CN101193858A - 神经蛋白酶抑制剂及其确定 - Google Patents

神经蛋白酶抑制剂及其确定 Download PDF

Info

Publication number
CN101193858A
CN101193858A CNA2006800101171A CN200680010117A CN101193858A CN 101193858 A CN101193858 A CN 101193858A CN A2006800101171 A CNA2006800101171 A CN A2006800101171A CN 200680010117 A CN200680010117 A CN 200680010117A CN 101193858 A CN101193858 A CN 101193858A
Authority
CN
China
Prior art keywords
agrin
enzyme
neuroprotein
fragment
cynapse
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2006800101171A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101193858B (zh
Inventor
P·松德雷杰
S·赫特沃
M·F·博利杰
B·德赖尔
B·孔茨
D·卢谢
R·赖夫
S·萨尔斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Zuerich
Original Assignee
Universitaet Zuerich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Zuerich filed Critical Universitaet Zuerich
Publication of CN101193858A publication Critical patent/CN101193858A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101193858B publication Critical patent/CN101193858B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6427—Chymotrypsins (3.4.21.1; 3.4.21.2); Trypsin (3.4.21.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/63—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/30—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/45—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups at least one of the singly-bound nitrogen atoms being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom, e.g. N-acylaminosulfonamides
    • C07C311/47—Y being a hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/50—Compounds containing any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C07C311/52—Y being a hetero atom
    • C07C311/64—X and Y being nitrogen atoms, e.g. N-sulfonylguanidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及确定化合物是否是神经蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于，将化合物与神经蛋白酶、其变体或包含蛋白酶结构域的片段以及包含集聚素、其变体或含有集聚素口－或口－切割位点的片段的蛋白质或多肽在水缓冲溶液中共同培养，并且测量集聚素的切割量。本发明还涉及通过这种方法发现的神经蛋白酶抑制剂，尤其是式(1)化合物，其中Hal1和Hal2是氟、氯或溴，以及该抑制剂在治疗和/或预防突触缺乏引起的疾病例如骨骼肌萎缩、精神分裂症和认知障碍中的应用。

