JP2022023041A - クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法 - Google Patents

クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022023041A
JP2022023041A JP2021150945A JP2021150945A JP2022023041A JP 2022023041 A JP2022023041 A JP 2022023041A JP 2021150945 A JP2021150945 A JP 2021150945A JP 2021150945 A JP2021150945 A JP 2021150945A JP 2022023041 A JP2022023041 A JP 2022023041A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
collagenase
sequence
toxin
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2021150945A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7354197B2 (ja
Inventor
ハーバー，ウェイン，ケー．
K Herber Wayne
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Auxilium International Holdings Inc
Original Assignee
Auxilium International Holdings Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Auxilium International Holdings Inc filed Critical Auxilium International Holdings Inc
Publication of JP2022023041A publication Critical patent/JP2022023041A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7354197B2 publication Critical patent/JP7354197B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24003—Microbial collagenase (3.4.24.3)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96402—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from non-mammals
    • G01N2333/96405—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from non-mammals in general
    • G01N2333/96408—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from non-mammals in general with EC number
    • G01N2333/96419—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

Figure 2022023041000001
【課題】コラゲナーゼＩＩをコードする組み換え核酸、及びポリペプチド、これを調製するための方法およびその使用のための方法の提供。
【解決手段】特定のヌクレオチド配列またはヌクレオチドの相補体を含む組み換え核酸分子、及び、組み換え核酸を含むベクターを含む組み換え宿主細胞を、組み換え核酸の発現に適切な条件下で培養することと、コラゲナーゼＩＩを回収することと、を含む成熟コラゲナーゼＩＩを産生する方法。
【選択図】図１８Ｂ

