ES2904884T3

ES2904884T3 - Enzima del clostridium histolyticum

Info

Publication number: ES2904884T3
Application number: ES19174182T
Authority: ES
Inventors: Wayne Herber
Original assignee: Endo Global Ventures
Current assignee: Endo Global Ventures
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2022-04-06
Anticipated expiration: 2033-01-10
Also published as: US9757435B2; US11879141B2; HUE057423T2; BR112014017229A2; AU2023229488A1; AU2013208028A1; JP2015506176A; JP2020188810A; EP4015627A1; EP4015627B1; ES2968836T3; DK3584317T5; US20230416717A1; BR112014017229B1; EP2802652A4; JP7354197B2; CA2970639A1; BR112014017229A8; US20180055918A1; JP6263755B2

Abstract

Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende: a) un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2 o el complemento de la SEQ ID NO: 2, y b) una secuencia reguladora heteróloga unida operativamente al polinucleótido.

Description

DESCRIPCIÓN

Enzima del clostridium histolyticum

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El colágeno es el principal constituyente estructural de los organismos de los mamíferos y constituye una gran parte del contenido proteico total de la piel y otras partes del cuerpo animal. En los seres humanos, es especialmente importante en los procesos de cicatrización de heridas y de envejecimiento natural. Diversos traumas cutáneos, que incluyen las quemaduras, la cirugía y las infecciones, se caracterizan por la acumulación de tejido fibroso rico en colágeno y con un mayor contenido de proteoglicanos. Además de la sustitución del tejido normal que ha sido dañado o destruido, a veces se forman depósitos excesivos y desfigurantes de tejido nuevo durante el proceso de curación. El exceso de deposición de colágeno se ha atribuido a una alteración del equilibrio entre la síntesis y la degradación del colágeno.

Las enfermedades y afecciones asociadas a la deposición excesiva de colágeno y a la acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno pueden denominarse "enfermedades mediadas por el colágeno" La colagenasa, una enzima que tiene la capacidad específica de digerir el colágeno, se ha utilizado para tratar una variedad de enfermedades mediadas por el colágeno, incluyendo, por ejemplo, la contractura de Dupuytren, la enfermedad de Peyronie, el lipoma y la capsulitis adhesiva. Patente U.S. n° 6.086.872 y 5.589.171 divulgan el uso de preparados de colagenasa en el tratamiento de la enfermedad de Dupuytren. La patente U.S. n° 6.022.539 divulga el uso de preparados de colagenasa en el tratamiento de la enfermedad de Peyronie. Los documentos de Patente U.S. n° 6.958.150 y 7.842.673 divulgan el uso de la colagenasa para el tratamiento del lipoma. La publicación de la solicitud de patente U.S. n° 2006/020448A1 divulga el uso de colagenasa en el tratamiento de la capsulitis adhesiva. La colagenasa para su uso en la terapia puede obtenerse de una variedad de fuentes, incluyendo mamíferos, hongos y bacterias. Una fuente común de colagenasa cruda proviene de un proceso de fermentación bacteriana, concretamente de la fermentación de Clostridium histolyticum (C. histolyticum). La colagenasa cruda obtenida de C. histolyticum puede purificarse utilizando cualquiera de las técnicas cromatográficas.

Uno de los inconvenientes de la fermentación de las bacterias es que se producirán diversas toxinas que, de estar presentes en la composición terapéutica, serían perjudiciales para la salud del paciente. Por ejemplo, la fermentación de C. histolyticum da lugar a la síntesis de las toxinas hemolíticas alfa y épsilon, que pueden causar la lisis de los glóbulos rojos (hemólisis), lo que puede provocar una crisis hemolítica y anemia hemolítica. La crisis hemolítica se produce cuando se produce una rápida destrucción de un gran número de glóbulos rojos junto con la incapacidad del organismo de reponer los glóbulos rojos con la suficiente rapidez para restablecer los niveles normales de glóbulos rojos. Una crisis hemolítica provoca una anemia hemolítica aguda (y a menudo grave), y puede dar lugar a fatiga, dificultad para respirar, mareos, dolor de cabeza, frialdad en las manos y los pies, piel pálida, dolor en el pecho, ictericia, dolor en la parte superior del abdomen, úlceras y dolor en las piernas, reacciones graves a una transfusión de sangre, arritmias, agrandamiento del corazón e insuficiencia cardíaca. Para garantizar que la preparación de colagenasa terapéutica no contenga toxinas hemolíticas que puedan expresarse durante la fermentación de C. histolyticum , se presenta un procedimiento para liberar un producto farmacológico antes de su administración a un paciente.

Como se ha comentado anteriormente, la colagenasa para su uso en la terapia puede obtenerse a partir de una variedad de fuentes, como las fuentes bacterianas (por ejemplo, de la fermentación de C. histolyticum). Sería útil desarrollar fuentes adicionales de colagenasa, como formas recombinantes de enzimas de colagenasa.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En algunos aspectos, la presente invención se basa en el descubrimiento de secuencias polinucleotídicas mutadas que codifican la colagenasa I y la colagenasa II funcionales. La invención abarca, pues, el ácido nucleico recombinante y los polipéptidos que comprenden las nuevas secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas. La presente divulgación también proporciona un procedimiento para detectar la secreción de una toxina hemolítica por una cepa de producción bacteriana, en la que la cepa de producción produce una colagenasa, antes de la administración terapéutica de dicha colagenasa a un paciente y procedimientos para detectar la presencia de una toxina hemolítica en una composición de colagenasa.

Se divulga en el presente documento una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (secuencia de nucleótidos de la colagenasa I) o el complemento de la SEQ ID NO: 1. En ciertos aspectos de la divulgación, el ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia reguladora heteróloga unida operativamente al polinucleótido. También se divulga una molécula de ácido nucleico recombinante que consiste en un polinucleótido de la SEQ ID NO: 1. También se divulga una molécula de ácido nucleico recombinante que consiste en un polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 y una secuencia reguladora heteróloga unida operativamente al polinucleótido.

La invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende: a) un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2 (secuencia de nucleótidos de la colagenasa II) o el complemento de la SEQ ID NO: 2, y b) una secuencia reguladora heteróloga unida operativamente al polinucleótido. En ciertos aspectos, la secuencia reguladora heteróloga es un promotor heterólogo unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2 o al complemento de la SEQ ID NO: 2. También se divulga una molécula de ácido nucleico recombinante que consiste en un polinucleótido de la SEQ ID NO: 2. En aspectos adicionales, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante que consiste en un polinucleótido de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia reguladora heteróloga unida operativamente al polinucleótido.

La invención también incluye polipéptidos recombinantes codificados por un ácido nucleico recombinante de la invención. También se divulgan polipéptidos que comprenden un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.

También se divulga en el presente documento un casete de expresión que comprende un ácido nucleico recombinante, en el que el ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.

La invención también proporciona un vector que comprende un ácido nucleico recombinante de la invención. También se divulga un vector que comprende un ácido nucleico recombinante, en el que el ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula huésped recombinante que comprende el vector de la invención . También se divulga una célula huésped recombinante que comprende el vector o plásmido que comprende ^{un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ}Id ^{NO: 2. La invención también abarca un}procedimiento de producción de colagenasa II que comprende el cultivo de la célula huésped de la invención bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico y la recuperación de la colagenasa II. También se divulga un procedimiento de producción de colagenasa I o colagenasa II que comprende el cultivo de la célula huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico y la recuperación de la colagenasa I o colagenasa II. También se divulga en el presente documento una enzima colagenasa producida mediante el cultivo de la célula huésped recombinante.

Se divulga en el presente documento una colagenasa I producida recombinantemente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, la invención se dirige a una colagenasa II producida recombinantemente que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, o una colagenasa II producida recombinantemente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

También se incluyen en la presente invención las composiciones farmacéuticas que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y el polipéptido recombinante de la invención. También se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden colagenasa I como se describe en el presente documento, colagenasa II como se describe en el presente documento, o una combinación de las mismas. Se divulga en el presente documento una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un polipéptido que comprende la secuencia amino de la SEQ ID NO: 3. En una realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, o una combinación de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.. En ciertos aspectos adicionales, la presente invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un polipéptido que comprende la secuencia amino de la SEQ ID NO: 6 o una combinación de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y un polipéptido que comprende la secuencia amino de la SEQ ID NO 5. La invención incluye adicionalmente la composición farmacéutica de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de un paciente que sufre de una condición mediada por el colágeno. También se divulgan procedimientos para tratar una enfermedad mediada por colágeno que comprenden la administración de una cantidad eficaz de colagenasa I, colagenasa II o una combinación de las mismas.

Como se discutió anteriormente, se divulgan en el presente documento procedimientos para detectar la secreción de una toxina hemolítica por una cepa de producción bacteriana y procedimientos para detectar la presencia de una toxina hemolítica en una composición de colagenasa.

En una realización de la divulgación, una cepa bacteriana que produce colagenasa se prueba para la producción de toxinas hemolíticas utilizando un ensayo de hemólisis. En un aspecto de la divulgación, el ensayo de hemólisis se realiza utilizando un sustrato de agar sangre.

En otra realización de la divulgación, un producto de colagenasa se prueba para la presencia de toxinas hemolíticas utilizando un ensayo de hemólisis. En ciertos aspectos de la divulgación, el ensayo de hemólisis se realiza utilizando un sustrato de agar sangre. En aspectos adicionales de la divulgación, el ensayo de hemólisis se realiza utilizando la detección fotométrica de la hemoglobina liberada. La ausencia de toxinas hemolíticas, determinada por un ensayo de hemólisis o de detección fotométrica, apoyaría la liberación del producto farmacológico para su administración terapéutica.

Diversas cepas de bacterias productoras de colagenasa pueden ser ensayadas para la actividad hemolítica de acuerdo con un procedimiento de la divulgación, en apoyo de la liberación de un producto farmacológico de colagenasa para la administración terapéutica. Por ejemplo, los miembros de los géneros Actinobacillus, Actinomadura, Bacillus, Bacteriodes, Bifidobacterium, Brucella, Capnocytophaga, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium, Flavobacterium, Fusobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Serratia, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus, Treponema, y Vibrio pueden ser ensayados para la actividad hemolítica de acuerdo con un procedimiento de la divulgación, en apoyo de la liberación de un producto farmacológico de colagenasa para la administración terapéutica.

En otra realización de la divulgación, un producto de colagenasa producido por, y purificado a partir de, una cepa de bacterias productoras de colagenasa se ensaya para la actividad hemolítica de acuerdo con un procedimiento de la divulgación, en apoyo de la liberación de un producto farmacológico de colagenasa para la administración terapéutica. En algunas realizaciones de la divulgación, la cepa de producción se selecciona de, pero no se limita a, los géneros mencionados anteriormente. En otro aspecto de la divulgación, la cepa de producción es una cepa de Escherichia coli (E. coli ), incluyendo formas de E. coli que han sido transformadas con formas recombinantes de colagenasa I y colagenasa II. En ciertos aspectos de la divulgación, la cepa de producción es una cepa de Clostridium perfringens (C. prefrigens). En aspectos adicionales de la divulgación, la cepa de producción es una cepa de C. histolyticum .

En aún otra realización de la divulgación, la composición de colagenasa se ensaya para la actividad hemolítica de acuerdo con un procedimiento de la divulgación, en el que la composición de colagenasa comprende una combinación de colagenasa I y colagenasa II purificadas de C. histolyticum . También se divulga en el presente documento un procedimiento de producción de un producto farmacéutico consistente en colagenasa I y II de C. histolyticum , en el que dicho procedimiento comprende probar una cepa de producción bacteriana para la ausencia de una toxina hemolítica funcional y secretada de acuerdo con un procedimiento de la divulgación.

También se divulga en el presente documento un procedimiento de purificación de una composición de colagenasa cruda, en el que dicho procedimiento comprende la purificación de la composición por filtración y cromatografía en columna, seguida de la confirmación de la ausencia de una toxina hemolítica de acuerdo con un procedimiento descrito en el presente documento.

También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar una afección mediada por colágeno en un paciente que la necesita, en el que dicho procedimiento comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un producto farmacológico que comprende colagenasa, en el que la ausencia de una toxina hemolítica en dicho producto farmacológico o en una cepa de producción bacteriana que produce dicha colagenasa se confirma de acuerdo con un procedimiento de la divulgación antes de la administración de dicho producto farmacológico a un paciente, y/o la formulación de la colagenasa en una composición farmacéutica.

