K.M.ら、Biochemistry 26: 338-343,1987)。プロテアーゼによるこの部位での切断によって、2つの断片(見かけ上の分子量が約55kDa(マウスのニューロトリプシン)または約67kDa(ヒトのニューロトリプシン)の非触媒ドメインを含む断片、そして約30kDaのプロテアーゼドメインのみを含む断片)がもたらされる。
骨髄腫細胞での安定なトランスフェクションのために、マウスおよびヒトのニューロトリプシンのコーディング領域を特別に設計したベクターに挿入した(Trauneckerら、Biotechnol.9: 109-113,1991)。このベクターによる発現は、Igκプロモーターおよびエンハンサ−によって促進される。目的の転写産物の3’末端は、安定したIg転写産物を模倣するためにIgκの定常ドメインをコード化しているエクソンにスプライシングされる。ベクターは、L−ヒスチジノールの存在下において安定なトランスフェクタントの選択を可能にするヒスチジノール脱水素酵素遺伝子を含んでいる。L−ヒスチジノールはL−ヒスタミンの前駆体およびタンパク質合成の阻害剤である。組換え型ニューロトリプシン生産のために、マウス骨髄腫細胞系統J558L(ECACC #88032902;European Collection of Cell Cultures)内にベクターを安定的にトランスフェクションした。原形質融合またはエレクトロポレーションによる安定的なトランスフェクションのための他の適当な系統としては、マウスP3−X63Ag8.653、マウスSp2/0−Ag14、マウスNSOおよびラットYB2/0が挙げられる(Gilliesら、Biotechnology 7: 799-804,1989;Nakataniら、Biotechnology 7: 805-810,1989;Bebbingtonら、Biotechnology 10: 169-175,1992; Shitaraら、J.Immunol.Meth.167: 271-278,1994)。
使用されたニューロトリプシンの原料は、ニューロトリプシンを発現する骨髄腫細胞系統の培養から生じた細胞培養の調製済み上清であった。これらの細胞は、TechnoMouse発酵器(Integra Biosciences)内での無血清培地における増殖に順応させた(Stoll,T.S.ら、J.Biotechnol.45: 111-123,1996;Ackermann,G.E. and Fent, K., Marine Environmental Research 46: 363-367,1998)。2mMグルタミンおよび10%FCSを含むDMEM(Gibco、No.41966-029)培地から開始して、1%FCSを含むこの培地で増殖させるように、細胞を段階的に順応させた。24ウェルプレートで順応させ、ほぼ隔日で培地交換した。細胞がコンフルエンシーに達した時に、それらを別のウェルに分けた。手順全体を通じて、細胞をコンフルエンシー付近の密度に保った。1%FCSを含むDMEMで良好に増殖している細胞を、0.5% FCSを添加した、タンパク質を含む無血清培地(Bio-Whittacker, No.77201)に移した。HL−1培地中では、次にHL−1培地のみ(FCS不含)で成長するように細胞を段階的に順応させた。タンパク質不含培地TurboDoma(Cell Culture Technologies GmbH, Zurich,No.THP)に細胞を順応させるために、HL−1培地を段階的にTurboDomaに交換した。HL−1からTurboDoma培地への順応段階は、FCSの減少と同様に実施した。
前記実施例の上清20Lを1μm polygard CR光学フィルター(ミリポア)を通してろ過して、クロスフローろ過(SKAN AG)によって5Lに濃縮した。
それを120mlヘパリンカラム(Heparin sepharose 6 Fast Flow XK 50/20カラム;Amersham Biosciences)に加える前に、濃縮済みの上清にNaClを最終濃度0.3Mになるように加えた。カラムを20mM MOPS、300mM NaCl、pH7.2(バッファーA)で平衡化させた。Aekta Purifier(Amersham Biosciences Europe GmbH)のカラムに20℃、流速1ml/分でサンプルを加えた。カラムを4×カラム容積(CV)のバッファーAで洗った。結合タンパク質を20mM MOPS、1M NaCl、pH7.2(バッファーB)の勾配で溶出させた。勾配は以下の通りであった:1CVでは0%Bから43%B、3CVでは43%B、2CVでは43%から100%B、3CVでは100%B。ニューロトリプシンは450mMの塩化ナトリウム濃度で溶出し始める。ニューロトリプシン(完全長タンパク質およびプロテアーゼドメイン)を含む溶出画分をプールして、分注して、−20℃で保存した。