Description

関連出願
本願は、２０１２年１月１２日提出の米国特許仮出願第６１／５８５，９０９号の優先権を主張する。上記で示される願書の全内容は本明細書中で参照により組み込まれる。
コラーゲンは、哺乳類生物の主要な構造的要素であり、動物身体の皮膚および他の部分の総タンパク質含量の大分部を構成する。ヒトにおいて、これは、創傷治癒過程および自然の加齢の過程において特に重要である。熱傷、外科手術および感染を含む様々な皮膚外傷は、コラーゲンに富み、プロテオグリカン含量が高い繊維組織の蓄積を特徴とする。損傷を受け、破壊された正常組織の置き換えに加えて、過剰で外見を損なう新しい組織の沈着が治癒過程中に形成されることがある。過剰なコラーゲン沈着は、コラーゲン合成とコラーゲン分解との間の均衡の乱れに起因する。
過剰なコラーゲン沈着およびコラーゲンに富む繊維組織の不規則な蓄積が付随する疾患および状態は、「コラーゲン介在疾患」と呼ばれ得る。特異的なコラーゲン消化能を有する酵素であるコラゲナーゼは、例えば、デュプイトラン拘縮、ペイロニー病、脂肪腫および癒着性関節包炎を含む様々なコラーゲン介在疾患を処置するために使用されてきた。参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６，０８６，８７２号および同第５，５８９，１７１号は、デュピュイトラン病の処置におけるコラゲナーゼ調製物の使用を開示する。参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６，０２２，５３９号は、ペイロニー病の処置におけるコラゲナーゼ調製物の使用を開示する。参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６，９５８，１５０号および同第７，８４２，６７３号は、脂肪腫の処置のためのコラゲナーゼの使用を開示する。参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２０４４８Ａ１号は、癒着性関節包炎の処置におけるコラゲナーゼの使用を開示する。治療における使用のためのコラゲナーゼは、哺乳動物、真菌および細菌性供給源を含む、様々な供給源から得られ得る。粗コラゲナーゼのある一般的な供給源は、細菌性発酵過程、具体的にはクロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）（Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ））の発酵からのものである。Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）から得られた粗コラゲナーゼは、多くのクロマトグラフィー技術の何れかを用いて精製され得る。
細菌発酵のある１つの欠点は、治療用組成物中に存在する場合、患者の健康に有害である様々な毒素が産生されることである。例えば、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）発酵の結果、溶血性毒素αおよびεの合成が起こり、これにより赤血球細胞の溶解（溶血）が引き起こされ得、溶血クリーゼおよび溶血性貧血に至る可能性がある。溶血クリーゼは、正常な赤血球細胞レベルを再確立するのに十分に迅速に赤血球細胞を身体が補給できないことと合わせて、多数の赤血球細胞の急速な破壊があるときに起こる。溶血クリーゼは、急性（およびしばしば重篤な）溶血性貧血を引き起こし、その結果、倦怠感、息切れ、目まい、頭痛、手足の冷感、青白い皮膚、胸痛、黄疸、上腹部痛、下腿潰瘍および疼痛、輸血に対する激しい反応、不整脈，心肥大および心不全が起こり得る。治療用コラゲナーゼ調製物が、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）発酵中に発現され得る溶血性毒素を含有しないことを確実にするために、患者への投与前に医薬品に出荷許可を与えるための方法が与えられる。
上記で論じられるとおり、治療での使用のためのコラゲナーゼは、細菌性供給源などの様々な供給源から得られ得る（例えばＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の発酵から）。組み換え型のコラゲナーゼ酵素など、コラゲナーゼのさらなる供給源を開発することは有用であろう。
いくつかの態様において、本発明は、機能性コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩをコードする突然変異ポリヌクレオチド配列の発見に基づく。したがって、本発明は、新規ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含む組み換え核酸およびポリペプチドならびにこれを使用するための方法を包含する。本発明はまた、コラゲナーゼの患者への治療的投与前に、コラゲナーゼを産生する細菌性産生株による溶血性毒素の分泌を検出するための方法および、コラゲナーゼ組成物中の溶血性毒素の存在を検出するための方法も提供する。
ある実施形態において、本発明は、配列番号１（コラゲナーゼＩヌクレオチド配列）または配列番号１の相補体の配列を有するポリヌクレオチドを含む組み換え核酸分子を対象とする。ある一定の態様において、本組み換え核酸は、このポリヌクレオチドに操作可能に連結される異種制御配列をさらに含む。ある一定のさらなる実施形態において、本発明は、配列番号１のポリヌクレオチドからなる組み換え核酸分子である。またさらなる態様において、本発明は、配列番号１のポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドに操作可能に連結される異種制御配列からなる組み換え核酸分子に関する。
別の実施形態において、本発明は、配列番号２の配列（コラゲナーゼＩＩヌクレオチド配列）または配列番号２の相補体を有するポリヌクレオチドを含む組み換え核酸分子である。ある一定の態様において、本組み換え核酸は、このポリヌクレオチドに操作可能に連結される異種プロモーターをさらに含む。ある一定のさらなる実施形態において、本発明は、配列番号２のポリヌクレオチドからなる組み換え核酸分子である。またさらなる態様において、本発明は、配列番号２のポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドに操作可能に連結される異種制御配列からなる組み換え核酸分子に関する。
本発明はまた、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリヌクレオチドを含む組み換え核酸によりコードされる組み換えポリペプチドも含む。
ある一定のさらなる実施形態において、本発明は、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリヌクレオチドを含む組み換え核酸を含む発現カセットを対象とする。
またさらなる実施形態において、本発明は、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリヌクレオチドを含む組み換え核酸を含むベクターを対象とする。いくつかの実施形態において、ベクターはプラスミドである。
さらなる態様において、本発明は、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドを含む組み換え宿主細胞を対象とする。本発明はまた、その核酸の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、コラゲナーゼＩまたはコラゲナーゼＩＩを回収することを含む、コラゲナーゼＩまたはコラゲナーゼＩＩを産生する方法も包含する。本発明はまた、組み換え宿主細胞を培養することによって産生されるコラゲナーゼ酵素も含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含む組み換え産生コラゲナーゼＩ、配列番号４のアミノ酸配列を含む組み換え産生コラゲナーゼＩＩ、配列番号５のアミノ酸配列を含む組み換え産生コラゲナーゼＩまたは配列番号６のアミノ酸配列を含む組み換え産生コラゲナーゼＩＩを対象とする。
本発明において、本明細書中に記載のようなコラゲナーゼＩ、本明細書中に記載のようなコラゲナーゼＩＩまたはそれらの組み合わせを含む医薬組成物も含まれる。ある一定の態様において、本発明は、医薬的に許容可能な担体と、配列番号３のアミノ配列を含むポリペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの組み合わせと、を含む医薬組成物を対象とする。ある一定のさらなる態様において、本発明は、医薬的に許容可能な担体と、配列番号５のアミノ配列を含むポリペプチド、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの組み合わせと、を含む医薬組成物を対象とする。本発明は、さらに、有効量のコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩまたはそれらの組み合わせを投与することを含む、コラーゲン介在疾患を処置する方法を含む。
上記で論じられるように、本発明は、細菌性産生株による溶血性毒素の分泌を検出するための方法およびコラゲナーゼ組成物中の溶血性毒素の存在を検出するための方法を包含する。
本発明のある実施形態において、コラゲナーゼを産生する細菌株は、溶血アッセイを用いた溶血性毒素の産生に対して試験される。ある態様において、溶血アッセイは血液寒天基質を用いて行われる。
別の実施形態において、溶血アッセイを用いて、溶血性毒素の存在についてコラゲナーゼ産物を試験する。ある一定の態様において、血液寒天基質を用いて溶血アッセイが行われる。さらなる態様において、溶血アッセイは、放出されるヘモグロビンの光度検出を用いて行われる。溶血アッセイまたは光度検出によって測定した場合に溶血性毒素が存在しないことは、治療的投与のための医薬品の出荷許可を裏付ける。
治療的投与に対するコラゲナーゼ医薬品の出荷許可の裏付けとして、本発明の方法に従い、溶血性活性について、コラゲナーゼ産生細菌の様々な株をアッセイし得る。例えば、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アクチノマヅラ属（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテリオデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）およびビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）を、治療的投与のためのコラゲナーゼ医薬品の出荷許可の裏付けとして、本発明の方法に従い溶血性活性についてアッセイし得る。
別の実施形態において、治療的投与のためのコラゲナーゼ医薬品の出荷許可の裏付けとして、本発明の方法に従い、コラゲナーゼ産生細菌株により産生され、そこから精製されるコラゲナーゼ産物を溶血性活性についてアッセイする。いくつかの実施形態において、上記で列挙されるがそれらに限定されない属から産生株を選択する。本発明の別の態様において、産生株は、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの組み換え型で形質転換されているＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形態を含む、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株である。本発明のある一定の態様において、産生株は、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）株である。さらなる態様において、産生株はＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）株である。
本発明のまた別の実施形態において、本発明の方法に従い、精製Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの組み合わせを含むコラゲナーゼ組成物を溶血性活性についてアッセイする。さらなる実施形態において、本発明は、本発明の方法に従い、機能性の分泌性溶血性毒素がないことについて細菌性産生株を試験することを含む、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）コラゲナーゼＩおよびＩＩからなる医薬品を産生する方法である。
また別の実施形態において、本発明は、ろ過およびカラムクロマトグラフィーによって組成物を精製し、続いて本明細書中に記載の方法に従い溶血性毒素がないことを確認することを含む、粗コラゲナーゼ組成物を精製する方法である。
さらなる実施形態において、本発明は、コラーゲン介在状態の処置を必要とする患者においてコラーゲン介在状態を処置する方法であって、コラゲナーゼを含む有効量の医薬品をその患者に投与することを含み、患者へのその医薬品の、および／または医薬組成物中のコラゲナーゼの製剤の投与前に、本発明の方法に従い、この医薬品中またはそのコラゲナーゼを産生する細菌性産生株中に溶血性毒素がないことを確認する方法である。
試料中の溶血性毒素の有無について試験するためのキットも記載される。
添付の図面（同種の参照文字が様々な図を通じて同じ部分を指す。）で示されるような次の本発明の好ましい実施形態のさらに具体的な記載から、本発明の前述および他の目的、特性および長所が明らかとなろう。この図面は必ずしも縮尺比に従って縮小されておらず、代わりに、本発明の原理を説明ことに重点を置く。
図１は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿２８３４および２８３５の推定α毒素とのクロストリジウム・セプチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素タンパク質アラインメントを示す。Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素アミノ酸配列（配列番号７）は、各列の上部の配列である。Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿２８３４および２８３５（配列番号８）は、各列の下部の配列である。下線と影付きの配列は、成熟Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素のＮ末端である。アミノ酸の上の星印は、機能性に重要な非保存的な必須の残基を示す（配列中のミスマッチを識別）。陰影付きは、保存的な必須残基を示す（同一性を確認）。配列の付番は、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）配列に基づく。 図２は、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）の血液寒天のプレーティングを示す。矢印は、β溶血性活性を示す。 図３は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿２５７６の推定δ毒素とのバチルス・プロテオリティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）サーモリシンのアミノ酸アラインメントを示す。各列の上部の配列は、バチルス・プロテオリティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（Ｂ．プロテオリティクス（Ｂ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ））サーモリシンタンパク質の配列（配列番号９）を示す。各列の下部の配列は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿２５７６の配列（配列番号１０）である。緑色の陰影は、前駆タンパク質領域を示す。付番は、サーモリシン配列に基づく。 図４は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿２５７６の推定δ毒素との、Ｂ．プロテオリティクス（Ｂ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）サーモリシンのプロ配列アミノ酸アラインメントを示す。各列の上部の配列は、Ｂ．プロテオリティクス（Ｂ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）サーモリシンタンパク質（配列番号１１）のプロ配列である。各列の下部の配列は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿２５７６のプロ配列（配列番号１２）である。アミノ酸の上の星印は、機能性に重要な非保存的な必須の残基を示す（配列中のミスマッチを識別）。緑色の陰影は、保存的な必須残基を示す（同一性を確認）。付番は、サーモリシン配列に基づく。 図５は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿２５７６の推定δ毒素とのＢ．プロテオリティクス（Ｂ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）サーモリシンの成熟配列タンパク質アラインメントを示す。各列の上部の配列は、Ｂ．プロテオリティクス（Ｂ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）サーモリシンの成熟配列（配列番号１３）である。各列の下部の配列は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿２５７６（配列番号１４）である。アミノ酸の上の星印は、機能性に重要な非保存的な必須残基である（配列中のミスマッチを識別）。緑色の陰影は、保存的な必須残基を示す（同一性を確認）。付番は、サーモリシン配列に基づく。 図６は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿１９２０の推定ε毒素との、Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）パーフリンゴリジンのタンパク質アラインメントを示す。各列の上部の配列は、Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）パーフリンゴリジンアミノ酸配列（配列番号１５）である。各列の下部の配列は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿１９２０のアミノ酸配列（配列番号１６）である。青い星印は、パーフリンゴリジンＫ４３のシグナルぺプチダーゼ切断部位を示す。アミノ酸の上の星印は、機能性に重要な非保存的な必須残基である（配列中のミスマッチを識別）。緑色の陰影は、保存的な必須残基を示す（同一性を確認）。付番は、パーフリンゴリジン配列に基づく。 図７は、テタノリシンのβ溶血性表現型を示す。 図８は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿１８６１の推定γ毒素との、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クロストリパインのタンパク質アラインメントを示す。各列の上部の配列は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クロストリパインアミノ酸配列（配列番号１７）である。各列の下部の配列は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＣＬＨ＿１９２０アミノ酸配列（配列番号１８）である。アミノ酸の上の星印は、機能性に重要な非保存的な必須の残基を示す（配列中のミスマッチを識別）。緑色の陰影は、保存的な必須の残基を示す（同一性を確認）。付番は、クロストリパインＸ６３６７３配列に基づく。 図９は、ｃｏｌＧからの翻訳アミノ酸配列および配列番号３のアミノ酸配列のアラインメント比較を示す（ＣＬＨ＿１７６８および１７６９からの翻訳アミノ酸配列；上部の配列）。図９で示されるように、配列番号３のアミノ酸配列によりコードされる成熟タンパク質は、ｃｏｌＧアミノ酸配列からの翻訳アミノ酸配列と３個のアミノ酸が異なる。成熟タンパク質のＮ末端は、配列番号３の配列のＩｌｅ１１９で始まる。配列番号３のＩｌｅ１１９で始まる成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５である。 図９は、ｃｏｌＧからの翻訳アミノ酸配列および配列番号３のアミノ酸配列のアラインメント比較を示す（ＣＬＨ＿１７６８および１７６９からの翻訳アミノ酸配列；上部の配列）。図９で示されるように、配列番号３のアミノ酸配列によりコードされる成熟タンパク質は、ｃｏｌＧアミノ酸配列からの翻訳アミノ酸配列と３個のアミノ酸が異なる。成熟タンパク質のＮ末端は、配列番号３の配列のＩｌｅ１１９で始まる。配列番号３のＩｌｅ１１９で始まる成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５である。 図１０は、ｃｏｌＨからの翻訳アミノ酸配列および配列番号４のアラインメント比較を示す（ＣＬＨ＿２１１６からの翻訳アミノ酸配列；下部の配列）。図１０で示されるように、配列番号４のアミノ酸配列によりコードされる成熟タンパク質は、翻訳ｃｏｌＧアミノ酸配列と８個のアミノ酸が異なる。成熟タンパク質のＮ末端は、ｃｏｌＧおよび配列番号４のＡｌａ３１で始まる。配列番号４のＡｌａ３１で始まる成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６である。 図１０は、ｃｏｌＨからの翻訳アミノ酸配列および配列番号４のアラインメント比較を示す（ＣＬＨ＿２１１６からの翻訳アミノ酸配列；下部の配列）。図１０で示されるように、配列番号４のアミノ酸配列によりコードされる成熟タンパク質は、翻訳ｃｏｌＧアミノ酸配列と８個のアミノ酸が異なる。成熟タンパク質のＮ末端は、ｃｏｌＧおよび配列番号４のＡｌａ３１で始まる。配列番号４のＡｌａ３１で始まる成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６である。 図１１は、配列番号１のヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿１７６８および１７６９；コラゲナーゼＩ）。 図１１は、配列番号１のヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿１７６８および１７６９；コラゲナーゼＩ）。 図１２は、配列番号２のヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿２１１６；コラゲナーゼＩＩ）。 図１２は、配列番号２のヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿２１１６；コラゲナーゼＩＩ）。 図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ、配列番号８および配列番号２１のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿２８３５およびＣＬＨ＿２８３４；α毒素）。 図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ、配列番号８および配列番号２１のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿２８３５およびＣＬＨ＿２８３４；α毒素）。 図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれ、配列番号１０および配列番号２２のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿２５７６；δ毒素）。 図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれ、配列番号１０および配列番号２２のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿２５７６；δ毒素）。 図１５Ａおよび１５Ｂは、それぞれ、配列番号１６および配列番号２３のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿１９２０；ε毒素）。 図１５Ａおよび１５Ｂは、それぞれ、配列番号１６および配列番号２３のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿１９２０；ε毒素）。 図１６Ａおよび１６Ｂは、それぞれ、配列番号１８および配列番号２４のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿１８６１；γ毒素）。 図１６Ａおよび１６Ｂは、それぞれ、配列番号１８および配列番号２４のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す（ＣＬＨ＿１８６１；γ毒素）。 図１７Ａは、配列番号３のアミノ酸配列を示す（ｃｏｌＧ）。 図１７Ｂは、配列番号５のアミノ酸配列を示す。 図１８Ａは、配列番号４のアミノ酸配列を示す（ｃｏｌＨ）。 図１８Ｂは、配列番号６のアミノ酸配列を示す。
本発明の好ましい実施形態の説明は次のとおりである。
「ａ」または「ａｎ」という語は、別段の断りがない限り、１以上を包含するものとする。例えば「ヘモロイティック毒素（ｈｅｍｏｌｏｙｔｉｃ ｔｏｘｉｎ）」は、１以上の溶血性毒素を指す。
本発明の実施は、別段の断りがない限り、当技術分野の技術の範囲内にある、細胞培養、分子生物学、微生物学、細胞生物学および免疫学の従来の技術を用いる。このような技術は、文献中で詳細に説明されている。例えば、本明細書中で参照により明確にその内容が組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５），”Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ｓｅｖｅｒａｌ ｖｏｌｕｍｅｓ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｓｅｖｅｒａｌ ｖｏｌｕｍｅｓ）およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｓｅｖｅｒａｌ ｖｏｌｕｍｅｓ）を参照のこと。
Ａ．組み換え核酸およびタンパク質
コラゲナーゼの主要な供給源は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の発酵由来である。Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む注射用製剤は、商品名ＸＩＡＦＬＥＸ（登録商標）のもと販売されており、デュプイトラン拘縮の処置に対してＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎにより承認されている。それぞれｃｏｌＧおよびｃｏｌＨ遺伝子によりコードされるコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩに対するアミノ酸配列は、文献に記載されている。例えば、ｃｏｌＧは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８７２１５およびＭａｔｓｕｓｈｉｔａら（１９９９）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８１（３）：９２３－９３３に記載されており、ｃｏｌＨは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ２９９８１およびＹｏｓｈｉｈａｒａら（１９９４）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７６（２１）：６４８９－６４９６（これらのそれぞれの内容が、本明細書中で参照により明確に組み込まれる。）に記載されている。本発明は、機能性コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを産生し、分泌するＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）株（実施例中、下記のクローン００４）においてコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩをコードする遺伝子の配列決定分析に一部基づく。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８７１２５およびＤ２９９８１）に対する文献記載配列とは異なることが分かっている（配列番号１９および２０）（図９および１０）。
コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、メタロプロテアーゼであり、それらの活性には堅く結合する亜鉛および緩く結合するカルシウムが必要である（Ｅｄｄｉｅ Ｌ．ＡｎｇｌｅｔｏｎおよびＨ．Ｅ．Ｖａｎ Ｗａｒｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８，２７，７４０６－７４１２）。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、全タイプのコラーゲンに対して幅広い特異性を有する（Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ，Ｄ；Ｂｏｎｄ，ＭおよびＶａｎ Ｗａｒｔ，Ｈ；（１９８５），ＪＢＣ，２６０ ｐ２７７１－２７７６）。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、生理的条件下でコラーゲンの三重らせん領域を加水分解することによってコラーゲンを消化する（Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ，Ｄ；Ｂｏｎｄ，ＭおよびＶａｎ Ｗａｒｔ，Ｈ；（１９８５），ＪＢＣ，２６０ ｐ２７７１－２７７６）。各コラゲナーゼが異なる特異性を示す（例えば、それぞれが、切断に対して異なる好ましいアミノ配列を有する）としても、一緒に、それらは、コラーゲンに対して相乗的活性を有する（Ｍａｎｄｌ，Ｉ．，（１９６４），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３：ｐ．１７３７－１７４１；Ｖｏｓ－Ｓｃｈｅｐｅｒｋｅｕｔｅｒ，ＧＨ（１９９７），Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６：ｐ．４０３－４１２）。
本発明は、配列番号１のポリヌクレオチドまたは配列番号１の相補体を含むかまたはそれからなる組み換え核酸分子を包含する。ある一定の態様において、本組み換え核酸は、このポリヌクレオチドに操作可能に連結される異種制御配列をさらに含む。本発明は、配列番号２のポリヌクレオチドまたは配列番号２の相補体を含むかまたはそれからなる組み換え核酸分子をさらに包含する。ある一定の態様において、本組み換え核酸は、このポリヌクレオチドに操作可能に連結される異種プロモーターをさらに含む。
本発明はまた、本明細書中に記載の組み換え核酸によりコードされる組み換えポリペプチドも包含する。いくつかの態様において、本組み換えポリペプチドは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる組み換え核酸によりコードされる。いくつかの実施形態において、本組み換えポリペプチドは、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、本組み換えポリペプチドは、配列番号５（図９の配列番号３のＩｌｅ１１９で始まる成熟コラゲナーゼＩタンパク質）または配列番号６（図１０の配列番号４のＡｌａ３１で始まる成熟コラゲナーゼＩＩタンパク質）のアミノ酸配列を含む。また別の実施形態において、本組み換えポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる。
また別の実施形態において、本発明は、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドをコードする組み換え核酸を対象とする。さらなる実施形態において、本発明は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドをコードする組み換え核酸を対象とする。さらなる態様において、本組み換え核酸は、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