Description

神经蛋白酶抑制剂及其确定
发明领域
本发明涉及确定一个化合物是否是神经蛋白酶(neurotrypsin)抑制剂的方法，涉及神经蛋白酶的特定抑制剂，涉及这些抑制剂在治疗和/或预防骨骼肌萎缩和精神分裂症中的应用，以及作为认知增强剂的应用。
发明背景
丝氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶家族，该蛋白水解酶的共性是具有强烈的催化机理。丝氨酸蛋白酶存在于病毒、细菌和真核生物中。它们包括外肽酶，肽链内切酶以及寡肽酶。不同进化起源的几类肽酶在反应机理上具有相似性。尽管蛋白折叠方式非常不同，但是催化残基的几何定位非常相似。活性位点中的丝氨酸、组氨酸和天门冬氨酸残基组成的催化中心负责肽键有效的水解切割。丝氨酸蛋白酶的例子包括凝血酶因子XIIa，IXa和Xa，血浆酶tPA，胰蛋白酶，糜蛋白酶，以及类似于尿激酶，类胰蛋白酶，胰肽酶E，激肽释放酶，补体C，蛋白酶A，丝氨酸羧肽酶II的蛋白。它们参与很多重要过程例如血液凝结和食物消化。有显示说丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制细胞过程，例如粘附，迁移，自由基产生和凋亡。静脉给与丝氨酸蛋白酶抑制剂会提供保护作用来对抗组织损伤。小分子抑制剂在治疗涉及血液病，肿瘤，哮喘，炎症，神经病，肺部疾病以及免疫疾病的不同疾病中具有很高的潜能。适当的丝氨酸蛋白酶抑制剂在治疗血栓形成疾病、哮喘、硬化、关节炎、癌症、黑素瘤、心瓣手术后再狭窄、动脉粥样硬化、外伤、休克以及再灌注损伤等方面可能是有用的。
研究的酶神经蛋白酶(WO 98/49322)属于糜蛋白酶家族，该家族的成员几乎都存在于动物体内。神经蛋白酶的氨基酸序列定义了875个氨基酸序列的镶嵌蛋白，由Kringle结构域伴随四个清除受体富半胱氨酸重复(小鼠有三个)以及丝氨酸蛋白酶结构域组成(图1，A和B)。就像凝血酶tPA，胰蛋白酶和其它酶一样，神经蛋白酶在它的S1口袋底部包含一个天门冬氨酸残基，因此在这个结合位点显示出与碱性氨基酸的特异结合。神经蛋白酶和血液凝结过程以及纤维蛋白溶解系统的蛋白酶，例如因子X，因子IX，凝血酶，组织血浆酶原激活物以及血浆酶的结构相似性说明它可能是来自于神经系统细胞外信号传导机制的蛋白酶的一份子(Gschwend，T.P.等人，Molec.Cell Neurosci.9：207-219，1997；Proba，K.，等人，Biochim.Biophys.Acta 1396：143-147，1998)。
以下将要描述的是，神经蛋白酶定位在中枢神经系统(CNS)的突触前神经末梢以及神经肌肉连接处(NMJ)。突触是神经细胞(神经元)用来连接化学物质即神经递质进行信号传导的。突触由突触前神经末梢(由信号发射细胞组成)和突触后特异的信号接收细胞组成。突触前神经末梢释放神经递质到突触间隙与神经递质受体在突触后特异结合。神经递质和受体的结合包括突触后细胞中电脉冲的产生。在两个神经元之间的信号传递是神经元功能的基础。脑功能是大量神经元信息处理网络的专一集合。
大多数突触都存在于中枢神经系统中(CNS，大脑)，每一个突触连接两个神经元。通过这种两面的点对点的连接，每一个神经元可以连接成千上万个其它神经元。尽管如此，突触也与腺体或肌肉细胞连接神经元。神经肌肉连接(NMJ，肌肉侧板)是连接神经细胞与条纹肌肉细胞的突触。定位于大脑外的突触，脑干和脊髓束被叫做外周神经系统(PNS)突触。CNS突触和PNS突触显示出许多结构和功能的共性以及共享它们的许多分子成分(突触分子)。因此，突触靶点分子可能在靶定CNS和PNS的突触功能上很有用。
骨骼肌萎缩(肌肉减少)，定义为肌肉体积和力量的损失，其发病机理和功能损害在老年人身上发挥主要作用。主要表现为肌肉力量损失，代谢率降低，骨密度的逐步减少以及需氧能力的降低(Doherty，T.J.，J.Appl.Physiol.95：1717-1727，2003)。肌肉体积的损失表明肌肉伴随年龄代表性区域的减少，最终导致肌纤维的数量和单个剩余肌纤维的厚度的减少。
在过去许多年里在肌肉体积退化的鉴别和特征描述方面有了很大进步。与这些过程相关的重要基因编码在萎缩的肌肉中增加的重组人泛素蛋白连接酶。在具有增殖活性的因素中，例如阻塞萎缩(blockatrophy)，发现类胰岛素生长因子1(IGF-1)具有必不可缺的作用。已深入研究了这种和一些其它的控制骨骼肌体积的调节通路(其综述参见：Glass，D.J.，Nature Cell Biol.5：87-90，2003)。尽管控制肌肉退化导致萎缩的分子机理的特征描述和类胰岛素生长因子的增殖作用研究取得重大进展，尽管许多公司致力于开发能够刺激肌肉体积增长的药物，目前仍旧没有药物被批准。
在老年人(肌肉减少)身上发现骨骼肌萎缩的形态学特征是肌纤维数量的大量减少。从众多的个体研究中得到的大量证据支持伴随年龄增长神经系统输入肌纤维片段的过程遭到破坏，导致后来的萎缩以及最后神经纤维的消失(Kamal，H.K.，Nutrition Reviews 61：157-167，2003)。在老年人身上发现的另一个骨骼肌萎缩的特征是肌肉萎缩与神经元数量的大量减少(Welle，S.，Can.J.Appl.Physiol.27：19-41，2002)和神经肌肉连接的显著结构改变(Tapia，J.C.等人，Abstract Viewer/ItineraryPlanner，Washington DC：Society for Neuroscience)是一致的。这些特征表明一个重要的与年龄相关的神经肌肉连接的结构和功能的退化是最终导致去神经支配的结构和功能过程的重要影响因素。去神经支配的肌纤维在几周内没有收到补偿性的再接种变得日益萎缩，最终消失。
精神分裂症是慢性的，严重的并且丧失能力的脑部疾病。大约1％的世界人口在他的一生中患有精神分裂症。患有精神分裂症的人经受巨大的痛苦。大约10％的患者最后自杀。尽管精神分裂症对男性和女性的影响相同，症状总是更早地出现在通常十几岁后期或二十岁早期的男性身上，而女性通常在二十多岁到三十岁早期表现症状。患有精神分裂症的人经常忍受极大的痛苦症状例如听到其它人没有听到的声音，或认为其它人在猜测他们的想法，控制他们的思维，或打算伤害他们。这些症状让他们感到害怕，性格变得孤僻。他们的言行失控以致于不被别人理解或令人恐惧。目前精神分裂症可利用的治疗方法很大程度上降低了他们的痛苦，但是大约2/3的精神分裂症患者在疾病发作后很多年内都需要公众救助。他们中的大多数人不能回到工作或学校，具有相对很少的社会关系或没有，并且大多数精神分裂症患者要在一生中忍受一些症状。估计五个患者中不会有多于一个能够彻底痊愈。因此精神分裂症是全世界范围内最重要的公共健康问题之一，社会每年要付出几十亿美元。
目前在精神分裂症患者脑内最一致的神经病理学发现就是中枢神经系统灰质内突触数量的减少，反射地引起神经纤维网(突触区域)容量的减少。没有发现神经元恶化的证据。代表性地，每组织区域内计量的神经元数量是增加的，一个观察解释了神经元之间神经纤维网区域内突触数量的选择性减少，同时神经元细胞保持不变。在过去二十年里许多关于post mortem material独立的研究中报告了这个现象，并且在额叶前部皮质内广泛地发现该现象。Selemon，L.D.和Goldman-Rakic，P.S.认真地综述了证明这一发现的文献(Psychiatry 45：17-25，1999)。McGlashan，T.H.和Hoffman，R.E.(Arch.Gen.Psychiatry 57：637-648，2000)根据“过量的突触修剪”假设总结了精神分裂症的基本形态学观察特征，病程发展，电生理学观察特征和代谢作用，并且得出结论：“过量的突触修剪”或“发展地减少的突触连通性”是日益增加的吸引人的精神分裂症的病理生理模型。基于这个模型，精神分裂症起于严重地减少的突触连通性，在妊娠期和儿童早期突触发生受到发展地干扰和/或在青春期过量的突触修剪作为结果。模型说明了失调的现象学，症状，疾病发作，神经发展不足，退化窗，临床表现的性别差异，由发病年龄决定的疾病进程，以及尽管减少了表型的生育力，人口中精神分裂症基因型的保留。
认知增强剂是在临床和亚临床水平用来预防，改善或治疗认知不足的药物。这些药物对治疗还未发展为阿尔茨海默病(适度的认知损伤)的中老年人记忆困难很有益处。尽管如此，这些药物对已确诊为阿尔茨海默病或其他与痴呆有关的疾病的患者的认知功能改善很有益处，或者对外伤后认知功能障碍的患者的认知功能改善很有益处，也可以改善被认为是衰老过程正常特征的与年龄相关的认知功能损伤。
适度的认知损伤是临床研究中与年龄相关的认知障碍广泛引用的一个概念(Ritchie，K.和Touchon，J.，The Lancet 355：225-228，2000)。它是指中老年人记忆功能的亚临床疾病，具有很高的可能性进一步发展成为阿尔茨海默病。采用早期治疗的观点来鉴别具有痴呆的潜在风险的人是很重要的，因为这样可以减少患者和家人的痛苦，最小化事故的风险，延长自治，并可能最终预防痴呆发作。
除了痴呆的认知功能损伤在中老年人群中非常普遍，以致于很多人认为这是衰老过程不可避免的特征。虽然如此，因为患者日常生活的困难，认知损伤还是具有临床意义。尽管除了痴呆，人们所能看到的损伤范围很广泛，建议使用一些临床指征来描述正常认知范围的末端。初期的一个是良性的衰老健忘。它的临床特征包括不能回忆起小的细节，对最近事件的细微的遗忘，以及知道记忆困难。术语年龄相关的认知下降是指很广范围内的认知功能(注意力，记忆力，学习能力，思维能力，语言能力和视觉空间功能)，并且通过参考中老年人标准来诊断。认知增强剂的处方可以延长受影响个体的能力来进行日常生活，并延长他们的自治。其它至少部分影响个体的相关认知损伤失调可能最终导致痴呆包括帕金森病，多样硬化症，中风以及头部外伤。认知增强剂药物的处方也可以改善这些患者的认知功能。
发明简述
本发明涉及测量神经蛋白酶催化活性的方法，其特征在于，将神经蛋白酶、其变体或包含神经蛋白酶的蛋白酶结构域的片段在水缓冲溶液中与包含集聚素、其变体或含有集聚素□-或□-切割位点的片段的蛋白质或多肽培养，并且测量集聚素切割的量。进一步地，本发明涉及确定化合物是否是神经蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于，将化合物与神经蛋白酶、其变体或包含神经蛋白酶的蛋白酶结构域的片段以及包含集聚素、其变体或含有集聚素□-或□-切割位点的片段的蛋白质或多肽在水缓冲溶液中共同培养，并且测量集聚素的切割量。
另外，本发明涉及通过这种方法发现的神经蛋白酶抑制剂，尤其是用下式表示的化合物
Figure S2006800101171D00051
其中Hal1和Hal2各自独立地是氟、氯或溴；及其药学可接受的加成盐。
本发明进一步涉及这些抑制剂作为药物，尤其是用于治疗和/或预防突触缺乏引起的疾病，例如骨骼肌萎缩，精神分裂症以及认知障碍的应用，以及这些抑制剂在制备用于治疗和/或预防骨骼肌萎缩、精神分裂症以及认知障碍的药物中的应用。
附图简述
图1：神经蛋白酶的结构域
(A)hNt：人神经蛋白酶
(B)mNt：小鼠神经蛋白酶
神经蛋白酶由富脯氨酸碱性结构域(PB)、kringle结构域(KR)、三个(mNt)或四个(hNt)清除受体富半胱氨酸结构域(SRCR1、SRCR2、SRCR3和SRCR4)以及蛋白酶结构域(PROT)组成。
图2：神经蛋白酶介导的集聚素切割：用集聚素和神经蛋白酶共转染的HEK293细胞进行集聚素的蛋白质印迹免疫分析。
半铺满的HEK293T细胞用pcDNA3.1-神经蛋白酶或用pcDNA3.1-集聚素或用两者进行瞬时转染。用SDS-PAGE分离样品。膜与多克隆的定向对着集聚素C-末端部分的抗集聚素抗体培养，伴随与次级过氧化酶连接的抗体培养。
(泳道1，Ag)用集聚素单转染的细胞清洁提取物。
(泳道2，Ag+hNt)用集聚素和神经蛋白酶双转染的细胞清洁提取物。注意集聚素是强烈减少的。
(泳道3，Ag+hNt)用集聚素和神经蛋白酶双转染的细胞培养基。采用定向对着集聚素C-末端部分的抗集聚素抗体来检测100-kDa的条带。
(泳道4，Ag)用集聚素单转染的细胞培养基。
采用抗神经蛋白酶抗体复制印迹的方法确认在所有条件下生产的神经蛋白酶。培养基分析显示出集聚素免疫反应活性被释放到培养基表面，该活性在双转染的细胞提取物中失活。在用集聚素和无催化活性的神经蛋白酶转染的HEK293T细胞培养基表面没有检测到信号。
图3：与神经蛋白酶表达的时间图一致的体内集聚素切割的时间图。
不同年龄小鼠脊髓束的匀浆经过SDS-PAGE和蛋白质印迹免疫分析，然后采用与神经蛋白酶相对的专一抗体SZ 177和与集聚素C-末端100-kDa片段相对的专一抗体R132探查神经蛋白酶和集聚素C-末端100-kDa片段。在不同样品中□-actin作为等量组织匀浆的对照来使用。
图4：运动神经元中神经蛋白酶的转基因过度表达导致集聚素切割增加。
采用抗人(hNt)和小鼠(mNt)神经蛋白酶抗体以及抗集聚素C-末端100-kDa片段抗体来探查脊髓束提取物的蛋白质印迹免疫分析。结果说明了在小鼠过度表达的神经蛋白酶中集聚素C-末端100-kDa片段出现增加。
图5：神经蛋白酶从神经肌肉连接处(NMJ)移走集聚素。在出生后0天(PO)，4天(P4)和8天(P8)的小鼠横隔膜神经肌肉连接处集聚素免疫染色。在运动神经元中转基因小鼠过度表达神经蛋白酶，在过度表达开始后几小时到几天内集聚素从神经肌肉连接处消失。P4：过渡态。从NMJ中集聚素的部分消失。箭头指向单独的成形很好的NMJ。星号表示部分散布的NMJ。P8：从NMJ中集聚素几乎全部消失。箭头指向单独的成形很好的NMJ。星号表示部分散布的NMJ。
图6：伴随着突触后装置的分散，依赖神经蛋白酶的集聚素从NMJ中的移动。
如图7中采用荧光标记的□-金环蛇毒素(□-Btx)来为乙酰胆碱受体染色，相同小鼠横膈膜的NMJ。在过度表达开始后几小时到几天内乙酰胆碱受体消失。P4：过渡态。NMJ部分消失。箭头指向单独的成形很好的NMJ。星号表示部分散布的NMJ。P8：NMJ几乎全部消失。箭头指向单独的成形很好的NMJ。星号表示部分散布的NMJ。
图7：Nt-过度表达的小鼠比目鱼肌中NMJ分裂。
(A-C)□-金环蛇毒素(□-Btx)为野生型小鼠NMJ染色表明典型的类似于Pretzel的结构。
(D-F)□-金环蛇毒素为Nt-过度表达的小鼠NMJ染色表明突触后装置的明确的分裂。
(G-I)过度表达Nt(神经蛋白酶丝氨酸711丙氨酸)的无催化活性形式的转基因小鼠的NMJs没有改变。
图8：野生型神经蛋白酶过度表达的小鼠比目鱼肌的横截面。
(A)野生型小鼠
(B)神经蛋白酶过度表达的小鼠。
对比野生型小鼠，Nt-过度表达的小鼠肌肉包含更少的肌纤维。(A)和(B)中箭头指向单个肌纤维。
图9：在海马CA1区域的放射层的神经纤维网中，每单位体积组织中突触数量的量化。在所有实验动物中，每单位体积组织中突触数量是从电子显微镜截面中确定的，该截面取自海马CA1区域的放射层的相同位置。
wt：野生型；
CMV-Cre：在CMV引物控制下转基因系表达Cre催化重级酶；
491(inact.Nt)：转基因系491，具有无活性转基因，包含一个转录停止片段；
494(inact.Nt)：转基因系494，具有无活性转基因，包含一个转录停止片段；
DTG(Nt491/cre)：来源于西491系的双重转基因小鼠，无活性的神经蛋白酶转基因通过交叉Cre催化重级酶被激活；
DTG(Nt494/cre)：来源于西494系的双重转基因小鼠，无活性的神经蛋白酶转基因通过交叉Cre催化重级酶被激活。
**，p＜0.01。
图10：CA1锥体神经元的次级树枝状分支上的脊柱。
野生型小鼠CA1锥体神经元的次级树枝状分支上的脊柱(A和B)和双重转基因小鼠过度表达的神经蛋白酶(C和D)。在体外电生理学实验中CA1锥体细胞被生物胞素用离子透入法填满，并且采用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶组织化学使其形象化。野生型小鼠的树突具有许多长的，长得很好的脊骨(大箭头)；另外，也发现许多短而粗硬的脊骨(小箭头)。神经蛋白酶过度表达的小鼠(同胞仔)的树突受控于短而粗硬的脊骨(小箭头)；长的，长得很好的脊骨(大箭头)非常稀少。总的脊骨密度(每单位长度树突的脊骨数量)在神经蛋白酶过度表达的小鼠中(C和D)很明显地降低。
图11：纯化的全长的人神经蛋白酶。
SDS-PAGE伴随着银显色(A)和蛋白质印迹免疫分析(B)显示了全长的人神经蛋白酶的单个条带(用箭头表示)在非还原条件下迁移到相应的大约75kDa的位置。采用抗神经蛋白酶抗体来进行免疫检测(B)。标准的分子量(kDa)显示在左侧空白区域。
图12：纯化的集聚素-EGFP。显示在银染色的SDS凝胶(A)上的和通过在集聚素C-末端部分凸起的抗体检测蛋白质印迹免疫分析(B)，纯化的工程集聚素-EGFP(用箭头表示)。标准的分子量(kDa)显示在左侧空白区域。注意EGFP只是用来在这个模式中占位，该模式设计只包含切割位点□，但不是切割位点□。
图13：纯化的集聚素-C45片段。
(A)银染色SDS-PAGE胶显示纯化的集聚素-C45片段(用箭头表示)迁移在50kDa下面。数量表明精确分子量加标准蛋白(BIORAD)。
(B)蛋白质印迹检测纯化的集聚素-C45片段(用箭头表示)，采用StrepTactin来检测C-末端链锁状球菌标记物。数量表明精确分子量加标准蛋白(BIORAD)。
图14：采用集聚素-EGFP作为底物来检测神经蛋白酶活性。为了测试切割位点□的纯化神经氨基酸的活性，包含有一个切割位点□(集聚素-EGFP)的底物单独培养(-)以及与神经蛋白酶共同培养(+)，然后进行SDS-PAGE，伴随采用抗集聚素C-末端切割片段的抗体进行蛋白质印迹分析(参见实施例22)。通道1显示没有给与神经蛋白酶的集聚素-EGFP(用箭头标注Ag-EGFP)作为对照。通道2显示集聚素-EGFP(用箭头标注Ag-EGFP)以及通过神经蛋白酶活性产生的大约150kDa的C-末端片段(用箭头标注Ag-CF)。分子量用kDa标记(千道尔顿)。
图15：采用集聚素-C45作为底物来检测神经蛋白酶活性。为了测试集聚素切割位点□的纯化神经氨基酸的活性，包含有一个切割位点□(集聚素-C45)的底物单独培养(-)以及与神经蛋白酶共同培养(+)，然后进行SDS-PAGE。
(A)银染色SDS-PAGE凝胶显示没有神经蛋白酶，250ng集聚素-C45培养在化验缓冲液中3小时(-)以及250ng集聚素-C45与神经蛋白酶共同培养在化验缓冲液中3小时(+)。精确分子量加标准蛋白(BIORAD)显示在左侧，数量表明分子量(kDa)。能够看到集聚素-C45(用箭头表示)在50kDa以下。发现集聚素-C45的切割产物在20到25kDa之间(用箭头表示)。Ag-C45-NF：集聚素-C45的N-末端切割片段；Ag-C45-CF：集聚素-C45的C-末端切割片段。
(B)与(A)相同的样品进行蛋白质印迹分析，通过它们的C-末端链锁状球菌标记物采用StrepTactin(IBA GmbH)检测没有切割的集聚素-C45和切割的集聚素-C45的C-末端片段。Ag-C45-CF：集聚素-C45的C-末端切割片段(用箭头表示)。
图16：采用抗体检测集聚素底物和C-末端产物，基于神经蛋白酶抑制剂扫描分析的蛋白质印迹分析。
上面的条带显示作为底物的分子量在250到600kDa之间的集聚素-EGFP蛋白(箭头标记Ag-EGFP)。下面的条带显示神经蛋白酶产生的集聚素-EGFP片段，分子量在大约150kDa(箭头标记Ag-CF)，根据被测试抑制剂分子No.7，47，48，49，50和51的抑制活性不同，看起来具有不同的强度。柱状图显示了由神经蛋白酶介导的集聚素-EGFP的切割产生的150kDa条带(Ag-CF)的相对强度(I)，阳性对照设为100％并且阴性对照设为0％。阴性对照(-)：只有集聚素-EGFP没有神经蛋白酶。阳性对照(+)：集聚素-EGFP同时加入神经蛋白酶。
No.7：N1-脒基-N4-(3，5-二溴亚水杨基)-磺胺
No.47：4-氯环己-4-烯-1，2-二甲酸N1-脒基磺胺
No.48：N1-脒基-N4-(4-二甲基氨基亚苄基)-磺胺
No.49：N1-脒基-N4-亚苄基-磺胺
No.50：N1-脒基-N4-(2，4-二氯亚苄基)-磺胺
No.51：N1-脒基-N4-(4-甲氧基亚苄基)-磺胺
图17：通过化合物No.7的神经蛋白酶活性的剂量依赖性抑制。
(A)依赖化合物No.7 N1-脒基-N4-(3，5-二溴亚水杨基)-磺胺的浓度，通过神经蛋白酶介导的集聚素-EGFP切割产生的150kDa集聚素C-末端片段(Ag-CF)的蛋白质印迹检测。
通道1：集聚素-EGFP
通道2：集聚素+小鼠神经蛋白酶
通道3：集聚素+小鼠神经蛋白酶+25□M化合物No.7
通道4：集聚素+小鼠神经蛋白酶+37.5□M化合物No.7
通道5：集聚素+小鼠神经蛋白酶+50□M化合物No.7
通道6：集聚素+小鼠神经蛋白酶+75□M化合物No.7
通道7：集聚素+小鼠神经蛋白酶+100□M化合物No.7
(B)从(A)得到的对抗抑制剂浓度的强度数据绘制的图表，采用I＝100％强度来表示集聚素+小鼠神经蛋白酶而不加入抑制剂化合物No.7的强度。
图18-24：化合物No.7 N1-脒基-N4-(3，5-二溴亚水杨基)-磺胺的特异性测试：没有测试的蛋白酶Xa，胰蛋白酶，tPA，凝血酶，尿激酶，激肽释放酶和血浆酶的抑制作用。
图表显示了测试蛋白酶Xa(图18)，胰蛋白酶(图19)，tPA(图20)，凝血酶(图21)，尿激酶(图22)，激肽释放酶(图23)和血浆酶(图24)的初始反应速率(□M)，分别在化合物No.7不在(中空的正方形)和存在(中空的三角形)与底物浓度(CM)来作图。按照指定浓度加入苄脒(BA)作为测量tPA(图20)和尿激酶(图22)竞争性抑制的阳性对照，以及在Xa(图18)和血浆酶(图24)的化验中按照指定浓度加入对氨基苄脒(pABA)(中空的菱形)。
发明的详细描述
本发明基于神经蛋白酶的抑制允许提高突触前活性的事实(突触形成，突触区分，突触组织，突触保护，突触加固)。神经蛋白酶基因在中枢神经系统的许多神经元中表达(Gschwend，T.P.，等人，Molec.CellNeurosci.9：207-219，1997；Wolfer，D.P.等人，Molec.Cell.Neurosci.18：407-433，2001)，包括脊髓束的运动神经元(实施例1)，以及在许多中枢神经系统突触中和神经肌肉连接处发现神经蛋白酶蛋白(Molinari，F.等人，Science 298：1779-1781，2002)。神经蛋白酶在发展和/或保持良好稳定的突触功能方面起了很重要的作用。过量的神经蛋白酶(过度表达)与突触连接不足相关。转基因小鼠在CNS神经元中过度表达神经蛋白酶显示在大脑皮层和海马区域突触数量的减少，这两个大脑区域都对认知功能非常重要，例如记忆和学习。同样地，转基因小鼠在脊椎运动神经元过度表达神经蛋白酶显示了神经肌肉连接(NMJ)和调节肌肉活性的神经控制的突触的减少。
在运动神经元过度表达神经蛋白酶的转基因小鼠横膈膜的神经肌肉连接的改变类似于集聚素基因失活得到的结果。蛋白多糖集聚素是一种特征非常明显的突触前试剂(突触形成，突触区分，突触组织，突触保护，突触加固)(Sanes，J.R.和Lichtman，J.，Nature Rev.Neurosci.2：791-805，2001)。它具有一个大约220kDa分子量的蛋白核心。集聚素以一些异构体形式存在。这些编码细胞外分泌基质蛋白和转运短的N-末端细胞质片段的ll-型跨膜蛋白。集聚素具有突触前活性的区域定位在集聚素的C-末端部分，尤其是G结构域第3个昆布氨酸(Bezakova，G.和Ruegg，M.A.，Nature Rev.Molec.Cell Biol.4：295-308，2003)。集聚素是神经蛋白酶的底物(实施例2)。神经蛋白酶在两个位点切割集聚素(实施例25)。一个位点(□位点)定位在精氨酸995(R995)和丙氨酸996(A996)之间。另一个位点(□位点)定位在赖氨酸1754(K1754)和丝氨酸1755(S1755)之间。氨基酸数是指大鼠(NP 786930)锚定膜的集聚素(接合变体A4B0)。尽管如此，切割位点□和□都很好的保留在哺乳动物集聚素中，包括人类集聚素。神经蛋白酶切割集聚素产生从A996到K1754大约100kDa(千道尔顿)的片段和从S1755到C-末端大约22kDa的片段。切割位点□和□从集聚素的N-末端部分分离集聚素突触的组织活性。集聚素的切割也发生在体内。在野生型小鼠中，刚出生几周内可以发现大量的集聚素100kDa片段，当神经蛋白酶发展表达时达到顶点(实施例3)。大量的集聚素100kDa片段在运动神经元中过度表达神经蛋白酶的转基因小鼠中显著增加(实施例4和5)。