También se describen kits para analizar la presencia o ausencia de toxinas hemolíticas en una muestra.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Lo anterior y otros objetos, características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción más particular de las realizaciones preferidas de la invención, como se ilustra en los dibujos adjuntos en los que los caracteres de referencia similares se refieren a las mismas partes a través de las diferentes vistas. Los dibujos no están necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en la ilustración de los principios de la invención.

La FIG. 1 muestra la alineación de proteínas de la toxina alfa de Clostridium septicum (C. septicum ) con la toxina alfa putativa de C. histolyticum CLH_2834 y 2835. La secuencia de aminoácidos de la toxina alfa de C. septicum (SEQ ID NO: 7) es la secuencia superior de cada fila. El C. histolyticum CLH_2834 & 2835 (SEQ ID NO: 8) es la secuencia inferior de cada fila. La secuencia subrayada y sombreada es el N-terminal de la toxina madura de C. septicum alpha. Los asteriscos sobre los aminoácidos muestran los residuos esenciales no conservados que son críticos para la funcionalidad (identifican el desajuste en la secuencia). El sombreado muestra los residuos esenciales conservados (confirma la identidad). La numeración de la secuencia se basa en la secuencia de C. septicum .

La FIG. 2 muestra una placa de agar sangre de C. septicum. Las flechas indican la actividad beta hemolítica.

La FIG. 3 muestra la alineación de aminoácidos de la termolisina de Bacillus proteolyticus con la toxina putativa delta de C. histolyticum CLH_2576. La secuencia superior de cada fila muestra la secuencia de la proteína termolisina de Bacillus prote olyticus ( B. proteolyticus) (SEQ ID NO: 9). La secuencia inferior de cada fila es la secuencia de C. histolyticum CLH 2576 (SEQ ID NO: 10). El sombreado verde muestra la región de la proproteína. La numeración se basa en la secuencia de la termolisina.

La FIG. 4 muestra la alineación de aminoácidos de la prosecuencia de termolisina de B. proteolyticus con la toxina putativa delta de C. histolyticum CLH _2576. La secuencia superior de cada fila es la prosecuencia de la proteína termolisina de B. proteolyticus (SEQ ID NO: 11). La secuencia inferior de cada fila es la prosecuencia de C. histolyticum CLH_2576 (SEQ ID NO: 12). Los asteriscos sobre los aminoácidos muestran los residuos esenciales no conservados que son críticos para la funcionalidad (identifica el desajuste en la secuencia). El sombreado verde muestra los residuos esenciales conservados (confirma la identidad). La numeración se basa en la secuencia de la termolisina.

La FIG. 5 muestra la alineación de la secuencia madura de la termolisina de B. proteolyticus con la toxina putativa delta de C. histolyticum CLH _2576. La secuencia superior de cada fila es la secuencia madura de la termolisina de B. proteolyticus (SEQ ID NO: 13). La secuencia inferior de cada fila es C. histolyticum CLH_2576 (SEQ ID NO: 14). Los asteriscos sobre los aminoácidos muestran los residuos esenciales no conservados que son críticos para la funcionalidad (identifica el desajuste en la secuencia). El sombreado verde muestra los residuos esenciales conservados (confirma la identidad). La numeración se basa en la secuencia de la termolisina.

La FIG. 6 muestra la alineación proteica de la perfringolisina de C. perfringens con la toxina putativa épsilon de C. histolyticum CLH_1920. La secuencia superior de cada fila es la secuencia de aminoácidos de la perfringolisina de C. perfringens (SEQ ID NO: 15). La secuencia inferior de cada fila es la secuencia de aminoácidos de C. histolyticum CLH_1920 (SEQ ID NO: 16). La estrella azul muestra el sitio de escisión de la peptidasa señal de la perfringolisina K43. Los asteriscos sobre los aminoácidos muestran los residuos esenciales no conservados que son críticos para la funcionalidad (identifica la no coincidencia en la secuencia). El sombreado verde muestra los residuos esenciales conservados (confirma la identidad). La numeración se basa en la secuencia de perfringolisina.

La FIG. 7 muestra el fenotipo beta hemolítico de la tetanolisina.

La FIG. 8 muestra la alineación de la proteína de C. histolyticum clostripain con la toxina putativa gamma de C. histolyticum CLH_1861. La secuencia superior de cada fila es la secuencia de aminoácidos de la clostripina de C. histolyticum (SEQ ID NO: 17). La secuencia inferior de cada fila es la secuencia de aminoácidos de C. histolyticum CLH_1920 (SEQ ID NO: 18). Los asteriscos sobre los aminoácidos muestran los residuos esenciales no conservados que son críticos para la funcionalidad (identifican la no coincidencia en la secuencia). El sombreado verde muestra los residuos esenciales conservados (confirma la identidad). La numeración se basa en la secuencia de clostripain X63673.

La FIG. 9 muestra una comparación de la alineación de la secuencia de aminoácidos traducida de colG y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (la secuencia de aminoácidos traducida de CLH_1768 y 1769; la secuencia superior). Como se muestra en la FIG. 9, la proteína madura codificada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 difiere de la secuencia de aminoácidos traducida de la secuencia de aminoácidos de colG en tres aminoácidos. El N-terminal de la proteína madura comienza en Ile 119 de la secuencia de la SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de la proteína madura que comienza en Ile 119 de la SEQ ID NO: 3 es la SEQ ID NO: 5.

La FIG. 10 muestra una comparación de alineación de la secuencia de aminoácidos traducida de colH y la SEQ ID NO: 4 (la secuencia de aminoácidos traducida de CLH_2116; la secuencia inferior). Como se muestra en la FIG. 10, la proteína madura codificada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 difiere de la secuencia de aminoácidos de colG traducida en ocho aminoácidos. El N-terminal de la proteína madura comienza en Ala 31 en colG y en la SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de la proteína madura que comienza en Ala 31 de la SEQ ID NO: 4 es la SEQ ID NO: 6.

La FIG. 11 muestra la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 (CLH_1768 y 1769; colagenasa I).

La FIG. 12 muestra la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 (CLH 2116; colagenasa II).

La FIG. 13A y 13B muestran la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 21, respectivamente (CLH_2835 y CLH_2834; toxina alfa).

La FIG. 14Ay 14B muestran la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente (CLH 2576; toxina delta).

La FIG. 15Ay 15B muestran la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos de la SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID NO: 23, respectivamente (CLH_1920; toxina épsilon).

La FIG. 16Ay 16B muestran la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente (CLH_1861; toxina gamma).

La FIG. 17A muestra la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (colG).

La FIG. 17B muestra la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.

La FIG. 18A muestra la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 (colH).

La FIG. 18B muestra la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A continuación se describen las realizaciones preferidas de la invención.

Las palabras "un" o "una, uno" se refieren a uno o más, a menos que se especifique lo contrario. Por ejemplo, "una toxina hemolítica" se refiere a una o más toxinas hemolíticas.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de cultivo celular, biología molecular, microbiología, biología celular e inmunología, que están bien dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican ampliamente en la literatura. Véase, por ejemplo Sambrooket al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press Ausubel et al. (1995), "Short Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons; Methods in Enzymology (varios volúmenes); Methods in Cell Biology (varios volúmenes), y Methods in Molecular Biology (varios volúmenes).

A. Ácidos nucleicos y proteínas recombinantes

Una fuente importante de colagenasa proviene de la fermentación de C. histolyticum. Una formulación inyectable que comprende la colagenasa I y la colagenasa II de C. histolyticum se vende bajo el nombre comercial de XIAFLEX® y está aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para el tratamiento de la contractura de Dupuytren. En la literatura se han descrito las secuencias de aminoácidos de la colagenasa I y la colagenasa II codificadas por los genes colG y colH, respectivamente. Por ejemplo, colG se describe en el GenBank Acc. No. D87215 y Matsushita et al. (1999), Journal of Bacteriology 181(3): 923-933y colHse ha descrito en el GenBank Acc. No. D29981 y Yoshihara et al. (1994), Journal of Bacteriology 176(21): 6489-6496. La presente invención se basa parcialmente en el análisis de la secuenciación de los genes que codifican la colagenasa I y la colagenasa II en una cepa de C. histolyticum (Clon 004 descrito más adelante en los Ejemplos) que produce y secreta colagenasa I y colagenasa II funcionales. Las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican la colagenasa I y la colagenasa II resultaron ser diferentes de las secuencias descritas en la literatura para C. histolyticum (por ejemplo, los números de cuenta del GenBank D87125 y D29981) (SEQ ID NO: 19 y 20) (FIGs. 9 y 10).

La colagenasa I y la colagenasa II son metaloproteasas y requieren de zinc fuertemente unido y de calcio débilmente unido para su actividad (Eddie L. Angleton y H. E. Van Wart, Biochemistry 1988, 27, 7406 - 7412). La colagenasa I y la colagenasa II tienen una amplia especificidad hacia todos los tipos de colágeno (Steinbrink, D; Bond, M y Van Wart, H; (1985), JBC, 260 p2771-2776). La colagenasa I y la colagenasa II digieren el colágeno hidrolizando la región triple helicoidal del mismo bajo condiciones fisiológicas (Steinbrink, D; Bond, M y Van Wart, H; (1985), JBC, 260 p2771-2776). Aunque cada colagenasa muestra una especificidad diferente (por ejemplo, cada una tiene una secuencia amino preferida para la escisión), juntas tienen una actividad sinérgica hacia el colágeno (Mandl, I., (1964), Biochemistry, 3: p.1737-1741 Vos-Scheperkeuter, GH, (1997), Cell Transplantation, 6: p.403-412).

Se divulga en el presente documento una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende o consiste en un polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 o el complemento de la SEQ ID NO: 1. En ciertos aspectos, el ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia reguladora heteróloga unida operativamente al polinucleótido. La invención abarca una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende a) un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2 o el complemento de la SEQ ID NO: 2, y b) una secuencia reguladora heteróloga unida operativamente al polinucleótido. También se divulga una molécula de ácido nucleico recombinante que consiste en un polinucleótido de la SEQ ID NO: 2 o el complemento de la SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos de la divulgación, el ácido nucleico recombinante comprende además un promotor heterólogo unido operativamente al polinucleótido.

La invención también abarca los polipéptidos recombinantes codificados por los ácidos nucleicos recombinantes de la invención. En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos recombinantes están codificados por los ácidos nucleicos recombinantes que comprenden o consisten en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido recombinante de la invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. También se divulga un polipéptido recombinante que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5 (la proteína colagenasa I madura, que comienza en Ile 119 de la SEQ ID NO: 3 en la FIG. 9). En una realización, la invención proporciona un polipéptido recombinante que comprende o consiste en la SEQ iD NO:6 (la proteína colagenasa II madura, que comienza en el Ala 31 de la SEQ ID NO: 4 en la FIG. 10).

Se divulga en el presente documento un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3 o la SEQ iD NO:4. Se divulga en el presente documento un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6. En un aspecto adicional de la divulgación, el ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6.

Un ácido nucleico recombinante es una molécula de ácido nucleico que contiene, además de una secuencia polinucleotídica descrita en el presente documento (por ejemplo, la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2), una secuencia adicional de nucleótidos heteróloga codificante o no codificante. El término "heterólogo" significa que el polinucleótido se origina en una especie diferente o en la misma especie, sin embargo, desde otra ubicación en el genoma que dicha secuencia de nucleótidos añadida. Los polipéptidos o proteínas recombinantes se refieren a polipéptidos o proteínas producidos mediante técnicas recombinantes, por ejemplo, aquellas proteínas o polipéptidos producidos a partir de células transformadas por un constructo de ácido nucleico exógeno que codifica el polipéptido o la proteína deseada.

La divulgación también se refiere a ácidos nucleicos que comprenden la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, en el que dicho ácido nucleico está unido operativamente a una secuencia reguladora. Se divulgan en el presente documento ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o la SeQ ID NO: 6, en el que dicho ácido nucleico está unido operativamente a una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y/o aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Ejemplos no limitantes de secuencias reguladoras son los promotores y los potenciadores. Las secuencias reguladoras también incluyen otros elementos de control de la expresión, por ejemplo, los descritos en Goeddei, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Un ácido nucleico está "unido operativamente" a una secuencia reguladora cuando la molécula de ácido nucleico está unida a la secuencia reguladora de manera que permite la expresión de la secuencia de ácido nucleico.