組み換え核酸は、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１または配列番号２のポリヌクレオチド配列）に加えて、さらなる異種コードまたは非コードヌクレオチド配列を含有する核酸分子である。「異種」という用語は、ポリヌクレオチドが、異なる種由来であるか、または、同じ種由来であるが、その添加されるヌクレオチド配列とは別のゲノム位置からのものであることを意味する。組み換えポリペプチドまたはタンパク質とは、組み換え技術を用いて産生されるポリペプチドまたはタンパク質、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性核酸コンストラクトにより形質転換された細胞から産生されるタンパク質またはポリペプチドを指す。
本発明はまた、制御配列に操作可能に連結されている、配列番号１または配列番号２のポリヌクレオチド配列を含む核酸に関する。本発明は、さらに、制御配列に操作可能に連結されている、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に関する。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を支配するおよび／またはある一定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を支配する制御配列（例えば、組織特異的な制御配列）を含む。制御配列の非限定例は、プロモーターおよびエンハンサーである。制御配列はまた、他の発現調節エレメント、例えばＧｏｅｄｄｅｉ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（この内容は、本明細書中で参照により明確に組み込まれる。）に記載のもの、も含む。核酸は、その核酸分子が、その核酸配列の発現を可能とするように制御配列に連結される場合、制御配列に「操作可能に連結される」。
本明細書中に記載の核酸分子は、マーカー配列、例えばポリペプチドの単離または精製を支援するためのポリペプチドをコードする配列にさらに融合させ得る。このような配列としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質をコードするもの、インフルエンザからのヘマグルチニンＡ（ＨＡ）ポリペプチドマーカーをコードするものおよびヘキサヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグなどをコードするものが挙げられるがこれらに限定されない。ある一定の態様において、本発明は、マーカーアミノ酸配列に融合される、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを対象とする。
さらなる態様において、本発明は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列の変異体である核酸を対象とする。変異体核酸は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド置換、付加または欠失を含む核酸である。いくつかの態様において、変異体は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列のものと同一であるかまたは実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸である。
当業者により理解されるであろうとおり、遺伝子コードの縮重のために、いくつかの異なる核酸配列が、ある一定のタンパク質をコードし得る。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはそれぞれ、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、例えば、具体的なアミノ酸が１つのコドンにより特定される全ての位置において、そのコドンは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく同じアミノ酸をコードする対応するコドンの何れかに変更され得る。当業者は、機能的に同一である分子を得るために、ヌクレオチド配列中の各コドン（メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧおよび通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く。）が修飾され得ることを理解するであろう。
ある一定の実施形態において、本発明は、１以上のアミノ酸が欠失しているかまたは付加されている、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドを対象とし、このポリペプチドは、コラーゲンを分解するかまたは溶解させる活性を保持する。またさらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、１以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換されており、このポリペプチドは、コラーゲンを分解するかまたは溶解させる活性を保持し、このポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８７１２５（配列番号１９）およびＤ２９９８１（配列番号２０）のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある一定の態様において、アミノ酸が置換される場合、この置換は、保存的アミノ酸変化である。保存的アミノ酸変化は、例えば、非極性アミノ酸の別の非極性アミノ酸に対する置換、極性アミノ酸の別の極性アミノ酸に対する置換または正電荷アミノ酸の別の正電荷アミノ酸に対する置換である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ；正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ；負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
単離核酸および単離ポリペプチドは、それらが天然で存在する形態または環境にはない。例えば、単離核酸は、通常は天然で核酸分子の側面にあるヌクレオチドから分離されているものである。組み換え核酸およびベクター内の組み換え核酸も単離核酸の例である。また、単離核酸分子としては、異種宿主細胞中の組み換え核酸分子ならびに溶液中の部分的または実質的に精製されている核酸分子が挙げられる。
下記でより詳細に記載されるように、本発明はまた、本明細書中に記載の核酸分子を含む、組み換え宿主細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、両生類細胞および哺乳動物細胞なども包含する。
発現カセットは、このような配列と適合性である宿主において、構造遺伝子（即ちタンパク質コード配列、例えば本発明のコラゲナーゼ）の発現に影響を及ぼすことが可能なヌクレオチド配列である。発現カセットは、ポリペプチドコード配列；および場合によっては他の配列、例えば、転写終結シグナルと操作可能に連結されるプロモーターを含み得る。発現を達成することにおいて必要であるかまたは役立つさらなる因子、例えばエンハンサーも使用され得る。
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターにも関する。ある実施形態において、本核酸は、配列番号１または配列番号２またはその相補体である。別の実施形態において、本核酸は、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸である。「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子である。ベクターの非限定例は、さらなるＤＮＡセグメントが核酸連結され得る環状の２本鎖ＤＮＡであるプラスミドである。ベクターの別の例は、ウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに核酸連結される。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば細菌性複製起点およびエピソーム性哺乳動物ベクターを有する細菌性ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。発現ベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を支配することが可能である。このような発現ベクターとしては例えばプラスミドが挙げられる。本発明は、他の発現ベクター、例えば、遺伝子発現を支配することが可能であるウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）などを包含する。当業者により認められるであろうように、発現ベクターの設計は、いくつかの因子、例えば形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどに依存する。発現ベクターは、発現のために使用しようとする宿主細胞に基づいて選択される１以上の制御配列を含む。上記で論じられるように、この制御配列は、発現させようとする核酸、例えば本発明の核酸に操作可能に連結される。いくつかの実施形態において、この制御配列は、形質転換宿主細胞に対して生来のものである制御配列である。発現ベクターは、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子および、ネオマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンおよびストレプトマイシン耐性に対する耐性を付与する遺伝子を含むがこれらに限定されない、１以上の選択可能マーカーを含み得る。
本明細書中に記載のベクターによって、原核および真核宿主細胞に対して形質転換を行い得る。本発明のベクターで形質転換され得る宿主細胞としては、細菌細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を含む昆虫細胞（バキュロウイルス）、真菌細胞、例えば酵母細胞など、植物細胞および哺乳動物細胞、例えば胸腺細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞など、およびラクトコッカス・ラクティス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、本宿主細胞は細菌細胞である。また別の実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。またさらなる実施形態において、宿主細胞は、ラクトコッカス・ラクティス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞である。ラクトコッカス・ラクティス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）細菌における組み換えポリペプチドの産生のための方法は、例えば内容が本明細書中で参照により明確に組み込まれる米国特許第７，３５８，０６７号に記載されている。ある実施形態において、宿主細胞はラクトコッカス・ラクティス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）であり、核酸は、ｐＨ制御可能プロモーターＰ１７０およびその誘導体に操作可能に連結される配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む。Ｐ１７０プロモーターおよびその誘導体は、内容が本明細書中で参照により組み込まれるＷＯ９４／１６０８６およびＷＯ９８／１００７９で詳細に記載されている。
核酸分子を遺伝子コンストラクト、例えば発現ベクターに核酸連結し、真核性（酵母、鳥類、昆虫、植物または哺乳動物）または原核性（細菌細胞）の何れかの宿主に形質転換または形質導入することは、標準的手順である。リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン－介在形質移入、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含むが限定されない従来の形質転換または形質移入技術を用いて、原核または真核細胞に、本明細書中に記載のベクターを導入し得る。様々な過程によって、組み換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを単離または精製し得る（例えば均一性のために）。
本発明は、本発明の核酸を含むベクターを用いて形質転換または形質移入された宿主細胞を培養することを含む、機能性コラゲナーゼＩまたはコラゲナーゼＩＩまたはそれらの組み合わせを産生する方法を包含する。本方法は、培地または宿主細胞からポリペプチドを単離することをさらに含む。機能性コラゲナーゼは、天然のコラゲナーゼ、例えばコラーゲン分解能を保持するコラゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドである。
陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、アフィニティークロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはそれらの何らかの組み合わせを含むが限定されない方法によって、本ポリペプチドを単離し得る。使用される特定の方法は、ポリペプチドの特性および宿主細胞の選択に依存し；適切な方法は当業者にとって容易に明らかとなろう。
いくつかの実施形態において、本発明は、コラゲナーゼＩまたはコラゲナーゼＩＩを産生させる方法であり、この方法は、（ｉ）配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列または適切な制御配列に操作可能に連結される配列番号３、４、５または６のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え細菌を構築し；（ｉｉ）この遺伝子を発現させるために適切な条件下でこの組み換え細菌を培養し、（ｉｉｉ）コラゲナーゼＩまたはコラゲナーゼＩＩを組み換え細菌から回収する段階を含む。このコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび金属キレートクロマトグラフィーを含む、当業者とって公知の様々な方法によって精製され得る。いくつかの実施形態において、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、ろ過およびカラムクロマトグラフィーを介して精製され、精製されたコラゲナーゼＩおよびＩＩは、内容が本明細書中で参照により明確に組み込まれる米国特許第７，８１１，２５０号に記載の方法を用いて約１：１の比で組み合わせられる。
本発明の組成物（本明細書中に記載の核酸によりコードされるコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩまたはそれらの組み合わせを含み、および／または配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸配列を含む。）および方法によって処置され得るコラーゲン介在疾患の例としては、デュピュイトラン病、ペイロニー病、肩関節周囲炎（癒着性関節包炎）、ケロイド、肥厚性瘢痕、陥凹性瘢痕、例えば炎症性ざ瘡の結果起こるもの；術後癒着、尋常性座瘡、脂肪腫および外見を損なう状態、例えば、皺、セルライト形成および腫瘍性線維などが挙げられるがこれらに限定されない。参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６，０８６，８７２号および同第５，５８９，１７１号は、デュピュイトラン病の処置におけるコラゲナーゼ調製物の使用を開示する。参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６，０２２，５３９号は、ペイロニー病の処置におけるコラゲナーゼ調製物の使用を開示する。
コラーゲン介在疾患の処置におけるその使用に加えて、本明細書中に記載の組み換えポリペプチドを含む組成物はまた、多岐にわたる実験室、診断および治療適用において有用であるように、個々の細胞および細胞塊への組織の解離にも有用である。これらの適用は、小口径合成血管グラフトシーディング（ｇｒａｆｔ ｓｅｅｄｉｎｇ）用の微小血管内皮細胞、遺伝子治療、薬物毒性スクリーニングおよび体外肝臓補助装置のための肝細胞、軟骨再生用の軟骨細胞およびインスリン依存性糖尿病の処置のためのランゲルハンス島を含め、様々な使用に対する多くのタイプの細胞の単離を含む。酵素処置は、細胞外マトリクスタンパク質および、細胞と細胞との接触を維持するタンパク質を断片化するために作用する。コラーゲンは、組織超微細構造の主要なタンパク質成分なので、所望の組織崩壊を遂行するために、酵素コラゲナーゼが頻繁に使用されてきた。一般に、本発明の組成物は、細胞の除去または細胞外マトリクスの修飾が所望される何らかの適用に有用である。
本発明は、医薬的に許容可能な担体と、本明細書中に記載の方法に従い産生されたコラゲナーゼＩおよび／またはコラゲナーゼＩＩと、を含む医薬組成物を包含する。また別の実施形態において、本医薬組成物は、配列番号３または配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるコラゲナーゼＩを含む。さらなる実施形態において、本医薬組成物は、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるコラゲナーゼＩＩを含む。また別の態様において、本医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体と、本明細書中に記載のようなコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩと、を含む。さらなる態様において、本医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体と、１：１の質量比のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩと、を含む。本発明の医薬組成物は、１以上の医薬的に許容可能な担体または賦形剤とともに製剤化される有効量の本発明のコラゲナーゼを含む。
Ｂ．溶血性毒素の存在を検出する方法
いくつかの実施形態において、本発明は、コラゲナーゼを産生する細菌発酵において溶血性毒素の存在を検出する方法を包含する。ある一定の態様において、本発明は、医薬品産生株中で溶血性毒素の存在を検出することを含む、患者へのコラゲナーゼ製剤原料の治療投与前に、コラゲナーゼ医薬品に出荷許可を与えるための方法を提供する。「医薬品産生株」、「産生株」、「コラゲナーゼ産生株」および「細菌性産生株」という用語は、交換可能に使用され、コラゲナーゼが得られる細菌株を指す。他の態様において、本発明は、医薬品中で溶血性毒素の存在を検出することを含む、患者へのコラゲナーゼ製剤原料の治療投与前に、コラゲナーゼ医薬品に出荷許可を与えるための方法を提供する。
本明細書中で使用される場合、「コラゲナーゼ医薬品に出荷許可を与える」という句は、コラゲナーゼ医薬品中に溶血性毒素がないことを確認することを意味する。「製剤原料」、「医薬品」または「コラゲナーゼ組成物」という用語は、交換可能に使用され得ることが理解される。また本明細書中で使用される場合、「ヘモリジン」および「溶血性毒素」も交換可能に使用され、赤血球細胞の溶解に関与する毒素を指す。
溶血性活性の有無について、コラゲナーゼ産生株および医薬品をアッセイし得、コラゲナーゼ製剤原料が、再現性が高く、副作用の可能性を低下させながら、最適な酵素性活性および優れた治療効果をもたらすことを保証し得ることが発見された。本発明に従い、医薬品中でコラゲナーゼと同時に存在し得る機能性の溶血性毒素の分泌または存在について産生株または医薬品をアッセイするための方法が提供される。本発明は、試験試料を赤血球細胞と温置し、続いて赤血球細胞の溶解を検出することを含む、細菌性産生株またはコラゲナーゼ組成物を含む試験試料を溶血性毒素の存在についてアッセイする方法を包含する。
赤血球細胞の溶解を検出するための具体的な方法は、例えば、その各内容が本明細書中で参照により明確に組み込まれる、１）Ｒｙａｎ ＫＪおよびＲａｙ ＣＧ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｉｎ Ｓｈｅｒｒｉｓ ｍｅｄｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｒｙａｎ ＫＪ，Ｒａｙ ＣＧおよびＳｈｅｒｒｉｓ ＪＣ（ｅｄｓ．）ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，２００４；２２９－２６０；および２）Ｅｓｃｈｂａｃｈ Ｅら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｌｙｓｉｓ ａｓｓａｙ ｉｎ ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅｓ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ｉｃｈｔｈｙｏｔｏｘｉｃ ａｌｇａｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２１，５１３－５１９（２００１）を含む文献を通じて記載されている。
本発明のある実施形態において、本方法は、血液寒天基質上で、コラゲナーゼ産生株の試料、特に、コラゲナーゼ産生株から単離された部分精製コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ医薬品を温置し、温置時間後に排除ゾーンについて血液寒天を観察することを含み、排除ゾーンは赤血球細胞の溶解を示す。細菌性産生株を試験した場合、赤血球細胞の溶解は、細菌性産生株からの機能性溶血性毒素の分泌を示す。部分精製コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ医薬品を試験した場合、赤血球細胞の溶解は、部分精製コラゲナーゼ中またはコラゲナーゼ医薬品中での機能性の溶血性毒素の存在を示す。ある一定の実施形態において、本産生株は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の株である。排除ゾーンがないことは、溶血性毒素がないことを示す。排除ゾーンがないことが観察されることは、コラゲナーゼ産生株において、部分精製コラゲナーゼ中にまたはコラゲナーゼ医薬品中に溶血性毒素がないことを示すかまたはこれを確認し、医薬品が治療投与に対して出荷許可が可能になる。
別の実施形態において、本方法は、コラゲナーゼ産生株から採取された抽出物と、またはコラゲナーゼ産生株から単離される部分精製コラゲナーゼと、またはコラゲナーゼ医薬品と、赤血球細胞を温置し、続いて、温置混合物中のヘモグロビンの出現により示されるような赤血球細胞の溶解について温置混合物を測光法で分析することを含む。溶血性毒素は、赤血球細胞を溶解し、温置試料中にヘモグロビンを放出させる。ヘモグロビンの光度検出は、溶血性毒素の存在に対する高感度アッセイを提供し得る。ある態様において、コラゲナーゼ産生株から採取される抽出物と、またはコラゲナーゼ産生株から単離される部分精製コラゲナーゼと、またはコラゲナーゼ医薬品と、赤血球細胞を温置し、次いで、５４０ｎｍの波長にて測光法でヘモグロビンの存在について抽出物を分析する。別の態様において、４１４ｎｍの波長で測光分析が行われる。また別の態様において、マイクロタイタープレートを使用して、温置および測光分析が行われ得る。ヘモグロビンがないこと、およびしたがって溶血性毒素がないことによって、患者への治療投与用の医薬品の出荷許可が可能になる。
Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）において見出されるような溶血性毒素は、ヘモリジンの２種類の異なるファミリー：アエロリジン様ヘモリジンおよび酸素不安定性ヘモリジンに属する。アエロリジン様ヘモリジンは、不活性プロ毒素として細胞外環境に分泌される不活性タンパク質前駆体として細菌によって合成される。不活性プロ毒素は、標的細胞膜上の受容体、例えば赤血球細胞上の受容体に結合し、そこでプロテアーゼによってプロ毒素が切断されその活性構造になる。活性化されると、毒素は細胞表面上でオリゴマー化してプレポア複合体となり、次にβバレルが標的細胞膜に挿入される。βバレルは膜においてポアを形成し、それによりカルシウムイオンが細胞に急速に流入するようになり、細胞に対して毒性となる。Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のα毒素は、毒素のアエロリジン様ファミリーのメンバーであり、溶血性活性を保持するクロストリジウム・セプチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素と顕著な相同性を共有することが発見されているので、アエロリジン様ヘモリジンである可能性が最も高い（例えば下記実施例１参照）。
Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のε毒素およびクロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）（Ｃ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ））のテタノリシンが、酸素不安定性ヘモリジンとして記載されている［Ｈａｔｈｅｗａｙ ＣＬ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ３（１）：６６－９８（１９９０）］。Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のε毒素は、コレステロールに対して親和性があるチオール活性化、βバレル、ポア形成毒素のメンバーであるテタンロイシン（ｔｅｔａｎｌｏｙｓｉｎ）と相同性を共有することが発見されている。このようなタンパク質は、コレステロール依存性細胞溶解素（ＣＤＣ）のファミリーの一部である。これらのタンパク質は、水溶性タンパク質単量体として細菌によって細胞外環境に分泌され、ここでそれらは標的細胞膜に結合するが、この結合にはコレステロール結合が介在する。この毒素は次に、膜表面上でオリゴマー化して、細胞溶解に関与する弧状および環状構造を形成する。Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のε毒素は、酸素不安定性ヘモリジンであることが知られており、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の他の株、例えばＣ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ノビー（Ｃ．ｎｏｖｙｉ）およびＣ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）などにより産生される酸素不安定性ヘモリジンと血清学的に類似している。
ある一定の態様において、本発明は、本明細書中に記載のアッセイを用いて、細菌性産生株中でＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）α毒素の存在を検出する方法を対象とする。他の態様において、本発明は、医薬品中でＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）α毒素の存在を検出する方法を対象とする。さらなる態様において、本発明は、細菌性産生株中でＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ε毒素の存在を検出する方法を対象とする。また別の態様において、本発明は、医薬品中でＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ε毒素の存在を検出する方法を対象とする。またさらなる態様において、本発明は、細菌性産生株中でＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）α毒素およびε毒素の存在を検出する方法を対象とする。さらなる実施形態において、本発明は、医薬品中でＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）α毒素およびε毒素の存在を検出する方法を対象とする。
本発明はまた、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）から得られるコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩからなる医薬品を作製する方法も包含し、この方法は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の株を発酵させる段階を含み、溶血性毒素による赤血球細胞の溶解に適切な条件下で赤血球細胞とこの産生株を温置することによって、機能性の分泌型溶血性毒素が無いことが確認され、赤血球細胞の溶解は、溶血性毒素の分泌を示し、赤血球細胞の溶解がないことは、溶血性毒素がないことを示す。別の態様において、本発明は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）から得られるコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩからなる医薬品を作製する方法を対象とし、この方法は、溶血性毒素での赤血球細胞の溶解に適切な条件下で赤血球細胞とともに医薬品を温置することによって、医薬品中で機能性の分泌型溶血性毒素がないことを確認する段階を含み、赤血球細胞の溶解は溶血性毒素の分泌を示し、赤血球細胞の溶解がないことは、溶血性毒素がないことを示す。
本発明のさらなる態様は、ろ過およびカラムクロマトグラフィーによって組成物を精製し、続いて、溶血性毒素による赤血球細胞の溶解に適切な条件下で赤血球細胞とともに精製組成物の試料を温置することによって溶血性毒素がないことを確認するすることを含む、粗コラゲナーゼ組成物を精製する方法を含み、赤血球細胞の溶解は、溶血性毒素の分泌を示し、赤血球細胞の溶解がないことは、溶血性毒素がないことを示す。
上記で論じられるように、いくつかの疾患および状態は、過剰なコラーゲン沈着およびコラーゲンに富む繊維状組織の不規則な蓄積を付随し、コラーゲン医薬品で処置され得る。このような疾患および状態は、まとめて、本明細書中で「コラーゲン介在疾患」と呼ぶ。本発明はまた、コラーゲン介在疾患の処置を必要とする患者においてコラーゲン介在疾患を処置する方法も包含し、コラゲナーゼを含む組成物がこの患者に投与され、投与前に、本明細書中に記載の方法を用いて、溶血性毒素の有無についてこの組成物または細菌性産生株がアッセイされる。本明細書中に記載の組成物および方法により処置され得るコラーゲン介在性状態の例としては、デュピュイトラン病、ペイロニー病、肩関節周囲炎（癒着性関節包炎）、ケロイド、肥厚性瘢痕、陥凹性瘢痕、例えば炎症性ざ瘡の結果起こるもの；術後癒着、尋常性座瘡、脂肪腫および外見を損なう状態、例えば、皺、セルライト形成および腫瘍性線維が挙げられるが、これらに限定されない。ある一定の態様において、ペイロニー病またはデュピュイトラン病または癒着性関節包炎を処置するために、アッセイされた組成物が患者に投与される。
本発明の方法に従いアッセイされ得る産生株に関して、例えば、アクチノバチルス属（ＡｃｔｉｎｏＢａｃｉｌｌｕｓ）、アクチノマヅラ属（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテリオデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）およびビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）のメンバーである細菌によりコラゲナーゼが発現される。本発明のある実施形態において、産生株は、上記で列挙される属から選択される。別の実施形態において、産生株は、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの組み換え型を用いて形質転換されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）型を含む、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。より好ましい実施形態において、産生株は、Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）株である。最も好ましい実施形態において、産生株はＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）（Ｃ．ｈｉｓ）株である。