使用説明書に従って、Cu2+イオンをセファロース(Chelating Sepharose Fast Flow, Amersham Biosciences Europe GmbH)に結合させた。固体の塩化ナトリウムをサンプルに加えて、濃度を0.5M以上に上げた。続いて、29℃のSS34ローター内で12,000rpm、30分間Sorvall RC−5B遠心分離機でサンプルを遠心分離にかけた。結果として得られる上清を、4℃のEttanクロマトグラフィーシステム(Amersham Biosciences Europe GmbH)において流速1ml/分で1ml銅セファロースカラムに注いだ。20mM MOPS、0.5M塩化ナトリウム(pH7.2)中の10〜250mMのイミダゾール勾配でタンパク質を溶出させた。勾配は以下の通りであった:15CVでは0%Bから10%B、5CVでは10%Bから100%B、10CVでは100%B。完全長ニューロトリプシンは150mMのイミダゾールで溶出し始める。完全長ニューロトリプシンを含む画分をプールして、4℃で保存した。
イオン交換クロマトグラフィーでは、サンプルを2.5倍希釈して塩化ナトリウムの最終濃度を0.2Mにして、4℃のSS34ローター内で12,000rpm、30分間Sorvall RC−5B遠心分離機で遠心分離にかけた。透明な上清を、20mM MOPS、200mM NaCl(pH7.2)で平衡化したMonoS PC 1.6/5カラム(Amersham Biosciences Europe GmbH)に流速0.1ml/分で注いだ。結合タンパク質を直線勾配の塩化ナトリウム(0.05M〜1M)で溶出させた。完全長ニューロトリプシンは300mMの塩化ナトリウムで溶出し始める。プロテアーゼドメインを含む画分をプールして、20℃で保存した。
完全長タンパク質およびプロテアーゼドメインを含む前記実施例のヘパリン親和性クロマトグラフィーからの画分を上記の疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけた。遠心分離した溶液の上清を平衡化済み12mlカラム(20mM MOPS、1.75M塩化ナトリウム、pH7.2)に流速1ml/分で加えた。20mM MOPS(pH7.2)中の直線勾配で濃度を減らした塩化ナトリウム(1.75M〜0.05M)を加えて1ml/分で結合タンパク質を溶出させた。プロテアーゼドメインは濃度1Mの塩化ナトリウムで溶出し始める。プロテアーゼドメインを含む画分をプールして、−20℃で保存した。
pCDNA−Agrin SN Y4Z19は膜結合型アグリンをコード化する。最初に、HpaI部位を導入するプライマー
とNotI部位を導入する
を使用して、分泌型の溶解性アグリン変異体を作成した。結果として得られるPCR産物をHpaIとNotIで切断して、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断した、ヒトカルシンテニン−1のコード配列を含むpEAK8ベクター内にクローニングした。事前に、ベクター内の追加のHpaI部位をクイックチェンジストラテジー(Stratagene)を使用して取り除いた。結果として得られるコンストラクトは、翻訳中に切断されるヒトカルシンテニン−1のシグナル配列を有する分泌型アグリンをコード化する。このコンストラクトに基づいて、アグリン遺伝子内のHpaIおよびBspHI部位を利用して、プライマー
によるPCR産物のクロ−ニングによってN末端8×Hisタグを加えた。第三段階では、鋳型として先に記載されているコンストラクトおよびプライマー
そして鋳型としてpEGFPおよびプライマー
を用いたSOE PCRにおいて、C末端のLG3ドメインをEGFPと置換させた。結果として得られるPCR断片をSOE PCRにおいて結合させて、同様に切断したベクター内のEcoRV、NotI部位にクローニングした。結果として得られる分泌型のタンパク質の配列は、配列番号9である。