Una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento puede fusionarse además con una secuencia marcadora, por ejemplo, una secuencia que codifica un polipéptido para ayudar al aislamiento o la purificación del polipéptido. Tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, las que codifican una proteína de fusión de glutatión-S-transferasa (GST), las que codifican un marcador polipéptido de hemaglutina A (HA) de la gripe, y las que codifican el péptido de hexa-histidina, como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.). En ciertos aspectos, la invención se dirige a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, o la SEQ ID NO: 6, en el que dicho polipéptido tiene fusionada una secuencia de aminoácidos marcadora. También se divulga un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o la SEQ ID NO: 5, en el que dicho polipéptido tiene fusionada una secuencia de aminoácidos marcadora

En el presente documento se divulga una variante de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. Un ácido nucleico variante es un ácido nucleico que incluye una sustitución, adición o supresión de nucleótidos en relación con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, la variante es un ácido nucleico que codifica secuencias de aminoácidos idénticas o sustancialmente idénticas a la de las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. Como comprenderá el artesano experto, debido a la degeneración del código genético, varias secuencias de ácido nucleico diferentes pueden codificar una proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Así, por ejemplo, en cada posición en la que un aminoácido específico está especificado por un codón, éste puede cambiarse por cualquiera de los codones correspondientes que codifican el mismo aminoácido sin alterar la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Un experto en la materia entenderá que cada codón de una secuencia de nucleótidos (excepto AUG, que es el único codón para la metionina, y TGG, que suele ser el único codón para el triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica.

En ciertas realizaciones, la invención se dirige al polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, o la SEQ ID NO: 6, en el que se han suprimido o añadido uno o más aminoácidos, en el que el polipéptido posee la actividad de degradar o lisar colágeno siempre que el polipéptido esté codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con el primer aspecto de la invención. También se divulga un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o la SEQ ID NO: 5, en el que se han suprimido o añadido uno o más aminoácidos, en el que el polipéptido posee la actividad de degradar o lisar colágeno. En una realización adicional de la divulgación, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6, en el que uno o más residuos de aminoácidos han sido sustituidos por un residuo de aminoácido diferente, en el que el polipéptido posee la actividad de degradar o lisar colágeno y en el que el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es diferente de las secuencias de aminoácidos de GenBank Acc. D87125 (SEQ ID NO: 19) y D29981 (SEQ ID NO: 20). En ciertos aspectos, cuando se sustituye un aminoácido, la sustitución es un cambio de aminoácido conservador. Un cambio conservador de aminoácidos es, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido no polar por otro aminoácido no polar o la sustitución de un aminoácido polar por otro aminoácido polar o la sustitución de un aminoácido cargado positivamente por otro aminoácido cargado positivamente, y similares. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen la alanina, la leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptófano y la metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen la glicina, la serina, la treonina, la cisteína, la tirosina, la asparagina y la glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen la arginina, la lisina y la histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico.

Un ácido nucleico aislado y un polipéptido aislado no se encuentran en la forma o el entorno en el que existen en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado es aquel que está separado de los nucleótidos que normalmente flanquean la molécula de ácido nucleico en la naturaleza. Los ácidos nucleicos recombinantes y los ácidos nucleicos recombinantes dentro de un vector son también un ejemplo de ácido nucleico aislado. Asimismo, las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen moléculas de ácido nucleico recombinantes en células huésped heterólogas, así como moléculas de ácido nucleico parcial o sustancialmente purificadas en solución.

Como se describe con más detalle a continuación, la invención también abarca células huésped recombinantes, como células bacterianas, células fúngicas, células vegetales, células de insectos, células aviares, células de anfibios y células de mamíferos, que comprenden el vector de la invención.

Un casete de expresión es una secuencia de nucleótidos que es capaz de afectar a la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia de codificación de proteínas, como una colagenasa de la invención) en un huésped compatible con tales secuencias. Los casetes de expresión pueden incluir un promotor vinculado operativamente con la secuencia codificante del polipéptido; y, opcionalmente, con otras secuencias, por ejemplo, señales determinación de la transcripción. También pueden utilizarse factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, por ejemplo, potenciadores.

La invención también se refiere a vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención. También se divulga un vector que comprende el ácido nucleico es la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, o un complemento del mismo. En otra realización de la divulgación, el ácido nucleico es un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID n O: 6. Un "vector" es una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un ejemplo no limitativo de un vector es un plásmido que es un ADN circular de doble cadena en el que se puede ligar un segmento de ADN adicional. Otro ejemplo de vector es un vector viral, en el que se liga un segmento de ADN adicional en el genoma viral. Algunos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, los vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped al introducirse en ella, y por tanto se replican junto con el genoma del huésped. Los vectores de expresión son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están vinculados de forma operativa. Estos vectores de expresión incluyen, por ejemplo, plásmidos. La invención abarca otros vectores de expresión, como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados) que son capaces de dirigir la expresión génica. Como apreciará el artesano experto, el diseño del vector de expresión depende de varios factores, como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína que se desea, y otros similares. Los vectores de expresión incluyen una o más secuencias reguladoras que se seleccionan en función de la célula huésped que se va a utilizar para la expresión. Como se ha comentado anteriormente, la secuencia reguladora está unida de forma operativa al ácido nucleico que se va a expresar, por ejemplo, un ácido nucleico de la invención. En algunas realizaciones, la secuencia reguladora es una secuencia reguladora nativa de la célula huésped transformada. Un vector de expresión puede comprender uno o más marcadores seleccionables, incluyendo, pero no limitados a, el gen que codifica la dihidrofolato reductasa y los genes que confieren resistencia a la neomicina, la tetraciclina, la ampicilina, el cloranfenicol, la kanamicina y la estreptomicina.

Las células huésped procariotas y eucariotas pueden ser transfectadas por los vectores descritos en el presente documento. Las células huésped que pueden ser transfectadas con los vectores de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas como E. coli (por ejemplo, Cepas de E. coli K12), Streptomyces, Pseudomonas, Serratia marcescens y Salmonella typhimurium, células de insectos (baculovirus), incluyendo Drosophila, células fúngicas, como células de levadura, células vegetales y células de mamíferos, como timocitos, células de ovario de hámster chino (CHO), células COS y células de lactococcus lactis. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana. En otra realización, la célula huésped es una cepa de E. coli . En una realización adicional, la célula huésped es una célula de lactococcus lactis. Se han descrito procedimientos para la producción de polipéptidos recombinantes en la bacteria lactococcus lactis, por ejemplo, en la Pat. U.S. N° 7.358.067. En una realización, la célula huésped es lactococcus lactis y el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 unido operativamente al promotor regulable por pH P170 y sus derivados. El promotor P170 y sus derivados se han descrito en detalle en WO 94/16086 y en WO 98/10079. También se divulga una célula huésped de lactococcus lactis en la que el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 unido operativamente al promotor regulable por pH P170 y sus derivados.

La ligadura de la molécula de ácido nucleico en un constructo genético, como un vector de expresión, y la transformación o transfección en huéspedes, ya sean eucariotas (levaduras, aves, insectos, plantas o mamíferos) o procariotas (células bacterianas), son procedimientos estándar. Un vector descrito en el presente documento puede introducirse en células procariotas o eucariotas utilizando técnicas convencionales de transformación o transfección, incluyendo, pero sin limitarse a ello, la coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la lipofección o la electroporación. Los polipéptidos de la presente invención pueden aislarse o purificarse (por ejemplo, hasta la homogeneidad) a partir de un cultivo celular recombinante mediante diversos procesos.

La invención abarca procedimientos para producir una colagenasa II funcional o una combinación de colagenasa II y I que comprenden el cultivo de una célula huésped transformada o transfectada con un vector que comprende un ácido nucleico de la invención. También se divulgan procedimientos para producir una colagenasa I funcional que comprenden el cultivo de una célula huésped transformada o transfectada con un vector que comprende un ácido nucleico divulgado en el presente documento. El procedimiento comprende además el aislamiento del polipéptido del medio o de la célula huésped. Una colagenasa funcional es un polipéptido que tiene una actividad biológica de una colagenasa natural, por ejemplo, una colagenasa que posee la capacidad de degradar el colágeno.

El polipéptido puede aislarse por procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la precipitación con etanol, la cromatografía de afinidad y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), o una combinación de cualquiera de ellos. El procedimiento concreto que se utilice dependerá de las propiedades del polipéptido y de la selección de la célula huésped; los procedimientos adecuados serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia.

Se divulga en el presente documento un procedimiento para producir colagenasa I o colagenasa II, dicho procedimiento comprende los pasos de (i) construir una bacteria recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:2, o el polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 3, 4, 5 o 6 operativamente ligada a una secuencia reguladora apropiada; (ii) cultivar dicha bacteria recombinante bajo condiciones adecuadas para expresar el gen, y (iii) recolectar de la bacteria recombinante, la colagenasa I o la colagenasa II. La colagenasa I y la colagenasa II pueden purificarse por una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo la cromatografía de afinidad con ligando de colorante, la cromatografía de afinidad con heparina, la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía de hidroxilapatita, la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de quelación de metales. En algunas realizaciones de la divulgación, la colagenasa I y la colagenasa II se purifican mediante filtración y cromatografía en columna y la colagenasa I y II purificada se combinan en una relación de aproximadamente 1 a 1 utilizando los procedimientos descritos enla U.S. Pat. N° 7.811.250.

Ejemplos de enfermedades mediadas por colágeno que pueden ser tratadas por las composiciones (que comprenden colagenasa I, colagenasa II, o una combinación de las mismas codificadas por los ácidos nucleicos descritos en el presente documento y/o que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y/o la SEQ ID NO: 4) y los procedimientos de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Dupuytren, la enfermedad de Peyronie, el hombro congelado (capsulitis adhesiva), los queloides, las cicatrices hipertróficas, las cicatrices deprimidas, como las resultantes del acné inflamatorio; las adherencias posquirúrgicas, el acné vulgar, los lipomas y las afecciones desfigurantes como las arrugas, la formación de celulitis y la fibrosis neoplásica. Las Patentes U.S. n° 6.086.872 y 5,589,171 divulgan el uso de preparados de colagenasa en el tratamiento de la enfermedad de Dupuytren. La patente U.S. n° 6.022.539 divulga el uso de preparados de colagenasa en el tratamiento de la enfermedad de Peyronie.

Además de su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por el colágeno, una composición que comprende un polipéptido recombinante descrito en el presente documento también es útil para la disociación del tejido en células individuales y grupos de células, como es útil en una amplia variedad de aplicaciones de laboratorio, de diagnóstico y terapéuticas. Estas aplicaciones implican el aislamiento de muchos tipos de células para diversos usos, como las células endoteliales microvasculares para la siembra de injertos vasculares sintéticos de pequeño diámetro, los hepatocitos para la terapia génica, el cribado toxicológico de fármacos y los dispositivos de asistencia hepática extracorpórea, los condrocitos para la regeneración del cartílago y los islotes de Langerhans para el tratamiento de la diabetes mellitus dependiente de la insulina. El tratamiento enzimático actúa para fragmentar las proteínas de la matriz extracelular y las proteínas que mantienen el contacto entre células. Dado que el colágeno es el principal componente proteico de la ultraestructura de los tejidos, la enzima colagenasa se ha utilizado con frecuencia para lograr la desintegración tisular deseada. En general, la composición de la presente divulgación es útil para cualquier aplicación en la que se desee la eliminación de células o la modificación de una matriz extracelular.

La invención abarca una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y el polipéptido recombinante de la invención. También se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y colagenasa I y/o colagenasa II producidas de acuerdo con un procedimiento descrito en el presente documento. En otra realización de la divulgación, las composiciones farmacéuticas comprenden colagenasa I que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende colagenasa II que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 6. En aún otro aspecto, la composición farmacéutica comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una colagenasa I y una colagenasa II como se describe en el presente documento. En un aspecto adicional, la composición farmacéutica comprende un portador farmacéuticamente aceptable y la colagenasa I y la colagenasa II en relación de masa 1:1. La composición farmacéutica de la presente invención comprende una cantidad eficaz de una colagenasa de la presente invención formulada junto con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

B. Procedimientos de detección de la presencia de una toxina hemolítica

También se divulgan en el presente documento procedimientos para detectar la presencia de una toxina hemolítica en una fermentación bacteriana, en la que la fermentación bacteriana produce una colagenasa. En ciertos aspectos, la invención proporciona un procedimiento para liberar un producto farmacológico de colagenasa antes de la administración terapéutica de dicha sustancia farmacológica de colagenasa a un paciente que comprende detectar la presencia de una toxina hemolítica en la cepa de producción del producto farmacológico. Los términos "cepa de producción de productos farmacéuticos", "cepa de producción", "cepa de producción de colagenasa" y "cepa de producción bacteriana" se utilizan indistintamente y se refieren a una cepa bacteriana de la que se obtiene una colagenasa. También se divulga en el presente documento un procedimiento para liberar un producto farmacológico de colagenasa antes de la administración terapéutica de dicho producto farmacológico de colagenasa a un paciente, que comprende la detección de la presencia de una toxina hemolítica en el producto farmacológico.