ある一定の態様において、産生株は、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの混合物を含むコラゲナーゼ組成物を産生する。さらなる実施形態において、コラゲナーゼＩの混合物およびコラゲナーゼＩを産生させるために使用される産生株は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）である。別の実施形態において、コラゲナーゼ医薬品は、約１：１の質量比の高精製Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの混合物を含む。
試料中で赤血球細胞の溶解を引き起こす物質であるヘモリジンの存在について試験するためのキットも与えられる。本キットは、溶血性であるかまたはヘモリジンを含有する試験物質の同定を可能とする。試験物質としては、化学物質、生体物質および放射線放射物質が挙げられるがこれらに限定されない。ある実施形態において、本キットは、例えば、赤血球細胞および関連試験材料を含むキットを含め、試験試料中のヘモリジンの存在について試験するための材料を含む。別の実施形態において、本キットは、血液寒天から構成されるペトリ皿と、陽性対照と、溶血性遺伝子が突然変異しているかまたはノックアウトされている細菌株から構成され、機能性溶血性タンパク質が産生されない陰性対照と、を含む。また別の実施形態において、本キットは、赤血球細胞と、マイクロタイタープレートと、陽性対照と、本医薬品から構成される陰性対照と、を含む。
理解されるであろうように、本発明のキットおよび方法は、コラゲナーゼ組成物中でのヘモリジンの有無を検出するために使用し得るが、このコラゲナーゼは細菌から得られる。
色素リガンドアフィニティークロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび金属キレートクロマトグラフィーを含む当業者にとって公知の様々な方法によって、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）から得られる粗コラゲナーゼを精製し得る。粗製および部分精製コラゲナーゼは、Ａｄｖａｎｃｅ Ｂｉｏｆａｃｔｕｒｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｌｙｎｂｒｏｏｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを含む多くの供給源から市販されている。Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）から得られる粗コラゲナーゼの精製方法はまた、内容が参照により本明細書中に明確に組み込まれる米国特許第号７，８１１，５６０号によっても記載されている。ある一定の実施形態において、精製手順は、ａ）ＭＵＳＴＡＮＧ Ｑ陰イオン交換カプセルであるフィルターに通して粗回収物をろ過し；ｂ）硫酸アンモニウムを添加し；好ましくは最終濃度を１Ｍとし；ｃ）好ましくは０．４５μｍフィルターを通じて粗回収物をろ過し；ｄ）ろ液をＨＩＣカラム；好ましくはフェニルセファロース６ＦＦ（ｌｏｗ ｓｕｂ）に通し；ｅ）ろ液にロイペプチンを添加し；ＨＩＣ後溶出産物に対して好ましくは最終濃度を０．２ｍＭとし；ｆ）ＴＦＦによる緩衝液交換、好ましくはＴＦＦによる緩衝液交換によって、硫酸アンモニウムを除去し、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの正しい結合のためにロイペプチンを維持し；ｇ）好ましくは０．４５μｍフィルターを通じて段階（ｆ）の混合物をろ過し；ｈ）Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰを用いてコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを分離し；ｉ）個別にコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩに対してＴＦＦ濃縮物および処方物を調製し（ここでＴＦＦは、１０および／または３０Ｋ ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）ＰＥＳまたはＲＣ－ポリエーテルスルホンまたは再生セルロースフィルター膜を使用する接線流ろ過である。）（ＴＦＦは、選択タンパク質を保持し、濃縮し、ある緩衝溶液から別のものにタンパク質の溶液交換を行うための手段を提供する。）；およびｊ）０．２μｍろ過システムを通じてろ過する段階を含む。
Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）α、β、δ、εおよびγ毒素
Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クローン００４のα、δおよびε毒素のアミノ酸配列は、図面で示され、それぞれ配列番号８、配列番号１２および配列番号１６である。Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クローン００４のα、δおよびε毒素のヌクレオチド配列も図面で示され、それぞれ配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３である。配列番号８、配列番号１２、配列番号１６の各アミノ酸の配列は、これらのタンパク質を非機能性にし、および／または分泌されないようにする配列特性を有する。
γ毒素（クロストリパイン）の場合、モデルタンパク質（実施例セクション参照）と比較した場合、アミノ酸の相違は３個しかなく、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クローン００４γ毒素において異なることが見出されるアミノ酸残基の中で、活性に必須なものとして同定されているものはない。したがって、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クローン００４γ毒素（配列番号１８のアミノ酸配列を有する。）は分泌され、機能性であることが予想される。Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クローン００４γ毒素のヌクレオチド配列は配列番号２４である。
上記で論じられるように、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を有するβ毒素は完全に機能性である。
理解されるであろうように、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）α、β、εまたはγ毒素のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（配列番号８、配列番号１２、配列番号１６および配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４）に、１以上の突然変異（例えば１以上のアミノ酸残基または核酸残基の欠失または付加）が導入され得る。ある一定の態様において、毒素の活性、機能、産生および／または分泌を向上させるかまたは減ずるために、１または突然変異が導入される。ある実施形態において、α、βおよび／またはε毒素を機能性にし、および／または分泌されるようにする突然変異が導入され得る。別の実施形態において、γ毒素の配列（配列番号１８）は、タンパク質を非機能性にし、および／または分泌されないようにするために突然変異され得る。
本発明により、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６またはそれらの断片もしくは変異体またはそれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）またはＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）毒素に対する抗体を産生させる方法も包含される。さらに、本発明は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６またはそれらの断片もしくは変異体またはそれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）毒素に対する免疫反応を刺激する方法を含む。本発明はまた、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６またはそれらの断片もしくは変異体またはそれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む有効量のタンパク質またはペプチドを含むワクチンも含む。配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６またはそれらの断片もしくは変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）株によって産生させ得るかまたは、組み換えタンパク質またはペプチドであり得る。
Ｄ．コラゲナーゼを含む医薬組成物および処置方法
本明細書中に記載の発明は、タンパク質配列および組み換えタンパク質を含む医薬組成物およびまた、本明細書中に記載の方法に従いアッセイされるコラゲナーゼ医薬品を含む医薬組成物も包含する。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体または賦形剤」という用語は、無毒性の、不活性固形物、半固形物または液体充填剤、希釈剤、封入材料または何らかのタイプの製剤補助剤を意味する。「処置する」または「処置」とは、発症、合併症もしくは疾患の生化学的兆候を阻止するかもしくは遅延させ、症状を緩和もしくは改善するかまたは疾患、状態もしくは障害のさらなる発現を停止させるかもしくは抑制するための本発明の態様の、組成物、化合物または物質の投与を含む。「治療的有効量」または「有効量」は、単独で、または１以上の他の活性剤と組み合わせて、処置しようとする疾患または状態の１以上の症状を、調節、軽減、抑制、改善、阻止するかまたはそれに影響を与え得る量である。免疫反応を生成させる内容において、またはワクチンの調製において、「有効量」は、抗原に対する抗体の産生を含め、免疫反応を生成させるために効果的である量を包含する。
医薬的に許容可能な担体となり得る材料のいくつかの例は、糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプンなど；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；粉状トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；グリコール、例えばプロピレングリコールなど；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；アルギン酸；発熱物質不含水；等張性塩水；リンゲル溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝溶液ならびに他の無毒性の相溶性の潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど、ならびに着色剤、解除剤、コーティング剤、香料、防腐剤および抗酸化剤も、処方者の判断に従い、組成物中に存在させ得る。
コラゲナーゼ組成物は、具体的な数の活性単位または具体的な質量の好ましくは精製酵素の何れかを混合することによっても調製され得る。コラゲナーゼ活性は、合成ペプチドまたはコラーゲン基質の何れかに対する酵素の加水分解能によっても測定され得る。当業者は、機能的に同等な酵素組成物を定義し、調製するために、本明細書中で開示されるもの以外の酵素アッセイも使用し得ることを認めるであろう。コラゲナーゼ活性は、例えばＳＲＣ単位で示され得る。１ＳＲＣ単位は、２５℃およびｐＨ７．４で、ラット尾部コラーゲンを１ナノモルロイシン／分に等しくニンヒドリン反応物質中に溶解させる。本発明のある一定の実施形態において、コラゲナーゼ活性は、ＡＢＣ単位で記載される。このコラゲナーゼの効力アッセイは、ｐＨ７．２および３７℃で２０から２４時間にわたる、未変性コラーゲン（ウシの腱由来）の消化に基づく。ニンヒドリンとの反応によって、切断されるペプチド結合数が測定される。トリプシン消化対照により放出されるアミノ基が差し引かれる。コラゲナーゼの１純ＡＢＣ単位は、１．０９ナノモルのロイシン／分と等しく、ニンヒドリン反応性物質が可溶化される。１ＳＲＣ単位は、およそ６．３ＡＢＣ単位と等しい。
ある一定の態様において、注射用コラゲナーゼのための製剤原料は、２種類の微生物性コラゲナーゼからなり、コラゲナーゼＡＵＸ ＩおよびコラゲナーゼＡＢＣ ＩおよびコラゲナーゼＡＵＸ ＩＩおよびコラゲナーゼＡＢＣ ＩＩと呼ばれる。「コラゲナーゼＩ」、「ＡＢＣ Ｉ」、「ＡＵＸ Ｉ」、「コラゲナーゼＡＵＸ Ｉ」および「コラゲナーゼＡＢＣ Ｉ」という用語は同じものを意味し、交換可能に使用され得ることが理解される。同様に、「コラゲナーゼＩＩ」、「ＡＢＣ ＩＩ」、「ＡＵＸ ＩＩ」、「コラゲナーゼＡＵＸ ＩＩ」および「コラゲナーゼＡＢＣ ＩＩ」という用語は同じ酵素を指し、これらも交換可能に使用され得る。これらのコラゲナーゼは細菌細胞により分泌される。これらは、クロマトグラフィー法によって、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）培養上清から単離され、精製される。両コラゲナーゼとも、特殊なプロテアーゼであり、同じＥＣ番号（Ｅ．Ｃ３．４．２４．３）を共有する。
コラゲナーゼＡＵＸ Ｉは、１１５ｋＤａの分子量を有するおよそ１０００アミノ酸からなる１本鎖ポリペプチド鎖を有する。コラゲナーゼＡＵＸ ＩＩもまた、１１０ｋＤａの分子量を有する約１０００アミノ酸からなる１本鎖ポリペプチド鎖を有する。
いくつかの実施形態において、製剤原料（コラゲナーゼ濃縮物）は、コラゲナーゼＡＵＸ ＩおよびＡＵＸ ＩＩに対する質量比がおよそ１：１である。ある実施形態において、コラゲナーゼ濃縮物の吸光係数は１．５２８である。
本発明の医薬組成物は、非経口的に、局所的にまたは埋め込みリザーバーを介して投与され得る。「非経口」という用語は、本明細書中で使用される場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または点滴技術を含む。好ましい実施形態において、本組成物は患部組織に注射される。ペイロニー病またはデュピュイトラン病または癒着性関節包炎の場合、本組成物は、手の神経束またはペイロニー斑に注射される。「局所投与」という用語は、本明細書中で、患部組織へのこのような直接注射を包含するものと定義される。ある一定の態様において、本発明の医薬組成物は注射用製剤である。ある一定のさらなる態様において、本医薬組成物は局所製剤である。
さらに、処置に依存して、いくつかの状況で、本医薬組成物の投与後に注射部位を固定化することによって結果が改善し得る。例えば投与部位（例えば手）を４時間以上固定化し得る。
適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて公知の技術に従い、注射用製剤、例えば滅菌注射用水性または油性縣濁液を製剤化し得る。滅菌注射用調製物はまた、無毒性の、非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液、縣濁液またはエマルション、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液として、であり得る。使用され得る許容可能なビヒクルおよび溶媒の中でも、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌固定油は溶媒または懸濁化媒体として従来から使用される。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む何らかの無刺激性の固定油を使用し得る。さらに、注射物質の調製において、脂肪酸、例えばオレイン酸などを使用する。
使用前に、例えば、細菌保持フィルターを通じてろ過によって、または、滅菌水または他の滅菌注射用の媒体中で溶解または分散され得る滅菌性固形組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、注射用製剤を滅菌し得る。本滅菌溶液はまた、後の使用のために凍結乾燥することもできる。
いくつかの実施形態において、コラゲナーゼを含む組成物を凍結乾燥し、約８．０のｐＨレベルのスクロース、Ｔｒｉｓを用いて注射用組成物を製剤化する。一般に、製剤中に、塩化カルシウムなど、カルシウムの供給源が含まれる。
本発明の医薬組成物の局所または経皮投与のための剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチが挙げられる。滅菌状態下で、医薬的に許容可能な担体および、必要とされ得る場合、何らかの必要とされる防腐剤または緩衝液とともに活性成分を混合する。
軟膏、ペースト、クリームおよびジェルは、本発明のポリペプチドに加えて、賦形剤、例えば動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはそれらの混合物を含有し得る。
粉末およびスプレーは、本発明のポリペプチドに加えて、賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末など、またはこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレーは、さらに、通常の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素などを含有し得る。
経皮パッチは、活性物質の身体への制御送達をもたらすさらなる長所がある。このような剤形は、的確な媒体中で活性物質を溶解させるかまたは分散させることによって作製し得る。皮膚を横断するポリペプチドの流れを向上させるために、吸収促進剤も使用し得る。速度調節膜を提供するか、またはポリマーマトリクスもしくはゲル中で本発明のポリペプチドを分散するかの何れかにより、速度が調節され得る。
医薬の治療投与は、非経口的なもの、局所的なものまたは埋め込みリザーバーを介したものであり得る。本明細書中で使用される場合、非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または点滴技術を含む。「局所投与」という用語は、本明細書中で、このような直接注射を包含するものと定義される。ある実施形態において、本医薬組成物の治療投与は注射による。
局所または経皮投与のための剤形での医薬の治療投与は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチを含む。滅菌条件下で、医薬的に許容可能な担体および必要とされ得る場合、何らかの必要とされる防腐剤または緩衝液とともに活性成分を混合する。
軟膏、ペースト、クリームおよびジェルは、医薬品の活性化合物に加えて、賦形剤、例えば動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛などまたはそれらの混合物を含有し得る。
粉末およびスプレーは、医薬品の化合物に加えて、賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末などまたはこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレーは、さらに、通常の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素などを含有し得る。
経皮パッチは、化合物の身体への制御送達をもたらすさらなる長所を有する。このような剤形は、的確な媒体中で化合物を溶解させるかまたは分散させることによって作製し得る。皮膚を横断する化合物の流れを向上させるために、吸収促進剤も使用し得る。速度調節膜を提供するか、ポリマーマトリクスもしくはゲル中で化合物を分散させるかの何れかによって、速度を調節し得る。
単に説明を目的とするものであり、本発明の範囲を限定するものではない次の実施例と関連させて、本発明がより詳細に理解されよう。開示される実施形態に対する様々な変更および改変は、当業者にとって明らかとなろうし、このような変更および改変は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、なされ得る。
実施例
実施例１：Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ゲノム配列決定および毒素配列分析
Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）α、δおよびε（α、δおよびε毒素）に関する科学的研究が不足しているため、これらの毒素のタンパク質構造に関する知識は限られたものとなっている。この知識不足に対処するため、推定毒素遺伝子の同定に特に焦点を当てて産生生物をより詳細に理解するために、ゲノム配列決定の取り組みが行われた。この努力の結果として、最近になってようやく、コラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）産生株（クローン００４）（Ａｕｘｉｌｉｕｍ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）の完全なゲノムが作製されたが、これは明らかに、あらゆるＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）株の中で初めて報告されたゲノム配列であった。
ゲノム配列プロジェクトには３つの基本的な段階があった。第一にゲノムＤＮＡをクローン００４培養物から抽出し、配列決定のためにＣｒｅａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）に回した。工業的な標準的方法を用いて、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クローン００４のゲノム配列を得た。第二に、ゲノム配列データベースに対して配列情報を問い合わせるために、標準的なバイオインフォマティクス法（ＢＬＡＳＴ分析）を用いてゲノム配列から得られた結果を分析した。この第二の段階の結果、同定された各Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）遺伝子に対するタンパク質情報が割り当てられた。２つのデータベースを使用することは、総合的な評価を確保するだけでなく、タンパク質割り当てを実証するための第二のソースともなる。本プロジェクトにおける第三の段階は、ＢＬＡＳＴ分析により自動的に割り当てられたタンパク質とのＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）推定毒素配列の比較分析であった。
ｉ．Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ゲノム配列決定およびモデルタンパク質の同定
クローン００４由来のＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）（ＣＬＨ）ＷＣＢの増殖物から単離されるゲノムＤＮＡの試料をゲノム配列決定のためにＣｒｅａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）に回した。Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓは、クライアントにより提出されたゲノムＤＮＡ試料の配列決定のために使用された標準的方法を用いた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａゲノム分析装置付きのチタン化学（ｔｉｔａｎｉｕｍ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（断片配列決定）を用いてＲｏｃｈｅ／４５４ ＧＳ－ＦＬＸシステムから、ゲノム配列を作製した。プライマーウォーキングによってゲノムの仕上げを行うために、ＡＮＩ ３７３０ｘｌを使用した。２９．４４％ＧＣ含量である２，８４２，９０６塩基対のゲノム配列全体を完遂したが、これらの値は、他のクロストリジウムゲノムに対して得られた典型的なゲノムサイズおよびＧＣ含量であった。同定された２，８８７個のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）のそれぞれに固有のＣＬＨ番号を割り当てた。ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴ分析およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを用いて、推定２，８８７遺伝子のそれぞれをさらに調べ、その結果、β、γ、αおよびε毒素に対して遺伝子座が仮に割り当てられた。最初の評価の結果を表１で与える。したがって、２つのデータベースの包括的な検索を介した自動分析の結果として、モデルタンパク質の割り当てが完遂された。モデルタンパク質割り当ては、操作者の解釈により影響を受けなかった。
Figure 2022023041000002
Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ゲノムのＢＬＡＳＴ分析の結果の検査から、エラスターゼをコードするＯＲＦは明らかにならなかった。しかし、プロテアーゼは、これらのプロテアーゼの活性部位の最も顕著な官能基の基準に基づき、ＭＥＲＯＰＳ（ｈｔｔｐ：／／ＭＥＲＯＰＳ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）によって分類されている。このＭＥＲＯＰＳに基づく機能アプローチを用いて、エラスターゼは、Ｍ４ぺプチダーゼファミリーに分類されるが、このファミリーではサーモリシン（ＥＣ３．４．２４．２７）が最もよく研究されているファミリーメンバーであり、このようなプロテアーゼに対する古典的なモデルである。この知識を用いて、ＢＬＡＳＴ分析出力の再検査から、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）が、サーモリシンと顕著な相同性を共有する単一のＯＲＦを保持することが示唆された。したがって、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）内の推定δ毒素遺伝子は、Ｂ．プロテオリティクス（Ｂ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）サーモリシンの相同体として割り当てられた。
最初の評価の結果を、２つの配列データベースとの比較に基づき下記表２で与える。
Figure 2022023041000003
ｉｉ．タンパク質配列アラインメントおよび分析
シグナルペプチドを同定するために、候補シグナルペプチド配列を同定するＳｉｇｎａｌＰと呼ばれるプログラムにおいて試料および調節配列を分析した（Ｎｉｅｌｓｅｎ（２００４），Ｊ．Ｇｌａｓｇｏｗら、ｅｄｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２２－１３０．ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）。シグナルペプチドは通常、タンパク質配列の最初の７０アミノ酸（またはＮ末端領域）内に位置し、分泌されるべき酵素に対するシグナル配列として作用する。シグナルペプチドが切断され、得られたタンパク質配列が成熟タンパク質となる。ＳｉｇｎａｌＰを用いて、使用者は、成熟タンパク質のＮ末端を同定するために、シグナルペプチド切断部位の位置を同定し得る。しかし、一部の試料配列の場合、特にα毒素およびβ毒素（ＡＵＸ－Ｉ）の場合、成熟タンパク質のみが同定され、シグナルペプチド配列を含むタンパク質配列全体は同定されなかった。さらなる試験から、使用した配列断片化手順によって、成熟タンパク質からシグナルペプチド配列が分離されたことが明らかになった。成熟タンパク質およびシグナル配列を再構築し、アラインメントツールを通じてプロセシングした。
タンパク質配列全てを回収した後、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）７．０．１０（Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，２０１０）を用いてペアワイズ配列アラインメントを構築した。ペアワイズ配列アラインメントは、２配列間の類似性および相違を判定するための２つの配列の直接比較である。調節および試料配列の両者をＭＡＴＬＡＢ（登録商標）にアップロードし、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムおよびＢＬＯＳＵＭ５０スコアマトリクスを用いてアラインメントを作製した。アルゴリズムおよびアルゴリズムとしてアラインメントを構築することにおけるスコアマトリクス支援は、スコアマトリクスに基づき各アミノ酸のマッチまたはミスマッチの値を規定し、必要に応じてギャップ値を組み込む。２配列の長さが異なることおよび、適切なアミノ酸が互いにマッチしていることを確実にすることを含むがこれに限定されない複数の理由のためにギャップが生じ得る。スコアマトリクスは、配列間で頻繁に観察される置換率に基づき、２配列間の類似性または非類似性を評価するのに役立つ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。
Ｈａｔｈｅｗａｙ（１９９０）ｒｅｖｉｅｗ（Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ３：６６－９８）は、５種類の毒素全てが分泌型タンパク質（エクソサブスタンス（ｅｘｏｓｕｂｓｔａｎｃｅ））であり、５種類の毒素全てが識別可能な機能を有することを示した。推定ＣＬＨ毒素の分析を行うために、この情報を使用した。推定ＣＬＨ毒素のタンパク質機能を分析するために、文献の知見およびＢＬＡＳＴの結果に基づき若干のモデルタンパク質を選択した。Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）からＦａｓｔａ方式で対照をダウンロードした。
１．アルファ（α）毒素
Ｂｏｗｅｎ（１９５２）（Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２５：１２４－１３８）の研究の後、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）α毒素に関して文献には僅かな情報しか存在しない。したがって、推定毒素遺伝子に対するゲノム配列の照合は興味深かった。ゲノムの予備分析から、２つのデータベースのＢＬＡＳＴ分析により判定されるように、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）が、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素と顕著なアミノ酸相同性を共有する１個のＯＲＦを保持したことが示唆された。したがって、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）内の推定α毒素遺伝子が、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素の相同体として割り当てられている。Ｒｏｄｎｅｙ Ｋ．Ｔｗｅｔｅｎの研究室により幅広く研究されているように、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素は、毒素のアエロリジン様ファミリーのメンバーとして分類された。とりわけ、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素は、溶血性活性を保持せず（Ｂａｌｌａｒｄら（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６０：７８４－７９０；Ｍｅｌｔｏｎ－Ｗｉｔｔら（２００６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ ４５：１４３４７－１４３５４）、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ε毒素に対して記載されるように（Ｈａｔｈｅｗａｙ（１９９０），Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ３：６６－９８）、酸素不安定性ヘモリジンとは区別される。
Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素は、不活性プロ毒素として細胞外環境に対してプロセシングされる不活性プレプロタンパク質として生産される。次に、プロ毒素が細胞膜上の受容体に結合し、そこでこれらがプロテアーゼ（通常フリン）によって切断されてその活性構造となる。毒素内のフリンコンセンサス部位は、真核性プロテアーゼによる活性化に必須である。活性化は、Ｃ末端からの４０－４５アミノ酸の切断を含む。Ｃ末端切断がないので、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素は機能性ではない。全長Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素は溶血性である（Ｂａｌｌａｒｄら、１９９２）。活性毒素は、およそ４１．３ｋＤａである（Ｇｏｒｄｏｎら、１９９７）。活性化されたら、毒素は細胞表面上でオリゴマー化してプレプロ複合体となり、続いてβバレルが膜に挿入される。