5CVの50mM Tris−HCl、150mM NaCl(pH8.0)での平衡化後、タンパク質サンプルを10ml/分で加えた。カラムを10CVの50mM Tris−HCl、150mM NaCl(pH8.0)で洗った。溶出では、25CV中の洗浄バッファー中イミダゾール0〜500mM勾配を使用した。アグリン−EGFPは20〜50mMのイミダゾールで溶出した。ウェスタンブロットおよびSDS−PAGEで決定された、目的タンパク質を含む画分をプールして、1:125で希釈して、20mM Tris−HCl、150mM NaCl、0.1%PEG6000(pH8.0)に対して4℃で一晩透析した。
透析物の添加後、8ml POROS HQ20カラムを2CVの20mM Tris−HCl、150mM NaCl(pH8.0)で洗った。溶出では、洗浄バッファー中の塩化ナトリウムの勾配は150−2,000mMであった。アグリン−EGFPは約900−1,100mMの塩化ナトリウム濃度で溶出した。ウェスタンブロットおよびSDS−PAGEで決定された、目的タンパク質を含む画分をプールして、1:125で希釈して、20mM Tris−HCl、150mM NaCl、0.1% PEG6000(pH8.0)に対して4℃で一晩透析した。結果として得られるニューロトリプシンは90%純粋であり、インビトロでの活性アッセイに適していた。タンパク質を液体窒素で凍結させて、−20℃で保存した。
HpaI部位を導入するプライマー
(HisBNterm)およびNotI部位を導入するプライマー
(BStreplink)、そして鋳型としてpcDNA3.1−AgrinY0Z0を使用して、アグリンの最後の2つのLGドメインおよび最後のEGF様ドメインをコードするDNA断片を増幅させた。この戦略を利用して、N末端8×HisタグおよびC末端StrepタグをコードするDNA配列を挿入した。結果として得られるPCR産物を制限酵素NotIおよびHpaI(太字はプライマー配列)で切断して、同じ制限酵素で切断したヒトカルシンテニン−1のシグナルペプチドのコード配列を含むpEAK8ベクター内にクローニングした。結果として得られるコンストラクトpEAK8−C45agrinは、C45アグリンの分泌シグナルとしてヒトカルシンテニン−1のシグナル配列のコーディング領域を含む。プラスミド増幅の他、クローニングを大腸菌内で実施した。発現のために、リン酸カルシウム法を利用してHEK293T細胞にトランスフェクションさせた。HEK293T細胞内での発現中、シグナルペプチドは切断される。結果として得られる分泌型タンパク質の配列は、配列番号12である。
HEK293T細胞を16×150cm2の組織培養物フラスコ内で80%コンフルエントまで増殖させた。4×500cm2プレートに接種するために各フラスコを使用した。500cm2プレートは80mlの培地を含み、ポリ−L−リジンでコーティングされていた。細胞は2日以内に60〜80%コンフルエントまで増殖した。リン酸カルシウム法によって培養液(DMEM/10%FCS)1ml当たり各1μgのpcDNA−agrinY4Z8、pcDNA−hNTを細胞にトランスフェクションさせた。翌朝、培地をFCS不含DMEMと交換した。37℃、10%CO2で4日間細胞を増殖させた。上清を回収して、4℃で3,000rpm30分間遠心分離にかけて、室温でろ過(孔径0.45μm)した。最終濃度が20mMを超えないように1M HEPESバッファーを用いてろ液のpHを7.0に設定した。それを1ml/分でヘパリンカラム(17mlヘパリンセファロース;容量約2mg/mlゲルマトリックス)にのせた。カラムは5CVの20mM HEPES、80mM NaCl、pH7.5で平衡化させて、2CVの20mM HEPES、80mM NaCl(pH7.5)で洗った。20mM HEPES(pH7.5)において8CVの80〜1000mM NaClの直線勾配によって結合タンパク質を、溶出させた。100kDa断片は約400〜600mMのNaClで溶出した。SDS−PAGEおよびウェスタンブロットによってモニターしながら、標的タンパク質を含む画分をプールした。プールした画分を4℃で一晩20mM HEPES(pH7.5)1:100に対して透析して、NaCl濃度を5mM未満に下げた。透析物を4℃、12,000rpmで30分間遠心分離にかけて、20mM Tris(pH8.0)で平衡化したMonoQカラム(7.8ml HQ POROSカラム、容量:10〜20mg/mlマトリックス)にのせた。結合タンパク質は、20mM Tris(pH8.0)中の20CVでの0〜1,000mM NaClの直線勾配で溶出する。100kDa断片は100〜200mMのNaClで溶出した。SDS−PAGEおよびウェスタンブロットによって決定されるように、標的タンパク質を含む画分をプールした。