Tal como se utiliza en el presente documento, la frase "liberar un producto farmacológico de colagenasa" significa confirmar la ausencia de una toxina hemolítica en el producto farmacológico de colagenasa. Se entiende que los términos "sustancia farmacológica", "producto farmacológico" o "composición de colagenasa" pueden utilizarse indistintamente. También en este caso, los términos "hemolisina" y "toxina hemolítica" se utilizan indistintamente, y se refieren a una toxina que es responsable de la lisis de un glóbulo rojo.

Se ha descubierto que la cepa de producción de colagenasa y el producto farmacológico pueden ensayarse para detectar la presencia o ausencia de actividad hemolítica, asegurando que la sustancia farmacológica de colagenasa proporcione una actividad enzimática altamente reproducible y óptima y un efecto terapéutico superior, al tiempo que se reduce el potencial de efectos secundarios. Se proporcionan procedimientos para ensayar la cepa de producción o el producto farmacéutico para la secreción o presencia de una toxina hemolítica funcional que puede estar co-presente con la colagenasa en el producto farmacéutico. También se divulga un procedimiento de ensayo de una muestra de prueba para la presencia de una toxina hemolítica, en el que la muestra de prueba comprende una cepa de producción bacteriana o una composición de colagenasa, que comprende la incubación de la muestra de prueba con glóbulos rojos, seguida de la detección de la lisis de los glóbulos rojos.

Los procedimientos específicos para detectar la lisis de los glóbulos rojos se describen en toda la literatura, incluyendo, por ejemplo, 1) Ryan KJ y Ray CG. Principios de diagnóstico de laboratorio. En Sherris medical microbiology: an introduction to infectious diseases. Ryan KJ, Ray CG y Sherris JC (eds.) McGraw-Hill Professional, 2004; 229-260y 2) Eschbach E et al. Ensayo mejorado de lisis eritrocitaria en placas de microtitulación para la detección sensible y la medición eficiente de compuestos hemolíticos de algas ictiotóxicas. Journal of Applied Toxicology 21, 513-519 (2001).

En una realización de la divulgación, el procedimiento comprende incubar muestras de una cepa de producción de colagenasa, una colagenasa parcialmente purificada aislada de una cepa de producción de colagenasa, o un producto farmacéutico de colagenasa en un sustrato de agar sangre, y observar el agar sangre para ver si hay zonas de aclaramiento después del periodo de incubación, en el que una zona de aclaramiento indica la lisis de glóbulos rojos. Si se probó la cepa del producto bacteriano, la lisis de los glóbulos rojos indica la secreción de una toxina hemolítica funcional de la cepa de producción bacteriana. Si se probó una colagenasa parcialmente purificada o un producto farmacológico de colagenasa, la lisis de los glóbulos rojos indica la presencia de una toxina hemolítica funcional en la colagenasa parcialmente purificada o en el producto farmacológico de colagenasa. En ciertas realizaciones de la divulgación, la cepa de producción es una cepa de C. histolyticum. La ausencia de una zona de eliminación indica la ausencia de una toxina hemolítica. La ausencia observada de zonas de eliminación indica o confirma la ausencia de toxinas hemolíticas en la cepa de producción de colagenasa, en la colagenasa parcialmente purificada o en el producto farmacéutico de colagenasa, y permite que el producto farmacéutico sea liberado para su administración terapéutica.

En otra realización de la divulgación, el procedimiento comprende incubar glóbulos rojos con extractos tomados de una cepa de producción de colagenasa, o con una colagenasa parcialmente purificada aislada de una cepa de producción de colagenasa, o con un producto farmacéutico de colagenasa, seguido de analizar fotométricamente la mezcla de incubación para la lisis de los glóbulos rojos como se indica por la aparición de hemoglobina en la mezcla de incubación. Una toxina hemolítica lisará los glóbulos rojos, liberando hemoglobina en la muestra incubada. La detección fotométrica de la hemoglobina puede proporcionar un ensayo sensible para la presencia de toxinas hemolíticas. En un aspecto, los glóbulos rojos se incuban con extractos tomados de una cepa productora de colagenasa, o con una colagenasa parcialmente purificada aislada de una cepa productora de colagenasa, o con un producto farmacológico de colagenasa, y luego se analizan fotométricamente los extractos para detectar la presencia de hemoglobina a una longitud de onda de 540 nm. En otro aspecto, el análisis fotométrico se realiza a una longitud de onda de 414 nm. En otro aspecto, la incubación y el análisis fotométrico pueden realizarse utilizando placas de microtitulación. La ausencia de hemoglobina, y por tanto de toxinas hemolíticas, permitiría la liberación del producto farmacológico para su administración terapéutica a un paciente.

Las toxinas hemolíticas que se encuentran en C. histolyticum pertenecen a dos familias diferentes de hemolisinas: hemolisinas similares a la aerolisina y hemolisinas lábiles al oxígeno. Las hemolisinas similares a la aerolisina son sintetizadas por la bacteria como preproteínas inactivas que se secretan en el medio extracelular como protoxinas inactivas. Las protoxinas inactivas se unen a los receptores de la membrana de la célula objetivo, por ejemplo, los receptores de los glóbulos rojos, donde las protoxinas son escindidas en sus estructuras activas por las proteasas. Una vez activadas, las toxinas se oligomerizan en la superficie celular formando un complejo preporoso, seguido de la inserción de un barril beta en la membrana de la célula objetivo. El barril beta forma un poro en la membrana, permitiendo la rápida entrada de iones de calcio en la célula, con consecuencias tóxicas para la misma. La toxina alfa de C. histolyticum es muy probablemente una hemolisina similar a la aerolisina, ya que se ha descubierto que comparte una homología significativa con la toxina alfa de Clostridium septicum , que es un miembro de la familia de toxinas similares a la aerolisina, y que posee actividad hemolítica (véase, por ejemplo, el ejemplo 1 a continuación).

La toxina Epsilon de C. histolyticum , y la tetanolisina de Clostridium tetani (C. tetani), han sido descritas como hemolisinas lábiles al oxígeno [Hatheway CL. Clin Microbiol Rev 3(1): 66-98 (1990)]. Se ha descubierto que la toxina Epsilon de C. histolyticum comparte homología con la tetanloysina, que es un miembro de las toxinas activadas por tiol, de barril beta, formadoras de poros con afinidad por el colesterol. Estas proteínas forman parte de una familia de citolisinas dependientes del colesterol (CDC). Estas proteínas son secretadas por la bacteria en el medio extracelular como proteínas monoméricas solubles en agua, donde se unen a las membranas de las células objetivo, mediadas por la unión del colesterol. A continuación, la toxina se oligomera en la superficie de la membrana para formar arcos y estructuras anulares que son responsables de la citolisis. Se sabe que la toxina épsilon de C. histolyticum es una hemolisina lábil al oxígeno, y es similar serológicamente a las hemolisinas lábiles al oxígeno producidas por otras cepas de Clostridium , como C. tetani, C. novyi y C. septicum.

También se divulga en el presente documento un procedimiento para detectar la presencia de la toxina alfa de C. histolyticum en una cepa de producción bacteriana utilizando un ensayo descrito en el presente documento. También se divulga un procedimiento para detectar la presencia de la toxina alfa de C. histolyticum en un producto farmacéutico. También se divulga un procedimiento para detectar la presencia de la toxina C. histolyticum epsilon en una cepa de producción bacteriana. También se divulga un procedimiento para detectar la presencia de la toxina C. histolyticum epsilon en un producto farmacéutico. También se divulga un procedimiento para detectar la presencia de la toxina alfa y la toxina épsilon de C. histolyticum en una cepa de producción bacteriana. También se divulga un procedimiento para detectar la presencia de la toxina alfa y la toxina épsilon de C. histolyticum en un producto farmacéutico.

También se divulga en el presente documento un procedimiento de producción de un producto farmacéutico consistente en colagenasa I y colagenasa II, en el que la colagenasa I y II se obtienen de C. histolyticum, y en el que el procedimiento comprende los pasos de fermentar una cepa de C. histolyticum en la que la ausencia de una toxina hemolítica funcional y secretada se ha confirmado incubando la cepa de producción con glóbulos rojos bajo condiciones adecuadas para la lisis de los glóbulos rojos por una toxina hemolítica, donde la lisis de los glóbulos rojos indica la secreción de una toxina hemolítica y donde la ausencia de lisis de los glóbulos rojos indica la ausencia de una toxina hemolítica. También se divulga un procedimiento para producir un producto farmacéutico que consiste en colagenasa I y colagenasa II, en el que la colagenasa I y II se obtienen de C. histolyticum, y en el que el procedimiento comprende los pasos de confirmar la ausencia de una toxina hemolítica funcional y secretada en el producto farmacéutico incubando el producto farmacéutico con glóbulos rojos bajo condiciones adecuadas para la lisis de los glóbulos rojos por una toxina hemolítica, en el que la lisis de los glóbulos rojos indica la secreción de una toxina hemolítica y en el que la ausencia de lisis de los glóbulos rojos indica la ausencia de una toxina hemolítica.

También se divulgan en el presente documento procedimientos de purificación de una composición de colagenasa cruda que comprenden la purificación de la composición por filtración y cromatografía en columna, seguida de la confirmación de la ausencia de una toxina hemolítica mediante la incubación de una muestra de la composición purificada con glóbulos rojos bajo condiciones adecuadas para la lisis de los glóbulos rojos por una toxina hemolítica, en la que la lisis de los glóbulos rojos indica la secreción de una toxina hemolítica y en la que la ausencia de lisis de los glóbulos rojos indica la ausencia de una toxina hemolítica.

Como se discutió anteriormente, varias enfermedades y condiciones están asociadas con la deposición excesiva de colágeno y la acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno y pueden ser tratadas con productos farmacológicos de colágeno. Dichas enfermedades y afecciones se denominan colectivamente en el presente documento "enfermedades mediadas por el colágeno". Se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar una enfermedad mediada por colágeno en un paciente que la necesita, en el que la composición que comprende colagenasa se administra a dicho paciente y en el que, antes de dicha administración, dicha composición o cepa de producción bacteriana se ensaya para detectar la presencia o ausencia de toxinas hemolíticas utilizando un procedimiento descrito en el presente documento. Ejemplos de afecciones mediadas por el colágeno que pueden ser tratadas por las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a: Enfermedad de Dupuytren; enfermedad de Peyronie; hombro congelado (capsulitis adhesiva), queloides; cicatrices hipertróficas; cicatrices deprimidas como las resultantes del acné inflamatorio; adherencias posquirúrgicas; acné vulgar; lipomas, y afecciones desfigurantes como arrugas, formación de celulitis y fibrosis neoplásica. En ciertos aspectos, la composición ensayada se administra a un paciente para tratar las enfermedades de Peyronie o Duputyren o la capsulitis adhesiva.

Con respecto a la cepa de producción que puede ensayarse de acuerdo con un procedimiento de la divulgación, se sabe, por ejemplo, que la colagenasa es expresada por bacterias que son miembros de los géneros Actinobacillus, Actinomadura, Bacillus, Bacteriodes, Bifidobacterium Brucella, Capnocytophaga, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium, Flavobacterium, Fusobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Serratia, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus, Treponema y Vibrio. En una realización de la divulgación, la cepa de producción se selecciona entre los géneros enumerados anteriormente. En otra realización de la divulgación, la cepa de producción es una cepa de E. c o li, incluyendo formas de E. coli que han sido transformadas con formas recombinantes de colagenasa I y colagenasa II. En una realización más preferida de la divulgación, la cepa de producción es una cepa de C.perfringens . En una realización más preferida de la divulgación, la cepa de producción es una cepa de C. histolyticum (C. his).