モデルＣ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素は、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３と呼ばれる３つの別個のドメインからなる。Ｄ１ドメインは受容体結合およびオリゴマー化に関与し、一方でＤ２ドメインは、両親媒性のヘパリン構造に寄与する。Ｄ３ドメインは、既知のＡＴ活性化部位（Ｒ３９８）で切断された短いカルボキシル末端ペプチドを含むＤ３プロペプチド領域を有し、α毒素の未成熟オリゴマー化を阻止する分子内シャペロンとして機能する。飽和突然変異誘発を用いて、各ドメイン内の１アミノ酸置換によって、生物学的活性に必須の残基の決定ができる（Ｍｅｌｔｏｎ－Ｗｉｔｔら、２００６）。重要なこととして、機能的アッセイは、ＬＤ５０用量を決定するために細胞生存能アッセイを利用する。したがって、機能アッセイを用いて、コード領域全体内の１アミノ酸置換の相対的影響を評価した。
ＣＬＨα毒素の一次構造をさらに理解するために、ＣＬＨα毒素を用いて、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）で行って、モデルタンパク質（Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素）のタンパク質アラインメントを作成した。結果を図１で与える。
翻訳ＣＬＨ推定α毒素は、認識可能なシグナル配列を有し、分泌型タンパク質である可能性が非常に高い。したがって、エクソサブスタンス（ｅｘｏｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の第一の基準が達成される。Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素タンパク質配列とＣＬＨα毒素タンパク質配列との間に、７５％の陽性の相同性がある。モデルα毒素とＣＬＨ推定α毒素との間で相同性が高い領域が複数同定された。図１において、このような領域および必須のアミノ酸残基を緑の陰影で強調する。
とりわけ、アラインメントによって、Ｍｅｌｔｏｎ－Ｗｉｔｔら（２００６）（Ｂｉｏｃｈｅｍ ４５：１４３４７－１４３５４）の研究に基づき、個々にＣＬＨ＿２８３４および２８３５タンパク質を非機能性にする、必須のアミノ酸残基における複数の相違が示される。成熟タンパク質のＮ末端領域で始まっているので、推定シグナルペプチド切断部位から約２０アミノ酸下流に位置するＣＬＨα毒素配列において１７アミノ酸配列領域がない。この１７アミノ酸ストレッチ内で、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素上のＷ７４残基が、ループ１（Ｌ１）において重要な残基として同定されている。ＣＬＨ配列バージョンにおけるＤ１ドメインからの１７アミノ酸の欠如から、野生型と比べてこのドメインに対する構造が変化していることおよび受容体結合機能性の破壊が示唆される。
タンパク質のＣ末端領域内で、いくつかのアミノ酸残基の変化によってもまた、ＣＬＨタンパク質が非機能性になる。ＣＬＨα毒素において、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素のアミノ酸Ｔ３０２をプロリンにより置換した。ＣＬＨα毒素において、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素の残基Ｅ３０３をスレオニンにより置換する。Ｍｅｌｔｏｎ－Ｗｉｔｔら（２００６）（Ｂｉｏｃｈｅｍ ４５：１４３４７－１４３５４）の研究から、これらの改変のそれぞれの結果、個々に、致死率が０％となろう。注目すべきことは、２配列間の活性化部位のまたはフリン切断部位の比較である。Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）α毒素は、フリンコンセンサス切断部位がＫ３９１で始まり、Ｒ３９８で終結することを示す。最小切断配列がＡｒｇ－Ｘ－Ｘ－Ａｒｇであるものの、この領域は、コンセンサスフリン切断配列Ａｒｇ－Ｘ－Ｌｙｓ／Ａｒｇ－Ａｒｇに適合する。ＣＬＨ推定α毒素は、類似のＲ３９８位置においてアルギニンの代わりにグルタミン残基を有する。上で述べたように、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）活性化部位は、重要な残基として同定されるＲ３９８を有する、アミノ酸配列、ＤＫＫＲＲＧＫＲＳＶＤＳを保持する。Ｄ３ペプチドにおけるＣＬＨα毒素相同性配列は、ＮＴＳＳＴ－ＥＱＮＶＥＶである。したがって、推定Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）α毒素フリン切断部位は非機能性と思われ、このタンパク質は、発現される場合でも、真核性細胞フリンプロテアーゼとの接触によってプロセシングされて、機能性毒素を生成させ得ない。比較アミノ酸配列分析の知見を表３でまとめる。
Figure 2022023041000004
配列アラインメント分析のまとめから、推定ＣＬＨα毒素は、その成熟タンパク質を非機能性にする多数のアミノ酸残基の相違があることが示唆される。α毒素についての機能性に対する表現型の関連性は、溶血性活性の証明である。重要なこととして、コラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）産生株は、血液寒天上にプレーティングした場合、溶血性活性を示さない。血液寒天溶血性評価の結果を図２で示す。
図２のパネルＡは、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クローン００４細胞増殖の試料を血液寒天上で培養した場合に得られる結果を示す。β溶血性表現型の証拠はない。対照的に、図２のパネルＢは、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）の試料を血液寒天上で培養した場合に得られる結果を示す。パネルＣで示されるように、試料塗布エリアを十分に越えて広がるβ溶血の明確な証拠がある。提供される画像は、被験物質を検査する場合に観察される質的な相違を的確に表していない。β溶血の出現は、容易に識別可能であり、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）プレートスタンドにおける溶血の完全な欠如は、Ｃ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）培養物（α毒素の産生体）を検証する場合に指摘される広い溶血ゾーンとは、全く対照的である。
２．デルタ（δ）毒素
Ｈａｔｈｅｗａｙら（１９９０）（Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ３：６６－９８）は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のδ毒素を、主にＴａｋａｈａｓｈｉら（１９７０）（ＢＢＲＣ ３９：１０５８－１０６４）による最初の研究コミュニケーションに基づきエラスターゼとして定義している。その後、この毒素におけるさらなる実質的な研究は明確に公表されてない。Ｔａｋａｈａｓｈｉらによって、ディファレンシャル限外ろ過（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて、エラスターゼ活性を示す４つの分画がＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）から単離された。最初に、名目５０ｋＤａカットオフ膜の膜を通過したが、名目１０ｋＤａのカットオフの膜により保持された分画に焦点を当てた。
サーモリシンは、成熟酵素分子量が３４．６ｋＤａである亜鉛メタロプロテアーゼである。重要なこととして、サーモリシンは、分泌で用いられるプレ配列（シグナルペプチド）だけでなく、成熟タンパク質のサイズの３分の２であるおよそ２００アミノ酸残基の冗長なプロ配列も含有するタンパク質のクラスに対するモデルタンパク質である。成熟酵素の阻害剤としての、また、酵素の正確な折り畳みを確実にするシャペロンとしての役割を果たすプロ配列がある不活性プレプロタンパク質として、サーモリシン様酵素が生産される（Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅら（１９９６）、ＪＢＣ ２７１：２６４７７－２６４８１）。細胞外環境において、分子の成熟酵素部分によって、プロ配列が自動的に除去される。したがって、サーモリシン様酵素に対する成熟経路は、分泌段階、細胞外マトリクスでのプロ成熟型の存在、プロ配列の切断および成熟活性酵素の存在を含む。
サーモリシンおよび推定Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）δ毒素であるＣＬＨ＿２５７６に対する遺伝子配列アラインメントを図３で示す。この画像は、理論的に１つのポリペプチドとして転写される単一の単位として、全長プレプロ成熟アミノ酸配列を提示する。サーモリシンのＮ末端の最初の２８アミノ酸は、Ｓｅｒ２３２で終結する緑色の陰影付きのプロ配列に隣接することが示される。陰影なしの成熟アミノ酸配列はＩｌｅ２３３で始まる。ＳｉｇｎａｌＰプログラムを用いて、サーモリシンおよびＣＬＨ＿２５７６ポリペプチドが分泌されることが予想される。翻訳される推定Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）δ毒素は、識別可能なシグナル配列および分泌型タンパク質である可能性が非常に高い。サーモリシンタンパク質配列とＣＬＨδ毒素タンパク質配列との間に６５％の陽性の相同性がある。
両タンパク質のプロおよび成熟型の性質を理解するために、機能性に関して個別の配列として個々の領域を分析した。プロ配列アラインメントを図４で示す。２つのプロ配列型の間で５７％の陽性の相同性がある。Ｄｅｍｉｄｙｕｋら（２００８）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ ２７：３４３－３５４）によって、１００を超えるサーモリシン様プロテアーゼのプロ配列の一次構造分析の再評価が最近行われた。これらの試験者は、前駆体またはプロペプチドと呼ばれることもあるプロ配列内でかなりの変動性が存在することに気付いた。プロ配列は、対応する成熟酵素と比較して、突然変異に対してより耐性があった。それにもかかわらず、重要な残基での高度の保存および置換を示す領域は、機能を劇的に変化させ得ることが指摘された。図３の緑色の陰影付きの残基は、プロ配列が機能するのに重要であるアミノ酸残基を特定する。サーモリシンとＣＬＨ＿２７５６配列との間の相違は見付からない。サーモリシン配列におけるＩｌｅ１８３およびＡｒｇ１８４に対応する２個の残基に黄色の陰影を付すが；ＣＬＨ＿２７５６配列中の置換は、機能の変化を何ら引き起こさないと思われる類似のアミノ酸である。
重要なこととして、Ｓｅｒ１８５で始まるＣＬＨ＿２７５６配列の黄色の陰影により示されるように、プロ配列のＣ末端に非相同性の領域がある。この領域は、自己触媒の部位であり、ＣＬＨ＿２７５６配列は、成熟酵素の活性部位による切断に対する許容可能な基質ではないことが示唆される。Ｗｅｔｍｏｒｅら（１９９４）（Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２：７４７－７５９）によって、モデル酵素としてバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）サーモリシン様中性プロテアーゼを用いて、切断部位周囲のアミノ酸残基の重要性が調べられた。これらの試験者は、プロセシングが、切断部位から３残基上流のアミノ酸の性質に対して特に感受性であったと判断した。前駆タンパク質プロセシング部位周辺の配列について、コンセンサス配列を同定し、重要な残基での変化の結果、輸送が行われないかまたは成熟機能性酵素へのタンパク質のプロセシングが起こらなかった。コンセンサス配列の重要な特徴は、位置Ｐ３に非極性残基（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌ）、位置Ｐ１に極性残基またはＰｒｏ（Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ）および位置Ｐ１’に非極性残基が存在することであった。さらに、プロサーモリシン成熟は、セリンとイソロイシン残基との間で起こることが示されている（Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅら（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３００：５９９－６０３）。切断部位周囲で配列アラインメントを探索するために、サーモリシンに対するおよびＣＬＨ＿２５７６に対する前駆タンパク質プロセシング部位の比較配列評価を検査によって行い得る。前駆タンパク質プロセシングエリア中のＣＬＨ＿２５７６アミノ酸配列が、自己触媒を可能にするための適切なアミノ酸配置を含有しないことは明らかである。前駆タンパク質プロセシング部位が配列アラインメントに基づく予想部位と合理的に近いか否かを判断するために、ＣＬＨ＿２５７６アミノ配列について問い合わせるために理論的演習を行う場合、調整によって正確なアミノ酸配列が同定できるようにならないことは明らかである。前駆タンパク質プロセシング部位２残基をＣ末端側にずらすことによって、Ｗｅｔｍｏｒｅらの規則に違反しないアミノ酸の正確な配置が可能となる。しかし、Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅら（１９９４）（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３００：５９９－６０３）のＳｅｒ－Ｉｌｅ規則は存在しない。したがって、ＣＬＨ＿２５７６ポリペプチドの前駆タンパク質型は、自己触媒に対する適切な基質ではないと結論付けられる。正味の影響は、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）（クローン００４）の細胞ブロス中に成熟活性酵素が存在しないことである。
両タンパク質の成熟型を探索するために、比較配列アラインメントを図５で示す。図５での配列アラインメントの検査から、多くの必須のアミノ酸が保存されていることが示唆される。とりわけ、Ａｌａ１４０で始まるＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤ配列は、サーモリシンに対する活性部位の成分として同定されており、ＣＬＨ＿２５７６により示される高い相同性から、ＣＬＨδ毒素が、プロテアーゼのサーモリシンクラスのメンバーであることが示唆される（Ｋｏｏｉら（１９９６）、Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４５：２１９－２２５；Ｋｏｏｉら、（１９９７）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：４７２－４７７）。緑色の陰影付きの複数の残基が、結合または触媒に必須であるとして同定されている。この２分子の配列間の注目に値するある相違は、サーモリシンにおけるＧ１３５で始まるＧＧＩ領域である。アミノ酸残基のこのストレッチは、定められた機能が割り当てられていないサーモリシン様プロテアーゼにおいてよく保存されている（Ｆｒｉｇｅｒｉｏら（１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １０：２２３－２３０）。対応するＣＬＨ＿２５７６領域は、この配列においていくつかの顕著な相違を保持する。それにもかかわらず、全般的に相同性および必須のアミノ酸残基の保存性が高いことにより、およそ３５ｋＤａの予想分子量を有するδ毒素としてのＣＬＨ＿２５７６の選択が確認される。この評価は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９７０）（ＢＢＲＣ ３９：１０５８－１０６４）により与えられる情報と合致する。
まとめると、ゲノム配列分析を用いて推定ＣＬＨδ毒素が同定された。しかし、この配列の照合から、前駆タンパク質の切断が起こらず、この分子が非機能性となることが示唆される。したがって、Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ２１０００のクローン００４誘導体において発現され、分泌される場合、δ毒素は機能性ではないと推測される。
３．イプシロン（ε）毒素
ＭａｃＬｅｎｎａｎら（１９６２）（Ｂａｃｔ Ｒｅｖ ２６：１７６－２７４）およびＨａｔｈｅｗａｙは、酸素不安定性へモリシンとしてのＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のε毒素が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の他の株、例えばＣ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ノビー（Ｃ．ｎｏｖｙｉ）およびＣ．セプチクム（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）などにより産生されるものと血清学的に類似することを記載した。Ｂｏｗｅｎ（１９５２）（Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２５：１２４－１３８）は、α毒素活性に対して観察されるように、対数期中にε毒素が発現され、定常期中に分解され、同様にインビトロでプロテイナーゼによって分解されたことを明らかにした。
Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ゲノムのＢＬＡＳＴ分析の結果の検査によって、コレステロールに対する親和性を有するチオール活性化型のポア形成タンパク質のメンバーであるパーフリンゴリジンおよびテタノリシンと同じクラスのヘモリジンをコードするＯＲＦが同定された。このようなタンパク質は、コレステロール依存性細胞溶解素（ＣＤＣ）のファミリーの一部であり、これらは全て、別個のタンパク質配列および特有の構造を示す。完全なタンパク質配列が利用可能である２５を超えるＣＤＣタンパク質が同定されている。ＣＤＣは、全て５０－６０ｋＤａの分子量の範囲にあるグラム陽性細菌の様々な種により分泌されるβ－バレルポア形成毒素の一群である。原型のＣＤＣは、全ＣＤＣに対するモデルタンパク質となるパーフリンゴリジンである（Ｈｅｕｃｋら、２００７，ＪＢＣ ２８２：２２６２９－２２６３７）。ＣＤＣの典型的な構成は、水溶性単量体のタンパク質としての細胞外環境への輸出を促進するための切断可能なシグナル配列を含む。続いて、折り畳まれた単量体型が標的真核細胞膜に結合し、これにはコレステロール結合が介在し、次いで膜表面上でオリゴマー化して、細胞溶解に関与する弧状および環状構造を形成する。ＣＤＣは、チオール活性化細胞溶解素としても知られており、最初はヘモリジンとして記載されていた（Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎら、２０００）。
パーフリンゴリジンおよび推定ε毒素であるＣＬＨ＿１９２０に対する遺伝子配列アラインメントを図６で示す。この画像は、理論的に１つのポリペプチドとして転写される単一の単位としての全長（プレ＋成熟）タンパク質配列を示す。パーフリンゴリジンのＮ末端の最初の２９アミノ酸は、シグナルぺプチダーゼ切断部位のＬｙｓ２９の上に青い星印を付して示す。ＣＬＨ＿１９２０配列のＳｉｇｎａｌＰ分析によって、認識可能なシグナルペプチド切断部位は同定されず、非分泌型タンパク質であることが予想された。パーフリンゴリジンタンパク質配列とＣＬＨ＿１９２０推定ε毒素タンパク質配列との間には８４％の陽性の相同性がある。
緑色の陰影付きのアミノ酸残基は、２つのタンパク質間で保存される必須のアミノ酸を示す。重要なこととして、グルタミン４５８で始まる１１個のアミノ酸配列（ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ）は、ウンデカペプチド配列と呼ばれる必須領域である。成熟タンパク質領域と呼ばれる配列内で相同性が高いことに加え、このウンデカペプチド配列は、ＣＤＣとしてＣＬＨ＿１９２０タンパク質を同定するのに役立つ。したがって、分泌型タンパク質として作製される場合、ＣＬＨ＿１９２０タンパク質は、溶血性の機能性を有すると予想される。２つのタンパク質間の非相同性の単一領域を黄色の陰影で強調する。重要なこととして、ＣＤＣのＣ末端はコレステロール結合に重要であることが示されている（Ｓｈｉｍａｄａら、１９９９，ＪＢＣ ２７４：１８５３６－１８５４２）。ＣＤＣによる溶血の過程は、ポア形成前に結合および膜挿入という２つの重要な段階を含む。Ｓｈｉｍａｄａら（１９９９）（ＪＢＣ ２７４：１８５３６－１８５４２）は、Ｃ末端に対する中程度の変化が結合段階に影響を与えることを明らかにした。３’末端アミノ酸の変化は、ＥＬＩＳＡ法により測定した場合、コレステロール結合を大幅に減少させる。赤血球細胞における対応する溶血性活性は、Ｃ末端アミノ酸変化の深刻度に依存して協調的に低下したかまたは消去された。ＣＬＨ＿１９２０配列のＣ末端の検査から、パーフリンゴリジン配列と比較して、いくつかの顕著な相違が示される。
表４でまとめられるように、推定Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ε毒素の溶血性活性は、理論的なアミノ酸配列の２つの特性ゆえに存在しないかもしれない。第一に、この分子は、分泌されないと予想され；したがって、この分子は、標的細胞との相互作用に利用可能ではない。第二に、ＣＬＨ＿１９２０タンパク質のＣ末端は、コレステロール結合のための相同性領域を保持せず、このことから、溶血に付随する重要なエレメントが欠失しているかもしれないことが示唆される。
Figure 2022023041000005
非臨床的毒性研究から、インビボでのヘモリジンの効果の非臨床および形態学的な指標が明らかになった。局所およびＩＶボーラス投与により生成されたデータは、ε毒素などの溶血性毒素がないことを裏付ける。
溶血性毒素がないことは、各Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クローン００４発酵の終了時に従来から行われる血液寒天上への試験物質のプレーティングによって検証され得、これによってまた、外来物質増殖がないことも確認される。溶血性毒素の発現の結果、血液細胞の溶解が起こり、それによって、その結果、へモリシンを産生するコロニー周辺で明らかなハローの形成が起こる。コラゲナーゼＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）産生株は、ハローまたは排除ゾーンを生じさせず（図２参照）、これにより産生株においてε毒素および何らかの他の溶血性の物質がないことが裏付けられる。ＣＤＣの溶血性機能を検証するために、従来からのプレーティング試験を模倣するため、市販のテタノリシンを血液寒天に塗布した。結果を図７で示すが、これにより、リン酸緩衝食塩水中の１０μｃＬの１０μｇ／ｍＬテタノリシン溶液を血液寒天の表面に塗布し、次いで３７℃で２４時間温置した場合、β溶血性表現型が観察されたことが示される。したがって、試験物質中に機能性ＣＤＣが存在した場合、β溶血性表現型が観察されるはずである。
４．クロストリパインまたはガンマ（γ）－毒素
Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のγ毒素は、クロストリパイン、システインエンドぺプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２．８）として記載されている。Ｄａｒｇａｔｚら（１９９３）（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４０：１４０－１４５）は、クロストリパインに対するＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）遺伝子をクローニングし、配列決定し、この情報を受託番号Ｘ６３６７３下でＧｅｎＢａｎｋに寄託した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／Ｘ６３６７３．１）。ＣＬＨ＿１８６１γ毒素の一次構造を理解するために、ＣＬＨ＿１８６１γ毒素理論的配列とともにモデルタンパク質（Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）クロストリパイン）のＭＡＴＬＡＢ（登録商標）からのタンパク質配列アラインメントを作成した。結果を図８で与える。
図８の検査から、モデルクロストリパインとゲノム分析から得られる配列との間で相同性が非常に高い（９９％）ことが示される。実際に、３アミノ酸しか異ならず、この中で活性に必須であると同定される残基はない。機能性に必須であるとして文献の研究において同定される重要なアミノ酸を緑色の陰影で示す。両タンパク質のＳｉｇｎａｌＰ分析から、高い分泌スコアおよび、青い星印で示されるシグナル切断部位が示される（Ｌａｂｒｏｕら（２００４）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７１：９８３－９９２）。したがって、ＣＬＨ＿１８６１分子が分泌され、機能性であることが予想されよう。通常の出荷許可の一部として、残留クロストリパイン分析を行った。
クロストリパイン分析は、一般にＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）毒素に対する配列アラインメントアプローチの長所を裏付ける。機能性の毒素遺伝子の存在は、必ず、既知のモデルタンパク質と高度の相同性を共有したアミノ酸配列につながることが予測されよう。さらに、必須のアミノ酸残基の保存も機能性毒素遺伝子の特徴である。
ゲノム配列分析から得られる情報から、推定α、δおよびε毒素に対する遺伝子座が存在するという証拠が提供された。各毒素の理論的一次構造のさらなる分析から、各毒素のアミノ酸配列における重要な欠陥の結果として、各毒素の非機能型が予測されることが示された。とりわけ、αおよびε毒素は、ポア形成、溶血性分子の２つのクラスに対する相同体として割り当てられ得る。発酵の終了時に、通常の純度試験の一部として全バッチからの試料を血液寒天上にプレーティングする。コロニー周辺のハローまたは排除ゾーンの欠如から、培養および発酵において溶血性活性がないことが確認される。その結果として、発酵試料の端部周辺に溶血性ハローがないことから、継続してαおよびε毒素の両者とも存在しないことが明らかとなる。
表５は、配列分析からの結果を示し、機能性を予想する。この結果によって、なぜクローン００４が機能上、毒性がなく、溶血性活性の欠如を示したかが確認される。
Figure 2022023041000006
５．β毒素（コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ）のＣ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）配列分析
推定Ｃ．ヒストリチクム（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）β毒素遺伝子座の配列分析を図９および１０で与える。図９で示されるように、クローン００４の成熟コラゲナーゼＩのアミノ酸配列（ＣＬＨ＿１７６８および１７６９；配列番号３）は、翻訳ｃｏｌＧ配列（配列番号１９）とアミノ酸が３個異なる。図１０は、クローン００４の成熟コラゲナーゼＩＩのアミノ酸配列（ＣＬＨ＿２１１６；配列番号４）が、翻訳ｃｏｌＨ配列（配列番号２０）と８個のアミノ酸で異なることを示す。両コラゲナーゼとも完全に機能性である。
本明細書で言及する特許および科学文献は、当業者にとって利用可能である知識を立証する。本明細書中で引用される全ての米国特許および公開または未公開米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書中で引用される全ての公開外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中で引用される全ての他の公開参考文献、書類、稿本および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
（参考文献）
１． Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｉｎ Ｊ． Ｇｌａｓｇｏｗ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｐｒｏｃ． Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ． Ｃｏｎｆ． ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １２２－１３０． ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ， １９９８．
２． Ｈａｔｈｅｗａｙ （１９９０） Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ３ ：６６－９８．
３． Ｂａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６０：７８４－７９０．
４． Ｍｅｌｔｏｎ－ Ｗｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｂｉｏｃｈｅｍ ４５： １４３４７－１４３５４．
５． Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ ｉｍｍｕｎ ６５ ：４１３０－４１３４．
６． Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９７０） ＢＢＲＣ ３９ ： １０５８－１０６４．
７． Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅ ＆ Ｂｅａｕｍｏｎｔ （１９９６） ＪＢＣ ２７１ ：２６４７７－２６４８１．
８． Ｄｅｍｉｄｙｕｋ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ ２７ ：３４３－３５４．
９． Ｗｅｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２ ：７４７－７５９．
１０． Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ３００ ：５９９－６０３．
１１． Ｋｏｏｉ ＆ Ｓｏｋｏｌ （１９９６） Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４５：２１９－２２５．
１２． Ｋｏｏｉ ｅｔｌ ａ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５ ：４７２－４７７．
１３． Ｆｒｉｇｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １０：２２３－２３０．
１４． ＭａｃＬｅｎｎａｎ （１９６２） Ｂａｃｔ Ｒｅｖ ２６： １７６－２７４．
１５． Ｂｏｗｅｎ （１９５２） Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２５： １２４－ １３８．
１６． Ｈｅｕｃｋ ｅｔ ａｌ． （２００７） ＪＢＣ ２８２ ：２２６２９－２２６３７．
１７． Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０００） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １８２ ： １９７－２０５．
１８． Ｓｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＪＢＣ ２７４ ： １８５３６－１８５４２
１９． Ｄａｒｇａｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４０ ： １４０－１４５．
２０． Ｌａｂｒｏｕ ＆ Ｒｉｇｄｅｎ （２００４） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７１ ：９８３－９９２．
本発明を、その好ましい態様を参照して詳細に示し、記載してきたが、形態および詳細における様々な変形が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当業者により理解されよう。

