BR112014017229B1

BR112014017229B1 - Ácido nucleico recombinante, cassette de expressão, vetor, célula hospedeira recombinante, método de produção da colagenase i ou ii, colagenase i ou ii, composição farmacêutica, e método de produção de um produto de droga

Info

Publication number: BR112014017229B1
Application number: BR112014017229-3A
Authority: BR
Inventors: Wayne K. Herber
Original assignee: Auxilium International Holdings, Inc
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2022-05-17
Also published as: MX2014008441A; NZ627372A; US11879141B2; EP3584317B1; JP6752309B2; MX351448B; JP2018075011A; CA2970639C; AU2019200192A1; NZ718173A; JP7354197B2; EP2802652A2; US20230416717A1; EP3584317A1; DK2802652T3; DK3584317T5; US9757435B2; WO2013106510A2; JP2020188810A; EP2802652A4

Abstract

ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE , POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE , MÉTODO DE PRODUÇÃO DA COLAGENASE I OU COLAGENTASE II, COLAGENASE I OU COLAGENTASE II, COLAGENASE I OU COLAGENTASE II, COMPOSIÇÃO E FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA DETECÇÃO DA SECREÇÃO DE UMA TOXINA HEMOLÍTICA DE UMA CEPA DE PRODUÇÃO BACTERIANA, MÉTODO PARA DETECÇÃO DA PRESENÇA DE UMA TOXINA HEMOLÍTICA EM UM PRODUTO DE DROGA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE DROGA CONSISTINDO NA COLAGENASE I E COLAGENASE II E PRODUTO DE DROGA COMPREENDENDO COLAGENASE. A invenção refere-se ácido nucleico e polipeptídeos recombinantes que codificam a colagenase I e a colagenase II, métodos para a preparação das mesmas e métodos para a utilização das mesmas. A invenção também engloba métodos relacionados à liberação de uma composição que compreende a colagenase antes da administração terapêutica.

Description

PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N°. 61/585.909 depositado em 12 de janeiro de 2012. Todo o conteúdo do pedido acima referido é incorporado por referência neste documento.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Colágeno é o principal constituinte estrutural dos organismos mamíferos e torna-se uma grande parcela do conteúdo da proteína total da pele e outras partes do corpo animal. Em humanos, é particularmente importante nos processos de ferida que cura o processo e envelhecimento natural. Vários traumas de pele, incluindo queimaduras, cirurgia, e infecção, são caracterizados pelo acúmulo de tecido fibroso rico em colágeno e tendo aumentado o conteúdo proteoglicano. Além da substituição do tecido normal que tenha sido danificado ou destruído, depósitos excessivos e desfigurantes do novo tecido às vezes formam durante o processo de cicatrização. A deposição de colágeno em excesso tem sido atribuída a um distúrbio no equilíbrio entre a síntese de colágeno e a degradação do colágeno.

[003] Doenças e condições associadas com deposição de colágeno em excesso e o acúmulo irregular de tecido fibroso rico em colágeno pode ser referido como "doenças mediada por colágeno". Colagenase, uma enzima que tem a capacidade específica de digerir o colágeno, tem sido usada para tratar uma variedade de doenças mediadas por colágeno, incluindo, por exemplo, contratura de Dupuytren, doença de Peyronie, lipoma e capsulite adesiva. Patente U.S. Nos. 6.086.872 e 5.589.171, incorporados a adendo por referência, divulgam o uso de preparações de colagenase no tratamento da doença de Dupuytren. Patente U.S. N°. 6.022.539, incorporados a adendo por referência, divulgam o uso de preparações de colagenase no tratamento da doença de Peyronie. Patente U.S. Nos. 6.958.150 e 7.842.673, incorporados a adendo por referência, divulgam o uso de colagenase para o tratamento de lipoma. Publicação do Pedido de Patente U.S. N°. 2006/020448A1, incorporados a adendo por referência, divulgam o uso de colagenase no tratamento da capsulite adesiva. Colagenase para uso na terapia pode ser obtido de uma variedade de fontes, incluindo fontes de mamíferos, fúngicas e bacterianas. Uma fonte comum de colagenase bruto é de um processo de fermentação bacteriana, especificamente a fermentação de Clostridium histolyticum (C. histolyticum). A colagenase bruta obtida da C. histolyticum pode ser purificado usando qualquer um de um número de técnicas cromatográficas.

[004] Uma desvantagem da fermentação de bactérias é que várias toxinas serão produzidas, que se presente na composição terapêutica, seria prejudicial para a saúde do paciente. Por exemplo, fermentação C. histolyticum resulta na síntese de toxinas hemolíticas alfa e épsilon, que pode causar a Lise das células vermelhas do sangue (hemólise), podendo levar a crise hemolítica e anemia hemolítica. Crise hemolítica ocorre quando existe uma rápida destruição de grande número de células vermelhas do sangue em conjunto com a incapacidade do organismo para repor os glóbulos vermelhos rapidamente o suficiente para restabelecer os níveis normais dos glóbulos vermelhos. Uma crise hemolítica faz com que a anemia hemolítica aguda (e, muitas vezes grave), e pode resultar em fadiga, falta de ar, tontura, dor de cabeça, frieza nas mãos e pés, pele pálida, dor no peito, icterícia, dor no abdômen superior, úlceras de perna e dor, reações graves de uma transfusão de sangue, arritmias, um coração aumentado e insuficiência cardíaca. Para assegurar que a preparação de colagenase terapêutica não contém toxinas hemolíticas que possam ser expressas durante a fermentação de C. histolyticum, é apresentado um método para liberar um produto de drogas antes da administração de um paciente.

[005] Como discutido acima, colagenase para uso em terapia pode ser obtido de uma variedade de fontes tais como fontes bacterianas (por exemplo, da fermentação de C. histolyticum). Seria útil desenvolver fontes adicionais de colagenase como formas recombinantes de enzimas colagenase.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Em alguns aspectos, a presente invenção é baseada na descoberta de sequências polinucleotídicas mutantes que codificam a colagenase funcional I e a colagenase II. A invenção, portanto, engloba ácidos nucleicos recombinantes e polipeptídeos que compreendem a nova sequência polinucleotídicas ou polipeptídica e métodos para o uso dos mesmos. A presente invenção também fornece um método para detectar a secreção de uma toxina hemolítica por uma cepa de produção bacteriana, em que a cepa de produção produz uma colagenase, antes da administração terapêutica da referida colagenase a um paciente e métodos para detectar a presença de uma toxina hemolítica em uma composição de colagenase.

[007] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a uma molécula de ácidos nucleicos recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 (sequência nucleotídica da colagenase I) ou o complemento da SEQ ID NO: 1. Em certos aspectos, o ácido nucleico recombinante ainda compreende uma sequência reguladora heteróloga operacionalmente ligada ao polinucleotídeo. Em determinadas modalidades adicionais, a invenção é uma molécula de ácidos nucleicos recombinantes, consistindo de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1. Ainda em outros aspectos, a invenção refere-se a uma molécula de ácidos nucleicos recombinantes, consistindo de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1 e uma sequência heteróloga reguladora operacionalmente ligados ao polinucleotídeo.

[008] Em outra modalidade, a invenção é dirigida a uma molécula de ácido nucleico recombinante, compreendendo um polinucleotídeo tendo a sequência da SEQ ID NO: 2 (sequência nucleotídica da colagenase II) ou o complemento da SEQ ID NO: 2. Em certos aspectos, o ácido nucleico recombinante ainda compreende um promotor heterólogo operativamente ligado a um polinucleotídeo. Em determinadas modalidades adicionais, a invenção é uma molécula de ácidos nucleicos recombinantes, consistindo de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 2. Ainda em outros aspectos, a invenção refere-se a uma molécula de ácidos nucleicos recombinantes, consistindo de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 2 e uma sequência heteróloga reguladora operacionalmente ligada ao polinucleotídeo.

[009] A invenção também inclui recombinantes polipeptídeos codificados por um ácido nucleico recombinante, compreendendo um polinucleotídeo tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[0010] Em determinadas modalidades adicionais, a invenção é direcionada para uma cassette de expressão, compreendendo um ácido nucleico recombinante, em que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[0011] Ainda em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada a um vetor compreendendo um ácido nucleico recombinante, em que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo.

[0012] Em um outro aspecto, a invenção é direcionada para uma célula hospedeira recombinante compreendendo o vetor ou plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. A invenção também engloba um método da produção de colagenase I ou colagenase II compreendendo o cultivo da célula hospedeira, sob condições adequadas para a expressão do ácido nucleico e recuperando a colagenase I ou colagenase II. A invenção inclui também uma enzima de colagenase produzida pelo cultivo da célula hospedeira recombinante.