En ciertos aspectos de la divulgación, la cepa de producción produce una composición de colagenasa que comprende una mezcla de colagenasa I y colagenasa II. En una realización adicional de la divulgación, la cepa de producción utilizada para producir una mezcla de colagenasa I y colagenasa I es C. histolyticum. En otra realización de la divulgación, el producto farmacológico de colagenasa comprende una mezcla de colagenasa I y colagenasa II de C. histolyticum altamente purificada en una relación de masa de aproximadamente 1 a 1.

También se presentan kits para analizar la presencia de hemolisinas en una muestra, donde una hemolisina es una sustancia que provoca la lisis de los glóbulos rojos. Los kits permiten la identificación de sustancias de prueba que son hemolíticas o contienen hemolisinas. Las sustancias de prueba incluyen, entre otras, sustancias químicas, biológicas y emisoras de radiación. En una realización de la divulgación, el kit comprende materiales para analizar la presencia de hemolisinas en una muestra de prueba, incluyendo, por ejemplo, un kit que comprende glóbulos rojos y materiales de prueba relacionados. En otra realización de la divulgación, el kit comprende una placa de Petri compuesta por agar sangre, un control positivo y un control negativo compuesto por una cepa bacteriana en la que los genes hemolíticos están mutados o eliminados, y en la que no se producen proteínas hemolíticas funcionales. En otra realización de la divulgación, el kit comprende glóbulos rojos, placas de microtitulación, un control positivo y un control negativo compuesto por el producto farmacéutico.

Como se comprenderá, los kits y procedimientos inventivos pueden utilizarse para detectar la presencia o ausencia de hemolisinas en composiciones de colagenasa, en las que la colagenasa se obtiene de una bacteria.

La colagenasa cruda obtenida de C. histolyticum puede purificarse por una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo la cromatografía de afinidad con ligando de colorante, la cromatografía de afinidad con heparina, la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía de hidroxilapatita, la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de quelación de metales. La colagenasa cruda y parcialmente purificada está disponible comercialmente en muchas fuentes, incluyendo Advance Biofactures Corp., Lynbrook, Nueva York. Los procedimientos de purificación de la colagenasa cruda obtenida de C. histolyticum también se describen en la Pat. U.S. N° 7.811.560. En ciertas realizaciones, el procedimiento de purificación comprende los pasos de: a) filtrar la cosecha cruda a través de un filtro de cápsula de intercambio aniónico MUSTANG Q; b) añadir sulfato de amonio; preferentemente hasta una concentración final de 1M; c) filtrar la recolección cruda; preferentemente a través de un filtro de 0,45 pm; d) someter el filtrado a través de una columna HIC; preferentemente una fenil sefarosa 6FF (low sub); e) añadir leupeptina al filtrado; preferentemente a una concentración final de 0,2 mM para eluir el producto después de HIC; f) eliminar el sulfato de amonio y mantener la leupeptina para la correcta unión de la colagenasa I y la colagenasa II con intercambio de tampón por TFF; preferentemente con intercambio de tampón por TFF; g) filtrar la mezcla del paso; f) preferentemente a través de un filtro de 0,45 pm; h) separar la colagenasa I y la colagenasa II utilizando Q-Sepharose HP; i) preparar la concentración ^{y la formulación del}t Ff ^{para la colagenasa I y la colagenasa II por separado; en la que el}t Ff ^{es una filtración de}flujo tangencial que utiliza membranas filtrantes de PES o RC-polietersulfona de 10 y/o 30 K MWCO (corte de peso molecular) o celulosa regenerada (el TFF proporciona un medio para retener y concentrar la proteína seleccionada e intercambiar la proteína de una solución tampón a otra); y j) filtrar a través de un sistema de filtración de 0,2 pm.

C. Toxinas C. histolyticum Alpha, Beta, Delta, Epsilon y Gamma

Las secuencias de aminoácidos de las toxinas alfa, delta y épsilon del clon 004 de C. histolyticum se muestran en las figuras y son SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 16, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de las toxinas alfa, delta y épsilon del clon 004 de C. histolyticum también se muestran en las figuras y son SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, y la SEQ ID NO: 23, respectivamente. Cada una de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 tienen características de secuencia que hacen que estas proteínas no sean funcionales y/o no sean secretadas.

Para la toxina gamma (clostripain), sólo hay tres diferencias de aminoácidos cuando se compara con la proteína modelo (véase la sección Ejemplos) y ninguno de los residuos de aminoácidos que se encuentran para diferir en la toxina gamma de C. histolyticum Clone 004 se han identificado como esenciales para la actividad. Así, se predice que la toxina gamma de C. histolyticum Clone 004 (que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18) es secretada y funcional. La secuencia de nucleótidos de la toxina gamma del clon 004 de C. histolyticum es la SEQ ID NO: 24.

Como se ha comentado anteriormente, las toxinas beta que tienen secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 son totalmente funcionales.

Como se entenderá, se pueden introducir una o más mutaciones (por ejemplo, la supresión o adición de uno o más residuos de aminoácidos o residuos de ácidos nucleicos) en las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de las toxinas alfa, beta, épsilon o gamma de C. histolyticum (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24). En ciertos aspectos de la divulgación, se introducen una o varias mutaciones para mejorar o perjudicar la actividad, función, producción y/o secreción de la toxina. En una realización de la divulgación, se puede introducir una mutación que haga que las toxinas alfa, beta y/o ^{épsilon sean funcionales y/o se secreten. En otra realización de la divulgación, la secuencia de la toxina gamma}(sEq iD ^{NO: 18) pueden mutar para que la proteína no sea funcional y/o no se segregue.}

También se divulgan en el presente documento procedimientos para producir anticuerpos contra C. histolyticum o una toxina de C. histolyticum que comprenden la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una composición que comprende una proteína o péptido, en la que dicha proteína o péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, o un fragmento o variante del mismo, o una combinación de cualquiera de ellos. Además, se divulgan en el presente documento procedimientos para estimular una respuesta inmunitaria a una toxina de C. histolyticum que comprenden la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una composición que comprende una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8, SeQ iD NO: 10, SeQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, o un fragmento o variante del mismo, o una combinación de cualquiera de ellos. También se divulga una vacuna que comprende una cantidad eficaz de una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, o un fragmento o variante del mismo, o una combinación de cualquiera de ellos. La proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, Se Q ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, o un fragmento o variante del mismo puede ser producido por una cepa de C. histolyticum o puede ser una proteína o péptido recombinante.

D. Composiciones farmacéuticas que comprenden colagenasa y procedimientos de tratamiento

Se divulgan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden las secuencias proteicas y las proteínas recombinantes y también, composiciones farmacéuticas que comprenden un producto farmacológico de colagenasa ensayado de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, el término "portador o excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un agente de carga sólido, semisólido o líquido no tóxico, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo. "Tratar" o "tratamiento" incluye la administración de las composiciones, compuestos o agentes de aspectos de la presente invención para prevenir o retrasar la aparición de los síntomas, complicaciones o indicios bioquímicos de una enfermedad, aliviando o mejorando los síntomas o deteniendo o inhibiendo el desarrollo posterior de la enfermedad, condición o trastorno. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad efectiva" es una cantidad que, sola o en combinación con uno o más agentes activos, puede controlar, disminuir, inhibir, mejorar, prevenir o afectar de otro modo a uno o más síntomas de una enfermedad o condición a tratar. En el contexto de la producción de una respuesta inmunitaria o en la preparación de una vacuna, una "cantidad eficaz" abarca una cantidad efectiva para producir una respuesta inmunitaria, incluida la generación de anticuerpos contra un antígeno.

Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables son azúcares como la lactosa, la glucosa y la sacarosa; almidones como el almidón de maíz y la fécula de patata; celulosa y sus derivados como la carboximetilcelulosa sódica, la etilcelulosa y el acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; glicoles como el propilenglicol; ésteres como el oleato de etilo y el laurato de etilo; agar; agentes tampones como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico, y soluciones tampón de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes liberadores, agentes de recubrimiento, agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, de acuerdo con el criterio del formulador.

Las composiciones de colagenasa también pueden prepararse mezclando un número específico de unidades de actividad o masas específicas de las enzimas preferentemente purificadas. La actividad de la colagenasa puede medirse por la capacidad de la enzima para hidrolizar el péptido sintético o el sustrato de colágeno. Los expertos en la materia reconocerán que también se pueden utilizar ensayos enzimáticos distintos a los en el presente documento divulgados para definir y preparar composiciones enzimáticas funcionalmente equivalentes. La actividad de la colagenasa puede describirse, por ejemplo, en unidades SRC. Una unidad de SRC solubilizará colágeno de cola de rata en material de reacción de ninhidrina equivalente a 1 nanomol de leucina por minuto, a 25 °C y pH 7,4. En ciertas realizaciones de la presente invención, la actividad de la colagenasa se describe en unidades ABC. Este ensayo de potencia de la colagenasa se basa en la digestión del colágeno no desnaturalizado (procedente del tendón bovino) a pH 7,2 y 37 °C durante 20-24 horas. El número de enlaces peptídicos escindidos se mide por reacción con ninhidrina. Se restan los grupos amino liberados por un control de digestión de tripsina. Una unidad neta ABC de colagenasa solubilizará material reactivo de ninhidrina equivalente a 1,09 nanomoles de leucina por minuto. 1 unidad SRC equivale aproximadamente a 6,3 unidades ABC.

En ciertos aspectos, la sustancia farmacológica de la colagenasa inyectable consiste en dos colagenasas microbianas, denominadas colagenasa AUX I y colagenasa ABC I y colagenasa AUX II y colagenasa ABC II. Se entiende que los términos "colagenasa I", "ABC I", "AUX I", "colagenasa AUX I" y "colagenasa ABC I" significan lo mismo y pueden utilizarse indistintamente. Del mismo modo, los términos "colagenasa II", "ABC II", "AUX II", "colagenasa a Ux II" y "colagenasa ABC II" se refieren a la misma enzima y también pueden utilizarse indistintamente. Estas colagenasas son secretadas por células bacterianas. Se aíslan y purifican a partir del sobrenadante del cultivo de C. histolyticum mediante procedimientos cromatográficos. Ambas colagenasas son proteasas especiales y comparten el mismo número EC (E.C 3.4.24.3).

La colagenasa AUX I tiene una sola cadena polipeptídica que consiste en aproximadamente 1000 aminoácidos con un peso molecular de 115 kDa. La colagenasa AUX II tiene también una única cadena polipeptídica que consiste en aproximadamente 1000 aminoácidos con un peso molecular de 110 kDa.

En algunas realizaciones de la divulgación, la sustancia farmacológica (concentrado de colagenasa) tiene una relación de masa de aproximadamente 1 a 1 para la colagenasa AUX I y AUX II. En una realización de la divulgación, el concentrado de colagenasa tiene un coeficiente de extinción de 1,528.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por vía parenteral, tópica o a través de un depósito implantado. El término "parenteral", tal como se utiliza en el presente documento, incluye las técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal. En una realización preferida, la composición se inyecta en el tejido afectado. En el caso de las enfermedades de Peyronie o Duputyren o de la capsulitis adhesiva, la composición se inyecta en el cordón de la mano o en la placa de Peyronies. El término "administración local" se define en el presente documento para abarcar dicha inyección directa en el tejido afectado. En ciertos aspectos, la composición farmacéutica de la invención es una formulación inyectable. En ciertos aspectos adicionales, la composición farmacéutica es una formulación tópica.

Además, dependiendo del tratamiento, se pueden obtener mejores resultados, en algunas circunstancias, inmovilizando el lugar de la inyección tras la administración de la composición farmacéutica. Por ejemplo, el lugar de administración (por ejemplo, la mano), puede ser inmovilizado durante 4 o más horas.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables, pueden formularse de acuerdo con el arte conocido utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanediol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer, el U.S.P. y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como disolvente o medio de suspensión. Para ello, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos, como el ácido oleico, se utilizan en la preparación de inyectables.

Las formulaciones inyectables pueden ser esterilizadas, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retenga bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden ser disueltas o dispersadas en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso. Las soluciones estériles también pueden ser liofilizadas para su uso posterior.

En algunas realizaciones, la composición que comprende colagenasa es una composición liofilizada e inyectable formulada con sacarosa, Tris a un nivel de pH de aproximadamente 8,0. Generalmente, se incluye una fuente de calcio en la formulación, como el cloruro de calcio.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes o parches. El componente activo se mezcla bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y los conservantes o tampones necesarios.

Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un polipéptido de esta invención, excipientes como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de la celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.