Claims (17)

  1. 配列番号２の９１～３０６３位のヌクレオチドまたは配列番号２の９１～３０６３位のヌクレオチドの相補体と、前記配列番号２の９１～３０６３位のヌクレオチドまたはその相補体に操作可能に連結された異種制御配列と、を含む組み換え核酸分子。
  2. 前記制御配列がプロモーターである、請求項１に記載の組み換え核酸。
  3. 請求項１または２に記載の核酸によってコードされる、組み換えポリペプチド。
  4. 請求項１または２に記載の核酸を含む、発現カセット。
  5. 請求項１または２に記載の核酸または請求項４に記載の発現カセットを含む、ベクター。
  6. プラスミドである、請求項５に記載のベクター。
  7. 請求項５または６に記載のベクターを含む、組み換え宿主細胞。
  8. 前記宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の組み換え宿主細胞。
  9. 前記宿主細胞が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、酵母細胞、植物細胞、胸腺細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、またはラクトコッカス・ラクティス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）である、請求項８に記載の組み換え宿主細胞。
  10. 前記宿主細胞が、ラクトコッカス・ラクティス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞である、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
  11. 前記宿主細胞が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
  12. 成熟コラゲナーゼＩＩを産生する方法であって、請求項７～１１のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞を、前記核酸の発現に適切な条件下で培養することと、前記成熟コラゲナーゼＩＩを回収することと、を含む、方法。
  13. 成熟コラゲナーゼＩＩを産生する方法であって、配列番号２の９１～３０６３位のヌクレオチドを有する核酸を含むベクターまたはプラスミドを含む組み換え宿主細胞を培養することを含む、方法。
  14. 請求項１２または１３に記載の方法によって産生される、コラゲナーゼＩＩ。
  15. 医薬的に許容可能な担体と、請求項３に記載の組み換えポリペプチドと、を含む医薬組成物。
  16. コラーゲン介在状態に罹患している患者を処置する方法であって、請求項１５に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法。
  17. 前記状態が、デュプイトラン拘縮、ペイロニー病、癒着性関節包炎、外側上顆炎、手根管症候群、セルライト、および脂肪腫からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
JP2021150945A 2012-01-12 2021-09-16 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法 Active JP7354197B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261585909P 2012-01-12 2012-01-12
US61/585,909 2012-01-12
JP2019019694A JP6752309B2 (ja) 2012-01-12 2019-02-06 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法
JP2020138009A JP6947888B2 (ja) 2012-01-12 2020-08-18 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020138009A Division JP6947888B2 (ja) 2012-01-12 2020-08-18 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022023041A true JP2022023041A (ja) 2022-02-07
JP7354197B2 JP7354197B2 (ja) 2023-10-02