液体窒素で満たされたチューブ内に精製タンパク質を流して急速冷凍させて、−80℃で保存した。標準的手順によってタンパク質50μgを使用してウサギに免疫付与した。結果として得られる抗体は、アグリンのC末端部分を含むアグリン断片、具体的には切断部位αとβの間に位置するアグリン部分を含むアグリン断片の他、完全長アグリンの検出に適している。
それぞれ10%FCSを添加したDMEM培地(GIBCO)100mlの入った5×500cm2培養プレート(CORNING)内で80%コンフルエントまでHEK293T細胞を培養した。トランスフェクションでは、500mM CaCl2 25mlおよびHBSバッファー(50mM HEPES、140mM NaCl、1.5mM Na2HPO4、pH7.1)25mlを1.5mgのpEAK8−agrin−C45DNAと15μgのpcDNA−hNT DNAに添加した。トランスフェクション混液を45分間室温でインキュベーションさせた。500cm2 HEK細胞のトランスフェクションのために、トランスフェクション混液10mlを培養物に滴下して加え、37℃で4時間培養した。PBSでの3回の洗浄およびFCS不含DMEM培地の添加によってトランスフェクション混液を除去した。60時間後、条件培地を回収して、Steritop 0.22μmフィルター(ミリポア)を使用してろ過した。pcDNA−hNTを細胞に同時トランスフェクションすることで、アグリン−C45断片が切断されて、ラットアグリンのLG3ドメインが放出される。主な汚染物質を取り除くために、条件培地を1:10に希釈して、50mM Tris−HCl、50mM NaCl(pH8.0)で5回透析して、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。透析済み培地を10ml/分でBioCADクロマトグラフィーシステム(Perseptive Biosystems)に接続した4ml MonoQカラム(BioRAD社Uno Sphere MonoQ材を自分で充填、2×4cm)にのせた。20CV 50mM Tris−HCl、50mM NaCl(pH8.0)でカラムを洗った。50mM Tris−HCl(pH8.0)中の50mM NaClから2000mM NaClへの勾配を溶出に使用した(任意で、この第一段階をNi2+−キレ−トセファロースカラムを使用した金属親和性クロマトグラフィーに代えることができる)。目的タンパク質は通過液画分において認められ、50mM Tris−HCl、150mM NaCl(pH8.0)で事前に平衡化させた10ml StrepTactinカラムを用いた親和性クロマトグラフィーにそのままかけた。重力流でのタンパク質の結合後、10CVの平衡化バッファーでカラムを洗った。2.5mMのデスチオビオチンを添加した0.5CVの平衡化バッファーを使って6回溶出させた。SDS−PAGEを利用して溶出物を分析して、Centriprep 10.000 Concentrators(MILLIPORE)を用いてアグリン−C45断片およびLG3ドメインを含む画分を200μl容積に濃縮した。結果として得られる濃縮液をSuperdex S75ゲルろ過カラム(Amersham Pharmacia、1.6×30)にのせた。50mM Tris−HCl、250mM NaCl(pH8.0)を使用して、流速0.3ml/分でクロマトグラフィーを実施した。SDS−PAGEを使って溶出物を分析して、純粋なLG3ドメインを含む画分をプールして、液体窒素中で凍結させた。
アグリンのLG3ドメインに対するポリクローナル抗体を作成するために、50μgの断片を使用してウサギに免疫付与した。結果として得られる抗体は、アグリンのLG3ドメインを含むアグリン断片の検出の他、完全長アグリンの検出に有用である。
ニューロトリプシン活性の測定は、タンパク質低結合性チューブ(Eppendorf)の150mM NaCl、5mM CaCl2、0.1%PEG、20mM MOPS(pH7.5)中で行う。ニューロトリプシン活性測定は、最高30%のDMSOを含む同じバッファーを使用して行うことも可能である。ヒトニューロトリプシンは、3時間以内に基質の約80%の切断をもたらす濃度で使用される。基質として、0.1〜1μMアグリン−EGFPまたは0.1〜3μMアグリン−C45が使用される。反応混合物は37℃で3時間インキュベーションする。次に、従来のSDS−PAGEサンプルバッファーの添加、そして70℃、5分間の加熱によって反応を止める。SDS−PAGE後に生じた切断産物を調べる。