Los polvos y aerosoles pueden contener, además de los polipéptidos de esta invención, excipientes como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los aerosoles pueden contener además los propulsores habituales, como los clorofluorohidrocarburos.

Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar un suministro controlado de un agente activo en el cuerpo. Dichas formas de dosificación pueden realizarse disolviendo o dispensando el agente activo en el medio adecuado. También se pueden utilizar potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del polipéptido a través de la piel. La tasa puede controlarse proporcionando una membrana de control de la tasa o dispersando el polipéptido de la invención en una matriz polimérica o gel.

La administración terapéutica del producto farmacéutico puede ser por vía parenteral, tópica o a través de un depósito implantado. El término parenteral, tal como se utiliza en el presente documento, incluye las técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal. El término "administración local" se define en el presente documento para abarcar dicha inyección directa. En una realización, la administración terapéutica de la composición farmacéutica es por inyección.

La administración terapéutica del fármaco en formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica incluye ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes o parches. El componente activo se mezcla bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y los conservantes o tampones necesarios.

Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo del producto farmacéutico, excipientes como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de la celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.

Los polvos y aerosoles pueden contener, además de los compuestos del producto farmacéutico, excipientes como la lactosa, el talco, el ácido silícico, el hidróxido de aluminio, los silicatos de calcio y el polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los aerosoles pueden contener además los propulsores habituales, como los clorofluorohidrocarburos.

Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar un suministro controlado de un compuesto al cuerpo. Dichas formas de dosificación pueden realizarse disolviendo o dispensando el compuesto en el medio adecuado. También se pueden utilizar potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de velocidad o dispersando el compuesto en una matriz polimérica o un gel.

La invención se entenderá mejor en relación con los siguientes ejemplos, que pretenden ser únicamente ilustrativos y no limitantes del alcance de la invención. Diversos cambios y modificaciones a las realizaciones divulgadas serán evidentes para los expertos en la materia y tales cambios y modificaciones pueden realizarse sin apartarse del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Secuenciación del genoma de C. histolyticum y análisis de la secuencia de la toxina

La escasez de estudios científicos relacionados con las toxinas alfa, delta y épsilon (a, 8 y £) de C. histolyticum ha dado lugar a un conocimiento limitado de la estructura proteica de estas toxinas. Para subsanar este déficit de conocimientos, se emprendió una iniciativa de secuenciación del genoma para comprender mejor el organismo productor, con especial atención a la identificación de los genes putativos de las toxinas. Como consecuencia de este esfuerzo, el genoma completo de la cepa de producción de colagenasa Clostridium Histolyticum (Clon 004) (Auxilium Product Operation, Malvern, PA) ha sido generado recientemente, representando aparentemente, la primera vez que se ha reportado la secuencia del genoma de cualquier cepa de C. histolyticum.

Hubo tres pasos fundamentales involucrados en el proyecto de secuenciación del genoma. En primer lugar, se extrajo el ADN genómico de un cultivo del clon 004 y se envió a Creative Genomics para su secuenciación (Shirley, NY, EE.UU.). La secuencia del genoma de C. histolyticum Clon 004 se obtuvo utilizando procedimientos estándar de la industria. En segundo lugar, los resultados obtenidos a partir de la secuencia del genoma se analizaron mediante procedimientos bioinformáticos estándar (análisis BLAST) para consultar la información de la secuencia en las bases de datos de secuencias genómicas. Esta segunda etapa dio lugar a la asignación de información sobre las proteínas para cada gen de C. histolyticum que se identificó. El uso de dos bases de datos garantizó una evaluación exhaustiva, pero también sirvió como segunda fuente para verificar la asignación de proteínas. El tercer paso del proyecto fue un análisis comparativo de la secuencia de la toxina putativa de C. histolyticum con la proteína asignada automáticamente por el análisis BLAST.

i. Secuenciación del genoma de C. histolyticum e identificación de proteínas modelo

Las muestras de ADN genómico aisladas de una expansión de C. histolyticum (CLH) WCB derivada del clon 004 se enviaron a Creative Genomics (Shirley, NY, USA) para la secuenciación del genoma. Creative Genomics empleó los procedimientos estándar utilizados para la determinación de la secuencia de las muestras de ADN genómico enviadas por los clientes. La secuencia del genoma se generó a partir del sistema Roche/454 GS-FLX con química de titanio (secuenciación de fragmentos) acompañado del analizador de genomas Illumina/Solexa. Se empleó el ANI 3730xl para alcanzar la terminación del genoma por medio de Primer Walking. Se completó la secuencia completa del genoma, de 2.842.906 pares de bases, con un contenido de GC del 29,44 % y estos valores fueron típicos del tamaño del genoma y el contenido de GC obtenidos para otros genomas de Clostridial. A cada uno de los 2.887 marcos de lectura abierta (ORF) identificados se le asignó un número CLH único. Cada uno de los 2.887 genes putativos se investigó más a fondo utilizando el análisis BLAST de las bases de datos GenBank y SwissProt, lo que dio como resultado la asignación tentativa de los loci para las toxinas beta, gamma, alfa y épsilon. Los resultados de la evaluación inicial se presentan en la Tabla 1. Así, la asignación de proteínas modelo se completó como resultado de un análisis automatizado mediante una búsqueda exhaustiva en dos bases de datos. La asignación de proteínas del modelo no se vio influida por la interpretación del operador.

Tabla 1: Asignaciones de proteínas modelo para las posibles toxinas CLH basadas en la comparación con dos bases de datos de secuencias

Una inspección de los resultados del análisis BLAST del genoma de C. histolyticum no reveló un ORF que codificara una elastasa. Sin embargo, las proteasas han sido clasificadas por MEROPS (http://MEROPS.sanger.ac.uk/) basándose en el criterio del grupo funcional más prominente en el sitio activo de dichas proteasas. Utilizando este enfoque funcional basado en MEROPS, una elastasa entra en la familia de las peptidasas M4, de las cuales la termolisina (EC 3.4.24.27) es el miembro mejor estudiado de la familia y es el modelo clásico para este tipo de proteasas. Utilizando estos conocimientos, una nueva inspección del resultado del análisis BLAST sugirió que C. histolyticum posee un único ORF que comparte una homología significativa con la termolisina. Por lo tanto, el gen putativo de la toxina delta dentro de C. histolyticum ha sido asignado como un homólogo de la termolisina de B. proteolyticus.

Los resultados de la evaluación inicial se presentan en la Tabla 2, basada en la comparación con dos bases de datos de secuencias.

Tabla 2: Asignaciones de proteínas modelo para toxinas CLH putativas

ii. Alineaciones y análisis de secuencias de proteínas

Para identificar el péptido señal, se analizaron las secuencias de la muestra y del control en un programa denominado SignalP para identificar posibles secuencias de péptidos señal (Nielsen (2004), J. Glasgow et al., eds., Proc. Sixth Int. Conf. en Sistemas Inteligentes para la Biología Molecular, 122-130. AAAI Press, 1998). Un péptido señal suele estar situado dentro de los primeros setenta aminoácidos (o la región N-terminal) de la secuencia de la proteína y actúa como secuencia señal para que la enzima sea secretada. El péptido señal se escinde y la secuencia proteica resultante es la proteína madura. Utilizando SignalP, el usuario puede identificar la ubicación del sitio de escisión del péptido señal para identificar el N-terminal de la proteína madura. Sin embargo, en el caso de algunas secuencias de muestras, en particular la toxina alfa y la toxina beta (AUX-I), sólo se identificó la proteína madura, y no toda la secuencia proteica, incluida la secuencia del péptido señal. Un examen más detallado reveló que el procedimiento de fragmentación de la secuencia empleado separó la secuencia del péptido señal de la proteína madura. Las secuencias de la proteína madura y de la señal se volvieron a ensamblar y se procesaron mediante la herramienta de alineación.

Una vez recolectadas todas las secuencias de proteínas, se construyeron alineaciones de secuencias por pares utilizando MATLAB 7.0.10 (The MathWorks, Inc., 2010). Los alineamientos de secuencias por pares son comparaciones directas de dos secuencias para determinar las similitudes y diferencias entre dos secuencias. Ambas secuencias, la de control y la de la muestra, se cargaron en MATLAB y se realizó un alineamiento mediante el algoritmo Needleman-Wunsch y la matriz de puntuación BLOSUM50. El algoritmo y la matriz de puntuación ayudan a ensamblar la alineación, ya que el algoritmo dicta el valor de cada aminoácido coincidente o no coincidente basándose en la matriz de puntuación e incorpora los valores de las diferencias cuando es necesario. Las brechas pueden ocurrir por múltiples razones, incluyendo, pero no limitado a, dos secuencias que tienen diferentes longitudes y para asegurar que los aminoácidos apropiados sean coincidentes entre sí. La matriz de puntuación se basa en las tasas de sustitución observadas con frecuencia entre las secuencias y sirve para calificar la similitud o disimilitud entre dos secuencias (National Centerfor Biotechnology Information).

La revisión de Hatheway (1990) (Clin Microbiol Rev 3: 66-98) indicaron que las cinco toxinas eran proteínas secretadas (exosustancias) y que las cinco toxinas tenían una funcionalidad identificable. Esta información se utilizó para llevar a cabo el análisis de las supuestas toxinas CLH. Para analizar la función proteica de las supuestas toxinas CLH, se seleccionaron varias proteínas modelo basándose en los hallazgos de la literatura y en los resultados de BLAST. Los controles se descargaron del National Centerfor Biotechnology Information (NCBI) en formato Fasta.

1. Toxina alfa (a)

Escasa información relacionada con la toxina alfa de C. histolyticum tras el trabajo de Bowen (1952) (Yale J Biol Med 25:124-138) existe en la literatura. Por lo tanto, la interrogación de la secuencia del genoma en busca de genes putativos de toxinas era de interés. Un análisis preliminar del genoma sugirió que C. histolyticum poseía un único ORF que comparte una significativa homología de aminoácidos con la toxina alfa de C. septicum , tal y como determinó el análisis BLAST de dos bases de datos. Por lo tanto, el gen putativo de la toxina alfa de C. histolyticum se ha asignado como un homólogo de la toxina alfa de C. septicum . La toxina alfa de C. septicum , ampliamente estudiada por el laboratorio de Rodney K. Tweten, fue clasificada como miembro de la familia de toxinas similares a la aerolisina. En particular, la toxina alfa de C. septicum posee actividad hemolítica (Ballard et al. (1992), Infect Immun 60: 784-790 Melton-Witt et al. (2006), Biochem 45: 14347-14354) y es distinta de las hemolisinas lábiles al oxígeno descritas para la toxina £ de C. histolyticum (Hatheway (1990), Clin Microbiol Rev 3:66-98).

La toxina alfa de C. septicum se elabora como una preproteína inactiva que se procesa al medio extracelular como una protoxina inactiva. A continuación, la protoxina se une a los receptores de la membrana celular, donde son escindidos en sus estructuras activas por las proteasas (usualmente la furina). Un sitio consenso de furina dentro de la toxina es esencial para la activación por parte de las proteasas eucariotas. La activación implica la escisión de 40 45 aminoácidos del C-terminal. En ausencia de la escisión C-terminal, la toxina alfa de C. septicum no es funcional. La toxina alfa de C. septicum de longitud completa es hemolítica (Ballard et al. 1992). La toxina activa es de aproximadamente 41,3 kDa (Gordon et al. 1997). Una vez activadas, las toxinas se oligomerizan en la superficie de la célula formando un complejo preporoso seguido de la inserción de un barril beta en la membrana. El modelo de toxina alfa de C. septicum consiste en tres dominios distintos denominados: D1, D2 y D3. El dominio D1 está implicado en la unión del receptor y la oligomerización, mientras que el dominio D2 contribuye a la estructura anfipática de la horquilla. El dominio D3 tiene una región de propéptidos d 3 que incluye un péptido corto carboxilo-terminal escindido en el sitio de activación AT conocido (R398) y funciona como una chaperona intramolecular que evita la oligomerización prematura de la toxina alfa. Utilizando la mutagénesis de saturación, las sustituciones de aminoácidos individuales dentro de cada dominio han permitido determinar los residuos esenciales para la actividad biológica (Melton-Witt et al., 2006). Es importante destacar que el ensayo funcional utilizó un ensayo de viabilidad celular para determinar las dosis LD⁵⁰. Así, el efecto relativo de las sustituciones de aminoácidos individuales dentro de toda la región de codificación se evaluó mediante un ensayo funcional.