集聚素在NMJ(实施例6)和CNS(实施例14)中是神经蛋白酶的天然底物。通过切割集聚素，神经蛋白酶阻断集聚素的突触前活性。转基因小鼠中神经肌肉连接处过量的神经蛋白酶在三天内控制预先建立的神经肌肉连接的消失(实施例4、5、6和7)。这些观察证明了神经蛋白酶是突触不稳定或抗突触试剂。
突触前和突触后试剂共同存在支持了这样的概念：神经系统的神经元通路是动态的而不是固定的体系。突触前和抗突触因子之间的平衡匹配导致动态平衡。例如，当突触连接需要变化来满足改变的需要时，适应性的变化是需要的，通过可控制的方式来移动突触前和抗突触因子之间的平衡。突触前和抗突触因子之间精细的紧密的相互作用很容易受到外界影响而导致不适当的突触动态平衡或不适当的功能需求的适应。当这种外界影响超过极限值的时候突触疾病就会产生。
神经蛋白酶活性的药物调整提供了空前的方法来调整突触功能。神经蛋白酶蛋白水解活性的抑制能够移动突触平衡，通过损失抗突触活性来加强突触前活性，因此增加突触的数量和/或大小和/或强度。
通过在脊椎运动神经元过度表达神经蛋白酶的转基因小鼠身上的实验显示了骨骼肌萎缩(实施例8和10)和突触连接退化(实施例9)之间的相关性。神经蛋白酶抑制剂会平衡过量的神经蛋白酶并允许治疗和预防由突触连接损失引起的骨骼肌萎缩，例如老年病人的骨骼肌萎缩。
在运动神经元过度表达神经蛋白酶的转基因小鼠系中，观察到明显的骨骼肌萎缩，主要是由于肌纤维数量的显著减少(实施例10)。表格1给出了运动神经元过量产生神经蛋白酶的作用的定量估计。运动神经元产生过量的神经蛋白酶导致成年小鼠比目鱼肌肌纤维数量18％到48％的减少，减少的比例取决于神经蛋白酶过度表达水平。因为神经蛋白酶过度表达局限在运动神经元(实验细节参见实施例4)，这些结果表明运动神经元表达的神经蛋白酶只通过神经肌肉连接局部作用在靶点肌纤维上。这种局部的萎缩效应严格地取决于神经蛋白酶的蛋白水解活性，因为小鼠过度表达没有催化活性的神经蛋白酶显示了正常的纤维数量。
在运动神经元过度表达神经蛋白酶的小鼠显示了神经肌肉连接(实施例9)分裂的显著增强。分裂和减少的纤维数量是老年人和动物身上观察到的骨骼肌的显著特点。正如以上提到的，神经肌肉联接的退化和肌纤维的损失并不是无催化活性神经蛋白酶过度表达引起的。这就表明来自于运动神经远的神经蛋白酶是一个减少肌纤维神经分布的因素并最终引起它们的损失。假定减少神经支配活性的试剂在发展的突触消除阶段在神经肌肉连接和中枢神经系统都起作用。很有可能减少神经支配活性持续贯穿人的一生并且在保持突触前和突触后因子之间的平衡方面起作用。神经蛋白酶表达的时间图支持这种可能，因为它在发展的突触消除时期达到最高点(小鼠和大鼠在出生后的头两周里)并且随后在一生中保持低水平表达。
转基因小鼠运动神经元过度表达神经蛋白酶导致神经肌肉连接退化(实施例7)。系统分析神经蛋白酶在保持不同类型肌肉神经肌肉连接的作用，包括横膈膜和比目鱼肌，显示运动神经元过度表达神经蛋白酶减少了神经肌肉连接的大小。运动神经元强烈地过度表达神经蛋白酶导致以前建立的神经肌肉连接完全分散。作为神经蛋白酶突触降解作用的结果，运动神经离开，没有突触后特化作用和/或具有结构和功能减少的突触后特化作用，开始超越以前的NMJ位点生长。超越肌纤维表面生长的神经建立了小的异位突触，用电子显微镜观察看起来不成熟，从缺乏突触后膜二级折叠得到结论。
转基因小鼠运动神经元过度表达神经蛋白酶导致蛋白多糖集聚素的切割(实施例5)。作为结果，集聚素C-末端部分从NMJ消失(实施例6)。集聚素具有NMJ保留和集聚素NMJ引发活性的区域定位在集聚素的C-末端部分，尤其是G结构域第三个昆布氨酸(Bezakova，G.，Nature Reviews Molecular Cell Biology 4：295-308，2003)。因此，集聚素C-末端结构域的移动从被称为分散因子中留下了没有保护的NMJ，几天内NMJ衰退并消失。当Thy-1引物开始驱动神经蛋白酶转基因的表达时(出生后2-5天)，运动神经元神经蛋白酶表达上调，导致一段时间内NMJ中集聚素的消失(实施例6)。在集聚素消失后很短时间内，突触后乙酰胆碱受体也消失(实施例7)。总结以上，这些观察表明运动神经元神经蛋白酶上调的一系列事件链。反过来，过量的神经蛋白酶在NMJ切割集聚素并且从NMJ移走集聚素C-末端部分。因为C-末端部分包含集聚素NMJ-保护和NMJ-引发能力的活性位点，NMJ现在毫无保护地面对分散因子最终被降解。
选择性地在运动神经元过度表达神经蛋白酶的小鼠的骨骼肌的肌纤维数量的显著减少表明神经蛋白酶是有原因地与终板退化相关的，伴随萎缩导致去神经支配，最终切除神经的肌肉纤维损失。这些观察与人和动物年龄依赖的骨骼肌萎缩的肌肉和神经肌肉连接的观察一致。在一种情况中，由于多重因素的收敛作用，年龄依赖的肌纤维损失发生，神经蛋白酶可控制的和精细的局部抑制可能干扰终板退化过程，去神经支配和肌纤维损失。因此，期望神经蛋白酶的抑制在年龄依赖的肌纤维去神经支配，肌纤维损失，以及骨骼肌萎缩具有有益的作用。
骨骼肌萎缩伴随着肌肉力量的实质损失，在伴随着年龄增长的发病机理和功能损伤方面起重要作用。大量的功能损伤包含极度虚弱，例如从椅子上起来很困难，或起床很困难，走路和其它活动速度很慢，以及保持平衡困难，导致摔倒和受伤。骨骼肌纤维损失在肌肉能够表现的绝对力量和肌肉能够表现力量的速度方面具有负面作用。
年龄增加与进行性代谢率降低相关，反过来具有实质的生理学结果，包括耐冷、耐热能力的降低以及肥胖趋势增加。骨骼肌包含身体重量大约40％的脂肪，在身体新陈代谢方面起到很重要的平衡作用。因此，伴随年龄增长骨骼肌质量的减少对代谢率降低起到主要作用。通过预防纤维进一步损失，神经蛋白酶的抑制作用起到了对抗这些新陈代谢和生理结果的作用。
骨骼肌伴随年龄质量和力量上的进行性损失被认为是随着年龄增长观察到的骨密度逐渐降低的主要原因。相反地，众所周知通过肌肉活性的骨头上外在的力量刺激骨形成。因此，通过肌肉收缩产生的力量是骨质量的一个重要决定因素。因此，通过抑制外周神经蛋白酶活性来预防肌纤维损失可以预防骨骼肌质量损害以及间接对抗骨质疏松症。
期望神经蛋白酶抑制对很多临床状况下的骨骼肌萎缩具有有益作用，其中肌肉损耗是伴随的难题，包括癌症、AIDS以及脓血症。
神经蛋白酶在中枢神经系统(CNS)具有抗突触功能。CNS的灰质神经元表达神经蛋白酶mRNA(Gschwend，T.P.，等人，Molec.CellNeurosci.9：207-219，1997)，在许多大脑区域富有突触的区域内存在大量的神经蛋白酶蛋白质(Molinah，F.等人，Science 298：1779-1781，2002)。尤其是在大脑皮层，海马和扁桃体富有突触的区域内发现高浓度的神经蛋白酶蛋白质。尽管如此，其他富有突触的区域也发现有神经蛋白酶的大量表达。在更高的放大倍率下，突触前末端的膜上发现神经蛋白酶蛋白质，尤其是突触间隙内层膜区域内(Molinari，F.等人，Science298：1779-1781，2002)。突触前末端的突触活性区域发现有神经蛋白酶最强烈的免疫染色。偶尔，在突触前囊泡内也能观察到神经蛋白酶免疫活性。值得注意的是：大多数突触前囊泡是缺乏神经蛋白酶免疫活性的。通过生化方法得到了神经蛋白酶突触定位的独立证据，例如通过突触体分析。在人类和小鼠中，膜内突触前活性区域的神经蛋白酶的免疫细胞化学定位是一样的。总的来说，结果表明神经蛋白酶定位在突触前末端，尤其是突触前活性区域的突触间隙突触前膜内层。
通过它在突触中的定位，尤其是突触前活性区域，神经蛋白酶位于战略位置来控制突触结构和功能。作为突触结构和功能的调节器，尤其是作为CNS的抗突触试剂，在CNS神经元中过度表达神经蛋白酶的转基因小鼠身上的实验证明了神经蛋白酶的作用(实施例11)。CNS神经元产生的过量神经蛋白酶引起中枢神经系统突触数量和大小的显著减少。采用形态学和电生理学方法发现了结构改变的证据。
在神经纤维网区域突触计数显示了每一区域突触数量的减少(实施例12)。在神经蛋白酶过度表达的小鼠中顺着染料填满的树突检查树枝状脊骨显示了脊骨大小和数量的减少(实施例13)。这些结果达成一致，因为许多突触在树枝状脊骨处终止。因此，更少的突触和更少的树枝状脊骨表现了相同现象的两个方面。总结一下，这些观察清楚地证明了神经蛋白酶地抗突触功能。
在CNS中，神经蛋白酶介导集聚素的切割(实施例14和15)。蛋白多糖集聚素出现在神经肌肉连接(Sanes，J.R.和Lichtman，J.，Nat.Rev.Neurosci.2：791-805，2001)和中枢神经系统的突触(Smith，M.A.和Hilgenberg，LG.，Neuroreport 13：1485-1495，2002；Kroger，S.和Schroder，J.E.，News Physiol.Sci.17：207-212，2002)。在CNS野生小鼠的匀浆中，在出生后最初几周内可以发现大量100kDa集聚素片段，当神经蛋白酶发展的表达时达到顶点(实施例14)。在CNS神经元中过度表达神经蛋白酶的转基因小鼠中大量的100kDa集聚素片段显著增加(实施例15)。用丙氨酸代替活性位点的丝氨酸使神经蛋白酶失活，集聚素没有切割发生。因此，神经蛋白酶的蛋白水解活性明显地介导了集聚素地切割和CNS100kDa集聚素片段的产生。在这些实验中使用的集聚素的形式是锚定膜形式。在中枢神经系统中主要发现集聚素N-末端连接的形式，用来控制中枢神经系统突触区别(Bose，CM.等人，J.Neurosci.20：9086-9095，2000)。
总之，神经蛋白酶不仅在NMJ中具有抗突触功能，在CNS中也具有该功能。过量神经蛋白酶(过量表达)与大脑皮层和海马区域突触连接不足相关，两个大脑结构对认知功能非常重要，例如记忆和学习。突触组织蛋白多糖集聚素也是CNS中神经蛋白酶的生理底物。通过切割集聚素，神经蛋白酶阻断集聚素的突触前活性。
突触前活性
(例如集聚素)
□□□□□□□□□□□□□□
□□□□□□□□□□□□□□
抗突触活性
(例如神经蛋白酶)
突触前试剂集聚素和抗突触试剂神经蛋白酶在CNS中共同存在相互作用支持了这一概念：神经系统的神经元通路是动态的而不是固定的体系。突触前和抗突触因子之间的平衡匹配导致动态平衡。例如，当突触连接需要变化来储存记忆，通过可控制的方式来移动突触前和抗突触因子之间的平衡。当线路中的变化完成，突触前和突触后之间的平衡恢复。
突触前和抗突触因子之间精细的紧密的相互作用很容易受到外界影响而导致不适当的突触动态平衡或不适当的功能需求的适应。当这种外界影响超过极限值的时候突触疾病就会产生。
神经蛋白酶活性的药物调整提供了空前的方法来调整突触功能。抑制神经蛋白酶蛋白水解活性导致寿命延长，因此，增加了集聚素的浓度。由于神经蛋白酶和集聚素之间的联系，神经蛋白酶抑制引起降低的抗突触活性，推进了集聚素的突触前活性。作为结果，平衡向突触前活性提高方向移动，导致突触的数量，大小和强度的增加。
突触前活性保持或增加
□□□□□□□□□□□□□□
□□□□□□□□
抗突触活性降低
通过降低神经蛋白酶抗突触活性，以抗突触活性的损失来提高突触前活性的突触调整概念在扰乱的认知脑功能领域提供了广泛的应用。尤其是，在突触形成的疾病和亚临床状态神经蛋白酶抑制很有益处，增加现有的突触的大小和浓度是必要的。
神经蛋白酶抑制在治疗精神分裂症方面是有用的。突触过量的神经蛋白酶驱动突触修剪，因此，产生突触显型，与精神分裂症患者大脑内发现的突触显型一致。这个实验观察证实了神经蛋白酶作为因素之一驱动突触修剪。在一种情况，由于多重修剪引发因素的收敛作用，过量的突触修剪发生，神经蛋白酶可控制的精细的局部抑制减少了驱动突触修剪。这就允许“精神分裂症的突触显型”恢复并导致精神分裂症症状的缓和。CNS中神经蛋白酶过度表达的小鼠的突触数量的减少表明神经蛋白酶抑制导致较小程度的突触修剪，因此，增加了突触数量，增强了神经元的连通性和通讯性。按照本发明抑制神经蛋白酶酶活性的化合物在精神分裂症中回复突触改变和重新建立正常的突触结构和功能是有用的，因此，可以停止或缩短精神分裂症症状并预防新的症状。
神经蛋白酶抑制也支持认知功能降低的临床和亚临床状态适度认知损害的认知增强。研究发现适度认知损害和其它临床和亚临床状态认知功能降低与一些CNS区域大脑组织萎缩的证据相关。神经蛋白酶过度表达的小鼠CNS中突触数量的减少表明神经蛋白酶抑制导致突触数量增加和神经元的连通性和通讯性提高。按照本发明抑制神经蛋白酶酶活性的化合物在所有有关突触数量减少或突触功能降低的临床和亚临床疾病中回复突触改变和重新建立正常的突触结构和功能是有用的。因此，神经蛋白酶的药物抑制可以改善不同原因引起的认知功能降低。
基于以上事实，本发明进一步涉及如上所述的式(1)的神经蛋白酶抑制剂的应用以及治疗和/或预防突触不足引起的疾病，例如骨骼肌萎缩，精神分裂症和认知障碍。尤其治疗被称为肌肉减少的骨骼肌萎缩，例如由于年老引起的骨骼肌萎缩，伴随骨质疏松的骨骼肌萎缩，以及与严重疾病例如癌症，AIDS和脓血症相关的肌肉损耗引起的骨骼肌萎缩，或因为严重的疾病或严重的伤害引起的卧床休息和/或瘫痪导致的骨骼肌萎缩。治疗的精神分裂症是完全的精神分裂症和类似于精神分裂的失常，包括慢性精神分裂症，慢性精神分裂症-情感失常，不确定的失常，各种各样症候学的急慢性精神分裂症，例如急性“Kraepelinic”精神分裂症或DSM-lll-R-原型类似于精神分裂的失常，插话式精神分裂失常，类似于精神分裂的错觉，类似于精神分裂的个性失常，例如具有适度症状类似于精神分裂的个性失常，精神分裂的个性失常，精神分裂症或类似于精神分裂症的潜在形式，以及非器质的精神失常。进一步地，这里描述的神经蛋白酶抑制剂可以用作认知增强剂，来改进大脑表现，改善学习和记忆功能。认知不足被认为是适度的认知损害，例如，在阿尔茨海默病的潜在早期阶段，中老年人除了痴呆以外认知功能的损害以及阿尔茨海默病患者认知功能的损害，帕金森病，多发性硬化病，休克和头部外伤。
同样地，本发明涉及式(1)的抑制剂的应用来生产药物制剂治疗和/或预防突触不足引起的疾病，例如骨骼肌萎缩，精神分裂症和认知障碍。进一步地，本发明涉及治疗和/或预防突触不足引起的疾病，例如骨骼肌萎缩，精神分裂症和认知障碍，包含给与需要这种治疗的恒温动物对抗上述疾病有效量的式(1)化合物或它们药学可接受的盐。式(1)化合物可以用如下方式给药，尤其是以药物组合物的形式用来预防或治疗疾病，优选给与恒温动物例如需要这种治疗的人对抗上述疾病有效剂量。对于体重大约70kg的个体而言，每日给药剂量从大约0.05g到大约5g本发明的化合物，优选从大约0.25g到大约1.5g。
神经蛋白酶由富脯氨酸碱性结构域(PB)，kringle结构域(KR)，三个(小鼠神经蛋白酶，mNT)或四个(人神经蛋白酶，hNT)清除受体富半胱氨酸结构域(SRCR1，SRCR2，SRCR3，和SRCR4)以及蛋白酶结构域(PROT)组成(图1)。酶原激活位点(ZA)表明了神经蛋白酶的蛋白酶结构域的N-末端的切割位点。在ZA位点蛋白水解切割位点将神经蛋白酶从无催化活性转变为有催化活性形式。通过小鼠神经蛋白酶的切割，产生包含非催化区域的大约55kDa的片段和包含蛋白酶区域的大约30kDa的片段。对于人神经蛋白酶，相应的产生分子量为67kDa和30kDa的片段。人神经蛋白酶的生物化学分析以及对神经蛋白酶抑制剂的研究要求蛋白数量在毫克到克范围。为了优化神经蛋白酶的产出和分泌，测试了一些真核表达体系，包括在小鼠骨髓瘤细胞中稳定表达，昆虫细胞中杆状病毒介导的表达，以及在人胚胎肾细胞(HEK)中的瞬时表达，在中国鼠卵巢细胞(CHO)中的瞬时表达，以及在巴斯德毕赤酵母中的稳定表达。这些体系具有这样的优势：能够适应自由血清条件从而降低浮在表面的污染蛋白的量，便于组织大量生产。神经蛋白酶的表达可以在以上表达体系中完成。尽管如此，神经蛋白酶最有效的生产和分泌方法是从骨髓瘤细胞中获得，如实施例16和17所描述的。
真核细胞中的表达可以使用许多真核表达载体完成(自制或商业上可买到)。同样地，可以使用许多真核细胞系，包括HEK293T和HEK293-EBNA细胞，COS细胞，CHO细胞，HeLa细胞，H9细胞，Jurkat细胞，NIH3T3细胞，C127细胞，CV1细胞，或Sf细胞。
神经蛋白酶的生产也可以基于能够内源性表达神经蛋白酶的哺乳动物细胞系。内源性的人神经蛋白酶的表达已经在人乳突细胞系HMC-1RNA水平观察到(Poorafshar，M.和Hellman，L，Eur.J.Biochem.261：244-250，19099)。HMC-1细胞系表明为了适当加工的天然存在的来源，因此很有可能激活人类神经蛋白酶。这些细胞可以在悬浮液培养基中生长并且表达人类神经蛋白酶。从HMC-1细胞中表达的蛋白质可以作为97kDa条带用特定的多克隆抗体在蛋白质印迹实验中检测，该抗体对着kringle结构域生长。
采用标准蛋白质纯化方法来纯化神经蛋白酶(实施例18和19)。优选肝素柱子的亲和力纯化，然后采用疏水相互作用柱子和固定相金属鳌和剂色谱柱。洗提的蛋白然后进一步用离子交换色谱柱Mono S纯化。根据实验需要，另外的离子交换色谱步骤(DEAE或Mono Q)或凝胶过滤在神经蛋白酶纯化过程中也是有用的。本发明涉及测量神经蛋白酶催化活性的方法，以神经蛋白酶，它们的变体或包含有神经蛋白酶蛋白酶结构域的片段，和包含有集聚素，它们的变体或包含有集聚素切割位点□或□的片段的蛋白或多肽为特征(实施例20和21)，共同培养在水缓冲溶液中，测量集聚素切割的量(实施例24)。
正如这里所使用的，“包含有集聚素，它们的变体或片段的蛋白或多肽”是指人或其它哺乳动物或鸟类集聚素，采用一个或多个例如两个或三个集聚素的其它肽或蛋白的融合蛋白，尤其是和标记蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)，增强的绿色荧光蛋白(EGFP)或短链标记肽如8x组氨酸，其中的一个或多个集聚素变体，例如用不同氨基酸取代或删除一个，两个，三个或四个氨基酸的变体，以上定义的集聚素变体的融合肽，或包含有至少6个，尤其是至少8个集聚素的氨基酸，例如8到20或400到600个氨基酸的集聚素，或者是以上或者是融合标记肽或蛋白质，并且其中集聚素变体或集聚素片段保留切割位点□，切割位点□或两个切割位点，尤其是包含以上定义的切割位点□和/或切割位点□的大多数序列的集聚素片段。“包含有集聚素，其变体或片段的蛋白质或多肽”可以进一步包含非肽标记物，例如这里描述的分光镜检测。
尤其是测量神经蛋白酶催化活性的方法涉及使用全长的人或其它哺乳动物或鸟类的神经蛋白酶或神经蛋白酶的蛋白酶结构域，全长的集聚素或它的片段，例如膜绑定的集聚素的工程变体，例如序列SEQ IDNO：9的集聚素EGFP，或例如序列SEQ ID NO：12的集聚素片段C-末端，集聚素-C45。
尤其优选的测量神经蛋白酶催化活性的反应条件是包含Ca2+并且pH值在7-8之间的缓冲液，例如10mM MOPS，pH7.5的缓冲液，或者50-100mM Tris-HCl，包含100-200mM NaCl，1-20mM CaCl2，尤其是2-5mM CaCl2，以及任选超过0.5％聚乙二醇，例如聚乙二醇6000，反应温度在20℃到40℃之间，例如25℃左右，反应时间在1到48小时之间，例如2到16小时之间，例如3小时左右。使用神经蛋白酶在一个浓度可以使大约80％的底物在3小时内切割。优选神经蛋白酶的浓度是0.1到10nM，例如1nM左右，集聚素使用10倍到5000倍神经蛋白酶的浓度，例如浓度的1000倍。
来源于集聚素底物的长度可以在全长集聚素到包含至少一个神经蛋白酶切割位点的小肽范围内变动。神经蛋白酶在两个明确的进化保守的位点切割集聚素(实施例25)。包含第一个切割位点(切割位点□)的大致氨基酸序列是....P-P/A-1/V-E-R-A-S/T-C-Y....，，切割发生在R995和A996残基之间。包含第二个切割位点(切割位点□)的大致氨基酸序列是....G/A-L/1/T-1/V-E-K-S-V/A-G....，切割发生在K1754和S1755残基之间。
从底物蛋白或肽释放的蛋白质或肽片段的测量分析。如果肽直接包含切割位点□或□的N-末端氨基酸序列，或D用来于与发色团或荧光底物通过肽的C-末端共价连接，测量释放的发色团或荧光底物。跨越切割位点□或□的短肽底物也可以通过荧光淬灭方法测量神经蛋白酶的蛋白水解活性(Le Bonniec，B.F.等人，Biochemistry 35：7114-7122，1996)。
采用特异抗体检测包含切割位点□或□的蛋白底物的切割产物，该抗体与通过神经蛋白酶蛋白水解活性产生的一个或其它片段相对(实施例22和23)或通过耦合荧光的，发色的或其它标签到集聚素或集聚素片段的一个或其它末端相对。为了检测切割产物，可以使用检测蛋白或多肽和它们的切割产物的任何方法。例如，通过SDS-PAGE伴随蛋白质印迹分析来检测全长集聚素和较大的集聚素片段的切割(大于大约10kDa)，或者采用荧光或其它标签蛋白在凝胶中直接看得见来检测小碎片的出现，代价就是消耗最初的底物。集聚素更小的片段(小于大约10kDa)通过结合在塑料表面或树脂珠上固定不动，通过片段溶解使切割形象化，该片段或者被抗体特异识别或者通过荧光或其它检测化合物来识别(Patel，D.等人，BioTechniques 31：1194-1203，2001)。
例如，一个用来研究神经蛋白酶在切割位点□切割集聚素的来源于集聚素的底物是基于集聚素跨膜形式的工程集聚素-EGFP。通过人calsyntenin-1和8x组氨酸标签的分泌信号肽序列实现跨膜部分的置换产生了该分子的可溶形式。采用金属亲和力色谱柱从细胞培养悬浮物中纯化该蛋白。为了检测切割位点□，LG3结构域和连接EGF4结构域和包含□位点的LG3结构域的茎环区被EGFP或连接短的连接臂的其它蛋白结构域取代(参见实施例20)。神经蛋白酶活性分析的有用的工作浓度从低的纳摩尔到微摩尔，例如1nM到10□M。通过蛋白质印迹分析，采用抗体检测在切割位点□切割产生的集聚素C-末端切割产物测量蛋白质底物和它的切割产物(实施例22)或者在ELISA分析中通过N-末端聚组氨酸标签的蛋白结合，监测通过适当抗体的C-末端片段的释放(实施例22)或在金属板监测器上测量EGFP部分的释放的荧光。
另一个监测神经蛋白酶蛋白水解活性的来源于集聚素的底物由大约45kDa的集聚素C-末端片段组成，包含集聚素的切割位点□。它由集聚素的LG2-EGF4和LG3结构域组成，包含EGF4和LG3结构域之间的切割位点□。为了在细胞培养基中生产分泌形式的蛋白，人calsyntenin-1分泌信号肽融合在N-末端，伴随一个8x组氨酸标签，便于纯化和与Ni-NTA盘子结合。为了检测和进一步纯化可以加入C-末端Streptag Il。该底物(实施例21)很适合从低的纳摩尔到微摩尔浓度测量神经蛋白酶活性，例如1nM到10□M。通过使用蛋白染料给未切割的底物和切割产品染色来监测神经蛋白酶活性，例如考马斯亮蓝或Sypro宝石红，或通过蛋白质印迹分析采用StrepTactin(IBA，Gottingen)检测切割产品的C-末端或使用适当的抗体检测LG3结构域(参见例23)。进一步包含C-末端EGFP或使用适当染料或其它信号给与蛋白定位的SNAP标签(Covalys)的构成物可以用来在盘子里进行高通量筛选分析，通过把蛋白质底物的N-末端部分结合到Ni-NTA盘子或Ni-NTA树脂珠上来检测神经蛋白酶切割的荧光释放(参见例子：Patel，D.，BioTechniques 31：1194-1203，2001)。
发色的蛋白水解底物代表性地包含由3到5个天然或人工氨基酸组成的天然或人工的肽。它们可以是N-末端保护的来减少氨基肽酶对其不必要的降解。在它们的C-末端进行修饰，通过酰胺键切割来释放发色基团或荧光基团。检测取决于离去基团的类型，可以从紫外到可见光区域。其它产生荧光信号。大部分通常使用的基团是吸收405nm波长光的硝基苯胺(pNA)(NaII，T.A.等人，J.Biol.Chem.279：48535-48542，2004)，荧光团7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)，激发波长是342nm，发射波长是440nm(Niyomrattanakit，P.等人，J.Virol.，78：13708-13716，2004)。为了检测神经蛋白酶活性使用一个短肽IER-pNA，在分析缓冲液(150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％PEG 6000，20mM MOPS，pH7.5)中浓度是20-50□M，温度从25到37℃。在浓度1-5nM神经蛋白酶切割，分光光度计上410nm处信号强度增加。