Family

ID=48782075

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014552282A Active JP6263755B2 (ja) 2012-01-12 2013-01-10 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法
JP2017224394A Active JP6496386B2 (ja) 2012-01-12 2017-11-22 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法
JP2019019694A Active JP6752309B2 (ja) 2012-01-12 2019-02-06 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法
JP2020138009A Active JP6947888B2 (ja) 2012-01-12 2020-08-18 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法
JP2021150945A Active JP7354197B2 (ja) 2012-01-12 2021-09-16 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014552282A Active JP6263755B2 (ja) 2012-01-12 2013-01-10 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法
JP2017224394A Active JP6496386B2 (ja) 2012-01-12 2017-11-22 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法
JP2019019694A Active JP6752309B2 (ja) 2012-01-12 2019-02-06 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法
JP2020138009A Active JP6947888B2 (ja) 2012-01-12 2020-08-18 クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法

Country Status (13)

Country Link
US (3) US9757435B2 (ja)
EP (4) EP3584317B1 (ja)
JP (5) JP6263755B2 (ja)
AU (6) AU2013208028B2 (ja)
BR (1) BR112014017229B1 (ja)
CA (2) CA2970639C (ja)
DK (2) DK3584317T5 (ja)
ES (2) ES2740499T3 (ja)
HU (2) HUE057423T2 (ja)
MX (1) MX351448B (ja)
NZ (5) NZ718173A (ja)
PT (2) PT3584317T (ja)
WO (1) WO2013106510A2 (ja)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2790717B1 (en) 2011-12-14 2018-05-30 The Board of Trustees of the University of Arkansas Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein
NZ718173A (en) * 2012-01-12 2017-09-29 Auxilium Int Holdings Inc Clostridium histolyticum enzymes and methods for the use thereof
RU2540919C1 (ru) * 2013-09-27 2015-02-10 Государственное автономное учреждение здравоохранения "Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения Республики Татарстан" Способ безоперационного лечения контрактуры дюпюитрена iii-iv степени тяжести
PT107276B (pt) * 2013-11-07 2018-06-07 Univ Aveiro Método para produção de colagenase recombinante para digestão de colagénios
WO2017074257A1 (en) * 2015-10-26 2017-05-04 Nanyang Technological University Non-viable derivatives of clostridium sporogenes as anti-cancer therapeutic agents
CN110582304A (zh) * 2016-12-08 2019-12-17 库尔维科公司 用于治疗或预防肝脏疾病的rna
WO2018104540A1 (en) * 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
WO2018148573A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Collagen-binding agent compositions and methods of using the same
JP2020511284A (ja) 2017-03-01 2020-04-16 エンド ベンチャーズ リミテッド セルライトを評価及び処置するための装置及び方法
KR102642381B1 (ko) 2017-03-28 2024-02-28 엔도 벤쳐즈 리미티드 개선된 콜라게나제 생성 방법
CZ308157B6 (cs) 2017-09-13 2020-01-29 MB PHARMA s.r.o. Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití
WO2020021330A2 (en) 2018-07-12 2020-01-30 Endo Global Aesthetics Limited Injection techniques for the treatment of cellulite
WO2020021332A2 (en) 2018-07-12 2020-01-30 Endo Global Aesthetics Limited Injection techniques for the treatment of cellulite
WO2020058755A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Endo Global Aesthetics Limited Compositions and methods for treating cellulite
CN109355222B (zh) * 2018-11-06 2020-06-02 上海交通大学 对水稻白叶枯病菌具有拮抗作用的芽孢杆菌及分离与应用
AU2020204922A1 (en) 2019-01-06 2021-07-01 Endo Global Aesthetics Limited Collagenase formulations and methods of producing the same
WO2020164721A1 (de) * 2019-02-14 2020-08-20 Nordmark Arzneimittel Gmbh & Co. Kg Chromatographische aufreinigung von wenigstens einem enzym, ausgesucht aus der gruppe bestehend aus kollagenase typ i, neutrale protease und clostripain
CN112941058B (zh) * 2021-04-02 2023-12-05 重庆科润生物医药研发有限公司 一种重组溶组织梭菌ii型胶原酶及其制备方法和应用
CN113025599B (zh) * 2021-04-02 2023-09-12 重庆科润生物医药研发有限公司 一种重组溶组织梭菌i型胶原酶及其制备方法和应用
WO2023112020A1 (en) * 2021-12-14 2023-06-22 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Modified recombinant collagenase, compositions comprising the same and uses thereof in dental related procedures