[0013] Em algumas modalidades, a invenção é direcionada para uma colagenase I produzida recombinantemente que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma colagenase II produzida recombinantemente que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma colagenase I produzida recombinantemente que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, ou uma colagenase II produzida recombinantemente que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0014] Também incluídas na presente invenção estão as composições farmacêuticas compreendendo colagenase I conforme descrito neste documento, colagenase II, conforme descrito neste documento, ou uma combinação destes. Em certos aspectos, a presente invenção destina-se a uma composição farmacêutica, compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou uma combinação destes. Em certos aspectos adicionais, a presente invenção destina-se a uma composição farmacêutica, compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, ou uma combinação destes. Além disso, a invenção inclui métodos de tratar uma doença mediada por colágeno compreendendo administrar uma quantidade eficaz da colagenase I, colagenase II ou uma combinação destes.

[0015] Como discutido acima, a invenção abrange métodos para detectar a secreção de uma toxina hemolítica por uma cepa de produção bacteriana e métodos para detectar a presença de uma toxina hemolítica em uma composição de colagenase.

[0016] Em uma modalidade da invenção, uma cepa bacteriana que produz colagenase é testada para a produção de toxinas hemolíticas usando um ensaio de hemólise. Em um aspecto, o ensaio de hemólise é executado usando um substrato de ágar sangue.

[0017] Em outra modalidade, um produto de colagenase é testado para a presença de toxinas hemolíticas usando um ensaio de hemólise. Em certos aspectos, o ensaio de hemólise é executado usando um substrato de ágar sangue. Em outros aspectos, o ensaio de hemólise é realizado detecção fotométrica da hemoglobina liberada. A ausência de toxinas hemolíticas, conforme determinado por um ensaio de hemólise ou detecção fotométrica, apoiaria a liberação do produto da droga para administração terapêutica.

[0018] Várias cepas de bactérias produtoras de colagenase podem ser analisadas para a atividade hemolítica de acordo com um método da invenção, para apoiar a liberação de um produto da droga de colagenase para administração terapêutica. Por exemplo, membros dos gêneros Actinobacillus, Actinomadura, Bacillus, Bacteriodes, Bifidobacterium, Brucella, Capnocytophaga, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium, Flavobacterium, Fusobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Serratia, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus, Treponema e Vibrio podem ser analisados para a atividade hemolítica de acordo com um método da invenção, para apoiar o liberação de um produto da droga de colagenase para administração terapêutica.

[0019] Em outra modalidade, um produto de colagenase produzido por, e purificado de, uma cepa da bactéria produtora de colágeno é analisada para a atividade hemolítica de acordo com um método da invenção, para apoiar a liberação de um produto da droga de colagenase para administração terapêutica. Em algumas modalidades, a cepa de produção é selecionada a partir de, mas não se limitando aos gêneros listados acima. Em outro aspecto da invenção, a cepa de produção é uma cepa de Escherichia coli (E. coli), incluindo as formas de E. coli que foram transformadas com formas recombinantes de colagenase I e colagenase II. Em certos aspectos da invenção, a cepa de produção é uma cepa de Clostridium perfringens (C. perfrigens). Em outros aspectos, a cepa da produção é uma cepa de C. histolyticum.

[0020] Em outra modalidade da invenção, a composição da colagenase é analisada para a atividade hemolítica de acordo com um método da invenção, em que a composição de colagenase compreende uma combinação da colagenase I e colagenase II purificada de C. histolyticum. Em uma modalidade adicional, a invenção é um método de produzir um produto de droga consistindo da colagenase I e II de C. histolyticum, em que o referido método compreende testar uma cepa bacteriana de produção para a ausência de uma toxina hemolítica funcional, secretada de acordo com um método da invenção.

[0021] Em outra modalidade, a invenção é um método de purificação de uma composição de colagenase bruto, em que o referido método compreende purificação da composição por cromatografia de filtração e coluna, seguida pela confirmação da ausência de uma toxina hemolítica de acordo com um método descrito neste documento.

[0022] Em uma outra modalidade, a invenção é um método de tratamento de uma condição mediada por colágeno em um paciente em necessidade dos mesmos, em que o referido método compreende a administração ao referido paciente uma quantidade eficaz de um produto da droga compreendendo colagenase, em que a ausência de uma toxina hemolítica na droga do referido produto ou em uma cepa de produção bacteriana produzindo a referida colagenase é confirmado de acordo com um método da invenção antes da administração do produto de droga referida a um paciente, e/ou formulação da colagenase em uma composição farmacêutica.

[0023] Kits de testes para a presença ou ausência de toxinas hemolíticas em uma amostra também são descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0024] O exposto anteriormente e outros objetos, características e vantagens da invenção estarão evidentes a partir da seguinte descrição mais específica das modalidades preferenciais da invenção, conforme ilustrado nas figuras acompanhantes nas quais caracteres de referência semelhantes referem-se às mesmas partes ao longo de vistas diferentes. As figuras não estão necessariamente em escala, em vez dá-se ênfase sobre a ilustração dos princípios da invenção.

[0025] A FIG. 1 mostra o alinhamento da proteína de toxina alfa de Clostridium septicum (C. septicum) com a toxina alfa putativa de C. histolyticum CLH_2834 e 2835. A sequência de aminoácidos da toxina alfa de C. septicum (SEQ ID NO: 7) é a sequência superior em cada linha. O C. histolyticum CLH_2834 & 2835 (SEQ ID NO: 8) é a sequência inferior em cada linha. A sequência sublinhada, sombreada é o terminal N da toxina alfa madura de C. septicum. Os asteriscos acima dos aminoácidos mostram resíduos essenciais não conservados críticos para a funcionalidade (identifica incompatibilidade em sequência). O sombreamento mostra resíduos essenciais conservados (confirma a identidade). A sequência da numeração é baseada na sequência de C. septicum.

[0026] A FIG. 2 mostra o plaqueamento do ágar sangue de C. septicum. As setas indicam atividade hemolítica beta.

[0027] A FIG. 3 mostra o alinhamento de aminoácidos da termolisina de Bacillus proteolyticus com a toxina delta putativa de C. histolyticum CLH_2576. A sequência superior em cada linha mostra a sequência da proteína termolisina de Bacillus proteolyticus (B. proteolyticus) (SEQ ID NO: 9). A sequência inferior em cada linha é a sequência de C. histolyticum CLH_2576 (SEQ ID NO: 10). O sombreamento verde mostra a região pró- proteína. A numeração é baseada na sequência da termolisina.

[0028] A FIG. 4 mostra o alinhamento de aminoácidos da pró- sequência da termolisina de B. proteolyticus com ao toxina delta putativa de C. histolyticum CLH_2576. A sequência superior em cada linha é a pró- sequência da proteína termolisina de B. proteolyticus (SEQ ID NO: 11). A sequência inferior em cada linha é a pró-sequência de C. histolyticum CLH_2576 (SEQ ID NO: 12). Os asteriscos acima dos aminoácidos mostram os resíduos essenciais não conservados críticos para a funcionalidade (identifica incompatibilidade na sequência). O sombreamento verde mostra os resíduos essenciais conservados (confirma a identidade). A numeração é baseada na sequência de termolisina.

[0029] A FIG. 5 mostra o alinhamento da proteína de sequência madura da termolisina de B. proteolyticus com a toxina delta putativa de C. histolyticum CLH_2576. A sequência superior em cada linha é a sequência madura da termolisina de B. proteolyticus (SEQ ID NO: 13). A sequência inferior em cada linha é C. histolyticum CLH_2576 (SEQ ID NO: 14). Os asteriscos acima dos aminoácidos mostram resíduos essenciais não conservados críticos para a funcionalidade (identifica incompatibilidade na sequência). O sombreamento verde mostra os resíduos essenciais conservados (confirma a identidade). A numeração é baseada na sequência de termolisina.

[0030] A FIG. 6 mostra o alinhamento de proteína da perfringolisina de C. perfringens com ao toxina épsilon putativa de C. histolyticum CLH_1920. A sequência superior em cada linha é a sequência de aminoácidos da perfringolisina de C. perfringens (SEQ ID NO: 15). A sequência inferior em cada linha é a sequência de aminoácidos de C. histolyticum CLH_1920 (SEQ ID NO: 16). A estrela azul mostra o sítio de clivagem da peptidase sinal da perfringolisina K43. Os asteriscos acima dos aminoácidos mostram resíduos essenciais não conservados críticos para a funcionalidade (identifica incompatibilidade na sequência). O sombreamento verde mostra os resíduos essenciais conservados (confirma a identidade). A numeração é baseada na sequência de perfringolisina.

[0031] A FIG. 7 mostra o fenótipo beta hemolítico da tetanolisina.

[0032] A FIG. 8 mostra o alinhamento da proteína de clostripaína de C. histolyticum com a toxina gama putativa de C. histolyticum CLH_1861. A sequência superior em cada linha é a sequência de aminoácidos da clostripaína de C. histolyticum (SEQ ID NO: 17). A sequência inferior em cada linha é a sequência de aminoácidos de C. histolyticum CLH_1920 (SEQ ID NO: 18). Os asteriscos acima dos aminoácidos mostram resíduos essenciais não conservados críticos para a funcionalidade (identifica incompatibilidade na sequência). O sombreamento verde mostra os resíduos essenciais conservados (confirma a identidade). A numeração com base na sequência de clostripaína X63673.