FRET底物在蛋白水解分析中广泛使用因为它们提供了非常适于高通量筛选(HTS)的同质的和灵敏的化验方法。该方法在高通量筛选设备中对竞争性神经蛋白酶抑制剂的有机化合物的库扫描尤其有用。在FRET化验中肽底物用两个荧光团合成，一个荧光给体(邻氨基苯甲酸，Abz″)，一个淬灭受体(乙-二胺-2，4-二硝基苯基，ED-DNP″)。这两个基团之间的距离要经过选择，能够激发光，给体(Abz)荧光能量能够被受体(ED-DNP)迅速淬灭，这种量子机械现象被称为荧光共振能迁移(FRET)，该现象没有光的发射就能发生。蛋白酶切割底物肽，荧光团与淬灭基团分离，恢复给体的完整荧光收益。依据7-100的因子荧光增强与蛋白水解速率线性相关(Le Bonniec，B.F.等人，Biochemistry35：7114-7122，1996)。
一个基于集聚素的检测神经蛋白酶活性很有用的FRET底物氨基酸序列为Abz-PIERASCY-ED-DNP的九肽，包含集聚素的神经蛋白酶识别位点□(Jerini AG，Berlin，Germany)。公认的切割位点定位于底物第4个氨基酸(R)和第5个氨基酸(A)之间。通过1-10nM在分析缓冲液(150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％PEG 6000，20mM MOPS，pH7.5)中的神经蛋白酶切割肽的浓度范围在1-40□M，温度从25到37℃，采用荧光测定法检测活性因为荧光分光光度计在320nm激发波长和430nm发射波长增强的信号强度。
另一个FRET底物基于两个荧光蛋白，蓝绿色荧光蛋白(CFP)和增强的黄色荧光蛋白(EYFP)。这两个蛋白之间有一个16氨基酸的连接，包含神经蛋白酶识别序列□(PIERA SCY)，分别在神经蛋白酶识别序列的上游和下游引入两个4个氨基酸的间隔(接头序列：GAGSPIERASCYGSST。)可供选择地，也可以使用在切割位点□两侧的相应的氨基酸序列。神经蛋白酶切割敏感的连接序列分离两个荧光团导致能量转移损失。采用1-10nM神经蛋白酶和0.1-1□M底物在25到37℃在分析缓冲液(150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％PEG 6000，20mMMOPS，pH7.5)中进行数据收集。因此，通过在400-450nm激发后给体增强的荧光强度(Em.485nm)和受体同时降低的荧光强度(Em.528nm)测量来评估底物的水解(Pollock，B.A.等人，Trends in Cell Biol.9：57-60，1999)。
本发明进一步涉及确定化合物是否是神经蛋白酶抑制剂的方法，特征是化合物与神经蛋白酶在水缓冲溶液中共同培养，尤其是人神经蛋白酶，包含蛋白酶结构域的它们的变体或片段，以及和包含集聚素的蛋白或多肽，包含集聚素切割位点□或切割位点□的它们的变体或片段在水缓冲溶液中共同培养，测量集聚素的切割量。
尤其是，确定化合物是否是神经蛋白酶抑制剂的方法涉及全长人神经蛋白酶或人神经蛋白酶的蛋白酶结构域的使用，以及全长集聚素或它们的片段的使用，例如固定在膜的集聚素的工程变体，例如序列为SEQID NO：9的集聚素EGFP或例如序列为SEQ ID NO：12的集聚素C-末端片段和集聚素C45。采用神经蛋白酶蛋白水解活性分析发现了神经蛋白酶的抑制剂(实施例26和27)。为了测量神经蛋白酶的蛋白水解活性，纯化的神经蛋白酶(实施例18和19)和纯化的集聚素，或包含至少一个切割位点的集聚素纯化的片段(实施例20和21)与化合物共同培养，在适当的条件下进行测试。培养过程完成后，测量神经蛋白酶的蛋白水解活性产生的切割产物。通过比较包含潜在的神经蛋白酶抑制剂的反应中和没有加入有机化合物的对照反应中产生的切割产物的量确定化合物的抑制作用(实施例27)。实施例28描述了确定作为神经蛋白酶抑制剂的化合物的抑制活性的剂量依赖性。实施例29描述了通过检测对其它丝氨酸蛋白酶的抑制活性来研究作为神经蛋白酶抑制剂的化合物的特异性。
尤其优选确定化合物是否是神经蛋白酶抑制剂的反应条件是包含Ca2+的pH值在7左右的缓冲液，例如100-200mM NaCl，5-20mMCaCl2，20mM MOPS，pH7.5，以及任选0.5％的聚乙二醇，反应温度在20℃到40℃之间，例如25℃左右，反应时间在1到48小时，例如3小时。优选神经蛋白酶的浓度是0.1到10nM，例如1nM左右，集聚素使用10倍到5000倍神经蛋白酶的浓度，例如浓度的1000倍。加入测试化合物，浓度逐渐增加，优选0.001到500□M之间。可以加入高于30％的DMSO来改善测试化合物的溶解性。
本发明进一步涉及在高通量筛选体系(HTS)检测神经蛋白酶活性和小分子有机化合物的神经蛋白酶抑制作用的方法：神经蛋白酶，包含神经蛋白酶的蛋白酶结构域的它们的变体或片段，以及和包含集聚素的蛋白或多肽，包含集聚素切割位点□或切割位点□的它们的变体或片段，或包含与集聚素切割位点□或切割位点□同源序列的其它蛋白质在水缓冲溶液中共同培养，在适合HTS的过程中测量切割产物的量。尤其是以上描述的测量神经蛋白酶催化活性的方法也可以采用适当的HTS读出方法用在多盘分析或点印迹分析上。
在多盘监测器上通过测量适当波长荧光或吸收的增加可以很容易地检测出或者包含切割位点□或者包含发色或荧光离去基团C-末端切割位点□的短肽底物。这种方法也可用于N-末端或C-末端具有亲和力标签的蛋白底物，例如聚组氨酸标签或Streptag Il或蛋白质标签，以及N-末端或C-末端融合的信号给与蛋白或蛋白结构域，例如荧光蛋白，或能够用发色团或荧光团标记的蛋白，或催化发色或荧光反应的酶如□-半乳糖苷酶或其它，通过把蛋白质的一部分固定在孔的表面，在适当的波长在孔的悬浮物中检测荧光或吸收或酶活性的产生。在HTS中神经蛋白酶活性产生的切割产物也可以用ELISA应用软件来监测，通过检测包有适合神经蛋白酶切割的蛋白底物的孔的悬浮物中切割产物的量，或用适当的连有信号给予酶或基团的抗体检测剩余的未切割底物的量(Gutierrez，O.A.等人，Anal.Biochem.307：18-24，2002)。
本发明进一步涉及用类似HPLC(Betageri，R.等人，J.Biochem.Biophys.Methods 27：191-197，1993)，FPLC，质谱(Mathur，S.等人，J.Biomol.Screen.8：136-148，2003)，SELDI(Cyphergen)或其它相关应用的其它适合类似于HTS的以上描述的任何短肽底物或蛋白底物的切割产物的检测的non-plate分析。
另外，本发明涉及通过这种方法发现的神经蛋白酶抑制剂，尤其是下式的化合物
Figure S2006800101171D00251
其中其中Hal1和Hal2各自独立地是氟、氯或溴；尤其是溴；及其药学可接受的加成盐。优选的化合物是Hal1和Hal2多种有一个是溴，且另一个是氯或氟，及其药学可接受的加成盐。尤其优选药学可接受的式(1)的加成盐，其中Hal1和Hal2是溴。
例如，这种药学可接受的盐用有机或无机酸形成。适合的无机酸是，例如，卤素酸如盐酸，硫酸，或磷酸。合适的有机酸是，例如羧酸，磷酸，磺酸或氨基磺酸，例如乙酸，丙酸，辛酸，癸酸，十二烷酸，羟基乙酸，乳酸，富马酸，琥珀酸，脂肪酸，庚二酸，辛二酸，壬二酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，氨基酸例如谷氨酸或天门冬氨酸，马来酸，羟基马来酸，甲基马来酸，环己胺羧酸，金刚烷羧酸，安息香酸，水杨酸，4-氨基水杨酸，邻苯二甲酸，苯乙酸，扁桃酸，苯乙烯酸，甲基或乙基磺酸，2-羟基乙基磺酸，乙基-1，2-二磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，1，5-萘-二磺酸，2-，3-或4-甲基苯磺酸，甲基硫酸，乙基硫酸，十二烷基硫酸，N-环己基氨基磺酸，N-甲基，N-乙基或N-丙基氨基磺酸，或其它有机质子酸，例如抗坏血酸。
为了分离或纯化也可能使用药学可接受的盐，例如苦味酸盐或高氯酸盐。为了治疗作用，采用只有药学可接受的盐或游离药物(适用于药物制剂可制备的形式)，这些是优选的。式(1)的化合物通过本领域内已知的方法制备，例如式(2)或它的前体的氨基的缩合，其中脒以被保护的形式或与式(3)的醛作为功能基团很容易转化成脒，缩合反应发生后或功能基团转化为脒之后，任意的保护基团被切割掉。
Figure S2006800101171D00261
尤其是，本发明涉及包含这里描述的式(1)化合物的药物组合物以及使用式(1)化合物作为药物制剂。
本专利也涉及包含式(1)化合物作为活性有效成分的药物组合物以及尤其可以被用来治疗以上提到的疾病的药物组合物。优选用来肠给药的组合物，例如鼻的，口的，直肠的或尤其是口服药，以及优选用来胃肠外给药的组合物，例如静脉内的，肌肉内或皮下给药，给与恒温动物尤其是人。组合物包含单独的活性有效成分或优选与药学可接受的载体在一起。活性有效成分的剂量取决于治疗疾病和人种，年龄，体重，以及个体状况，个体药物动力学数据以及给药模式。
药物组合物包含从大约1％到大约95％的活性有效成分，例如，包膜和无包膜片剂，安瓿，小瓶，栓剂，或胶囊；或药膏，药霜，药糊，泡沫，酊剂，滴剂，喷雾，分散剂等。例子是包含大约0.05g到大约1.0g活性有效成分的胶囊。本专利的药物组合物采用本身已知的方法来制备，例如通过常规的混合，粒化，包衣，溶解或冻干过程
。优选使用活性有效成分的溶液，以及悬浮液或分散液，尤其是等压水溶液，悬浮液或分散液，例如单独包含活性有效成分或与载体一起的冻干组合物，载体如甘露醇，可以在使用前制备。药物组合物是灭菌的和/或包含赋形剂，例如防腐剂，稳定剂，加湿剂和/或乳化剂，增溶剂，调节渗透压的盐和/或缓冲液，采用本身已知的方法来制备，例如通过常规的溶解和冻干过程。上述溶液或悬浮液包含增粘剂，代表性的羧甲基纤维素钠，羧甲基纤维素，右旋糖酐，聚乙烯吡咯烷酮，或凝胶，或增溶剂，例如吐温80□(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)。
在油中的悬浮液的油成分由常规用于注射的植物的，合成的或半合成的油组成。
合适的载体尤其是填充剂，例如糖，如乳糖，蔗糖，甘露糖或山梨糖，纤维素制备物和/或磷酸钙，例如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及黏合剂如淀粉，例如玉米，小麦，水稻或马铃薯淀粉，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮，和/或粉碎剂(如果需要)，例如以上提到的淀粉，以及羧甲基淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮，褐藻酸或它的盐，例如褐藻酸钠。另外的赋形剂尤其是流量调节剂和润滑剂，例如硅酸，滑石粉，硬脂酸或它的盐，例如硬脂酸镁或钙，和/或聚乙二醇，或它的衍生物。
片剂核心可以采用本领域内知道的合适的任意肠包衣。
口服的药物组合物也包括由凝胶组成的硬胶囊和由凝胶和可塑剂如甘油和山梨醇组成的软的密封胶囊。适合直肠给药的药物组合物是由活性有效成分和栓剂基质组成的栓剂。合适的栓剂基质是天然的或合成的甘油三酸酯，石蜡烃，聚乙二醇或高级烷醇。
实施例
实施例1：脊椎束运动神经元强烈表达的神经蛋白酶
在成年小鼠脊椎束的横截面进行的原位杂交模式显示出灰质区神经蛋白酶mRNA的很强烈的细胞表达(Gschwend，T.P.等人，Molec.CellNeurosci.9：207-219，1997)。发现在脊椎束中神经蛋白酶最强烈的表达是在灰质区前侧角状物的运动神经元。
为了脊椎束中神经蛋白酶蛋白的免疫组织化学定位，产生了针对神经蛋白酶催化结构域的抗体。为了产生免疫抗原，在大肠杆菌中生产在C-末端包含His标签的人神经蛋白酶催化结构域，在Ni-NTA柱子上进行纯化以及再折叠。50□g的部分用于使山羊免疫(使用完全的Freund′sadjuvans的初级免疫以及不完全的Freund′s adjuvans的强化注射)。采用固定相是蛋白G的亲和力色谱柱从免疫血清中分离IgG。通过固定相是神经蛋白酶蛋白水解结构域的亲和力色谱柱获得亲和力纯化的IgG。用戊巴比妥钠将成年小鼠(2个月大)深度麻醉(80mg/kg，Abbot)，用10ml 0.9％NaCl经颈动脉灌注，伴随包含4％多聚甲醛(Merck)，0.05％戊二醛(Merck)，以及在pH7.4(PB)，0.1M磷酸盐缓冲液中的0.2％苦味酸(BDH)的定影液。在60□m下用振动的薄片切片机切下头的大脑部分。为了增强免疫试剂的穿透力，断面在30％蔗糖的PB溶液中平衡，用液氮迅速冷冻，然后在PB中解冻，用0.3％Triton-X100预孵化10分钟。室温条件下(RT)，在0.05M Tris缓冲盐溶液(TBS；pH7.4)的20％标准山羊血清预孵化45分钟完成后，该部分与神经蛋白酶的初级抗体(1□g/ml)在4℃下培养36-48h。为了免疫过氧化酶日光显微镜方法，该部分在生物素标记的山羊抗兔IgG(1∶200，Vector Labs)中在4℃下培养12h，伴随室温下在抗生物素蛋白-生物素-过氧化酶复合物(Elite ABC；1∶100，Vector Labs)中培养3h。在0.004％H2O2存在下，通过在3，3′-二氨基联苯胺(Sigma；0.05％in TBS，pH7.6)中培养使免疫抗原位点形象化。断面裱在涂胶的幻灯片上，晾干，脱水，用Entelan(Merck)覆盖。
在成年小鼠脊椎束横截面上用这种方式检测的免疫组织化学染色图案显示了灰质中神经蛋白酶存在的强烈信号。发现最强烈的表达水平是在前侧角状物的运动神经元。对照部分采用相同过程处理，但是第一和第二抗体太过冗长，没有显示任何染色。
总结一下，这些实验清楚地证明了神经蛋白酶在脊椎束灰质区强烈表达。尤其是发现在定位于前侧角状物的支配骨骼肌的运动神经元中强烈表达。
实施例2：神经蛋白酶切割集聚素。
通过HEK293T细胞中两个蛋白的共表达来检测神经蛋白酶对集聚素的蛋白水解作用。包含小鼠神经蛋白酶编码序列的A 2310bp Kpnl-Hindlll片段经过Kpnl和Hindlll被克隆进入真核生物表达载体pcDNA3.1(-)(Invitrogen)。通过Kpnl和EcoRI编码大鼠集聚素(Rupp，F.等人，Neuron 6：811-823，1991；GenBank Nr.M64780)的cDNA克隆被插入pcDNA3(Invitrogen)的多聚连接中，大鼠集聚素由包含接合变体Y4和Z8的跨膜异构体组成。在37℃下具有10％CO2的潮湿空气中在DMEM/10％FCS中培养HEK293T细胞。为了转染，细胞被种到3mlDMEM/10％FCS中，放到3cm盘子上的玻璃盖子滑片上。播种后一天，汇集40-60％，使用磷酸钙沉淀，用编码神经蛋白酶和集聚素(5□g DNAeach)的cDNA瞬时转染细胞。转然后4h，仔细移走培养基并更换3ml新鲜的DMEM/10％FCS。
与神经蛋白酶共表达时采用蛋白质印迹分析来分析集聚素的降解情况。转染后48h，用PBS清洗细胞，并加入250□l缓冲液(20mMTris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂鸡尾酒)来溶解细胞。提取物在4℃下培养20分钟，然后在4℃下用15000×g离心分离20分钟。收集上清液。测定蛋白质浓度以后，上清液与5×Laemmli装载缓冲液混合，煮沸3分钟，离心并用于分析。用7.5％丙烯酰胺SDS-PAGE分离蛋白。电泳后，蛋白质转移到硝化纤维膜上。用胭脂红染色来检验转移质量。用包含0.1％吐温-20和5％(w/v)封闭试剂(Amersham)的TBS来封闭膜。以后的步骤都用0.1％吐温-20的TBS来完成。膜用初级抗体来培养60分钟(SZ177，1∶1000；AGR540，1∶1000；K-17，多克隆抗集聚素抗体(Santa Cruz)，1∶1000)。广泛清洗之后，膜用次级过氧化酶耦联的抗体培养45分钟。按照厂商说明用ChemiGlow(Alpha Innotech)来完成检测。用Chemilmager(AlphaInnotech)来照相。
在单转染的清洁提取物中很容易确定集聚素(图2，泳道1)。在双转染的提取物中，集聚素显著减少(图2，泳道2)。在用空载体转染的细胞中没有发现集聚素信号。经过抗神经蛋白酶抗体的印迹再检测之后，证实了在所有条件下神经蛋白酶的生产。这些不同条件下培养基的分析显示了从双转染细胞中释放到悬浮培养基中的细胞提取物中损失的免疫活性。在双转染HEK293T细胞的200□l培养基中用抗集聚素抗体检测到100-kDa条带(图2，泳道3)。单转染的细胞培养基中没有发现信号(图2，泳道4)。同样地，用集聚素和无催化活性的神经蛋白酶转染的HEK293T细胞培养基中也没有检测到信号。
总结一下，结果表明(1)HEK293T细胞生产的神经蛋白酶具有催化活性，(2)集聚素作为神经肌肉连接和中枢神经系统突触细胞外存在的组分能够被神经蛋白酶依赖的蛋白水解切割，和(3)神经蛋白酶依赖的切割导致了集聚素缩短的释放的形式的形成。集聚素的释放部分具有明显的大约100kDa的分子量。因为用于检测集聚素的抗体是由集聚素C-末端的抗原决定簇决定的，溶解的片段包含集聚素C-末端。
实施例3：在神经系统发展中体内集聚素切割与脊椎束中神经蛋白酶表达相一致。
为了测试体内集聚素的切割，采用蛋白质印迹分析，用集聚素C-末端100-kDa片段和Nt特异性抗体来分析发展中的脊椎束匀浆和成年小鼠。从出生后4，7，9，10，15和25天，以及3，6和12个月大的小鼠脊椎束中制备组织匀浆。如图3中证明的，在出生后头三周内Nt是最强烈表达的，出生后7天到10天之间具有最高表达水平。采用与集聚素C-末端部分相对的抗体的蛋白质印迹分析表明了非常相似的时间图，标志着神经蛋白酶切割集聚素也发生在体内。
实施例4：采用转基因小鼠技术在运动神经元中神经蛋白酶的选择性过度表达。
在Thy-1基因引物控制下神经蛋白酶过度表达。Thy-1基因在小鼠神经系统神经元中表达的相对比较晚(出生后4-10天，取决于定位；Gordon，J.W.等人，Cell 50：445-452，1987)。因此，Thy-1引物控制下的神经蛋白酶的表达确保避免了在早期发展阶段过量神经蛋白酶的出现引起的忧虑。
用有条件的必需的活化的转基因来产生神经蛋白酶过度表达的小鼠。为了这个目的，可移动的与loxP位点相连接的转录终止序列引入到神经蛋白酶cDNA之前。因此，终止序列可以和Cre催化重级酶/loxP重组体系一起移走(Sauer B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：5166-5170，1988)。Cre(Cre-催化重级酶)蛋白由大肠杆菌抗菌素P1编码，能够有效促进DNA分之间和分之内的重组。重组发生在叫做loxP的特异位点(Hamilton，D.L和Abremski，K.，J.MoI.Biol.178：481-486，1984)。Cre催化重级酶的这个显著特点允许loxP序列之间DNA特定的指示串的删除和插入。这样可以用来在体内产生特异的功能突变(Chen S.等人，Cell 51：7-19，1987)。
具有神经蛋白酶过度表达的有条件的构成物的小鼠与带有Cre催化重级酶DNA的杂合小鼠杂交，该Cre催化重级酶DNA是在为了在运动神经元中产生小鼠过度表达活性的神经蛋白酶的转录因子HB9中。在运动神经元的详述过程中HB9引物在体内是有活性的，所以，所有运动神经元表达HB9驱使的Cre催化重级酶，导致转录终止序列从非活性转基因中移走。
转基因小鼠通过PCR进行基因扩增。用于PCR的DNA从小鼠尾巴中提取。选定PCR引物的位置目的是为了防止鼠类自身的神经蛋白酶基因被检测到。3′-引物与DNA序列内部的Thy-1引物相符，5′-引物与神经蛋白酶cDNA内部的序列相符。该DNA片段对神经蛋白酶转基因而言是唯一的。检测Cre插入物的引物相当于来自于Cre基因内部的DNA序列，因为Cre通常不存在于小鼠中。通过这个过程，产生了过度表达人神经蛋白酶的三个小鼠系和过度表达鼠神经蛋白酶的四个系。通过Northern blotting和原位杂交在mRNA水平验证了转基因表达，并且通过蛋白质印迹分析在蛋白质水平验证了转基因表达。典型的过度表达是在2到10倍。
通过在相同的例如Thy-1引物条件下产生过度表达的神经蛋白酶无催化活性形式的转基因小鼠验证了神经蛋白酶介导的在它催化结构域的改造的依赖性。通过把基本活性位点丝氨酸711(对应于糜蛋白酶丝氨酸195)变异为丙氨酸就可以很容易地产生无活性神经蛋白酶。因为在所有的丝氨酸蛋白酶中，活性位点丝氨酸是与蛋白水解反应的共价中间体相关的，它的变异导致催化功能的完全丧失。过度表达神经蛋白酶无活性形式的转基因小鼠是健康的，不会出现任何异常。
实施例5：神经蛋白酶转基因过度表达增强了体内集聚素的切割。
从人神经蛋白酶(hNt)或小鼠神经蛋白酶(mNt)过度表达的成年小鼠脊椎束中制备组织匀浆。通过具有无活性转基因的小鼠(mNt的497，489和533系和hNt的493和494系)与在运动神经元特异的HB9引物控制下表达Cre催化重级酶的小鼠杂交获得这些小鼠。野生型小鼠用于对照。脊椎束匀浆进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。用与hNt和mNt以及集聚素C-末端100-kDa片段相对的抗体探测蛋白质印迹。如图4显示，在过度表达神经蛋白酶的转基因小鼠中集聚素C-末端100-kDa片段显著增加。金氨基酸C-末端100-kDa片段增加的量与不同转基因小鼠系中过度表达水平具有很好的相关性。这些结果表明在体内神经蛋白酶是以浓度依赖的方式切割集聚素。
实施例6：运动神经元中神经蛋白酶转基因过度表达导致几小时到几天内集聚素从NMJ中移走。
通过神经肌肉联接(NMJ)的免疫组织分析研究脊髓运动神经元中神经蛋白酶(Nt)的转基因过度表达作用。尤其关注的是出生后的一周，因为已知在出生后第一周用来驱动转基因Nt表达的Thy-1引物非常活跃(取决于位置具有一些变异)。为了这个分析，使用横膈膜因为NMJs的表面定位使得这个肌肉成为这种比较分析很好的模型。通过亲和力纯化的针对集聚素C-末端100-kDa片段的抗体的免疫组织学染色，使集聚素可视化。如图5中示范的，在转基因活性开始之前的时间点PO，在野生型小鼠和转基因小鼠中集聚素免疫活性是一样的(图5：PO)。在两种情况下，集聚素免疫活性很明显地与图6中显示的相同肌肉的NMJs的oBtx信号相匹配。在P8时间点比较野生型小鼠发现Nt过度表达的小鼠的横膈膜的NMJs上的集聚素免疫活性显著减少(图5：P8)。伴随与年龄匹配的野生型小鼠中集聚素阳性的NMJs的浓密迁移，终板带显示了很少数大的类似于NMJ的集聚素阳性结构。P4小鼠的集聚素免疫活性显示了以具有可变大小结构混合模式为特征的过渡态，从保留很好的NMJs到反映NMJs残基的小结构变化(图5：P4)。图5中大部分集聚素免疫活性结构与图6中□-Btx阳性结构严密匹配。尽管如此，在过渡态真实的比例中，比率在集聚素信号和oBtx信号之间的Nt-过度表达的小鼠的突触比PO时间点的要少(参见实施例7)。
这些结果说明了在体内NMJ处神经蛋白酶切割集聚素，依赖神经蛋白酶的切割后，在几小时到几天内集聚素C-末端部分从NMJ消失。这个尤其显著因为C-末端部分包含集聚素负责突触前活性的结构域。
实施例7：神经蛋白酶诱导的集聚素从NMJ的移动导致几小时到几天内NMJ的分散。
通过突触后结构的可视化处理来研究运动神经元中神经蛋白酶(Nt)过度表达和随后集聚素从NMJs移走的作用。用荧光的Q银环蛇霉素(□-Btx)给乙酰胆碱受体染色来使突触后结构可视化。如图6中所示Nt过度表达小鼠(Nt)与野生型小鼠(wt)的比较中，在出生时就很好地建立起突触后结构(出生后0天，PO)。在出生后第一周结束时(P8)，在Nt过度表达地小鼠中大部分NMJ的突触后结构已经实质上消失。只有一些残留的可以在被称为终板带的结构中制造出来的NMJ是在野生型小鼠中发现的高密度的NMJ。在出生后第4天(P4)，发现由静止的形状很好的NMJ和部分溶解的NMJ的混合物组成的异类的图案。转基因小鼠和野生型小鼠终板带中NMJ密度减少的比较表明在这个阶段Nt过度表达的小鼠中，一部分NMJ已经完全消失。
过渡态NMJs的特征是在□-Btx-deco额定的结构中集聚素的消失或明显减少。这种过渡态NMJs在Nt过度表达的小鼠中特异发现。对比Nt过度表达的小鼠，在野生型小鼠中集聚素的免疫染色总是与突触后结构的乙酰胆碱受体的□-Btx染色很好地匹配。