Para comprender mejor la estructura primaria de la toxina CLH alfa, se realizó la alineación de proteínas, realizada en MATLAB, de la proteína modelo (toxina C. septicum alfa) con la toxina CLH alfa. Los resultados se presentan en la FIG. 1.

La toxina alfa putativa CLH traducida tiene una secuencia señal identificable y tiene una probabilidad muy alta de ser una proteína secretada. Así, se cumple el primer criterio de una exosustancia. Existe una homología positiva del 75 % entre la secuencia de la proteína de la toxina alfa de C. septicum y la secuencia de la proteína de la toxina alfa de CLH. Se identificaron múltiples regiones de alta homología entre la toxina alfa modelo y la toxina alfa putativa de CLH. Dichas regiones y residuos de aminoácidos esenciales están resaltados en sombreado verde en la FIG. 1.

En particular, la alineación muestra múltiples diferencias en los residuos de aminoácidos esenciales que, basándose en el trabajo de Melton-Witt et al. (2006) (Biochem 45 :14347-14354), hacen que la proteína CLH_2834 y 2835 no sea funcional individualmente. Empezando por la región N-terminal de la proteína madura, falta una región de secuencia de 17 aminoácidos en la secuencia de la toxina CLH alfa, que está localizada aproximadamente 20 aminoácidos corriente abajo del sitio de escisión del péptido señal putativo. Dentro de este tramo de 17 aminoácidos, se ha identificado un residuo W74 en la toxina alfa de C. septicum como residuo crítico en el bucle 1 (L1). La falta de 17 aminoácidos del dominio D1 en la versión de la secuencia CLH sugiere una estructura alterada para este dominio en relación con el tipo salvaje y una interrupción de la funcionalidad de unión al receptor.

Dentro de la región C-terminal de la proteína, varios cambios de residuos de aminoácidos también hacen que la proteína CLH no sea funcional. El aminoácido T302 de la toxina alfa de C. septicum fue sustituido por prolina en la toxina alfa de CLH. El residuo E303 de la toxina alfa de C. septicum se sustituye por treonina en la toxina alfa de CLH. Los estudios de Melton-Witt et al. (2006) (Biochem 45: 14347-14354) indicaron que cada una de estas modificaciones dará como resultado individualmente un 0 % de letalidad. Cabe destacar la comparación del sitio de activación, o sitio de escisión de la furina, entre las dos secuencias. La toxina alfa de C. septicum presenta un sitio de escisión por consenso de furina que comienza con K391 y termina en R398. Esta región se ajusta a la secuencia de escisión de furina consensuada Arg-X-Lys/Arg-Arg, aunque la secuencia de escisión mínima es Arg-X-X-Arg. La putativa toxina alfa CLH tiene un residuo de glutamina en lugar de arginina en la posición análoga R398. Así, el sitio de activación de C. septicum posee la secuencia de aminoácidos DKKRRGKRSVDS, con R398 identificado como un residuo crítico. La secuencia homóloga de la toxina CLH alfa en el péptido D3 es NTSST-EQNVEV; empezando por N367 de la SEQ ID NO: 8. Por lo tanto, el sitio putativo de escisión de la furina de la toxina alfa de C. histolyticum parece no ser funcional, y esta proteína, aunque se exprese, no podría ser procesada por contacto con la furina proteasa de las células eucariotas para generar una toxina funcional. Los allazgos del análisis comparativo de la secuencia de aminoácidos se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Resumen de la comparación de la alineación de la secuencia de aminoácidos de la toxina putativa CLH alfa

El resumen del análisis de alineación de la secuencia sugiere que la toxina putativa CLH alfa posee un número significativo de diferencias de residuos de aminoácidos que harían que la proteína madura no fuera funcional. El vínculo fenotípico con la funcionalidad de la toxina alfa es la demostración de la actividad hemolítica. Es importante destacar que la cepa productora de colagenasa de Clostridium Histolyticum no presenta actividad hemolítica cuando se siemnbra en agar sangre. Los resultados de una evaluación hemolítica en agar sangre se ilustran en la FIG. 2.

El panel A de la FIG. 2 muestra los resultados obtenidos al cultivar una muestra de expansión celular de C. histolyticum Clone 004 en agar sangre. No hay evidencia de ningún fenotipo beta hemolítico. En cambio, el panel B de la FIG. 2 muestra los resultados obtenidos al cultivar una muestra de C. septicum en agar sangre. Hay una clara evidencia de hemólisis beta que se extiende mucho más allá de la zona de aplicación de la muestra, como se indica en el panel C. Las imágenes presentadas no representan adecuadamente la diferencia cualitativa observada cuando se ven los artículos de prueba. La aparición de la hemólisis beta es fácilmente discernible y la ausencia total de hemólisis en la placa de C. histolyticum contrasta con la amplia zona de hemólisis observada cuando se inspecciona el cultivo de C. septicum (productor de la toxina a).

2. Toxina Delta (5)

Hatheway et al. (1990) (Clin Microbiol Rev 3: 66-98) han definido la toxina 8 de C. histolyticum como una elastasa, basándose principalmente en la comunicación inicial de investigación de Takahashi, et al. (1970) (BBRC 39: 1058 1064). Al parecer, desde entonces no se han publicado más estudios sustanciales sobre esta toxina. Takahashi et al. aislaron cuatro fracciones que demostraban la actividad de la elastasa a partir de C. histolyticum mediante ultrafiltración diferencial. El enfoque primcipal estaba en una fracción que pasaba por las membranas de corte nominal de 50 kDa, pero que era retenida por las membranas de corte nominal de 10 kDa.

La termolisina es una metaloproteasa de zinc con un peso molecular de enzima madura de 34,6 kDa. Es importante destacar que la termolisina es una proteína modelo para una clase de proteínas que contienen una presecuencia empleada en la secreción (péptido señal), pero también una larga prosecuencia de aproximadamente 200 residuos de aminoácidos que tiene dos tercios del tamaño de la proteína madura. Las enzimas parecidas a la termolisina se elaboran como preproteínas inactivas, con la prosecuencia que desempeña un papel como inhibidor de la enzima madura y también como chaperona para garantizar el correcto plegado de la enzima (O'Donohue et al.(1996), JBC 271:26477-26481). La prosecuencia es eliminada autocatalíticamente por la porción enzimática madura de la molécula en el medio extracelular. Así pues, la vía de maduración de las enzimas similares a la termolisina incluye: un paso de secreción, la presencia de una forma pro-madura en la matriz extracelular, la escisión de la prosecuencia y la presencia de una enzima madura y activa.

La alineación de la secuencia del gen para la termolisina y la CLH 2576, la toxina putativa delta de C. histolyticum , se ilustra en la FIG. 3. Esta imagen muestra la secuencia de aminoácidos prepromadiuros de longitud completa como una sola unidad que se transcribe teóricamente como un solo polipéptido. Los 28 aminoácidos iniciales en el N-terminal de la termolisina se muestran yuxtapuestos a la prosecuencia sombreada en verde que termina en Ser232. La secuencia de aminoácidos maduros sin sombrear comienza con Ile233. Utilizando el programa SignalP, se predice que los polipéptidos termolisina y CLH 2576 son secretados. La toxina putativa traducida de C. histolyticum delta tiene una secuencia señal identificable y una probabilidad muy alta de ser una proteína secretada. Existe una homología positiva del 65 % entre la secuencia de la proteína termolisina y la secuencia de la proteína de la toxina delta CLH.

Para comprender la naturaleza de las formas pro y maduras de ambas proteínas, se analizaron las regiones individuales como secuencias distintas con respecto a la funcionalidad. La alineación de la prosecuencia se representa en la FIG. 4. Hay un 57 % de homología positiva entre las dos formas de prosecuencia. Una reciente revisión del análisis estructural primario de las prosecuencias de más de 100 proteasas similares a la termolisina fue realizada por Demidyuk et al. (2008) (Protein J 27: 343-354). Estos investigadores observaron que existía una considerable variabilidad en las prosecuencias, denominadas alternativamente precursores o propéptidos. Las prosecuencias eran más tolerantes a las mutaciones en comparación con las correspondientes enzimas maduras. Sin embargo, se observaron regiones que presentan un alto grado de conservación y sustituciones en residuos clave que pueden alterar drásticamente la función. Los residuos sombreados en verde en la FIG. 3 identifican aquellos residuos de aminoácidos que son críticos para que la prosecuencia funcione. No se observan diferencias entre las secuencias de termolisina y CLH_2756. Dos residuos correspondientes a Ile183 y Arg184 en la secuencia de la termolisina están sombreados en amarillo; sin embargo, las sustituciones en la secuencia de CLH_2756 son aminoácidos similares que probablemente no provocan ninguna alteración de la función.

Es importante destacar que hay una región de no-homología en el C-terminal de las prosecuencias como se ilustra por el sombreado amarillo de la secuencia CLH_2756 que comienza con Ser185. Esta región es el lugar de la autocatálisis y sugiere que la secuencia CLH 2756 no es un sustrato aceptable para la escisión por el sitio activo de la enzima madura. La criticidad de los residuos de aminoácidos alrededor del sitio de escisión fue investigada por Wetmore et al. (1994) (Mol Microbiol 12:747-759), utilizando la proteasa neutra similar a la termolisina de Bacillus cereus como enzima modelo. Estos investigadores determinaron que el procesamiento era especialmente sensible a la naturaleza del aminoácido situado tres residuos antes del sitio de escisión. Se identificó una secuencia de consenso para la secuencia alrededor del sitio de procesamiento de la proproteína y las alteraciones en los residuos clave dieron como resultado la no exportación o el no procesamiento de la proteína a una enzima madura y funcional. Las características clave de la secuencia de consenso fueron: la presencia de un residuo no polar en la posición P3 (Gly, Ala, Ile, Leu o Val), un residuo polar o Pro en la posición P1 (Pro, Ser, His, Glu) y un residuo no polar en la posición Pi'. Además, se ha demostrado que la maduración de la protermolisina se produce entre un residuo de serina e isoleucina (O'Donohue et al. (1994), Biochem J. 300: 599-603). Para explorar la alineación de la secuencia alrededor del sitio de escisión, se puede hacer una evaluación comparativa de la secuencia de los sitios de procesamiento de la proproteína para la termolisina y para la CLH_2576 por inspección. Es evidente que la secuencia de aminoácidos de la CLH_2576 en la zona de procesamiento de la proproteína no contiene la disposición de aminoácidos adecuada para permitir la autocatálisis. Cuando se realiza un ejercicio teórico para interrogar a la secuencia amino de la CLH_2576 para determinar si el sitio de procesamiento de la proproteína está razonablemente cerca del sitio predicho en base a la alineación de la secuencia, es evidente que ningún ajuste permite identificar la secuencia de aminoácidos adecuada. Desplazar los residuos del sitio 2 de procesamiento de proproteína hacia el lado C-terminal permite la disposición adecuada de los aminoácidos que no violan las reglas de Wetmore et al. Sin embargo, la regla Ser-Ile de O'Donohue et al. (1994) (Biochem J. 300: 599-603) no está presente. Así, se concluye que la forma proproteica del polipéptido CLH_2576 no es un sustrato adecuado para la autocatálisis. El efecto neto es que la enzima madura y activa no está presente en el caldo celular de C. histolyticum (Clon 004).

Para explorar las formas maduras de ambas proteínas, la alineación de la secuencia comparativa se representa en la FIG. 5. Una inspección de la alineación de la secuencia en la FIG. 5 sugiere que muchos aminoácidos esenciales se han conservado. En particular, la secuencia AHELTHAVTD que comienza con Ala140 de la SEQ ID NO: 13 ha sido identificado como un componente del sitio activo de la termolisina y la alta homología mostrada por CLH_2576 sugiere que la toxina CLH delta es un miembro de la clase de proteasas termolisina (Kooi et al. (1996), J MedMicrobiol 45:219-225 Kooi, et al., (1997), Infect Immun 65 :472-477). Se han identificado múltiples residuos sombreados en verde como esenciales para la unión o la catálisis. Una diferencia notable entre las secuencias de las dos moléculas es la región GGI que comienza con G135 en la termolisina. Este tramo de residuos de aminoácidos está muy conservado en las proteasas similares a la termolisina sin función definida asignada (Frigerio et al. (1997), Protein Eng 10:223-230.). La región correspondiente de CLH_2576 presenta varias diferencias significativas en esta secuencia. Sin embargo, el alto grado de homología general y la conservación de los residuos de aminoácidos esenciales confirman la selección de CLH_2576 como toxina delta con una masa molecular prevista de aproximadamente 35 kDa. Esta evaluación coincide con la información presentada por Takahashi et al (1970) (BBRC 39: 1058-1064).