[0033] A FIG. 9 mostra uma comparação de alinhamento entre a sequência de aminoácidos traduzida da colG e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (a sequência de aminoácidos traduzida de CLH_1768 e 1769; a sequência superior). Conforme mostrado na FIG. 9, a proteína madura codificada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 difere da sequência de aminoácidos traduzida da sequência de aminoácidos da colG por três aminoácidos. O terminal N da proteína madura começa na Ile 119 da sequência de SEQ ID NO: 3. A sequência de aminoácidos da proteína madura começando na Ile 119 da SEQ ID NO: 3 é a SEQ ID NO: 5.

[0034] A FIG. 10 mostra uma comparação de alinhamento da sequência de aminoácidos traduzida de colH e SEQ ID NO: 4 (a sequência de aminoácidos traduzida de CLH_2116; a sequência mais baixa). Conforme mostrado na FIG. 10, a proteína madura codificada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 difere da sequência dos aminoácidos da colG traduzida em oito aminoácidos. O terminal N da proteína madura começa na Ala 31 na colG e na SEQ ID NO: 4. A sequência dos aminoácidos da proteína madura começando na Ala 31 da SEQ ID NO: 4 é a SEQ ID NO: 6.

[0035] A FIG. 11 mostra a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 (CLH_1768 e 1769; colagenase I).

[0036] A FIG. 12 mostra a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 (CLH_2116; colagenase II).

[0037] A FIG. 13A e 13B mostram ao sequência de aminoácidos e de nucleotídeos da SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 21, respectivamente (CLH_2835 e CLH_2834; toxina alfa).

[0038] A FIG. 14A e 14B mostram a sequência de aminoácidos e de nucleotídeos da SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 22, respectivamente (CLH_2576; toxina delta).

[0039] A FIG. 15A e 15B mostram a sequência de aminoácidos e de nucleotídeos da SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 23, respectivamente (CLH_1920; toxina épsilon).

[0040] A FIG. 16A e 16B mostram a sequência de aminoácidos e de nucleotídeos da SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 24, respectivamente (CLH_1861; toxina gama).

[0041] A FIG. 17A mostra a sequência dos aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (colG).

[0042] A FIG. 17B mostra a sequência dos aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

[0043] A FIG. 18A mostra a sequência dos aminoácidos da SEQ ID NO: 4 (colH).

[0044] A FIG. 18B mostra a sequência dos aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0045] Segue uma descrição das modalidades preferenciais da invenção.

[0046] As palavras "um" ou "uma" são feitos para abranger um ou mais, a menos que especificado de outra forma. Por exemplo, "uma toxina hemolítica" refere-se a uma ou mais toxinas hemolíticas.

[0047] A prática da presente invenção vai empregar, salvo indicação em contrário, as técnicas convencionais de cultura celular, biologia molecular, microbiologia, célula biologia e imunologia, que estão bem dentro dos versados na técnica. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura. Veja, por exemplo, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al. (1995), "Short Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons; Methods in Enzymology (vários volumes); Methods in Cell Biology (vários volumes), e Methods in Molecular Biology (vários volumes); o conteúdo de cada um dos quais é expressamente incorporado por referência neste documento.

A. Ácidos nucleicos e proteínas recombinantes

[0048] Uma importante fonte de colagenase é a partir da fermentação de C. histolyticum. Uma formulação injetável compreendendo a colagenase I e colagenase II de C. histolyticum é vendida sob a marca XIAFLEX® e é aprovado pelo U.S. Food and Drug Administration para o tratamento da contratura de Dupuytren. As sequências de aminoácido para colagenase I e colagenase II codificadas pelo colG e genes colH, respectivamente, tem sido descritas na literatura. Por exemplo, colG é descrito no GenBank Ac. No. D87215 e Matsushita et al. (1999), Journal of Bacteriology 181(3): 923- 933, e colH foi descrito em GenBank Ac. No. D29981 e Yoshihara et al. (1994), Journal of Bacteriology 176(21): 6489-6496, o conteúdo de cada uma das quais são expressamente incorporados por referência neste documento. A presente invenção é baseada parcialmente na análise de sequenciamento dos genes codificando a colagenase I e colagenase II em uma cepa de C. histolyticum (Clone 004 descrito abaixo nos Exemplos) que produzem e secretam a colagenase I e colagenase II funcionais. As sequências dos nucleotídeos dos genes codificando a colagenase I e colagenase II foram encontrados serem diferentes das sequências da literatura descrita por C. histolyticum (por exemplo, GenBank Ac. Nos. D87125 e D29981) (SEQ ID NO: 19 e 20) (FIGs. 9 e 10).

[0049] Colagenase I e colagenase II são metaloproteases e exigem zinco ligado firmemente e cálcio ligado frouxamente para sua atividade (Eddie L. Angleton and H. E. Van Wart, Biochemistry 1988, 27, 7406 - 7412). Colagenase I e colagenase II têm ampla especificidade para todos os tipos de colágeno (Steinbrink, D; Bond, M and Van Wart, H; (1985), JBC, 260 p2771-2776). Colagenase I e colagenase II digerem o colágeno por hidrólise da região em tripla-hélice do colágeno sob condições fisiológicas (Steinbrink, D; Bond, M and Van Wart, H; (1985), JBC, 260 p2771-2776). Mesmo que cada colagenase mostre especificidade diferente (por exemplo, cada uma tem uma sequência amino preferencial diferente para clivagem), juntas, elas tem atividades sinérgicas em direção ao colágeno (Mandl, I., (1964), Biochemistry, 3: p.1737-1741; Vos-Scheperkeuter, GH, (1997), Cell Transplantation, 6: p.403-412).

[0050] A invenção engloba uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo ou consistindo de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou o complemento da SEQ ID NO: 1. Em certos aspectos, o ácido nucleico recombinante ainda compreende uma sequência reguladora heteróloga operacionalmente ligada ao polinucleotídeo. A invenção ainda engloba uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo ou consistindo de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 2 ou o complemento da SEQ ID NO: 2. Em certos aspectos, o ácido nucleico recombinante ainda compreende um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um polinucleotídeo.

[0051] A invenção também engloba polipeptídeos recombinantes codificados pelos ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos. Em alguns aspectos, os polipeptídeos recombinantes são codificados pelos ácidos nucleicos recombinantes compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos selecionados do grupo constituído pela SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Nas modalidades adicionais, o polipeptídeo recombinante compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (a proteína colagenase I madura, começando na Ile 119 da SEQ ID NO: 3 na FIG. 9) ou SEQ ID NO: 6 (a proteína colagenase II madura, começando na Ala 31 da SEQ ID NO: 4 na FIG. 10). Em outra modalidade, o polipeptídeo recombinante consiste a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

[0052] Em outra modalidade, a invenção é direcionada para um ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo que compreende ou consiste a sequência dos aminoácidos da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO: 4. Em uma outra modalidade, a invenção é direcionada para um ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo que compreende ou consiste a sequência dos aminoácidos da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Num outro aspecto, o ácido nucleico recombinante compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

[0053] Um ácido nucleico recombinante é uma molécula de ácido nucleico que contém, além de uma sequência de polinucleotídeos descrita neste documento (por exemplo, a sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2), uma outra sequência de nucleotídeos heteróloga codificante ou não-codificante. O termo "heteróloga" significa que o polinucleotídeo origina-se de uma espécie diferente ou da mesma espécie, no entanto, de outro local no genoma do que a referida sequência nucleotídica adicionada. Polipeptídeos ou proteínas recombinantes referem- se a polipeptídeos ou proteínas produzidas utilizando técnicas de recombinação, por exemplo, aquelas proteínas ou polipeptídeos produzidos a partir das células transformadas por um construto de ácido nucleico exógeno codificando o polipeptídeo ou proteína desejada.

[0054] A invenção refere-se também aos ácidos nucleicos que compreendem a sequência polinucleotídicas da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, em que o referido ácido nucleico está operacionalmente ligado a uma sequência reguladora. A invenção ainda refere-se aos ácidos nucleicos compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, em que o referido ácido nucleico está operativamente ligado a uma sequência reguladora. Sequências reguladoras incluem aquelas sequências reguladoras que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e/ou aquelas que direcionam a expressão da sequência de nucleotídeos apenas em certas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras de tecido específico). Exemplos não limitantes de sequências reguladoras são promotores e potenciadores. Sequências reguladoras também incluem outros elementos de controle de expressão, por exemplo, aqueles descritos em Goeddei, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), cujos conteúdos são expressamente incorporados por referência neste documento. Um ácido nucleico é "operacionalmente ligado" a uma sequência reguladora quando a molécula de ácido nucleico está ligada à sequência reguladora de uma forma que permite a expressão da sequência do ácido nucleico.