总之，这些实验说明运动神经元中Nt的高表达导致已经建立的NMJs的分散。NMJs的分散跟随小的延迟的Nt转基因上调(估计延迟几个消失到几天)。过渡态突触的分析说明突触后结构的分散跟随集聚素的切割和集聚素C-末端100kDa片段从NMJs的移走。这就表明在NMJ中通过阻断集聚素的突触前作用，Nt起到了抗突触作用。如果运动神经元中神经蛋白酶强烈过度表达使抗突触功能过分增强，突触前试剂集聚素被压倒，所以NMJ就分解了。
实施例8：运动神经元脊椎束中神经蛋白酶高表达的成年小鼠显示了明显的肌肉力量降低的神经肌肉显型。
通过杂交具有有条件的Nt转基因小鼠(实施例4中描述)和在HB9引物控制下表达Cre催化重级酶的小鼠产生运动神经元中过度表达Nt的转基因小鼠。HB9引物驱动脊髓运动神经元中Cre催化重级酶的过度表达，所以通过切除转录终止片段激活运动神经元中无活性的Thy1-Nt转基因。来源于这种杂交的双重转基因小鼠显示了运动显型。它们行走缓慢，走路不稳，步伐很小。它们也显示了肌肉力量相当的减少。
总之，运动神经元中Nt过度表达导致外在运动显型，主要特征是骨骼肌力量的降低。
实施例9：具有神经蛋白酶高表达的成年小鼠神经肌肉连接显示了突触前和突触后结构明显的分裂。
过度表达Nt的转基因小鼠和相同阶段(年轻的)的野生型小鼠的神经肌肉连接的比较显示了Nt过度表达小鼠明显的NMJs分裂。在Nt过度表达的小鼠(图7D、E和F)中没有发现野生型小鼠出生前三周内发展的NMJs的典型的Prezel结构。尽管Nt过度表达小鼠的NMJs占据了它们靶点肌纤维表面的大约相同区域，它们的突触后和它们的突触前连接没有形成邻近的结构，但是在众多的小连接位点里已经断掉了。在Nt过度表达小鼠中观察到的NMJs的分裂也可以在患有肌肉减少的老年人的NMJs中发现，肌肉减少是在老年人中发现的一种肌肉萎缩形式。
总之，运动神经元中神经蛋白酶高表达导致人类肌肉减少的研究中报道的非常类似于NMJs分裂的NMJs分裂。
实施例10：神经蛋白酶高表达的成年小鼠的肌肉的肌纤维数量明显减少。
从肌纤维数量方面分析运动神经元中过量表达Nt的年轻成年小鼠的肌肉。分离单个肌肉例如比目鱼肌，组织部分通过肌肉中间部分垂直肌肉长轴制备。用Hematoxyline-Eosine给截面染色，计算纤维数量。图8显示了野生小鼠比目鱼肌(图8A)和Nt过量表达的小鼠(图8B)的比较。相比野生型小鼠的肌肉，Nt过量表达的小鼠的肌肉相当细，并且肌纤维数量也明显少很多。计算四种Nt过量表达的不同的小鼠系的比目鱼肌的肌纤维数量(图1)。
表1：肌纤维数量
小鼠系 肌肉A 肌肉B 比例2×TG/WT
493×Hb9-Cre 2×TG 669/701 584/612 77％
493×Hb9-Cre WT 752/905 803/863
494×Hb9-Cre 2×TG 509/502 356/396 52％
494×Hb9-Cre WT 826/827 822/901
497×Hb9-Cre 2×TG 720/607 651/688 82％
497×Hb9-Cre WT 774/764 883/822
498×Hb9-Cre 2×TG 846/829 650/571 78％
498×Hb9-Cre WT 906/893 946/989
结果显示了四种独立的转基因小鼠系的Nt过量表达小鼠的肌纤维数量的显著减少。
总之，小鼠肌纤维的量化说明了运动神经元Nt的升高导致肌纤维数量的显著减少。
实施例11：神经蛋白酶在转基因小鼠中枢神经系统的过度表达。
按照实施例4的程序，获得能够过度表达神经蛋白酶的小鼠。这些小鼠在巨细胞病毒启动子控制下和表达Cre催化重级酶的杂合小鼠杂交。巨细胞病毒启动子在体内持续有活性，因此Cre催化重级酶持续在两个loxP序列启动重组。这个过程从无活性的转基因中移除了转录停止序列并允许神经蛋白酶cDNA转录。基因型如实施例4中那样通过PCR和DNA印迹杂交获得。
类似的，过度表达在Thy-1启动子下无活性的神经蛋白酶的转基因小鼠通过将活性位点的丝氨酸变异为丙氨酸产生。
实施例12：中枢神经系统神经元的神经蛋白酶水平增加导致突触数量减少。
为了确定突触丰富区域的单位体积的突触数量和测量突触的大小参数(包括突触前轴突终末区域，突触后脊区域和突触的长度(通过测量并列的突触前后膜长度)，两个独立的神经蛋白酶过度表达小鼠线路(Nt491/cre和Nt494/cre)和几个对照小鼠线路(野生型小鼠，CMV-Cre小鼠，和转基因双亲产生的带有无活性神经蛋白酶基因的Nt491-inact.Nt和Nt494-mact.Nt)被研究。小鼠在28天大的时候通过metiofane(Schering-Plough)深度麻醉，用0.9％氯化钠灌注心脏，然后用0.2％的多聚甲醛和1％的戊二醛在0.1M的磷酸盐缓冲液(PB)中固定，pH7.4。大脑从颅骨中取出，通过振荡器切成100□m厚的连续切片。切片在1％的四氧化锇磷酸盐缓冲液中固定，用2％的醋酸盐双氧铀处理，在乙醇和氧化丙烯中脱水，植入Durcupan ACM树脂(Fluka)中。用于电子显微镜分析的在前后水平前囟-2mm和中侧1.5mm包含海马CA1区域的切片要超级切片。突触的取样过程包括15到23EM海马CA1区域的放射层神经毡的样本，从三个不相邻的区域相互间隔至少50□m，初始的放大率为27500倍。电镜照片最后用80000倍放大率打印，代表组织90到135Dn(2)。一个突触被定义为两个并列的增厚膜，即突触前后膜的剖面，突触前膜的剖面包含至少三个突触囊泡与其它膜有紧密联系。突触按照超级结构标准分为轴突树突和轴脊突触。树突轴通过它们的大小和存在线粒体和微管来识别。树突脊直径较小，缺乏线粒体和微管，偶尔包含脊器官。轴突树突型突触在所有样本中仅占一小部分，因此被排除在统计评价之外。每张显微照片的所有轴脊突触被计算，除了接触到排除线的。轴突终末和突触后脊的横截面面积和所有轴脊突触的突触连接的长度通过一个磁性书写板(Kurta)和Macstereology 2.8(Ranfurly Microsystems)分析程序直接测量。突触的密度应用大小-频率方法和公式NV＝NA/d获得(NA每单位面前的突触的数量，d突触连接的平均长度；DeFelipe，J.，等人，Cereb.Cortex 9：722-732，1999)。
计算每mm3突触的数量。结果显示在图9。每mm3突触的数量在神经蛋白酶过度表达的小鼠中明显减少。相反，对照组小鼠的突触数量，例如用于产生双转基因(DTG)神经蛋白酶过度表达的双亲路线小鼠(491-inact.Nt，494-inact.Nt，和CMV-Cre)与野生型小鼠一样。因此，结果显示神经蛋白酶过度表达的小鼠突触明显减少。
实施例13：中枢神经系统神经元神经蛋白酶水平升高导致树突棘(突触后成分)数量减少。
应用不锈钢的刀片对17到32天大的神经蛋白酶过度表达小鼠和野生型小鼠进行平行矢状线的海马切片(300μm)，转移到充满34℃温暖的氧化的ACSF的培养室中，培养一小时，以保证足够的时间让脑组织从切割损伤中恢复。然后，切片保存在室温环境中直到以后实验中使用。
为了全细胞钳夹，记录切片被放进一个标准的沉浸的室中，也充满ACSF。个别的神经元通过一个轴向显微镜观察(Zeiss)，应用红外照明适合微分干涉对比光学。实验室保持在35-36℃，接近生理体温。ACSF通过室的流量在1-2ml/min。ASCF在进入记录室之前通过碳氧化物氧化。通过整细胞记录吸液管记录，拉到火红/褐色的钳子上，充满和室内一样的溶液。为了形态重建，神经元注射115mM KOH，20mM K-葡糖酸盐，10mM KCI，10mM HEPES(Good′s缓冲液)，10mM phospho-kreatine，4mM ATP-Mg，0.3mM GTP，和13.4mM生物胞素的溶液。每个带有生物胞素标记的CA1锥体细胞放在两张微孔过滤纸之间使之在固定时保持平整，在室温下浸入含有1％戊二醛，2％多聚甲醛和大约0.2％苦味酸的0.1M磷酸盐缓冲液(PB)，pH7.4中2-3小时。切片保存在40℃0.5％的多聚甲醛磷酸盐缓冲液中。经过磷酸盐缓冲液的几遍冲洗，切片用2％的过氧化氢处理15分钟，然后在20％的正常羊血清包含0.5％Triton X-100(TBST)的0.05M Tris-缓冲盐(pH7.4)中在室温下预先培养30分钟。然后在Vectastain Elite ABC(抗生物素蛋白-生物素-过氧化酶)试剂(1∶100；Vector Labs)in TBST 40℃下培养一整夜。经过5次TBST和Tris缓冲液(TB，pH7.6)的冲洗，包含生物胞素的细胞通过在0.0048％H2O2存在下在3，3′-双氨基联苯胺(0.05％in TB)中培养观察到。反应通过在TB中冲洗几次而停止。断片被装裱在切片上用Mowiol(Hoechst)盖住。如图10所显示的，中枢神经系统神经元过度表达神经蛋白酶的转基因小鼠的CA1海马锥体神经元存在明显的数量和树突棘的减少。因为树突棘代表这些神经元的突触后部分，该结果用一种独立的方法确定了神经蛋白酶过度表达小鼠的突触数量的减少。
实施例14：体内的集聚素分裂也出现在中枢神经系统，并且与中枢神经系统神经元的神经蛋白酶表达一致。
为了检查体内中枢神经系统的集聚素分裂，成长中的和成年小鼠的脑组织匀浆通过蛋白质印迹分析，针对神经蛋白酶和C-末端100-kDa集聚素片段应用特异性抗体。组织匀浆从小鼠脊髓获取，在出生后的第4，7，9，10，15和25天，也包括老小鼠的第3，6，12个月。发现神经蛋白酶在出生后的最初3周内表达最强，在第7到10天达到最高表达水平。应用抗体的蛋白质印迹分析相对C-末端的集聚素片段显示了非常相似的时间图，显示神经蛋白酶的集聚素分裂同样存在体内的中枢神经系统。
实施例15：转基因的过度表达神经蛋白酶的中枢神经系统神经元增强体内的集聚素分裂。
组织匀浆从过度表达人神经蛋白酶(hNt)或小鼠神经蛋白酶(mNt)的成年小鼠脑中获取，其通过在CMV启动子控制下杂交继承无活性转基因(路线497，498，和533对mNt和路线493和494对hNt)的小鼠和表达Cre重组酶的小鼠产生，并与野生型小鼠对照。脑组织匀浆应用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。蛋白质印迹分析通过针对hNt和mNt的抗体，也应用C-末端的集聚素片段探查。发现C-末端的集聚素片段在过度表达神经蛋白酶的转基因小鼠中明显增加。C-末端的集聚素片段的数量增加与不同转基因小鼠路线的过度表达水平有很好的相关性。人类和小鼠的神经蛋白酶表现出对集聚素同样的蛋白水解作用。这个结果显示神经蛋白酶在体内中枢神经系统以浓度依赖方式分裂集聚素。
实施例16：重组神经蛋白酶的生产。
神经蛋白酶是一个分泌的多区域蛋白。人类神经蛋白酶长度为875个氨基酸，估计大小为97kDa。小鼠神经蛋白酶长度为761个氨基酸，大小为985kDa(图1，A和B)。作为一种活性蛋白，这种丝氨酸蛋白酶的表达依赖于正确的折叠和很可能依赖于转录后修饰，例如N-糖基化被提议作用于人类的2个位点和小鼠蛋白的3个位点(Gschwend，T.P.等人，MoI.Cell.Neurosci.9：207-219，1997；Proba，K.等人，Biochim.Biophys.Acta 1396：143-147，1998)。另外，神经蛋白酶包含引导蛋白质从分泌处到达内质网的信号肽。由于疏水结构决定了其缺乏跨膜区域，神经蛋白酶不是一个完整的膜蛋白(Kyte，J.和Doolittle，R.F.，J.MoI.Biol.157：105-132，1982)。酵母的神经蛋白酶活性位点表现出与tPA(组织型纤维蛋白溶酶原激活物Tate，K.M.等人，Biochemistry 26：338-343，1987)高度相似。蛋白酶在此位点引起的分裂产生两个片段，一个包含无催化区域，分子量大约55kDa(小鼠神经蛋白酶)或67kDa(人类神经蛋白酶)。一个仅包含蛋白酶区域，大约30kDa。骨髓瘤细胞神经蛋白酶的产生。为了稳定的转染骨髓瘤细胞，小鼠和人类的神经蛋白酶编码区被插入到一个特别设计的带菌者(Traunecker等人，Biotechnol.9：109-113，1991)。带菌者的表达被Igκ启动子和增强子驱动。转录的3′端与编码Igκ持续区域的外显子相接合，为了模仿稳定的Ig转录。带菌者包含一个组氨醇脱氢酶基因，允许在L-组氨醇存在时选择稳定转染。L-组氨醇是L-组氨酸的前体和蛋白合成的抑制剂。为了产生重组神经蛋白酶，带菌者已经被稳定转染入小鼠骨髓瘤细胞线路J558L(ECACC#88032902；European Collection of Cell Cultures)。其它通过原生质体融合或电穿孔法稳定转染的合适线路包括小鼠P3-X63Ag8.653，，小鼠Sp2/0-Ag14，小鼠NSO和小鼠YB2/0(Gillies等人，Biotechnology 7：799-804，1989；Nakatani等人，Biotechnology 7：805-810，1989；Bebbington等人，Biotechnology 10：169-175，1992；Shitara等人，J.Immunol.Meth.167：271-278，1994)。
J558L细胞的稳定转染可通过电穿孔法得到。在1cm的细玻璃管内，总共106个细胞与10 Dg线性或超螺旋的带菌者在PBS中混合。电穿孔通过Bio-Rad基因脉冲发生器完成，脉冲为960 DF和170-230V。细胞被转移到包含10％FCS的DMEM 50ml中，并放到5个96孔板中，通过一个多通道吸液管加入100μl/孔。
J558L细胞的脂质体通过lipofectamine和PLUS试剂(Invitrogen)转染。1×107骨髓瘤细胞在500xg离心3分钟并用无血清DMEM培养基冲洗一次。第二次离心后细胞再悬浮在3ml的无血清DMEM培养基中。为了转染40□g的质粒DNA，编码的神经蛋白酶与320□l无血清DMEM和80□lPLUS试剂(Invitrogen)混合。在室温下培养15分钟后，将预混合的60□l lipofectamine转染试剂和340□l无血清DMEM加入反应，在室温下培养15分钟。1ml无血清DMEM在加入J558细胞之前先加入DNA脂质体混合。在10％的CO2存在，温度37℃条件下，转染的细胞在一个6cm组织培养盘中培养。4小时后，细胞用包含10％FCS的DMEM 45ml冲淡，并放到5个96孔板中，通过一个多通道吸液管加入100μl/孔。为了准备原生质体，将包含哺乳动物表达带菌者的菌株803克隆的大肠杆菌甘油托盘排列在一个LB琼脂/氨苄西林盘中，在37℃下生长一整夜(菌株803可行来自ATCC#35581)。一个单一群落接种2ml预温的(37℃)包含50□g/ml氨苄西林的LB培养基。在250rpm和37℃条件下振荡4小时后，100□l培养物转移到100ml新鲜培养基中。当培养物达到光学密度大约0.6(在600nm的OD)，加入氯霉素到最终浓度为120μg/ml，在250rpm和37℃条件下生长一整夜。在氯霉素存在时，携带colE1复制血统的质粒可被放大(Hershfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71，4355-3459，1974)。过夜后的培养物在2500xg 4℃条件下离心10分钟。小球悬浮在2.5ml冰冷的20％(w/v)蔗糖50mM Tris-HCl溶液中，pH8.0。加入500μl冰冷的1mg/ml溶解酵素250mM Tris-HCl溶液，pH8.0，放在冰上培养5分钟。加入1ml冰冷的250mM EDTA，PH8.0，在冰水培养5分钟，加入1ml冰冷的50mMTris-HCl，pH8.0，在室温下培养10分钟。在培养过程中，从通常为杆状细菌形成的球形原生质体可通过显微镜放大1000x观察到。大约90％的原生质体应该在培养过程结束时形成。20ml DMEM附加10％蔗糖，10mM MgCl2和40□l 10mg/ml DNasel加入原生质体悬浮液，在室温下培养15分钟后，在2500xg室温下旋转30分钟。同时骨髓瘤细胞J558L准备融合。骨髓瘤细胞在DMEM附加10％(v/v)FCS中生长，并且应该在转染时达到大约1×106细胞/ml的高细胞密度。每个原生质体融合5×106个细胞，在室温下500xg旋转10分钟。细胞再悬浮在5ml预热的DMEM中(37℃)，在最后离心后慢慢在原生质小球顶端铺置。为了混合原生质体和骨髓瘤细胞，试管在室温下500xg旋转10分钟。移除上清液后，细胞通过摇动试管混合。为了融合，加入2ml PEG 1500DMEM溶液附加10％DMSO，小球通过上下吸液几次重新悬浮。大约加入PEG溶液后1到2分钟，加入10ml预热的DMEM附加10％(v/v)FCS(37℃)。细胞在室温下500xg离心10分钟。吸除上清液，小球再悬浮在50ml预热的DMEM附加10％(v/v)FCS和100μl 50mg/ml卡那霉素中。最后，细胞被放到5个96孔板组织培养基中，通过一个多通道吸液管加入100μl/孔。为了选择转染的细胞，48小时后加入L-组氨酸至最终浓度为5mM。只有转染的骨髓瘤细胞在L-组氨酸处理后会存活。选择开始后大约12到14天可看到克隆。平均每个原生质体融合和脂质体转染可得到40到50个克隆。所以的克隆通过神经蛋白酶特异抗体的蛋白质印迹分析表达性。多数骨髓瘤细胞克隆不表达或表达中等数量的神经蛋白酶，一小部分5-10％显示非常高的表达水平。表达水平高的克隆经过3轮的单细胞稀释再克隆以保证神经蛋白酶表达的稳定性。从稳定表达的克隆收集细胞提取物和上清液，在10％SDS PAGE上分开。蛋白质转移到硝化纤维膜。通过识别无接触反应片段的神经蛋白酶特异性抗体和继发的与过氧化物酶相联系的羊抗兔抗体或识别蛋白酶区域的神经蛋白酶特异性抗体和与过氧化物酶相联系的兔抗羊抗体检测神经蛋白酶。虽然全长神经蛋白酶主要发现于细胞提取物，在上清液发现对应无接触反应片段的65kDa带和蛋白水解区域的30kDa带。
实施例17：神经蛋白酶的培养基等级生产。
使用的神经蛋白酶来源于有条件的细胞培养上清液，出自神经蛋白酶表达骨髓瘤细胞的培养。这些细胞已经适应生长在TechnoMouse发酵桶(Integra Biosciences)中的无血清培养基(Stoll，T.S.等人，J.Biotechnol.45：111-123，1996；Ackermann，G.E.和Fent，K.，Marine EnvironmentalResearch 46：363-367，1998)。从包含2mM谷氨酸盐和10％FCS的DMEM(Gibco，No.41966-029)组成的培养基开始，细胞逐步的适应在这种包含1％FCS的培养基中生长。适应在24孔板中完成，培养基大约每两天更换。当细胞达到铺满，它们被分裂开到另外的孔中，在整个过程中，细胞保持接近铺满的密度。在包含1％FCS的DMEM中生长良好的适应细胞转移到无血清但包含蛋白质的培养基HL-1(Bio-Whittacker，No.77201)附加0.5％FCS中。在HL-1培养基中，细胞逐步适应仅在HL-1培养基中生长(无FCS)。为了使细胞适应无蛋白质的培养基TurboDoma(Cell Culture Technologies GmbH，Zurich，No.THP)，HL-1培养基逐步被TurboDoma调换。完成从HL-1到TurboDoma培养基的适应步骤与FCS的减少相似。
实施例18：全长神经蛋白酶的纯化。
上述例子的20升悬浮液通过1μm前置滤芯CR光学过滤器(Millipore)过滤，并且通过错流过滤(SKAN AG)浓缩到5升。
肝素亲和力色谱。在上载悬浮液到120ml肝素柱(肝素琼脂糖6 FastFlow XK 50/20柱；Amersham Biosciences)上之前，NaCl加入到浓缩的悬浮液中达到最终浓度0.3M。。柱子用20mM MOPS，300mM NaCl，pH7.2(缓冲液A)平衡。样品上载到Aekta提纯器(Amersham BiosciencesEurope GmbH)柱子上，20℃下流速1ml/min。柱子用四倍柱体积(CV)的缓冲液A冲洗。固定的蛋白质用20mM MOPS，1M NaCl，pH7.2(缓冲液B)梯度洗脱。梯度为：1CV从0％到43％B，3CV43％B，2CV从43％到100％B，3CV100％B。浓度为450mM氯化钠时神经蛋白酶开始洗脱。收集包含神经蛋白酶的洗脱部分(全长蛋白质和蛋白酶结构域)，合并并且在-20℃下保存。
在丁基取代的聚合物基质上(丁基琼脂糖4 Fast Flow，AmershamBiosciences Europe GmbH)使用疏水相互作用色谱。为了调整样品到合适的上载条件，在恒速搅拌条件下缓慢加入干燥氯化钠。调整完氯化钠浓度，样品在Sorvall RC-5B离心机上在SS34转子中4℃条件下以12000rpm的转速离心30分钟。在Aekta提纯器色谱柱体系(AmershamBiosciences Europe GmbH)，20℃下将上清液以1ml/min的流速上载到平衡好的25ml柱子上(20mM MOPS，1.5M氯化钠，pH7.2)。在20mM MOPS，pH7.2，流速1ml/min条件下，采用降低氯化钠浓度(1.5M-0.05M)的线性洗脱条件来洗脱固定的蛋白质。浓度为900mM氯化钠时全长神经蛋白酶开始洗脱。收集包含洗脱片段的全长蛋白质，在-20℃下保存。
固定金属亲和力(IMAC)色谱。按照生产说明将Cu2+连接到琼脂糖上(螯合琼脂糖Fast Flow，Amersham Biosciences Europe GmbH)。固体氯化钠加入到样品中使浓度超过0.5M。样品在Sorvall RC-5B离心机上在SS34转子中29℃条件下以12000rpm的转速离心30分钟。得到的上清液在4℃条件下应用于Ettan色谱体系(Amersham BiosciencesEurope GmbH)1ml铜琼脂糖柱子上，流速1ml/min。采用10-250mM咪唑梯度在20mM MOPS，0.5M氯化钠，pH7.2条件下洗脱蛋白质。梯度如下：15CV从0％到10％B，5CV从10％到100％B，10CV100％B。浓度为150mM咪唑时全长神经蛋白酶开始洗脱。收集包含片段的全长神经蛋白酶，并且在4℃下保存。
离子交换色谱。为了离子交换色谱样品需要稀释2.5倍，达到氯化钠最后浓度0.2M，并且在Sorvall RC-5B离心机上在SS34转子中4℃条件下以12000rpm的转速离心30分钟。上清液以0.1ml/min的流速应用于MonoS PC 1.6/5柱子上(Amersham Biosciences Europe GmbH)，该柱子已经用20mM MOPS，200mM NaCl，pH7.2平衡过。用氯化钠的线性梯度来洗脱固定的蛋白质(0.05M-1M)。浓度为300mM氯化钠时全长神经蛋白酶开始洗脱。收集包含片段的蛋白酶结构域，并且在20℃下保存。
通过这种方式得到了电泳纯的全长神经蛋白酶。图11显示了纯化的全长神经蛋白酶，通过在SDS-PAGE凝胶上的银染色显现出来(A)，以及通过在蛋白质印迹中采用神经蛋白酶特异的抗体的免疫染色显现出来(B)。
实施例19：神经蛋白酶的蛋白酶结构域的纯化。
在以上实施例中从肝素亲和力色谱中得到的包含全长神经蛋白酶和蛋白酶结构域的片段进行以上的疏水相互作用色谱。经过离心的上清液以1ml/min的流速上载到平衡好的12ml柱子上(20mM MOPS，1.75M氯化钠，pH7.2)。在20mM MOPS，pH7.2，流速1ml/min条件下使用氯化钠浓度降低的线性梯度来洗脱固定的蛋白质(1.75M-0.05M)。浓度为1M氯化钠时蛋白酶结构域开始洗脱。收集包含片段的蛋白酶结构域，并且在-20℃下保存。
对全长Nt进行IMAC(固定的金属亲和力色谱)。对四个长度的Nt进行离子交换色谱。
通过这种方式，得到单独的电泳纯的神经蛋白酶催化结构域。
实施例20：克隆，表达和纯化适合于包含切割位点□，但不包含切割位点□的底物的工程集聚素蛋白。