En resumen, la toxina putativa CLH delta ha sido identificada mediante el análisis de la secuencia del genoma. Sin embargo, la interrogación de esta secuencia sugiere que la escisión de la proproteína no se producirá, haciendo que esta molécula no sea funcional. Por lo tanto, se deduce que la toxina 8, si se expresa y secreta en el derivado Clone 004 de C. histolyticum ATCC 21000, no es funcional.

3. Toxina Epsilon (z)

MacLennan et al. (1962) (Bact Rev 26:176-274) y Hatheway describieron la toxina £ de C. histolyticum como una hemolisina lábil al oxígeno, serológicamente similar a las producidas por otras cepas de Clostridium , como C. tetani, C. novyi y C. septicum. Bowen (1952) (Yale J Biol Med 25:124-138) demostró que la toxina £ se expresaba durante la fase exponencial y se degradaba durante la fase estacionaria, tal como se observaba para la actividad de la toxina a, y que era degradada de forma similar por las proteinasas in vitro.

Una inspección de los resultados del análisis BLAST del genoma de C. histolyticum identificó un ORF que codificaba una hemolisina que estaba en la misma clase que la perfringolisina y la tetanolisina, que son miembros de las proteínas activadas por tiol que forman poros con afinidad por el colesterol. Estas proteínas forman parte de una familia de citolisinas dependientes del colesterol (CDC) y todas ellas presentan secuencias proteicas distintivas y estructuras únicas. Se han identificado más de 25 proteínas CDC con secuencias proteicas completas disponibles. Las CDC son un grupo de toxinas formadoras de poros de barril p secretadas por varias especies de bacterias Gram positivas, todas ellas en el rango de peso molecular de 50-60 kDa. La CDC prototípica es la perfringolisina, que sirve de proteína modelo para todas las CDC (Heuck et al. 2007, JBC 282: 22629-22637). La organización típica de una CDC incluye una secuencia de señal escindible para facilitar la exportación al medio extracelular como proteína monomérica soluble en agua. Posteriormente, la forma monomérica plegada se une a una membrana eucariótica objetivo, mediada por la unión del colesterol, y luego se oligomeriza en la superficie de la membrana para formar arcos y estructuras anulares que son responsables de la citolisis. Las CDC también se conocen como citolisinas activadas por tiol y fueron descritas originalmente como hemolisinas (Billington et al., 2000).

La alineación de la secuencia del gen para la perfringolisina y la CLH_1920, la toxina putativa épsilon, se ilustra en la FIG. 6. Esta imagen muestra la secuencia de la proteína de longitud completa (pre más madura) como una sola unidad que se transcribe teóricamente como un solo polipéptido. Los 29 aminoácidos iniciales en el N-terminal de la perfringolisina se ilustran con una estrella azul sobre la Lys 29 en el lugar de escisión de la peptidasa señal. El análisis SignalP de la secuencia de CLH_1920 no identificó un sitio de escisión del péptido señal reconocible y se predijo que era una proteína no secretada. Existe una homología positiva del 84 % entre la secuencia de la proteína perfringolisina y la secuencia de la proteína putativa de la toxina épsilon CLH_1920.

Los residuos de aminoácidos sombreados en verde denotan aminoácidos esenciales que se conservan entre las dos proteínas. Es importante destacar que la secuencia de 11 aminoácidos ECTGLAWEWWr , que comienza con el ácido glutámico 458 de la SEQ ID NO: 15, es una región esencial que se denomina secuencia undecapéptida. Junto con el alto grado de homología dentro de la secuencia designada como región de la proteína madura, esta secuencia de undecapéptidos sirve para identificar la proteína CLH_1920 como una CDC. Por lo tanto, se espera que la proteína CLH_1920, si se elabora como una proteína secretada, tenga una funcionalidad hemolítica. Una única región de nohomología entre las dos proteínas está resaltada en sombreado amarillo. Es importante destacar que se ha demostrado que el extremo C de las CDC es crítico para la unión del colesterol (Shimada et al., 1999, JBC 274: 18536 18542). El proceso de hemólisis por parte de las CDC implica dos pasos críticos antes de la formación de los poros: la unión y la inserción en la membrana. Shimada, et al. (1999) (JBC 274: 18536-18542) demostraron que modestos cambios en el C-terminal afectaban al paso de unión. Una alteración de los aminoácidos terminales 3' reduce severamente la unión del colesterol, medida por un procedimiento ELISA. La correspondiente actividad hemolítica sobre los glóbulos rojos se redujo o eliminó de forma coordinada en función de la gravedad del cambio del aminoácido C-terminal. Una inspección del C-terminal de la secuencia de CLH_1920 muestra algunas diferencias significativas en comparación con la secuencia de la perfringolisina.

Como se resume en la Tabla 4, la actividad hemolítica de la toxina putativa de C. histolyticum epsilon puede estar ausente debido a dos características de la secuencia teórica de aminoácidos. En primer lugar, se prevé que la molécula no sea secretada; por lo tanto, la molécula no estaría disponible para la interacción con las células objetivo. En segundo lugar, el C-terminal de la proteína CLH_1920 no posee una región homóloga para la unión del colesterol, lo que sugiere que un elemento importante asociado a la hemólisis puede ser defectuoso.

Tabla 4: Resumen de la comparación de la alineación de la secuencia de aminoácidos de la toxina putativa CLH épsilon

Los estudios de toxicidad no clínicos no demostraron indicios clínicos ni morfológicos de efectos de la hemolisina in vivo. Los datos generados por la administración local e intravenosa en bolo apoyan la ausencia de toxinas hemolíticas como la toxina £.

La ausencia de toxinas hemolíticas puede verificarse mediante el chapado del material de prueba en agar sangre, que se realiza rutinariamente al final de cada fermentación de C. histolyticum Clone 004, lo que también confirma la ausencia de crecimiento extraño. La expresión de las toxinas hemolíticas da lugar a la lisis de las células sanguíneas y, por tanto, a la formación de distintos halos alrededor de las colonias que producen hemolisinas. La cepa productora de colagenasa C. histolyticum no produce halos o zonas de limpieza (ver FIG. 2) que apoyen la ausencia de la toxina £ y de cualquier otra entidad hemolítica en la cepa de producción. Para verificar la función hemolítica de un CDC, se aplicó la tetanolisina disponible en el mercado al agar sangre para imitar la prueba de chapado de rutina. Los resultados se ilustran en la FIG. 7 que muestra el fenotipo beta hemolítico observado cuando se aplican 10 jcL de una solución de 10 |jg/mL de tetanolisina en solución salina tamponada con fosfato a la superficie del agar sangre, y luego se incuba durante 24 horas a 37 °C. Por lo tanto, si un CDC funcional estuviera presente en el material de prueba, debería observarse el fenotipo beta hemolítico.

4. Clostripain o gamma (Y)-toxina

La toxina gamma de C. histolyticum ha sido descrita como clostripain, una endopeptidasa de cisteína (EC 3.4.22.8). Dargatz, et al. (1993) (Mol Gen Genet 240:140-145) clonó y secuenció el gen de C. histolyticum para la clostripina y esta información se depositó en el GenBank con el número de acceso X63673 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X63673.1). Para comprender la estructura primaria de la toxina gamma CLH_1861, se realizó la alineación de la secuencia proteica de MATLAB de la proteína modelofclostripain deC. histolyticum ) con la secuencia teórica de la toxina gamma CLH_1861. Los resultados se presentan en la FIG. 8.

Una inspección de la FIG. 8 muestra un grado muy alto de homología (99 %) entre el modelo de clostripain y la secuencia obtenida del análisis del genoma. De hecho, sólo hay 3 diferencias de aminoácidos, ninguno de los cuales son residuos identificados como esenciales para la actividad. Los aminoácidos críticos identificados en estudios bibliográficos como esenciales para la funcionalidad se muestran sombreados en verde. El análisis SignalP de ambas proteínas indicó que la alta puntuación de secreción y el sitio de escisión de la señal representado con una estrella azul (Labrou et al. (2004). Eur J Biochem 271 :983-992). Así, se podría predecir que la molécula CLH_1861 sería secretada y funcional. Se realizó un análisis de clostripain residual como parte de la liberación rutinaria.

El análisis de clostripain apoya los méritos del enfoque de alineación de secuencias para las toxinas de C. histolyticum en general. Se podría predecir que la presencia de un gen de toxina funcional se traduciría necesariamente en una secuencia de aminoácidos que compartiera un alto grado de homología con una proteína modelo conocida. Además, la conservación de los residuos de aminoácidos esenciales también sería una característica de un gen de toxina funcional.

La información obtenida del análisis de la secuencia del genoma proporcionó pruebas de la presencia de loci para las toxinas putativas alfa, delta y épsilon. El análisis posterior de la estructura primaria teórica de cada toxina indicó que se predijeron formas no funcionales de cada toxina como consecuencia de defectos clave en la secuencia de aminoácidos de cada toxina. En particular, las toxinas alfa y épsilon pueden asignarse como homólogas a dos clases de moléculas hemolíticas formadoras de poros. Al final de la fermentación, las muestras de cada lote se siembran en agar sangre como parte de una prueba rutinaria de pureza. La ausencia de halos o zonas de limpieza alrededor de las colonias confirma la ausencia de actividad hemolítica en el cultivo y la fermentación. Por consiguiente, la ausencia de halos hemolíticos alrededor del final de las muestras de fermentación demuestra la ausencia de las toxinas a y £ de forma continuada.

La tabla 5 muestra los resultados del análisis de la secuencia y la funcionalidad prevista. Los resultados confirman por qué el clon 004 ha mostrado funcionalmente la ausencia de toxicidad y la falta de actividad hemolítica.

Tabla 5: Resumen - Estado previsto de las exosustancias del clon 4 de C. histolyticum

5. Análisis de la secuencia de C. histolyticum de las toxinas beta (colagenasa I y colagenasa II)

El análisis de la secuencia de los loci putativos de la toxina beta de C. histolyticum se presenta en las FIGs. 9 y 10. Como se muestra en la FIG. 9, la secuencia de aminoácidos de la colagenasa I madura del clon 004 (CLH 1768 y 1769; SEQ ID NO: 3) difiere de la secuencia colG traducida (SEQ ID NO: 19) portres aminoácidos. La FIG. 10 muestra que la secuencia de aminoácidos de la colagenasa II madura del clon 004 (CLH_2116; SEQ ID NO: 4) difiere de la secuencia colH traducida (SEQ ID NO: 20) por ocho aminoácidos. Ambas colagenasas son totalmente funcionales.

La literatura científica y de patentes a la que se hace referencia en el presente documento establece los conocimientos disponibles para los expertos en la materia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende: a) un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2 o el complemento de la SEQ ID NO: 2, y b) una secuencia reguladora heteróloga unida operativamente al polinucleótido.

2. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en la que la secuencia reguladora heteróloga es un promotor heterólogo unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2 o al complemento de la SEQ ID NO: 2.

3. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en la que la molécula de ácido nucleico recombinante está fusionada a una secuencia marcadora.

4. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 3, en la que la secuencia marcadora codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: una proteína de fusión de la glutatión-S-transferasa (GST), un polipéptido marcador de la hemaglutina A (HA) de la gripe y un péptido de hexa-histidina.

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquier reivindicación anterior.

6. El vector de la reivindicación 5, en el que el vector es un plásmido.

7. Una célula huésped recombinante que comprende el vector de la reivindicación 5 o la reivindicación 6.

8. La célula huésped recombinante de la reivindicación 7, en la que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de insecto, una célula vegetal y una célula de mamífero.

9. La célula huésped recombinante de la reivindicación 8, en la que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Streptomyces, Pseudomonas, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, una célula de levadura, células vegetales, timocitos, célula de ovario de hámster chino (CHO), célula COS y Lactococcus lactis.

10. Un procedimiento de producción de colagenasa II que comprende cultivar la célula de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9 bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico y recuperar la colagenasa II.

11. Un polipéptido recombinante codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

12. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y el polipéptido recombinante de la reivindicación 11.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un paciente que padece una afección mediada por el colágeno.

14. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 13, en la que la afección se selecciona del grupo que consiste en la contractura de Dupuytren, la enfermedad de Peyronie, la capsulitis adhesiva, la epicondilitis lateral, el síndrome del túnel carpiano, la celulitis y el lipoma.