[0055] A molécula de ácido nucleico aqui descrita pode, além disso, ser fundida a uma sequência de marcador, por exemplo, uma sequência que codifica um polipeptídeo para ajudar no isolamento ou purificação do polipeptídeo. Tais sequências incluem, mas não estão limitadas àquelas que codificam uma proteína de fusão glutationa-S-transferase (GST), aquelas que codificam um marcador de polipeptídeo da hemaglutina A (HA) da gripe, e aquelas que codificam o peptídeo hexa-histidina, tais como a marcação fornecida em um vetor pQE (Qiagen, Inc.). Em certos aspectos, a invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, em que o referido polipeptídeo está fundido a uma sequência de aminoácidos do marcador.

[0056] Em um outro aspecto, a invenção é direcionada a um ácido nucleico que é uma variante da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Uma variante do ácido nucleico é um ácido nucleico que inclui uma substituição, adição ou deleção de nucleotídeos, em relação a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em alguns aspectos, a variante é um ácido nucleico que codifica sequências de aminoácidos idênticas ou substancialmente idênticas como aquelas sequências dos nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Como será entendido pelo versado na técnica, devido à degeneração do código genético, várias sequências diferentes dos ácidos nucleicos podem codificar uma dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU, cada, codificam o aminoácido alanina. Assim, por exemplo, em cada posição onde um aminoácido específico é especificado por um códon, o códon pode ser alterado a qualquer um dos códons correspondentes que codificam o mesmo aminoácido sem alterar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Um dos versados na técnica vai entender que cada códon numa sequência nucleotídica (exceto AUG, que é o único códon para metionina, e TGG, que é geralmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica.

[0057] Em determinadas modalidades, a invenção é direcionada para o polipeptídeo compreendendo ou consistindo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, em que um ou mais aminoácidos foram deletados ou adicionados, em que o polipeptídeo possui a atividade de degradar ou lisar o colágeno. Ainda em uma modalidade adicional, o polipeptídeo compreende ou consiste a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, em que o polipeptídeo possui a atividade de degradar ou lisar do colágeno e em que o polipeptídeo compreende ou consiste de uma sequência de aminoácido que é diferente das sequências do aminoácido do GenBank Ac. Nos. D87125 (SEQ ID NO: 19) e D29981 (SEQ ID NO: 20). Em certos aspectos, quando um aminoácido é substituído, a substituição é uma mudança do aminoácido conservador. Uma mudança de aminoácido conservador é, por exemplo, substituição de um aminoácido apolar para outro aminoácido apolar ou substituição de um aminoácido polar para um outro aminoácido polar ou substituição de um aminoácido positivamente carregado por outro aminoácido positivamente carregado e afins. Por exemplo, os aminoácidos apolares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; aminoácidos (básicos) carregados positivamente incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos (ácidos) carregados negativamente incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

[0058] Um ácido nucleico isolado e um polipeptídeo isolado não estão sob a forma ou o ambiente em que eles existem na natureza. Por exemplo, um ácido nucleico isolado é aquele está separado dos nucleotídeos que normalmente flanqueiam a molécula de ácido nucleico na natureza. Ácidos nucleicos recombinantes e os ácidos nucleicos recombinantes dentro de um vetor são também um exemplo de um ácido nucleico isolado. Além disso, moléculas isoladas dos ácidos nucleicos incluem moléculas de ácidos nucleicos recombinantes em células hospedeiras heterólogas, bem como substancialmente ou parcialmente moléculas de ácido nucleico purificadas na solução.

[0059] Conforme descrito em mais detalhes abaixo, a invenção também engloba células recombinantes, como células bacterianas, células fúngicas, células de plantas, células de inseto, células de aves, as células de anfíbios, e células de mamíferos, compreendendo as moléculas de ácido nucleico aqui descritas.

[0060] Um cassette de expressão é uma sequência de nucleotídeos que é capaz de afetar a expressão de um gene estrutural (ou seja, uma sequência de codificação da proteína, como a colagenase da invenção) em uma célula compatível com tais sequências. Cassettes de expressão podem incluir um promotor operacionalmente ligado à sequência codificante do polipeptídeo; e, opcionalmente, a outras sequências, por exemplo, sinais de terminação da transcrição. Fatores adicionais necessários ou úteis em efetuar a expressão também podem ser utilizados, por exemplo, potenciadores.

[0061] A invenção também se refere a vetores compreendendo um ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade, o ácido nucleico é SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, ou um complemento respectivo. Em outra modalidade, o ácido nucleico é um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência do aminoácido da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Um "vetor" é uma molécula de ácido nucleico, capaz de transportar um outro ácido nucleico, ao qual foi ligada. Um exemplo não limitante de um vetor é um plasmídeo que é um DNA de fita dupla circular no qual pode ser ligado a um segmento de DNA adicional. Outro exemplo de um vetor é um vetor viral, em que um segmento de DNA adicional é ligado no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos, tendo uma origem bacteriana da replicação e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, os vetores de mamíferos não epissomais) são integrados no genoma de uma célula hospedeira, mediante a introdução na célula hospedeira e desse modo são replicados junto ao genoma do hospedeiro. Vetores de expressão são capazes de direcionar a expressão dos genes aos quais estão ligados operacionalmente. Tais vetores de expressão incluem, por exemplo, plasmídeos. A invenção abrange outros vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus deficientes na replicação, adenovírus e adenovírus associados) que são capazes de direcionar a expressão gênica. Como será apreciado pelo versado na técnica, o design do vetor de expressão depende de vários fatores, tais como a escolha da célula hospedeira para ser transformado, o nível de expressão da proteína desejada, e similares. Vetores de expressão incluem uma ou mais sequências reguladoras que são selecionadas com base na célula hospedeira a ser usada para a expressão. Como discutido acima, a sequência reguladora está operacionalmente ligada ao ácido nucleico a ser expressa, por exemplo, um ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, a sequência reguladora é uma sequência reguladora nativa da célula hospedeira transformada. Um vetor de expressão pode compreender um ou mais marcadores selecionáveis, incluindo, mas não se limitando ao gene que codifica a dihidrofolato redutase e os genes que conferem resistência à neomicina, tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol, canamicina e resistência à estreptomicina.

[0062] Células hospedeiras procariotas e eucariotas podem transfectadas pelos vetores descritos neste documento. Células hospedeiras que podem ser transfectadas com os vetores da presente invenção incluem, mas não estão limitadas às células bacterianas, tais como E. coli (por exemplo, cepas de E. coli K12), Streptomyces, Pseudomonas, Serratia marcescens e Salmonella typhimurium, células de inseto (baculovirus), incluindo Drosófila, células fúngicas, como células de levedura, células de planta e células de mamíferos, tais como timócitos, células de ovário de hamster chinês (CHO), células COS e células de lactococcus lactis. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana. Ainda em outra modalidade, a célula hospedeira é uma cepa de E. coli. Ainda numa modalidade adicional, a célula hospedeira é célula de lactococcus lactis. Métodos para a produção de polipeptídeos recombinantes em bactérias de lactococcus lactis tem sido descrito, por exemplo, na Pat. U.S. N°. 7.358.067, cujo conteúdo é expressamente incorporado por referência neste documento. Em uma modalidade, a célula hospedeira é lactococcus lactis e o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 operacionalmente ligado ao promotor P170 regulável de pH e seus derivados. O promotor P170 e seus derivados têm sido descritos em detalhe na WO 94/16086 e WO 98/10079, cujo conteúdo é incorporado por referência neste documento.

[0063] Ligando a molécula de ácido nucleico em um construto de gene, como um vetor de expressão e transformando ou transfectando nos hospedeiros, tanto eucariontes (levedura, aves, inseto, planta ou mamíferos) quanto procariontes (células bacterianas), são procedimentos padrão. Um vetor aqui descrito pode ser introduzido nas células procarióticas ou eucarióticas usando técnicas convencionais de transfecção ou de transformação, incluindo, mas não se limitando ao fosfato de cálcio ou co-precipitação com cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE- dextrano, lipofecção ou eletroporação. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser isolados ou purificados (por exemplo, a homogeneidade) da cultura das células recombinantes por uma variedade de processos.

[0064] A invenção abrange métodos de produzir uma colagenase I ou colagenase II funcional ou uma combinação compreendendo seu cultivo numa célula hospedeira, transformada ou transfectada com um vetor compreendendo um ácido nucleico da invenção. Além disso, o método compreende isolar o polipeptídeo do meio ou a célula hospedeira. Uma colagenase funcional é um polipeptídeo que tem uma atividade biológica de uma colagenase de ocorrência natural, por exemplo, uma colagenase que possui a capacidade de degradar o colágeno.