pcDNA-集聚素SN Y4Z19编码膜固定的集聚素形式。首先，采用引入Hpal位点的序列为5’-AAAGTTAACAAACCTGGAATCCACTTCACACCAGC-3’(SEQ ID NO：1)的引物和引入Noti位点的序列为5’-AAAAGCGGCCGCTCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGGGAGTGGGGCAGGGTCTTAG-3’(SEQ ID NO：2)的引物构建分泌的可溶的集聚素变体。用Hpal和Noti切割得到的PCR产品，并采用相同的限制性核酸内切酶克隆进入包含人calsyntenin-1切割口编码序列的pEAK8载体。以前，采用快速改变策略(Stratagene)将载体中额外的Hpal位点移走。得到的构建体编码具有人calsyntenin-1信号序列的分泌集聚素，该序列在翻译过程中被切割。基于这个构建体采用集聚素基因Hpal和6spHI位点，用引物5’-AAAAGTTAACCATCACCATCATCACCATCACCATAAACCTGGAATCCACTTCACACCAG-3’(SEQ ID NO：3)和5’-TTTATCATGA CACAGTCGTTTTCATAG-3’(SEQ ID NO：4)克隆PCR产品，将N-末端8x His标签加入。在第三步SOE PCR中，C-末端的LG3结构域被EGFP用引物5’-GCTGGATATCAACAATCAGCAG-3’(SEQ IDNO：5)和5’-GGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGAGCCAACTAGCCCCTGTTCGCAGTGC-3’(SEQ ID NO：6)以上述构建体为模板取代，以及5’-GGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGAGCCAACTAGCCCCTGTTCGCAGTGC-3’(SEQ ID NO：7)和5’-GGCTGCGGCCGCTCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGTTATCTAGATC CGGTGGATC-3’(SEQ ID NO：8)以pEGFP为模板取代。SOE PCR中的PCR片段组合起来，在相同的切割载体通过EcoRV和No[Lambda]位点克隆。最终分泌蛋白具有SEQ ID NO：9的序列。
用工程集聚素-EGFP构建体转染HEK 293T细胞，该细胞在补充10％FCS的DMEM培养基中生长并培养6h。培养基换为没有FCS的DMEM并在37℃下培养50h。200ml上清液离心(4℃，30min GS3，5000rpm)来去掉细胞和不溶物。上清液与50mM Tris-HCl，150mMNaCl，0.1％PEG 6000，pH8.0按1∶25稀释后，透析两次，4℃下过夜。过滤溶液(孔径0.45μm)，进行进一步的色谱纯化。
IMAC色谱。用5 CV50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0平衡柱子后，以10ml/min的流速上载蛋白质样品。柱子用10 CV 50mMTris-HCl，150mM NaCl，pH8.0冲洗。使用25CV0到500mM咪唑的冲洗缓冲液梯度洗脱。20-50mM咪唑时集聚素-EGFP洗脱出来。收集包含蛋白质印迹分析和SDS-PAGE确定的目标蛋白的片段并且按1∶125稀释，在20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％PEG 6000，pH8.0中透析，4℃下过夜。
离子交换色谱。上载和透析后，用2CV20mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH8.0冲洗8ml POROS HQ20柱子。用150-2000mM氯化钠的冲洗缓冲液梯度洗脱。大约900-1100mM氯化钠浓度时集聚素-EGFP洗脱出来。收集包含蛋白质印迹分析和SDS-PAGE确定的目标蛋白的片段并且按1∶25稀释，在20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％PEG 6000，pH8.0中透析，4℃下过夜。得到90％纯度的神经蛋白酶，适于体外活性分析。蛋白质冷冻在液氮中，-20℃下保存。
通过这种方式产生的集聚素-EGFP融合肽包含切割位点□，但不包含切割位点□。集聚素-EGFP具有高于250kDa的分子量。神经蛋白酶切割集聚素-EGFP融合肽产生大约150kDa的C-末端片段。图12显示了纯化的集聚素-EGFP融合肽，通过SDS-PAGE凝胶的银染色(A)显现出来，以及在蛋白质印迹分析中采用针对C-末端半抗原(实施例22)的抗体的免疫染色(B)显现出来。注意EGFP对以上描述的应用并不是必须的，但的确表现出位置固定。用其它蛋白取代EGFP或使用在切割位点□突变的全长集聚素对以上描述的产品是一样的选择。
实施例21：适于包含切割位点□但不是切割位点□的底物的短的C-末端集聚素片段(集聚素-C45)的克隆，表达和纯化。
采用引5’-GCGAGTTAACCACCATCACCATCACCATCACCATGGAAGCCTGGCTGACTTTAATGGCTTCTCCTACC-3’(SEQ ID NO：10)引入Hpal位点(HisBNterm)5’-ACCTGCGGCCGCTCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGCCAGAGCCAGAGCCGGGAGTGGGGCAGGGTCTTAGCTC-3’(SEQ ID NO：11)引入Notl位点(BStreplink)，以及pcDNA3.1-集聚素Y0Z0作为模板，扩增编码最后两个LG结构域和最后类似于集聚素EGF结构域的DNA片段。采用这个策略，插入编码N-末端8xHis标签和C-末端链锁状球菌标签的DNA序列。得到的PCR产物用限制性酶Not\和Hpal(引物序列中的黑体字)切割，并采用相同的限制性核酸内切酶克隆进入包含人calsyntenin-1切割口编码序列的pEAK8载体。获得的构建体pEAK8-C45集聚素包含人calsyntenin-1的信号序列的编码区域作为C45集聚素的分泌信号。在大肠杆菌中进行克隆和质粒扩增。为了表达，采用磷酸钙方法转染HEK 293T细胞。在表达HEK 293T细胞过程中，信号肽被切割。得到的分泌蛋白具有SEQ ID NO：12的序列。
HEK 293T细胞放在7×500cm2培养盘(CORNING)中，每个用100ml DMEM培养基(GIBCO)再加10％FCS培养到80％融合。为了转染，35ml 500mM CaCl2和35ml HBS缓冲液(50mM HEPES，140mMNaCl，1.5mM Na2HPO4，pH7.1)平衡到室温。2mg pEAK8-集聚素-C45DNA加入到CaCl2溶液中，并用HBS缓冲液混合。转染混合物在室温下培养30分钟。为了转染500cm2 HEK细胞，在培养基中逐滴加入10ml转染混合物，37℃下培养4h。然后用PBS冲洗一次移走转染混合物，加入没有FCS的DMEM培养基。60h后收获有条件的培养基并采用Steritop 0.22□m过滤器过滤(MILLIPORE)。上清液直接在BioCAD灌注色谱系统(Perseptive Biosystems)的Ni-NTA柱子(8ml POROS)上进行IMAC纯化，用1M Tris缓冲液pH8.5预先调整溶液pH值到8.5。上载有条件的培养基，流速为10ml/min，柱子用20 CV 100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0冲洗。使用10CV0到10M咪唑的冲洗缓冲液梯度洗脱。收集包含纯的集聚素-C45片段的片段，缓冲液用NAP 25柱子(Pharmacia)交换到100mM Tris-HCl，150mM NaCl，10mMCaCl2，0.1％PEG 6000，pH8.0。纯化的蛋白质冷冻在液氮中，在-20℃下保存。通过这个过程纯化的集聚素适于神经蛋白酶的底物。
这种方式产生的集聚素-C45片段包含切割位点β，但不包含切割位点α。集聚素-C45具有大约45kDa的分子量。神经蛋白酶切割集聚素-C45蛋白质产生大约23kDa的N-末端片段和大约22kDa的C-末端片段。图13显示了纯化的集聚素-C45蛋白质，通过SDS-PAGE凝胶的银染色显现出来(A)，以及在蛋白质印迹中采用StrepTactin染色Strep-tagC-末端显现出来(B)。
实施例22：针对大鼠集聚素C-末端部分的多克隆抗体的产生。
在16×150cm2组织培养瓶中HEK 293T细胞生长到80％融合。每个瓶子用于接种4×500cm2盘子。包含80ml培养基的500cm2盘子用聚L-赖氨酸涂膜。两天内细胞长到60-80％融合。用磷酸钙方法转染细胞，每ml培养基(DMEM/10％FCS)用1μg pcDNA-agrinY4Z8和pcDNA-hNT。第二天早上培养基换为没有FCS的DMEM。在37℃/10％CO2条件下细胞生长4天。收获上清液，在4℃，3000rpm条件下离心30分钟并在室温下过滤(孔径0.45μm)。滤出液的pH值用1M HEPES缓冲液设为7.0，但不超过最终浓度20mM。它上载到肝素柱子上(17ml肝素琼脂糖；载量大约2mg/ml凝胶基质)，流速1ml/min。柱子用5CV20mM HEPES，80mM NaCl，pH7.5平衡，用2 CV 20mM HEPES，80mM NaCl，pH7.5冲洗。用8CV 20mM HEPES，pH7.5的氯化钠溶液洗脱，线性梯度为80-1000mM NaCl。收集包含靶蛋白的片段，用SDS-PAGE和蛋白质印迹监测。收集的片段与20mM HEPES，pH7.5按1∶100稀释，以使NaCl浓度低于5mM，在4℃下透析过夜。透析液在4℃，12000rpm条件下离心30分钟，上载到用20mM Tris，pH8.0平衡的MonoQ柱子上(7.8ml HQ POROS柱，载量：10-20mg/ml基质)。固定的蛋白用20 CV 0-1000mM NaCl的20mM Tris，pH8.0溶液线性洗脱。100-200mM NaCl时洗脱出100-kDa片段。收集用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析监测的包含靶蛋白的片段。
免疫。通过滴入充满液氮的管子使纯化的蛋白质快速冷冻，并在-80℃下保存。用50Dg蛋白质通过常规方法免疫兔子。产生的抗体适于检测全长集聚素，以及包含集聚素C-末端部分的集聚素片段，尤其是包含位于切割位点□和□之间的集聚素部分的片段。
实施例23：针对大鼠集聚素LG3结构域的多克隆抗体的产生。
HEK 293T细胞放在7×500cm2培养盘(CORNING)中，每个用100ml DMEM培养基(GIBCO)再加10％FCS培养到80％融合。为了转染，25ml 500mM CaCl2和25ml HBS缓冲液(50mM HEPES，140mMNaCl，1.5mM Na2HPO4，pH7.1)加入到1.5mg pEAK8-集聚素-C45 DNA和15□g pcDNA-hNT DNA中。转染混合物在室温下培养45分钟。为了转染500cm2HEK细胞，10ml转染混合物逐滴加入到培养基中并在37℃下培养4h。用PBS冲洗三次移走转染混合物并加入没有FCS的DMEM培养基。60小时后收获有条件的培养基并用顶载消毒箱0.22□m过滤器过滤(MILLIPORE)。用pcDNA-hNT共转染细胞，集聚素C45片段被切割，释放出大鼠集聚素LG3结构域。为了去掉主要的污染物，有条件的培养基按照1∶10稀释并在50mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH8.0溶液中透析5次，然后进行阴离子交换色谱。透析的培养基以10ml/min的流速上载到与BioCAD色谱体系(Perseptive Biosystems)相连接的4mlMonoQ柱子上(从BioRAD用Uno Sphere MonoQ材料自组装，2×4cm)。柱子用20 CV 50mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH8.0的溶液冲洗。洗脱梯度是50mM NaCl到2000mM NaCl的50mM Tris-HCl，pH8.0。(第一步可以被使用Ni2+螯合琼脂糖凝胶柱的金属亲和力色谱取代。)发现目标蛋白，采用预先用50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0平衡好的10ml StrepTactin柱直接进行亲和力色谱。重力流动时蛋白质结合后，柱子用10 CV平衡缓冲液冲洗。采用0.5 CV加了2.5mM脱硫生物素的平衡缓冲液洗脱6次。用SDS-PAGE分析洗脱物，采用Centriprep10.000浓缩器(MILLIPORE)将包含集聚素C45片段和LG3结构域的片段浓缩到200□l。得到的浓缩物上载到Superdex S75凝胶过滤柱上(Amersham Pharmacia，1.6×30)。采用50mM Tris-HCl，250mM NaCl，pH8.0，流速0.3ml/min进行色谱分析。用SDS-PAGE分析洗脱物，收集包含纯的LG3结构域的片段并冷冻在液氮中。
免疫。为了产生针对集聚素LG3结构域的多克隆抗体，使用50Dg片段来免疫兔子。获得的抗体用来检测全长集聚素，以及包含集聚素LG3结构域的集聚素片段。
实施例24：神经蛋白酶蛋白水解活性的分析。
在低蛋白结合管(Eppendorf)中在150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％PEG，和20mM MOPS，pH7.5溶液中进行神经蛋白酶活性测定。也可以使用包含超过30％DMSO的相同缓冲液进行神经蛋白酶活性测定。使用浓缩的人神经蛋白酶导致大约80％底物在3小时内切割。使用0.1-1□M集聚素-EGFP或0.1-3□M集聚素-C45作为底物。反应混合物在37℃下培养3h。加入常规的SDS-PAGE样品缓冲液和在70℃加热5分钟来终止反应。用SDS-PAGE检查产生的切割产物。
图14给出了一个分析的例子，采用工程集聚素-EGFP作为底物，采用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析方法，用针对集聚素C-末端部分的抗体来检测集聚素-EGFP的C-末端切割产物。图15给出了一个采用集聚素-C45作为底物的例子。在这个例子中，使用Streptactin(IBA GmbH)来检测C-末端切割产物。针对集聚素LG3结构域的抗体(按照实施例23中描述的产生)也用在这个过程中。
可供选择的，用常规的蛋白质染色方法来给SDS-PAGE凝胶染色，例如银染色(图15A)，考马斯亮蓝，或者为了定量，用Sypro宝石红(BioRad)。
实施例25：神经蛋白酶对集聚素切割位点的确定：切割位点□和□。
为了确定切割位点□的准确切割位置，在HEK293T细胞共表达人神经蛋白酶的膜固定集聚素变体。纯化在悬浮培养基中得到的100-kDa切割产物(参见实施例22)，在Procise 492 cLC音序器上(AppliedBiosystems)通过Edman降解测定N-末端序列。确定的序列是ASXYNSPLGXXSGDK，其中X代表半胱氨酸残基。从这一点中可以得出结论：切割发生在995位置的精氨酸之后的序列延伸VVTHGPPIERASCYNSPLGCCSDK。
一些哺乳动物集聚素序列和鸡(Gallus gallus)的集聚素序列的序列图表明在集聚素切割位点□旁侧的氨基酸的高进化保守性。
    生物体     切割位点□
    人类(Homo sapiens)     PPVERASCY
    大鼠(Rattus norvegicus)     PPIERASCY
    小白鼠(Mus musculus)     PPIERASCY
    鸡(Gallus gallus)     PAIERATCY
集聚素切割位点□的N-末端的5个氨基酸和C-末端的4个氨基酸(集聚素的切割位点□定位在精氨酸995和丙氨酸996之间)限定了集聚素切割位点□的共有序列P-P/A-I/V-E-R-A-S/T-C-Y。
为了确定切割位点□的准确切割位置，在HEK293T细胞共表达人神经蛋白酶的集聚素-C45。纯化获得的21-kDa切割产物(参见实施例23)并进行N-端测序。确定的序列是SVGDLETLAF。该序列发现存在于GLVEKSVGDLETLAFDGRT序列的延伸区域。从这一点中可以得出结论：神经蛋白酶切割集聚素的位点在EGF4和LG3结构域之间的赖氨酸754之后。
一些哺乳动物集聚素序列和鸡(Gallus gallus)的集聚素序列的序列图表明在集聚素切割位点□旁侧的氨基酸的高进化保守性。
    生物体     切割位点□
    人类(Homo sapiens)     GLVEKSAG
    大鼠(Rattus norvegicus)     GLVEKSVG
    小白鼠(Mus musculus)     GIVEKSVG
    鸡(Gallus gallus)     ATIEKSAG
集聚素切割位点□的N-末端的5个氨基酸和C-末端的4个氨基酸(集聚素的切割位点□定位在赖氨酸1754和丝氨酸1755之间)限定了集聚素切割位点□的共有序列G/A-L/I/T-V/I-E-K-S-V/A-G。
以上描述的结果可以通过体外活性分析得到确认，即用纯化的人神经蛋白酶和纯化的集聚素底物变体通过传递获得的切割产物到PVDF膜上以及随后的N-端测序。
总之，神经蛋白酶在两个位点切割集聚素。第一个切割位点(切割位点□)在R995-A996位置发现(从登记号NP 786930计数，大鼠集聚素)，实施例如切割发生在丝氨酸-苏氨酸富集的片段和SEA结构域之间的大鼠(Rattus norvegicus)集聚素的序列延伸PPIERA SCY的C-末端的精氨酸。比较哺乳动物和鸟类在集聚素切割位点□旁侧的序列说明了集聚素切割位点□的共有序列P-P/A-I/V-E-R-A-S/T-C-Y，其中神经蛋白酶切割发生在C-末端的精氨酸(R)残基。第二个切割位点(切割位点□)定位于K1754-S1755(从登记号NP 786930计数，大鼠集聚素)，例如切割发生在连接集聚素EGF4和LG3结构域的片段中的LVEKSVGD前后序列的C-末端的赖氨酸。比较哺乳动物和鸟类在集聚素切割位点□旁侧的序列说明集聚素切割位点□的共有序列G/A-L/I/T-V/I-E-K-S-V/A-G，其中神经蛋白酶切割发生在赖氨酸(K)残基的C-末端。
实施例26：制备小分子化合物进行抑制分析。
化合物溶在DMSO中达到最终浓度10mM。为了分析DMSO溶液用10mM MOPS，pH7.5稀释到浓度500DM和5％DMSO(1∶20稀释)。离心去掉不溶物质(15分钟，16krcf，室温)。上清液用于如实施例27所描述的抑制分析。
实施例27：确定小分子化合物对神经蛋白酶抑制作用的分析。
在150mM NaCl，5mM CaCl2，5％DMSO，0.1％PEG 6000，和20mM MOPS，pH7.5溶液中，在总体积为15□l，0.5ml低蛋白结合移液管中测量小分子化合物对神经蛋白酶催化活性的抑制作用。在一个合适的浓度使用人或鼠神经蛋白酶或不具有催化活性的神经蛋白酶，导致3小时内80％的底物切割。作为底物，使用工程溶解的集聚素，例如0.1-1□M集聚素-EGFP(实施例20)或0.1-3□M工程集聚素-C45(实施例21)。加入10mM MOPS，pH7.5，包含5％DMSO的抑制溶液，使最终浓度是25或150□M。反应混合物在37℃下培养3h。反应混合物中的5％DMSO是为了保持小分子无机化合物抑制剂的溶解性。加入底物或酶，反应开始。培养结束时，加入常规的SDS-PAGE样品缓冲液和在70℃加热5分钟来终止反应。SDS-PAGE分离消化的样品，并且在底物显现出来后检测。
使底物显现出来的一种方法就是蛋白质印迹分析。为了分析，蛋白质转移到硝化纤维膜上。从集聚素-EGFP切割产生的150-kDa消化片段或集聚素-C45切割产生的22-kDa消化片段的强度上来估计被筛选小分子化合物对神经蛋白酶的抑制作用。图16显示了通过蛋白质印迹分析筛选抑制剂的典型结果，用集聚素-EGFP作为底物，检测针对集聚素C-末端部分的抗体。在公认的抑制剂化合物存在的条件下，测定神经蛋白酶介导的切割产生的集聚素-EGFP 150-kDa片段的强度(图16A)，并且绘出了相对强度(图16B)。
发现化合物No.7(从ChemDiv，San Diego，CA的鉴别号码1672-3440，N1-脒基-N4-(3，5-二溴亚水杨基)-磺胺，IUPAC名称：氨基{[(4-{[(1E)-(3，5-二溴-2-羟基苯基)亚甲基]氨基}苯基)磺酰基]氨基}甲基脒)对神经蛋白酶具有显著的抑制活性。
可供选择的，通过传统的蛋白质染色方法在凝胶上染色完成消化样品的可视化和定量化，例如银染色，考马斯亮蓝染色，或为了量化，用Sypro宝石红(BioRad)染色。
实施例28：化合物No.7 N1-脒基-N4-(3，5-二溴亚水杨基)-磺胺抑制的剂量依赖性。
采用实施例27中描述的用工程集聚素-EGFP作为底物的分析来测试从0到200□M化合物No.7的不同浓度。通过蛋白质印迹分析(图17A)检测产物并定量(图17B)。与没有化合物No.7的反应相比，产物的半数最大量出现在大约60□M浓度时，所以化合物No.7的IC50值就在大约60□M范围内。
实施例29：确定化合物No.7 N1-脒基-N4-(3，5-二溴亚水杨基)-磺胺对神经蛋白酶抑制的特异性。
为了检测对人类神经蛋白酶有抑制作用的化合物的特异性，应用标准的酶动力学测量法，使用一组普通的丝氨酸蛋白酶。应用商业可用的蛋白酶的标准的光度测定化验和对硝基苯胺连结的短肽酶作用物。
蛋白酶：
从牛血浆中活化的因子Xa(6.1mg蛋白质/ml；Sigma Aldrich ChemieGmbH，D-89552 Steinheim，德国)。
猪胰蛋白酶(16099 U/mg；Fluka Chemie AG，CH-9471 Buchs，Switzerland)。
tPA：Actilyse(10mg；Dr.Karl Thomae GmbH，Birkendorfer StraBe65，D-88397 Biberach，德国)。
来自牛血浆的凝血酶(50NIH/mg，Merck，D-64271 Darmstadt，Germany)。
尿激酶HS medac(100000 I.E.；medac Gesellschaft fur klinischeSpezialpraparate mbH，D-22880 Wedel，Germany)。
来自猪胰腺的激肽释放酶(43U/mg s固体；Sigma Aldrich ChemieGmbH)。
底物：
Bz-IEGR-pNA：S-2222，Chromogenix-lnstrumentation实验室SpA，1-20128米兰，意大利。
Bz-FVR-pNA：N-苯甲酰-Phe-Val-Arg-对硝基苯胺HCI，BachemAG，CH-4416 Bubendorf，瑞士。
IPR-pNA：S-2288，Chromogenix-lnstrumentation实验室SpA
Bz-VGR-pNA：N-苯甲酰基-Val-Gly-Arg-对硝基苯胺，Sigma AldrichChemie GmbH。
N-甲苯磺酰基-GPK-pNA：N-甲苯磺酰基-Gly-Pro-Lys-对硝基苯胺，#90178，Fluka Chemie AG。
分析条件：
在100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM CaCl2，5％DMSO，0.1％PEG 6000，pH8.0的条件下进行分析。应用适当的蛋白酶量来测量开始速率，小于0.1倍KM改变缩氨酸-对硝基苯胺酶作用物的量。对于抑制研究，应用100□M化合物No.7。用Cary 50分光光度计在25℃下测量(VARIAN)。应用小于0.1倍Km的不同底物浓度，初始速率确定在直接依赖底物浓度的初始速率的范围内。在候选抑制剂No.7不存在和存在时绘制初始速率对底物浓度的图表。应用100□M浓度的化合物。
  蛋白酶     浓度   底物     浓度范围
  因子Xa     10nM   Bz-IEGR-pNA     5-30□M
  胰蛋白酶     2.8nM   Bz-FVR-pNA     1-5□M
  tPA     212nM   IPR-pNA     10-100□M
  凝血酶     28.4nM   Bz-FVR-pNA     2-20□M
  尿激酶     285.7I.E.   Bz-VGR-pNA     5-280□M
  血浆激肽释放酶     5U   Bz-FVR-pNA     20-240□M
  纤溶酶     0.08U   N-Tosyl-GPK-pNA     3-15□M
在化合物No.7的浓度为100DM时，研究的酶中没有显示明显的抑制活性。图18-24显示了在化合物No.7存在和不存在的情况下因子Xa、胰蛋白酶、tPA、凝血酶、尿激酶、激肽释放酶和纤溶酶的酶动力学测试结果。