切断部位αの正確な切断位置を決定するために、HEK293T細胞内で膜結合型アグリン変異体をヒトニューロトリプシンと同時発現させた。結果として得られる100kDaの切断産物は培養物上清中に出現して、精製して、Procise492cLCシーケンサー(Applied Biosystems)でのエドマン分解によってN末端の配列を決定した(実施例22参照)。決定した配列はASXYNSPLGXXSGDKであり、Xはシステイン残基を表す。このことから、995の位置のアルギニン後の配列VVTHGPPIERASCYNSPLGCCSDK内で切断が起こると結論付けることができる。
化合物をDMSOに溶かして、最終濃度10mMにした。分析では、DMSO溶液を10mM MOPS(pH7.5)で希釈して、濃度500μMと5%DMSO(1:20希釈)にした。不溶性の沈殿物質を遠心分離(15分、16krcf、室温)で除去した。実施例27に記載のとおり、不要物を除去した上清を阻害試験に使用した。
ニューロトリプシンの触媒活性に対する小分子化合物の阻害活性は、総量15μlで0.5ml低タンパク質結合性エッペンドルフチューブ内において150mM NaCl、5mM CaCl2、5%DMSO、0.1%PEG6000、20mM MOPS(pH7.5)中で測定する。ヒトまたはマウスのニューロトリプシン、またはニューロトリプシンの触媒活性を有する切断型は、3時間以内に基質の80%が切断される濃度で使用する。基質として、可溶性の改変アグリン(例えば、0.1〜1μMアグリン−EGFP(実施例20)または0.1〜3μM改変アグリン−C45(実施例21))を使用する。5%DMSOを含む10mM MOPS(pH7.5)中の阻害剤溶液を最終濃度25μMまたは150μMで加える。反応混合物を37℃で3時間インキュベーションする。反応混合物中の5%DMSOは、小さな無機化合物阻害剤の溶解度を保持するために必要である。反応は基質または酵素の添加によって開始する。インキュベーション終了時に、従来のSDS−PAGEサンプルバッファーの添加および70℃、5分間の加熱によって反応を止める。消化サンプルをSDS−PAGEで分離して、基質の可視化後に調べる。
改変アグリン−EGFPを基質として、実施例27に記載の分析によって0〜200μMの異なる濃度の化合物No.7を試験した。生じた産物をウェスタンブロットによって検出して(図17A)、定量した(図17B)。化合物No.7なしの反応と比較して、産物の最大量の半分は約60μMの濃度で存在した。したがって化合物No.7のIC50は約60μMの範囲内にある。
ヒトニューロトリプシンに対する阻害作用の見出されている化合物の特異性を確認するために、一組の通常のセリンプロテアーゼを用いた標準的な酵素反応速度測定を実施した。市販のプロテアーゼおよびパラニトロアニリド結合小ペプチド基質を用いた標準的な測光分析を利用した。
ウシ血漿由来の活性化第Xa因子(6.1mgタンパク質/ml; Sigma Aldrich Chemie GmbH,D-89552 Steinheim,Germany)。
ブタ膵臓トリプシン(16099U/mg;Fluka Chemie AG, CH-9471 Buchs,Switzerland)。
tPA: Actilyse(10mg;Dr. Karl Thomae GmbH, Birkendorfer Strasse 65, D-88397 Biberach,Germany)。
ウシ血漿由来のトロンビン(50NIH/mg;Merck, D-64271 Darmstadt,Germany)。
ウロキナ−ゼHS medac(100000I.E.;medac Gesellschaft fur klinische Spezialpraparate mbH, D-22880 Wedel, Germany)。
ブタ膵臓由来のカリクレイン(43U/mg固体;Sigma Aldrich Chemie GmbH)。
ヒト血漿由来のプラスミン(3.2U/mg固体;Sigma Aldrich Chemie GmbH)。
Bz-IEGR-pNA: S-2222, Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA, 1-20128 Milano, Italy。