[0065] O polipeptídeo pode ser isolado por métodos, incluindo, mas não se limitando à cromatografia de troca aniônica ou catiônica, precipitação por etanol, cromatografia de afinidade e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou uma combinação de qualquer um destes. O método particular usado dependerá das propriedades do polipeptídeo e a seleção da célula hospedeira; métodos adequados serão evidentes para aqueles versados na técnica.

[0066] Em algumas modalidades, a invenção é um método de produção de colagenase I ou colagenase II, o referido método compreendendo as etapas de (i) construir uma bactéria recombinante que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou o polinucleotídeo que codifica a sequência do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3, 4, 5 ou 6 operacionalmente ligado a uma sequência reguladora apropriada; (ii) cultivar a referida bactéria recombinante sob condições adequadas para expressar o gene, e (iii) colher a partir da bactéria recombinante, a colagenase I ou colagenase II. A colagenase I e colagenase II podem ser purificadas por uma variedade de métodos conhecidos para aqueles versados na técnica, incluindo cromatografia de afinidade do ligante de corante, cromatografia de afinidade à heparina, precipitação por sulfato de amônio, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca iônica e cromatografia de quelação de metal. Em algumas modalidades, a colagenase I e colagenase II são purificadas através de filtração e cromatografia em coluna e a colagenase I e II purificadas são combinados em uma proporção de cerca de 1 para 1 usando métodos descritos na Pat. U.S. N°. 7.811.250, cujo conteúdo é expressamente incorporado por referência neste documento.

[0067] Exemplos de doenças mediadas por colágeno que podem ser tratadas pelas composições (compreendendo colagenase I, colagenase II ou uma combinação destas codificadas pelos ácidos nucleicos aqui descritos e/ou compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e/ou SEQ ID NO: 4) e métodos da invenção incluem, mas não se limitam a, doença de Dupuytren, doença de Peyronie, ombro congelado (capsulite adesiva), queloides, cicatrizes hipertróficas, cicatrizes deprimidas, tais como as resultantes de acne inflamatória; aderências pós-cirúrgica, acne vulgaris, lipomas, e condições desfigurantes tais como rugas, formação de celulite e fibrose neoplásica. Patente U.S. Nos. 6.086.872 e 5.589.171, incorporadas a adendo por referência, divulgam o uso de preparações de colagenase no tratamento da doença de Dupuytren. Patente U.S. No. 6.022.539, incorporada a adendo por referência, divulgam o uso de preparações de colagenase no tratamento da doença de Peyronie.

[0068] Além de sua utilização no tratamento de doenças mediadas por colágeno, uma composição compreendendo um polipeptídeo recombinante aqui descrito também é útil para a dissociação do tecido nas células individuais e aglomerados de células como é útil em uma ampla variedade de laboratório, aplicações diagnósticas e terapêuticas. Esses pedidos envolvem o isolamento de muitos tipos de células para vários usos, incluindo células endoteliais microvasculares para propagação de prótese vascular sintética de pequeno diâmetro, hepatócitos para terapia gênica, dispositivos de assistência ao fígado extracorpóreo e triagem da toxicologia da droga, condrócitos para regeneração de cartilagem, e ilhotas de Langerhans para o tratamento da diabetes mellitus dependente da insulina. Tratamento com enzima funciona para fragmentar proteínas da matriz extracelular e proteínas que mantêm contato célula a célula. uma vez que o colágeno é o componente da proteína primário da ultraestrutura de tecido, a enzima colagenase tem sido frequentemente usada para realizar a desintegração do tecido desejado. Em geral, a composição da presente invenção é útil para qualquer pedido onde a remoção de células ou a modificação de uma matriz extracelular são desejadas.

[0069] A invenção abrange composições farmacêuticas compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e colagenase I e/ou colagenase II produzidas de acordo com um método descrito neste documento. Em outra modalidade, as composições farmacêuticas compreendem colagenase I compreendendo ou consistindo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5. Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica compreende colagenase II compreendendo ou consistindo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6. Em ainda outro aspecto, a composição farmacêutica compreende um carreador farmaceuticamente aceitável e uma colagenase I e colagenase II conforme descrito neste documento. Em um outro aspecto, a composição farmacêutica compreende um carreador farmaceuticamente aceitável e a colagenase I e colagenase II na proporção de massa de 1:1. A composição farmacêutica da presente invenção compreende uma quantidade eficaz de uma colagenase da presente invenção formulada juntamente com uma ou mais carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

B. Métodos de detecção da presença de uma toxina hemolítica

[0070] Em algumas modalidades, a invenção abrange métodos de detectar a presença de uma toxina hemolítica em uma fermentação bacteriana, em que a fermentação bacteriana produz uma colagenase. Em certos aspectos, a invenção fornece um método para liberar um produto da droga de colagenase antes da administração terapêutica de substância da droga de colagenase referida a um paciente que compreende a detecção da presença de uma toxina hemolítica da cepa de produção do produto de droga. O termo "cepa de produção do produto droga", "cepa de produção", "cepa de produção da colagenase" e "cepa de produção bacteriana" são usados de forma intercambiável e refere-se a uma cepa bacteriana do qual é obtida uma colagenase. Em outros aspectos, a invenção fornece um método para liberar um produto da droga de colagenase antes da administração terapêutica do produto da droga de colagenase referida a um paciente que compreende a detecção da presença de uma toxina hemolítica do produto de droga.

[0071] Como usado aqui, a frase "liberação de um produto da droga de colagenase" significa para confirmar a ausência de uma toxina hemolítica do produto de droga de colagenase. Entende-se que os termos "substância da droga", "produto da droga" ou "composição de colagenase" pode ser usada de forma intercambiável. Também como usado aqui, os termos "hemolisina" e "toxina hemolítica" são usados permutavelmente e referem-se a uma toxina que é responsável para a lise de células vermelhas sanguíneas.

[0072] Descobriu-se que o produto da droga e cepa de produção de colagenase pode ser analisado a presença ou ausência de atividade hemolítica, garantindo que a substância da droga de colagenase fornece uma atividade enzimática altamente reprodutível e ideal e efeito terapêutico superior, enquanto reduzindo o potencial de efeitos colaterais. Em conformidade com a invenção, métodos são fornecidos para análise do produto das drogas ou a produção da cepa para a secreção ou a presença de uma toxina hemolítica funcional que pode estar co-presente com colagenase no produto droga. A invenção engloba um método de análise de uma amostra de teste para a presença de uma toxina hemolítica, em que a amostra compreende uma cepa de produção bacteriana ou uma composição de colagenase, compreendendo a incubação do teste de amostra com células vermelhas do sangue, seguido por detecção de lise das células vermelhas do sangue.

[0073] Métodos específicos para a detecção de lise das células vermelhas do sangue são descritos em toda a literatura, incluindo, por exemplo, 1) Ryan KJ and Ray CG. Principles of laboratory diagnosis. Em Sherri’s medical microbiology: an introduction to infectious diseases. Ryan KJ, Ray CG, and Sherris JC (eds.) McGraw-Hill Professional, 2004; 229260; e 2) Eschbach E et al. Improved erythrocyte lysis assay in microtitre plates for sensitive detection and efficient measurement of hemolytic compounds from ichthyotoxic algae. Journal of Applied Toxicology 21, 513519 (2001), o conteúdo de cada um dos quais é expressamente incorporado por referência neste documento.

[0074] Em uma modalidade da invenção, o método compreende amostras de incubação de uma cepa de produção de colagenase, uma colagenase parcialmente purificada isolada de uma cepa de produção de colagenase, ou um produto da droga de colagenase em um substrato de ágar sangue e observando o ágar sangue para as zonas de afastamento após o período de incubação, em que uma zona de afastamento indica a lise das células vermelhas do sangue. Se o produto da cepa bacteriana foi testado, a lise das células vermelhas do sangue indica a secreção de uma toxina hemolítica funcional da cepa de produção bacteriana. Se uma colagenase parcialmente purificada ou um produto de droga de colagenase foi testado, a lise das células vermelhas do sangue indica a presença de uma toxina hemolítica funcional na colagenase parcialmente purificada ou nos produtos de droga de colagenase. Em determinadas modalidades, a cepa de produção é uma cepa de C. histolyticum. A ausência de uma zona de afastamento indica a ausência de uma toxina hemolítica. A ausência observada das zonas de afastamento indica ou confirma a ausência de toxinas hemolíticas da cepa de produção de colagenase, na colagenase parcialmente purificada ou do produto de droga de colagenase e permiti que o produto da droga seja liberado para a administração terapêutica.