Claims (24)

1.一种确定化合物是否是神经蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于，将化合物与神经蛋白酶、其变体或包含神经蛋白酶的蛋白酶结构域的片段以及包含集聚素、其变体或含有集聚素□-或□-切割位点的片段的蛋白质或多肽在水缓冲溶液中共同培养，并且测量集聚素的切割量。
2.权利要求1的方法，其中使用人神经蛋白酶、其变体或包含人神经蛋白酶的蛋白酶结构域的片段。
3.权利要求2的方法，其中使用人全长神经蛋白酶。
4.权利要求2的方法，其中使用包含人神经蛋白酶的蛋白酶结构域的片段。
5.权利要求1到4任一项的方法，其中包含集聚素、其变体或片段的蛋白质或多肽是具有标记蛋白或多肽的融合蛋白。
6.权利要求1到5任一项的方法，其中包含集聚素、其变体或片段的蛋白质或多肽含有用于通过光谱法检测的非肽标记物。
7.权利要求1到6任一项的方法，其中使用包含全长集聚素的蛋白质或多肽。
8.权利要求1到6任一项的方法，其中使用包含集聚素片段的蛋白质或多肽，所述集聚素片段含有切割位点□或切割位点□。
9.权利要求8的方法，其中集聚素片段是包含保留切割位点□和/或切割位点□的至少6个氨基酸的片段。
10.权利要求8的方法，其中集聚素片段是包含切割位点□的共有序列的至少8个氨基酸的片段。
11.权利要求8的方法，其中集聚素片段是包含切割位点□的共有序列的至少8个氨基酸的片段。
12.权利要求8的方法，其中使用集聚素C-末端片段C45。
13.测量神经蛋白酶催化活性的方法，其特征在于，将神经蛋白酶、其变体或包含蛋白酶结构域的片段在水缓冲溶液中与包含集聚素、其变体或含有集聚素□-或□-切割位点的片段的蛋白质或多肽培养，并且测量集聚素切割的量。
14.权利要求13的方法，其中包含集聚素、其变体或片段的蛋白质或多肽是具有标记蛋白或多肽的融合蛋白。
15.权利要求13或14的方法，其中包含集聚素、其变体或片段的蛋白质或多肽含有用于通过光谱法检测的非肽标记物。
16.式(1)化合物
Figure S2006800101171C00021
其中，其中Hal1和Hal2各自独立地是氟、氯或溴；及其药学可接受的加成盐。
17.权利要求16的式(1)化合物，其中Hal1和Hal2是溴；及其药学可接受的加成盐。
18.包含权利要求16或17的式(1)化合物和药物载体的药物组合物。
19.用作药物的权利要求16或17的式(1)化合物。
20.权利要求16或17的式(1)化合物在治疗和/或预防由突触缺乏引起的疾病中的应用。
21.权利要求20的应用，所述应用是在治疗和/或预防骨骼肌萎缩中的应用。
22.权利要求20的应用，所述应用是在治疗和/或预防精神分裂症中的应用。
23.权利要求20的应用，所述应用是在治疗和/或预防认知障碍中的应用。
24.权利要求16或17的式(1)化合物在制备用于治疗和/或预防突触缺乏引起的疾病的药物中的应用。
CN2006800101171A 2005-03-30 2006-03-29 神经蛋白酶抑制剂及其确定 Expired - Fee Related CN101193858B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05102481 2005-03-30
EP05102481.8 2005-03-30
PCT/EP2006/061152 WO2006103261A2 (en) 2005-03-30 2006-03-29 Inhibitors of neurotrypsin and determination thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101193858A true CN101193858A (zh) 2008-06-04
CN101193858B CN101193858B (zh) 2012-01-04