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009525283A (ja) * 2006-01-30 2009-07-09 オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド コラーゲン媒介疾患を処置するための組成物および方法
JP6496386B2 (ja) * 2012-01-12 2019-04-03 オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3821364A (en) * 1966-07-08 1974-06-28 Advance Biofactures Corp Process of producing collagenase
JPS5662229A (en) 1979-10-25 1981-05-28 Asahi Glass Co Ltd Electro-optical dimming panel
US4338300A (en) 1981-02-05 1982-07-06 The Regents Of The University Of California Use of purified clostridial collangenase in the treatment of Peyronie's disease
WO1984002653A1 (fr) 1983-01-05 1984-07-19 Pasteur Institut Preparation a activite collagenolytique ayant une activite elevee et compositions pharmaceutiques la contenant
US4524065A (en) 1983-08-04 1985-06-18 Bio-Specifics N.V. Method for the prevention and treatment of scars with enzymes
US4645668A (en) 1983-08-04 1987-02-24 Biospecifics, Nv Method for the prevention and treatment of scars with enzymes
US4542065A (en) 1984-05-21 1985-09-17 Ppg Industries, Inc. Chemically treated glass fibers and strands and dispersed products thereof
JPS61289885A (ja) 1985-06-14 1986-12-19 Nitta Zerachin Kk コラゲナ−ゼおよびコラゲナ−ゼの製造方法
JP2898022B2 (ja) 1989-09-05 1999-05-31 株式会社ニッピ コラーゲン分解酵素の製造方法
US5252461A (en) 1990-05-01 1993-10-12 The Regents Of The Univ. Of California Mixed immunoglobulins for detection of rheumatoid factors
CA2047306A1 (en) 1990-07-23 1992-01-24 Milan Holjevac Mutant bacterium clostridium histolyticum, a process for the obtaining thereof, and its use in the production of clostripain-free collagenase
US5393792A (en) 1991-11-20 1995-02-28 Advance Biofactures Of Curacao, N.V. High dosage topical forms of collagenase
US5462739A (en) 1991-11-21 1995-10-31 Yeda Research And Development Co., Ltd. Microdelivery device and method for enhanced drug administration to the eye
US5256140A (en) 1992-03-27 1993-10-26 Fallien Cosmeceuticals, Ltd. Composition for levelling skin
WO1994000580A1 (en) 1992-06-22 1994-01-06 Trigen, Inc. Molecular cloning of the genes reponsible for collagenase production from clostridium histolyticum
NZ259510A (en) 1992-12-30 1997-06-24 Bioteknologisk Inst Lactic acid bacterium containing an inserted promoter; isolation of dna therefor; preservation of food
JP3186881B2 (ja) 1993-02-18 2001-07-11 倉敷紡績株式会社 肝細胞の分離方法
US5332503A (en) 1993-04-16 1994-07-26 Baxter International Inc. Process for purifying collagenase
US5514340A (en) 1994-01-24 1996-05-07 Magnetix Biotechnology, Inc. Device for separating magnetically labelled cells
EP0766733A4 (en) 1994-06-24 1998-06-10 Boehringer Mannheim Corp GET A CLEAN MIX OF COLLAGENASE AND TWO OTHER PROTEASES FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM
US5589171A (en) 1994-08-22 1996-12-31 Advance Biofactures Of Curacao Treatment of Dupuytren's disease with collagenase
CA2158822C (en) 1994-09-27 2008-12-23 Kusuki Nishioka Therapeutic agent for rheumatic disease
US6958150B2 (en) 1994-12-15 2005-10-25 Advance Biofactures Of Curacao, N.V. Reduction of adipose tissue
WO1996028543A1 (de) 1995-03-16 1996-09-19 Knoll Aktiengesellschaft Neue, definierte enzymmischungen zur zellgewinnung und für die wundbehandlung
US5705170A (en) 1995-10-24 1998-01-06 Plantech International, Inc. Herbal cellulite treatments
US5989888A (en) 1996-01-24 1999-11-23 Roche Diagnostics Corporation Purified mixture of collagenase I, collagenase II and two other proteases
ES2185972T3 (es) 1996-09-06 2003-05-01 Bioteknologisk Inst Sistema de expresion regulable en bacterias productoras de acido lactico.
ATE272109T1 (de) * 1996-11-19 2004-08-15 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante collagenase typ i aus clostridium histolyticum und ihre verwendung zur isolierung von zellen und zellverbänden
US5830741A (en) 1996-12-06 1998-11-03 Boehringer Mannheim Corporation Composition for tissue dissociation containing collagenase I and II from clostridium histolyticum and a neutral protease
US5753785A (en) 1996-12-16 1998-05-19 Fina Technology, Inc. Production of E-B copolymers with a single metallocene catalyst and a single monomer
US6086872A (en) 1997-03-27 2000-07-11 Advance Biofactures Of Curacao, Nv Amelioration of dupuytren's disease
JPH10262658A (ja) 1997-03-28 1998-10-06 Kikkoman Corp ザルコシン・オキシダーゼの結晶、その製造方法及び三次元構造
NZ504160A (en) 1997-10-03 2001-08-31 Lavipharm Lab Inc A prolamine-plant polar lipid composition, its method of preparation and applications thereof
GB9724802D0 (en) 1997-11-24 1998-01-21 Unilever Plc Antiperspirant or deodorant compoistions
US20020036328A1 (en) 1998-11-16 2002-03-28 William R. Richards, Jr. Offset drain fermi-threshold field effect transistors
FR2788682B1 (fr) 1999-01-26 2001-04-06 Seb Sa Dispositif de thermographie
US6022539A (en) 1999-06-03 2000-02-08 Advance Biofactures Of Curacao Amelioration of peyronie's disease
RU2180002C2 (ru) 1999-08-16 2002-02-27 Пермское научно-производственное объединение "Биомед" Способ получения коллагеназы
AU6918700A (en) 1999-08-20 2001-03-19 Howard Murad Pharmaceutical compositions and methods for reducing the appearance of cellulite
US6280993B1 (en) * 1999-08-24 2001-08-28 Ichiro Yamato Gene encoding class I collagenase
ITMI991894A1 (it) 1999-09-09 2001-03-09 Carlo Ghisalberti Acido linoleico coniugato e trigliceride nuovi metodi di sintesi e d'uso
EP2332568A1 (en) 1999-09-24 2011-06-15 Proteon Therapeutics, Inc. Collagenase for opening obstructed biological conduits
US7811250B1 (en) 2000-02-04 2010-10-12 Boston Scientific Scimed, Inc. Fluid injectable single operator exchange catheters and methods of use
US20030026844A1 (en) 2000-04-18 2003-02-06 Hee-Yong Lee Injectable sustained release pharmaceutical composition and processes for preparing the same
AU2002210401B2 (en) 2000-10-20 2006-07-20 Bioneer A/S Fermentation method for production of heterologous gene products in lactic acid bacteria
AU3104102A (en) 2000-12-18 2002-07-01 Univ Texas Local regional chemotherapy and radiotherapy using in situ hydrogel
WO2002060410A2 (en) 2001-01-30 2002-08-08 The Regents Of The University Of Michigan Methods for sustained release local delivery of drugs for ablation of unwanted tissue
EP1402008B1 (de) 2001-07-02 2005-08-24 Nordmark Arzneimittel GmbH & Co.KG Verfahren zur aufreinigung eines enzyms und hiernach hergestelltes, aufgereinigtes enzym sowie verwendung des enzyms
GB0124124D0 (en) 2001-10-08 2001-11-28 Medical Res Council Methods of treatment
JP2003284553A (ja) 2002-03-28 2003-10-07 Seikagaku Kogyo Co Ltd 生理活性タンパク質
BR0215785A (pt) 2002-06-25 2006-06-06 Ultrashape Inc dispositivos e metodologias uteis para esteticas do corpo
EP1433845A1 (en) * 2002-12-23 2004-06-30 Georg-August-Universität Clostridium tetani collagenase and uses thereof
EP1462519A1 (en) 2003-03-24 2004-09-29 Boehringer Ingelheim Austria GmbH Method and devices for producing biomolecules
JP4205496B2 (ja) 2003-06-19 2009-01-07 三菱化学株式会社 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするｄｎａ、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
WO2005059111A2 (en) 2003-12-17 2005-06-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DELIVERY OF DNA OR RNA VIA GAP JUNCTIONS FROM HOST CELLS TO TARGET CELLS AND A CELL-BASED DELIVERY SYSTEM FOR ANTISENSE OR SiRNA
NZ576986A (en) 2004-01-30 2010-12-24 Shire Pharmaceuticals Ireland Ltd Production and purification of recombinant arylsulfatase A
JP5301152B2 (ja) 2004-04-07 2013-09-25 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション 神経成長因子アンタゴニストを投与することによって骨癌の疼痛を処置するための方法
ATE521355T1 (de) 2004-05-19 2011-09-15 Los Angeles Biomed Res Inst Verwendung eines detergens zur nicht- chirurgischen entfernung von fett
US7754230B2 (en) 2004-05-19 2010-07-13 The Regents Of The University Of California Methods and related compositions for reduction of fat
US7355027B2 (en) 2004-06-16 2008-04-08 Dynport Vaccine Company Llc Bacillus anthracis protective antigen
DE602005014117D1 (de) 2004-07-07 2009-06-04 Lundbeck As Valby H Neues carbamyliertes epo und verfahren zu dessen herstellung
MX2007000216A (es) 2004-07-08 2007-03-15 Amgen Inc Peptidos terapeuticos.
US20060020448A1 (en) 2004-07-21 2006-01-26 Microsoft Corporation Method and apparatus for capitalizing text using maximum entropy
JP4976131B2 (ja) 2004-08-30 2012-07-18 株式会社ダイセル ポリグリセリンモノエーテル及びその製造方法
JP4923131B2 (ja) 2004-08-30 2012-04-25 株式会社リコー ログ収集システム、ログ収集装置およびログ収集プログラム
US20150025420A1 (en) 2004-10-06 2015-01-22 Guided Therapy Systems, Llc Ultrasound treatment device and methods of use
DE102004060075A1 (de) 2004-12-14 2006-07-06 Merck Patent Gmbh Verfahren zur Herstellung von Onium-Salzen mit Dialkylphosphat-, Dialkylphosphinat oder (O-Alkyl)-alkyl- oder Alkyl-phosphonat-Anionen mit geringem Halogenid-Gehalt
US7854929B2 (en) 2005-01-21 2010-12-21 The Research Foundation Of State University Of New York Method for treating lateral epicondylitis using collagenase
ES2548516T3 (es) 2005-01-21 2015-10-19 The Research Foundation Of The State University Of New York Métodos para el tratamiento de la capsulitis adhesiva
US20070224184A1 (en) 2006-02-22 2007-09-27 The Research Foundation Of The State University Of New York Method for treating cellulite
JP2006254876A (ja) 2005-03-18 2006-09-28 Hokkaido Univ Ｌ−トリプトファン製造法
US20060241673A1 (en) 2005-04-21 2006-10-26 Zadini Filiberto P Subcision device
US20060251581A1 (en) 2005-05-09 2006-11-09 Mcintyre Jon T Method for treatment of uterine fibroid tumors
US20070003541A1 (en) 2005-07-01 2007-01-04 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for therapeutics
ITPD20050207A1 (it) 2005-07-07 2007-01-08 Fidia Farmaceutici Nuove composizioni farmaceutiche contenenti acido ialuronico e collagenas nel trattamento topico di ferite, ustioni ed ulcere
US20070031482A1 (en) 2005-08-02 2007-02-08 Ceramoptec Industries, Ind. PDT treatment method for cellulites and cosmetic use
WO2007100590A2 (en) 2006-02-22 2007-09-07 Auxilium Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cellulite
KR20090003281A (ko) 2006-03-31 2009-01-09 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 신체적 외관의 개선을 위한 화합물 및 화합물의 조합물의 신규한 용도
WO2008100833A2 (en) 2007-02-13 2008-08-21 Auxilium International Holdings, Inc. Production of recombinant collagenases colg and colh in escherichia coli
CN101678088B (zh) 2007-02-14 2014-01-08 友莱尔皮肤产品有限责任公司 修饰的突变体胶原蛋白酶及其在脂肪溶解和疤痕减少中的应用
MX2009012042A (es) 2007-05-11 2009-12-01 Sigma Tau Ind Farmaceuti Gel util para el suministro de ingredientes activos cosmeticos.
US9987221B2 (en) 2007-08-23 2018-06-05 Boston Scientific Scimed, Inc. Injectable hydrogel compositions
RU2492496C2 (ru) 2007-10-26 2013-09-10 Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. Световое детекторное устройство с выбором угла света
US20110262508A1 (en) 2007-11-07 2011-10-27 Paul Michael Watt Antimicrobial compositions, formulations and uses thereof
US20100159564A1 (en) * 2007-11-30 2010-06-24 Dwulet Francis E Protease resistant recombinant bacterial collagenases
EP2130551B1 (en) 2008-06-02 2012-06-06 Roche Diagnostics GmbH Improved purification of collagenases from clostridium histolyticum liquid culture
US8236356B2 (en) 2008-06-11 2012-08-07 Roche Diagnostics Operations, Inc. Growth medium for Clostridium histolyticum
CN102105133B (zh) 2008-07-21 2015-06-17 奥德纳米有限公司 控制释放型耳结构调节和先天性免疫系统调节组合物以及治疗耳部病症的方法
US8380531B2 (en) 2008-07-25 2013-02-19 Invivodata, Inc. Clinical trial endpoint development process
WO2010048409A1 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Allergan, Inc. Clinical assessment scales and methods
WO2010054978A1 (en) 2008-11-11 2010-05-20 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Compound useful for treating cellulite
WO2010058707A1 (ja) * 2008-11-19 2010-05-27 明治製菓株式会社 アフィニティタグが結合した融合コラゲナーゼおよびその製造法
IT1397646B1 (it) * 2009-12-15 2013-01-18 Seidita Collagenasi ricombinanti di c. histolyticum e metodo per la loro produzione.
WO2011109732A2 (en) 2010-03-05 2011-09-09 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Reverse thermal gels and uses therefor
US20130195828A1 (en) 2010-04-14 2013-08-01 Northwestern University Pharmaceutical Compositions and Methods for Digesting Atherosclerotic Plaques
US20130217789A1 (en) 2010-09-03 2013-08-22 North Carolina Central University Biodegradable liquogel and ph sensitive nanocarriers
ES2385239B1 (es) 2010-09-30 2013-06-19 Proteos Biotech S.L.U. Uso de colagenasa g recombinante, colagenasa h recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno.
US20120237492A1 (en) 2011-02-18 2012-09-20 Kythera Biopharmaceuticals, Inc. Treatment of submental fat
WO2012125948A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Biospecifics Technologies Corp. Compositions and methods for producing clostridial collagenases
TWI461214B (zh) 2011-06-13 2014-11-21 Univ Chang Gung Biodegradable water-sensitive glue, a drug delivery system as a carrier thereof, and a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of eye diseases
CN104114115B (zh) 2011-10-17 2017-02-22 声外科技术有限公司 用于处理脂肪团的超声波探头
BR112014009785B1 (pt) 2011-10-21 2020-06-30 Auxilium International Holdings, Inc. método cosmético para tratar ou reduzir panniculopatia fibrosclerótica edematória (pef)
ES2647895T3 (es) 2012-09-07 2017-12-27 Shiseido Company Ltd. Método para evaluar la celulitis y método para evaluar la eficacia de un fármaco contra la celulitis empleando fibulina-3 y/o sarcoglicano gamma como indicador
WO2014150545A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Mary Kay Inc. Cosmetic compositions and uses thereof
WO2014144859A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biospecifics Technologies Corporation Treatment method and product for uterine fibroids using purified collagenase
US20160000890A1 (en) 2013-03-15 2016-01-07 Biospecifics Technologies Corp. Thermosensitive hydrogel collagenase formulations
CN103751102A (zh) 2014-01-15 2014-04-30 上海交通大学 一种胶原酶温敏水凝胶及其制备方法和应用
SG11201610228RA (en) 2014-06-27 2017-01-27 Medytox Inc Methods and compositions of bile acids and salts for reduction of fat
WO2017139383A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 OutcomeMD, Inc. Determining a wellness, improvement, or effectiveness score
EP3532008B1 (en) 2016-10-28 2021-08-11 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA The cosmetic treatment of cellulite
JP2020511284A (ja) 2017-03-01 2020-04-16 エンド ベンチャーズ リミテッド セルライトを評価及び処置するための装置及び方法
KR102642381B1 (ko) 2017-03-28 2024-02-28 엔도 벤쳐즈 리미티드 개선된 콜라게나제 생성 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009525283A (ja) * 2006-01-30 2009-07-09 オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド コラーゲン媒介疾患を処置するための組成物および方法
JP6496386B2 (ja) * 2012-01-12 2019-04-03 オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2023229488A1 (en) 2023-09-28
US11879141B2 (en) 2024-01-23
US20180055918A1 (en) 2018-03-01
HUE046160T2 (hu) 2020-02-28
NZ627372A (en) 2016-04-29
NZ718173A (en) 2017-09-29
PT2802652T (pt) 2019-09-10
NZ766918A (en) 2023-03-31
CA2970639C (en) 2022-04-26
AU2016208384A1 (en) 2016-08-11
EP2802652B1 (en) 2019-06-05
HUE057423T2 (hu) 2022-05-28
JP6947888B2 (ja) 2021-10-13
JP2020188810A (ja) 2020-11-26
AU2019200192B2 (en) 2021-07-01
US9757435B2 (en) 2017-09-12
EP3584317B1 (en) 2021-11-24
AU2013208028A1 (en) 2014-08-07
WO2013106510A3 (en) 2013-10-03
US20200206326A1 (en) 2020-07-02
BR112014017229A2 (pt) 2017-06-13
DK2802652T3 (da) 2019-07-15
AU2013208028B2 (en) 2016-04-28
PT3584317T (pt) 2022-01-26
JP2018075011A (ja) 2018-05-17
CA2861033A1 (en) 2013-07-18
JP2015506176A (ja) 2015-03-02
DK3584317T3 (en) 2022-01-03
NZ733709A (en) 2022-10-28
DK3584317T5 (da) 2022-01-17
EP4276180A2 (en) 2023-11-15
CA2861033C (en) 2017-07-25
US20150010532A1 (en) 2015-01-08
JP6752309B2 (ja) 2020-09-09
CA2970639A1 (en) 2013-07-18
NZ750379A (en) 2022-10-28
JP7354197B2 (ja) 2023-10-02
EP4015627A1 (en) 2022-06-22
EP4276180A3 (en) 2024-01-10
AU2021221653A1 (en) 2021-09-23
AU2016208378B2 (en) 2018-10-11
ES2904884T3 (es) 2022-04-06
JP2019103505A (ja) 2019-06-27
EP4015627B1 (en) 2023-09-27
JP6263755B2 (ja) 2018-01-24
JP6496386B2 (ja) 2019-04-03
BR112014017229B1 (pt) 2022-05-17
EP2802652A4 (en) 2015-10-14
AU2016208378A1 (en) 2016-08-18
ES2740499T3 (es) 2020-02-05
AU2016208384B2 (en) 2018-09-13
AU2016208384C1 (en) 2023-10-05
AU2021221653B2 (en) 2023-10-05
AU2019200192A1 (en) 2019-04-04
BR112014017229A8 (pt) 2017-07-04
MX351448B (es) 2017-10-16
EP3584317A1 (en) 2019-12-25
MX2014008441A (es) 2015-03-13
US20230416717A1 (en) 2023-12-28
US10603365B2 (en) 2020-03-31
WO2013106510A2 (en) 2013-07-18
EP2802652A2 (en) 2014-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6947888B2 (ja) クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）酵素およびその使用のための方法
CN111295196A (zh) 控制皮肤酶活性的分子细菌疗法
US11975054B2 (en) Nucleic acid molecules encoding clostridium histolyticum collagenase I and methods of producing the same
WO2022226020A2 (en) Engineering b cell-based protein factories to treat serious diseases

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210916

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220823

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20221118

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230123

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20230228

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230627

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20230817

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230829

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230920

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7354197

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150