[0075] Em outra modalidade, o método compreende a incubação de células vermelhas do sangue com extratos tomados a partir de uma cepa de produção de colagenase, ou com uma colagenase parcialmente purificada isolada de uma cepa de produção de colagenase, ou com um produto de droga de colagenase, seguido pela análise fotométrica da mistura de incubação para a lise das células vermelhas, como indicado pelo aparecimento de hemoglobina na mistura de incubação. Uma toxina hemolítica irá lisar as células vermelhas, liberando hemoglobina na amostra incubada. A detecção fotométrica de hemoglobina pode fornecer um ensaio sensível para detecção da presença de toxinas hemolíticas. Em um aspecto, as células vermelhas são incubadas com extratos retirados de uma cepa de produção de colagenase, ou com uma colagenase parcialmente purificada isolada de uma cepa de produção de colagenase ou com um produto da droga de colagenase e em seguida analisando fotometricamente os extratos para a presença de hemoglobina no comprimento de onda de 540 nm. Em outro aspecto, a análise fotométrica é realizada no comprimento da onda de 414 nm. Ainda em outro aspecto, incubação e análise fotométrica podem ser executadas usando placas de microtitulação. A ausência de hemoglobina e, portanto, a ausência de toxinas hemolíticas, permitiria a liberação do produto da droga para administração terapêutica a um paciente.

[0076] Toxinas hemolíticas encontradas no C. histolyticum pertencem a duas famílias diferentes de hemolisinas: hemolisinas semelhantes a aerolisina e hemolisinas de oxigênio lábil. As hemolisinas semelhantes a aerolisina são sintetizadas pela bactéria como pré-proteínas inativas que são secretadas para o ambiente extracelular como pró-toxinas inativas. As pró-toxinas inativas ligarão os receptores em uma membrana de célula alvo, por exemplo, receptores em uma célula vermelha do sangue, onde as pró-toxinas são clivadas em suas estruturas ativas por proteases. Uma vez ativada, a oligomerização das toxinas na superfície da célula em um complexo pré-poro, seguido por inserção de um barril beta na membrana da célula alvo. O barril beta forma um poro na membrana, permitindo o rápido influxo de íons cálcio para a célula, com consequências tóxicas para a célula. A toxina alfa de C. histolyticum é mais provavelmente uma hemolisina semelhante a aerolisina, como foi descoberta por compartilhar significativa homologia com a toxina alfa de Clostridium septicum, que é um membro da família semelhante a aerolisina de toxinas, e que possuem atividade hemolítica (ver, por exemplo, o Exemplo 1 abaixo).

[0077] Toxina épsilon de C. histolyticum, e tetanolisina de Clostridium tetani (C. tetani), têm sido descritas como uma hemolisina de oxigênio lábil [Hatheway CL. Clin Microbiol Rev 3(1): 66-98 (1990)]. Toxina épsilon de C. histolyticum foi descoberta por compartilhar homologia com tetanolisina, que é um membro de toxinas formadoras de poros de barril beta ativadas por tiol com afinidade para o colesterol. Essas proteínas são parte de uma família de Citolisinas Dependentes de Colesterol (CDC). Estas proteínas são secretadas pela bactéria no ambiente extracelular, como proteínas monoméricas solúveis em água, onde elas se ligam às membranas da célula alvo, mediadas pela ligação de colesterol. A toxina então oligomerizada na superfície da membrana para formar arcos e estruturas semelhantes a anel que são responsáveis pela citólise. A toxina épsilon de C. histolyticum é conhecida por ser uma hemolisina de oxigênio lábil, e é semelhante sorologicamente àquelas hemolisinas de oxigênio lábil produzidas por outras cepas de Clostridium, como C. tetani, C. novyi, e C.septicum.

[0078] Em certos aspectos, a invenção é direcionada para um método de detectar a presença de toxina alfa de C. histolyticum em uma cepa de produção bacteriana usando um ensaio descrito neste documento. Em outros aspectos, a invenção é direcionada para um método de detectar a presença de toxina alfa de C. histolyticum em um produto de drogas. Em um outro aspecto, a invenção é direcionada para um método de detectar a presença da toxina épsilon de C. histolyticum em uma cepa de produção bacteriana. Em outro aspecto, a invenção é direcionada para um método de detectar a presença da toxina épsilon de C. histolyticum em um produto de drogas. Ainda em um aspecto adicional, a invenção é direcionada para um método de detectar a presença de toxina alfa e a toxina épsilon de C. histolyticum em uma cepa de produção bacteriana. Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada para um método de detectar a presença de toxina alfa e a toxina de C. histolyticum em um produto da droga.

[0079] A invenção engloba também um método de produzir um produto de droga consistindo de colagenase I e colagenase II, no qual a colagenase I e II são obtidas a partir de C. histolyticum, e em que o método compreende as etapas de fermentação de uma cepa de C. histolyticum na qual a ausência de uma toxina hemolítica secretada funcional foi confirmada, incubando a cepa de produção com células vermelhas sob condições adequadas para lise das células vermelhas do sangue por uma toxina hemolítica, em que a lise das células vermelhas do sangue indica secreção de uma toxina hemolítica e em que a ausência de lise das células vermelhas do sangue indica a ausência de uma toxina hemolítica. Em outro aspecto, a invenção é direcionada para um método de produzir um produto de droga consistindo de colagenase I e II, em que a colagenase I e II são obtidas a partir de C. histolyticum, e em que o método compreende as etapas de confirmar a ausência de uma toxina hemolítica secretada funcional no produto da droga pela incubação do produto droga com células vermelhas do sangue em condições adequadas para lise das células vermelhas do sangue por uma toxina hemolítica, em que a lise das células vermelhas do sangue indica a secreção de uma toxina hemolítica e em que a ausência de lise das células vermelhas do sangue indica a ausência de uma toxina hemolítica.

[0080] Outros aspectos da invenção incluem métodos de purificação de uma composição de colagenase bruta compreendendo a purificação da composição por filtração e cromatografia em coluna, seguido pela confirmação da ausência de uma toxina hemolítica incubando uma amostra da composição purificada com células vermelhas do sangue em condições adequadas para lise das células vermelhas do sangue por uma toxina hemolítica, em que a lise das células vermelhas do sangue indica a secreção de uma toxina hemolítica e em que indica a ausência de lise das células vermelhas do sangue a ausência de uma toxina hemolítica.

[0081] Como discutido acima, várias doenças e condições estão associadas com a deposição de colágeno em excesso e o acúmulo irregular de tecido fibroso rico em colágeno e podem ser tratadas com produtos de droga de colágeno. Tais doenças e condições são coletivamente referidas neste documento como "doenças mediadas por colágeno". A invenção também engloba um método de tratamento de uma doença mediada por colágeno em um paciente com necessidade disso, em que a composição compreendendo colagenase é administrada ao referido paciente e em que, antes da referida administração, a referida composição ou cepa de produção bacteriana é analisada para a presença ou ausência das toxinas hemolíticas usando um método descrito neste documento. Exemplos de condições mediadas por colágeno que podem ser tratadas pelas composições e métodos descritos neste documento incluem mas não estão limitados a: Doença de Dupuytren; doença de Peyronie; ombro congelado (capsulite adesiva), queloides; cicatrizes hipertróficas; cicatrizes deprimidas, tais como as resultantes de acne inflamatória; aderências pós- cirúrgica; acne vulgaris; lipomas e condições desfigurantes tais como rugas, formação de celulite e fibrose neoplásica. Em certos aspectos, a composição analisada é administrada a um paciente para o tratamento das doenças de Peyronie ou de Duputyren ou da capsulite adesiva.

[0082] No que diz respeito à cepa de produção que pode ser analisada de acordo com um método da invenção, sabe-se, por exemplo, que a colagenase é expressa por bactérias que são membros dos gêneros Actinobacillus, Actinomadura, Bacillus, Bacteriodes, Bifidobacterium, Brucella, Capnocytophaga, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium, Flavobacterium, Fusobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Serratia, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus, Treponema e Vibrio. Em uma modalidade da invenção, a cepa de produção é selecionada dos gêneros listados acima. Em outra modalidade, a cepa de produção é uma cepa de E. coli, incluindo as formas de E.coli que foram transformadas com formas recombinantes de colagenase I e colagenase II. Em uma modalidade mais preferida, a cepa de produção é uma cepa de C.perfringens. Em uma modalidade mais preferida, a cepa de produção é uma cepa de C. histolyticum (C. his).

[0083] Em certos aspectos, a cepa de produção produz uma composição de colagenase compreendendo uma mistura de colagenase I e colagenase II. Em uma outra modalidade, a cepa de produção utilizada para produzir uma mistura de colagenase I e colagenase I é C. histolyticum. Em outra modalidade, o produto de droga de colagenase compreende uma mistura de colagenase I e colagenase II altamente purificadas de C. histolyticum em uma proporção em massa de cerca de 1 para 1.