Family

ID=34939082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800101171A Expired - Fee Related CN101193858B (zh) 2005-03-30 2006-03-29 神经蛋白酶抑制剂及其确定

Country Status (15)

Country Link
US (1) US7897364B2 (zh)
EP (1) EP1868989A2 (zh)
JP (1) JP4920675B2 (zh)
KR (1) KR20070116932A (zh)
CN (1) CN101193858B (zh)
AU (1) AU2006228150B2 (zh)
BR (1) BRPI0609654A2 (zh)
CA (1) CA2600791A1 (zh)
IL (1) IL186120A (zh)
MX (1) MX2007011961A (zh)
NO (1) NO20075461L (zh)
NZ (1) NZ562796A (zh)
RU (1) RU2424228C2 (zh)
WO (1) WO2006103261A2 (zh)
ZA (1) ZA200707359B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008074813A2 (en) * 2006-12-21 2008-06-26 Neurotune Ag Optiogenin for the treatment of neural diseases
PL1990420T3 (pl) * 2007-05-10 2011-01-31 Neurotune Ag Sposób wykrywania aktywności neurotrypsyny in vivo, zastosowanie tego sposobu i zastosowanie C-końcowego fragmentu agryny 22 kDa jako biomarkera w diagnozowaniu i monitorowaniu zaburzeń związanych z neurotrypsyną
EP2295068A1 (en) * 2009-09-04 2011-03-16 Neurotune AG Modified agrin-fragment capable of restoring muscle strength for use as a medicament
US20130261130A1 (en) 2010-11-01 2013-10-03 Shaheen Ahmed Neurotrypsin inhibitors
US20130245064A1 (en) 2010-11-01 2013-09-19 Shaheen Ahmed Novel neurotrypsin inhibitors
EP2631657A1 (en) * 2012-02-25 2013-08-28 Neurotune AG Immunoassay for the detection of the 22kDa C-terminal fragment (CAF) of agrin

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH692507A5 (de) * 1997-04-26 2002-07-15 Peter Prof Dr Sonderegger Neurotrypsin als aktive Verbindung in einem Medikament.
DE19919634C2 (de) * 1999-04-30 2001-06-07 Aventis Pharma Gmbh Test zur Bestimmung der Integrität komplexer Phospholipid/Lipid-Strukturen mit Hilfe synthetischer fluoreszenz-markierter Acylglyceride und dessen Anwendung zur Bestimmung der Aktivität von Lipasen
DE10247478A1 (de) * 2002-10-11 2004-06-24 Bioagency Ag Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Proteinen

Also Published As

Publication number Publication date
US20090170950A1 (en) 2009-07-02
IL186120A (en) 2012-08-30
WO2006103261A9 (en) 2010-05-27
NZ562796A (en) 2010-02-26
CN101193858B (zh) 2012-01-04
CA2600791A1 (en) 2006-10-05
EP1868989A2 (en) 2007-12-26
RU2007139754A (ru) 2009-05-10
US7897364B2 (en) 2011-03-01
NO20075461L (no) 2007-11-20
WO2006103261A3 (en) 2007-02-22
WO2006103261A2 (en) 2006-10-05
ZA200707359B (en) 2009-08-26
MX2007011961A (es) 2008-03-14
BRPI0609654A2 (pt) 2010-04-20
KR20070116932A (ko) 2007-12-11
JP4920675B2 (ja) 2012-04-18
AU2006228150A1 (en) 2006-10-05
RU2424228C2 (ru) 2011-07-20
JP2008538178A (ja) 2008-10-16
AU2006228150B2 (en) 2011-09-29
IL186120A0 (en) 2008-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Stefansson et al. Activation of proteinase-activated receptor-2 by human kallikrein-related peptidases
Hayashita-Kinoh et al. Membrane-type 5 matrix metalloproteinase is expressed in differentiated neurons and regulates axonal growth
Hatsuzawa et al. Purification and characterization of furin, a Kex2-like processing endoprotease, produced in Chinese hamster ovary cells.
Hsu et al. Amyloid-degrading ability of nattokinase from Bacillus subtilis natto
Vassalli The urokinase receptor
Moilanen et al. Tumor-associated trypsinogen-2 (trypsinogen-2) activates procollagenases (MMP-1,-8,-13) and stromelysin-1 (MMP-3) and degrades type I collagen
ES2904884T3 (es) Enzima del clostridium histolyticum
ES2269178T3 (es) Dipeptidil peptidasas.
CN101193858B (zh) 神经蛋白酶抑制剂及其确定
Yan et al. A 25.7× 103 M r hydra metalloproteinase (HMP1), a member of the astacin family, localizes to the extracellular matrix of Hydra vulgaris in a head-specific manner and has a developmental function
CAMARGO et al. Structural features that make oligopeptides susceptible substrates for hydrolysis by recombinant thimet oligopeptidase
US6521436B1 (en) Nucleic acids encoding aggrecan degrading metallo proteases
EP0917566B1 (de) Rekombinante blutgerinnungsproteasen
Holcomb et al. Isolation, characterization and expression of a human brain mitochondrial glutaminase cDNA
Salles et al. A plasminogen activator is induced during goldfish optic nerve regeneration.
US9249406B2 (en) Mutated tissue plasminogen activators and uses thereof
US8034783B2 (en) Prodomain modulators of ADAM 10
Tervo et al. A rapid fluorometric assay for tear fluid plasmin activity
US20040014636A1 (en) Pharmaceutical compositions comprising a modulator of adamts-1
EP0937158B1 (de) VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER KATALYTISCHEN AKTIVITÄT VON FAKTOR IXa
Günthert et al. Attempts to Understand Metastasis Formation I: Metastasis-Related Molecules
KR20070120091A (ko) Ａｄａｍ-ｔｓ 프로테아제의 활성 측정을 위한티오펩톨라이드의 용도
Stallmach Neurobin/TMPRSS11c, a novel type II transmembrane serine protease of the nervous system which cleaves fibroblast growth factor-2 in vitro
Long Regulation of tumor cell invasion and metastasis by the type I insulin-like growth factor receptor (IGF-1R)
JP2006180840A (ja) 血栓の溶解を亢進させるポリペプチド及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1119156

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120104

Termination date: 20130329

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1119156

Country of ref document: HK