Bz-FVR-pNA: N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide HCI, Bachem AG, CH-4416Bubendorf, Switzerland。
IPR-pNA: S-2288, Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA。
Bz-VGR-pNA: N-Benzoyl-Val-Gly-Arg-p-nitroanilide, Sigma Aldrich Chemie GmbH。
N-Tosyl-GPK-pNA: N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-p-nitroanilide,#90178, Fluka Chemie AG。
初速度およびKmの0.1倍未満の範囲の様々な量のペプチド−p−ニトロアニリド基質を測定するために、適量のプロテアーゼを用いて、100mM Tris−HCl、150mM NaCl、1mM CaCl2、5%DMSO、0.1%PEG6000(pH8.0)中で分析を実施した。阻害試験では、100μMの化合物No.7を使用した。Cary 50 Spectrophotometer(VARIAN)において25℃で測定を実施した。基質濃度からの初速の直接的依存性の範囲内になるように、Kmの0.1倍未満の様々な基質濃度を利用して初速を測定した。候補阻害剤No.7の存在下、非存在下で基質濃度に対して初速をプロットした。化合物は濃度100μMで使用した。
Claims (15)
- 水性緩衝液中において化合物を、ニューロトリプシンもしくはニューロトリプシンのプロテアーゼドメインを含みかつセリンプロテアーゼ活性を有するニューロトリプシン断片、ならびに、アグリンを含むタンパク質またはアグリンのα−またはβ−切断部位を含むアグリン断片と一緒にインキュベーションし、そしてアグリンの切断量を測定することを特徴とする、化合物がニューロトリプシン阻害剤であるか否かを判定する方法。
- ヒトのニューロトリプシン、またはヒトのニューロトリプシンのプロテアーゼドメインを含む断片を使用する請求項1記載の方法。
- 完全長のヒトのニューロトリプシンを使用する請求項2記載の方法。
- ヒトのニューロトリプシンのプロテアーゼドメインを含む断片を使用する請求項2記載の方法。
- アグリンを含む該タンパク質またはアグリン断片が、マーカータンパク質またはマーカーペプチドを有する融合タンパク質である請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- アグリンを含む該タンパク質またはアグリン断片が、分光検出用の非ペプチド性マーカーを含む請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 完全長のアグリンを含むタンパク質を使用する請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 該切断部位αあるいは切断部位βを含むアグリン断片を含むタンパク質を使用する請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 該アグリン断片が該切断部位αまたは切断部位βを保持する少なくとも6個のアミノ酸を含む断片である請求項8記載の方法。
- 該アグリン断片が該切断部位αのコンセンサス配列の少なくとも8個のアミノ酸を含む断片である請求項8記載の方法。
- 該アグリン断片が該切断部位βのコンセンサス配列の少なくとも8個のアミノ酸を含む断片である請求項8記載の方法。
- C末端のアグリン断片C45を使用する請求項8記載の方法。
- 水性緩衝液中においてニューロトリプシンまたは該プロテアーゼドメインを含みかつセリンプロテアーゼ活性を有するニューロトリプシン断片と、アグリンを含むタンパク質またはアグリンの該α−またはβ−切断部位を含むアグリン断片とをインキュベーションし、そしてアグリンの切断量を測定することを特徴とする、ニューロトリプシンの触媒活性を測定する方法。
- アグリンを含む該タンパク質またはアグリン断片が、マーカータンパク質またはマーカーペプチドを有する融合タンパク質である請求項13記載の方法。
- アグリンを含む該タンパク質またはアグリン断片が、分光検出用の非ペプチド性マーカーを含む請求項13または14記載の方法。
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