[0084] Kits para testar a presença de hemolisinas em uma amostra também são apresentados, em que uma hemolisina é uma substância que causa a lise das células vermelhas do sangue. Os kits permitem a identificação das substâncias de teste que são hemolíticas, ou que contêm, hemolisinas. Substâncias de teste incluem, mas não estão limitadas a, substâncias químicas, biológicas e emissoras de radiação. Em uma modalidade, o kit compreende materiais para testar a presença de hemolisinas em uma amostra teste incluindo, por exemplo, um kit compreendendo células vermelhas do sangue e materiais de ensaio relacionados. Em outra modalidade, o kit compreende uma placa de Petri compreendida por ágar sangue, um controle positivo, e um controle negativo constituído por uma cepa bacteriana em que os genes hemolíticos são uma mutação ou nocauteados, e em que proteínas funcionais hemolíticas não são produzidas. Em outra modalidade, o kit compreende células vermelhas do sangue, placas de microtitulação, um controle positivo e um controle negativo contido no produto de droga.

[0085] Como será compreendido, os kits inventivos e métodos podem ser usados para detectarem a presença ou ausência de hemolisinas nas composições de colagenase, em que a colagenase é obtida a partir de uma bactéria.

[0086] A colagenase bruta obtida de C. histolyticum pode ser purificada por uma variedade de métodos conhecidos para aqueles versados na técnica, incluindo cromatografia de afinidade do ligante de corante, cromatografia de afinidade à heparina, precipitação por sulfato de amônio, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca iônica e cromatografia de quelação de metal. Colagenase bruta e parcialmente purificada é comercialmente disponível de várias fontes, incluindo o Advance Biofactures Corp., Lynbrook, New York. Métodos de purificação de colagenase bruta obtida de C. histolyticum também são descritos na Pat. U.S. No. 7.811.560, cujo conteúdo é expressamente incorporado por referência neste documento. Em determinadas modalidades, o procedimento de purificação compreende as etapas de: a) filtração da colheita bruta através de um filtro da cápsula de troca aniônica MUSTANG Q; b) adição do sulfato de amônio; preferencialmente a uma concentração final de 1M; c) filtração da colheita bruta; de preferência através de um filtro de 0,45 μm; d) submeter o flitrado através de uma coluna HIC; de preferência uma fenil sepharose 6FF (sub baixo); e) adição de leupeptina ao filtrado; de preferência a uma concentração final de 0,2 mM para o produto eluído pós-HIC; f) remoção do sulfato de amônio e manutenção da leupeptina para ligação correta da colagenase I e colagenase II com troca de tampão por TFF; de preferência com troca do tampão por TFF; g) filtração da mistura da etapa; (f) de preferência através de um filtro de 0,45 μm; h) separando a colagenase I e colagenase II usando Q-Sepharose HP; i) preparando a concentração de TFF e formulação de colagenase I e colagenase II separadamente; em que TFF é uma filtração de fluxo tangencial usando 10 e/ou 30 K MWCO (corte de peso molecular ) PES ou RC-polietersulfona ou membranas de filtro de celulose regeneradas (TFF fornece um meio para reter e concentrar as proteínas selecionadas e trocar a proteína da solução-tampão de uma para outra); e j) filtração através de um sistema de filtração de 0,2 μm.

C. Toxinas Alfa, Beta, Delta, Épsilon e Gama de C. histolyticum

[0087] As sequências de aminoácidos das toxinas alfa, delta e épsilon do Clone 004 de C. histolyticum são mostradas nas Figuras e são SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 16, respectivamente. As sequências de nucleotídeos das toxinas alfa, delta e épsilon do Clone 004 deC. histolyticum também são mostradas nas Figuras e são SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, e SEQ ID NO: 23, respectivamente. Cada uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 tem características da sequência que processam estas proteínas não funcionais e/ou não secretadas.

[0088] Para a toxina gama (clostripaína), existem apenas três diferenças dos aminoácidos quando comparados com a proteína de modelo (consulte a seção de Exemplos) e nenhum dos resíduos de aminoácidos que são encontrados para diferir na toxina gama do Clone 004 de C. histolyticum toxina gama foram identificados como essenciais para a atividade. Prevê-se assim, que a toxina gama do Clone 004 de C. histolyticum (tendo a sequência de aminoácidos do SEQ ID NO: 18) é secretada e funcional. A sequência de nucleotídeos da toxina gama do Clone 004 C. histolyticum é SEQ ID NO: 24.

[0089] Como discutido acima, as toxinas betas tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e a SEQ ID NO: 4 são totalmente funcionais.

[0090] Como será compreendido, uma ou mais mutações (por exemplo, a exclusão ou a adição de um ou mais resíduos de aminoácidos ou resíduos de ácido nucleico) pode ser introduzido as sequências de nucleotídeos e/ou aminoácido de toxinas alfa, beta, épsilon ou gama de C. histolyticum (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24). Em certos aspectos, uma ou mutações são introduzidas a fim de melhorar ou prejudicar a atividade, função, produção e/ou secreção da toxina. Em uma modalidade, uma mutação pode ser introduzida que torna as toxinas alfa, beta e/ou épsilon funcional e/ou segregados. Em outra modalidade, a sequência da toxina gama (SEQ ID NO: 18) pode ser uma mutação a fim de processar a proteína não funcional e/ou não secretada.

[0091] Também abrangido pela presente invenção são métodos de produzir anticorpos contra C. histolyticum ou uma toxina de C. histolyticum que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma proteína ou peptídeo, a um sujeito em que a referida proteína ou peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído pela SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e a SEQ ID NO: 6, ou um fragmento ou variante respectivos, ou uma combinação de qualquer um dos respectivos. Além disso, a presente invenção inclui métodos de estimular uma resposta imune a uma toxina de C. histolyticum que compreende a administração a um sujeito de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma proteína ou peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído pela SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e a SEQ ID NO: 6, ou um fragmento ou variante respectivos, ou uma combinação de qualquer um dos respectivos. A invenção também inclui uma vacina que compreende uma quantidade efetiva de uma proteína ou peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e a SEQ ID NO: 6, ou um fragmento ou variante respectivos, ou uma combinação de qualquer um dos respectivos. A proteína ou peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído pela SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e a SEQ ID NO: 6, ou um fragmento ou variante destas podem ser produzidos por uma cepa de C. histolyticum, ou pode ser uma proteína recombinante ou peptídeo.

D. Composições farmacêuticas compreendendo a colagenase e métodos de tratamento

[0092] A invenção aqui descrita abrange composições farmacêuticas compreendendo as sequências de proteína e proteínas recombinantes e também, composições farmacêuticas compreendendo um produto de droga de colagenase analisada de acordo com os métodos descritos neste documento. Como usado aqui, o termo "carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável" significa um enchimento atóxico, inerte de sólido ou semissólido, diluente, encapsulando o material ou formulação auxiliar de qualquer tipo. "Tratar" ou "tratamento" inclui a administração das composições, compostos ou agentes de aspectos da presente invenção para prevenir ou retardar o aparecimento dos sintomas, complicações ou bioquímicos indícios de uma doença, aliviando ou atenuando os sintomas ou prendendo ou inibindo ainda o desenvolvimento da doença, condição, ou desordem. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade eficaz" é uma quantidade que, isoladamente ou em combinação com um ou mais outros agentes ativos, pode controlar, diminuir, inibir, amenizar, evitar ou afetar um ou mais sintomas de uma doença ou condição a ser tratada. No contexto de produzir uma resposta imune ou na preparação de uma vacina, uma "quantidade eficaz" engloba uma quantidade eficaz para produzir uma resposta imune, incluindo a geração de anticorpos contra um antígeno.

[0093] Alguns exemplos de materiais que podem servir como transportadores farmaceuticamente aceitáveis são açúcares como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como o amido de milho e fécula de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; glicóis como propileno glicol; ésteres como oleato de etil e laurato de etil; ágar; agentes tamponantes como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico e soluções do fosfato de tampão, bem como outros lubrificantes compatíveis tóxicos tais como o lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes, liberando agentes de coloração, agentes de revestimento, agentes perfumantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.

[0094] Composições de colagenase também podem ser preparadas através da mistura de um número específico de unidades de atividade ou massas específicas das enzimas de preferência purificadas. Atividade de colagenase pode ser medida pela capacidade da enzima para hidrolisar ou peptídeo sintético ou substrato de colágeno. Aqueles versados na técnica reconhecerão que os ensaios enzimáticos diferentes dos divulgados neste documento podem também ser utilizados para definir e preparar composições de enzima funcionalmente equivalente. Atividade de colagenase pode ser descrita, por exemplo, nas unidades SRC. Uma unidade SRC solubilizará o colágeno da cauda de rato em material de reação de ninidrina equivalente a 1 nanomol de leucina por minuto, a 25oC e pH 7,4. Em determinadas modalidades da presente invenção, atividade de colagenase é descrita nas unidades de ABC. Este ensaio de potência de colagenase baseia-se na digestão de colágeno desnaturado (do tendão bovino) em pH 7,2 e 37oC durante 20-24 horas. O número de ligações peptídicas clivada é medido pela reação com ninidrina. Grupos aminoácidos liberados por um controle de digestão de tripsina são subtraídos. Uma unidade de colagenase de ABC líquida será solubilizar o material reativo ninidrina equivalente a 1.09 nanomoles de leucina por minuto. 1 unidade SRC é igual a aproximadamente 6.3 unidades de ABC.

[0095] Em certos aspectos, a substância da droga para colagenase injetável consiste de duas colagenases microbianas, referida como Colagenase AUX I e Colagenase ABC I e Colagenase AUX II e Colagenase ABC II. Entende-se que os termos "Colagenase I", "ABC I", "AUX I", "colagenase AUX I", e "colagenase ABC I" quer dizer o mesmo e pode ser usado de forma intercambiável. Da mesma forma, os termos "Colagenase II", "ABC II", "AUX II", "colagenase AUX II" e "colagenase ABC II" referem- se a mesma enzima e também podem ser usadas de forma intercambiável. Estas colagenases são secretadas pelas células bacterianas. Eles são isolados e purificados do sobrenadante da cultura de C. histolyticum por métodos cromatográficos. Ambas colagenases são proteases especiais e compartilham o mesmo número EC (E.C 3.4.24.3).

[0096] Colagenase AUX I tem uma única cadeia de polipeptídeo consistindo de aproximadamente 1000 aminoácidos com peso molecular de 115 kDa. Colagenase AUX II também tem uma única cadeia de polipeptídeo constituído por cerca de 1000 aminoácidos com peso molecular de 110 kDa.

[0097] Em algumas modalidades, a substância da droga (concentrado de colagenase) tem uma relação de massa de aproximadamente de 1 a 1 para colagenase AUX I e AUX II. Em uma modalidade, o concentrado de colagenase tem um coeficiente de extinção de 1,528.

[0098] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por via parentérica, topicamente ou através de um reservatório implantado. O termo "parenteral," como usado aqui, inclui técnicas de injeção ou infusão subcutânea, intracutânea, endovenosa, intramuscular, intra-articular, intra-arterial, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraniana. Em uma modalidade preferencial, a composição é injetada no tecido afetado. No caso das doenças de Peyronie ou de Duputyren ou da capsulite adesiva, a composição é injetada o cordão de mão ou placa do Peyronies. O termo "administração local" é definido neste documento para abranger tal injeção direta no tecido afetado. Em certos aspectos, a composição farmacêutica da invenção é uma formulação injetável. Em certos aspectos adicionais, a composição farmacêutica é uma formulação tópica.

[0099] Além disso, dependendo do tratamento, resultados aprimorados podem, em certas circunstâncias, serem obtidos imobilizando o local da injeção após administração da composição farmacêutica. Por exemplo, o site da administração (por exemplo, a mão), pode ser imobilizado por 4 ou mais horas.

[00100] Preparações injetáveis, por exemplo, estéril injetável aquosa ou suspensões oleaginosas, podem ser formuladas de acordo com a conhecida técnica usando dispersantes adequados ou agentes umectantes e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril pode também ser uma solução injetável estéril, suspensão ou emulsão em um diluente ou solvente, parentericamente aceitável não tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer, U.S.P. e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, estéril, óleos fixos são convencionalmente empregados como um meio solvente ou suspensão. Para este efeito, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado incluindo mono- ou diglicerídeos sintético. Além disso, ácidos graxos, como o ácido oleico, são utilizados na preparação de injetáveis.

[00101] As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou pela incorporação de agentes esterilizantes na forma das composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outros meios injetáveis estéreis antes da utilização. As soluções estéreis podem também ser liofilizadas para uso posterior.

[00102] Em algumas modalidades, a composição, compreendendo a colagenase é uma composição liofilizada, injetável, formulada com sacarose, Tris em um nível de pH de cerca de 8,0. Geralmente, uma fonte de cálcio está incluída na formulação, tais como o cloreto de cálcio.

[00103] Formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de uma composição farmacêutica desta invenção incluem pomadas, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, sprays, inalantes ou adesivos. O componente ativo é misturado em condições estéreis com um carreador farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes necessários ou tampões podem ser necessárias.

[00104] As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter, além de um polipeptídeo desta invenção, excipientes como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietileno glicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco ou suas misturas.

[00105] Pós e sprays podem conter, além de polipeptídeos desta invenção, excipientes como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas destas substâncias. Sprays além disso podem conter propelentes habituais, tais como clorofluorhidrocarbonetos.

[00106] Adesivos transdérmicos tem a vantagem adicional de proporcionar a entrega controlada de um agente ativo no corpo. Essas formas de dosagem podem ser feitas por dissolução ou dispensando o agente ativo no meio adequado. Potenciadores de absorção também podem ser usados para aumentar o fluxo do polipeptídeo através da pele. A taxa pode ser controlada fornecendo uma taxa de controle de membrana ou por dispersar o polipeptídeo da invenção em uma matriz de polímero ou gel.

[00107] Administração terapêutica da indústria farmacêutica pode ser por via parentérica, topicamente ou através de um reservatório implantado. O termo parenteral como usado aqui, inclui técnicas de injeção ou infusão subcutânea, intracutânea, endovenosa, intramuscular, intra-articular, intraarterial, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraniana. O termo "administração local" é definido neste documento para abranger tal injeção direta. Em uma modalidade, administração terapêutica da composição farmacêutica é por injeção.

[00108] Administração terapêutica da indústria farmacêutica nas formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica incluem pomadas, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, sprays, inalantes ou adesivos. O componente ativo é misturado em condições estéreis com um carreador farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes necessários ou tampões podem ser necessários.

[00109] As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter, além de um composto ativo do produto droga, excipientes como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietileno glicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco, ou suas misturas.

[00110] Pós e sprays podem conter, além dos compostos do produto da droga, excipientes como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas destas substâncias. Sprays além disso podem conter propelentes habituais, tais como clorofluorhidrocarbonetos.

[00111] Adesivos transdérmicos têm a vantagem adicional de proporcionar entrega controlada de um composto para o corpo. Essas formas de dosagem podem ser feitas por dissolução ou dispensando o composto no meio adequado. Potenciadores de absorção também podem ser usados para aumentar o fluxo do composto através da pele. A taxa pode ser controlada fornecendo uma taxa de controle de membrana ou por dispersar o composto em uma matriz de polímero ou gel.

[00112] A invenção será mais bem compreendida em conexão com os exemplos a seguir, que se destinam como uma ilustração apenas e não limitante no âmbito da invenção. Várias alterações e modificações para as modalidades divulgadas serão evidentes para aqueles versados na técnica e tais alterações e modificações podem ser feitas sem abandonar o sentido da invenção e o escopo das reivindicações acrescentadas.

EXEMPLOS Exemplo 1: Sequenciamento do genoma de C. histolyticum e análise da sequência da toxina

[00113] Uma escassez de estudos científicos relacionados ao C. histolyticum alfa, delta e épsilon (toxinas α, δ e ε) resultou em um conhecimento limitado sobre a estrutura de proteína destas toxinas. Para resolver este déficit de conhecimento, uma iniciativa de sequenciamento do genoma foi realizada para compreender mais plenamente o organismo de produção, com incidência particular sobre a identificação dos genes da toxina putativa. Como consequência deste esforço, o genoma completo da cepa de produção da Colagenase de Clostridium Histolyticum (Clone 004) (Auxilium Product Operation, Malvern, PA) só recentemente foi gerado, aparentemente representando, a primeira vez que a sequência do genoma de qualquer cepa de C. histolyticum foi relatada.

[00114] Houve três etapas fundamentais envolvidas no projeto de sequência do genoma. Em primeiro lugar, DNA genômico foi extraído de um cultivo de Clone 004 e encaminhada para a Creative Genomics para sequenciamento (Shirley, NY, EUA). A sequência do genoma do Clone 004 de C. histolyticum foi obtida usando métodos padrão da indústria. Em segundo lugar, os resultados obtidos com a sequência do genoma foram analisados utilizando métodos padrão de Bioinformática (análise do BLAST) para consultar as informações de sequência contra os bancos de dados da sequência do genoma. Nesta segunda fase resultou na atribuição de informações de proteína para cada gene de C. histolyticum que foi identificado. O uso de dois bancos de dados garantiu uma avaliação abrangente, mas também serviu como uma segunda fonte para verificar a atribuição da proteína. A terceira etapa do projeto foi uma análise comparativa da sequência da toxina putativa de C. histolyticum com a proteína atribuída automaticamente pela análise do BLAST.

i. Sequenciamento do Genoma de C. histolyticum e Identificação das Proteínas Modelo

[00115] Amostras de DNA genômico isolado de uma expansão de C. histolyticum (CLH) WCB derivado do Clone 004 foi enviado à genômica criativa (Shirley, NY, EUA) para o sequenciamento do genoma. Genômica Criativa empregou métodos padrão utilizados para a determinação da sequência genômica de amostras de DNA enviadas por clientes. A sequência do genoma foi gerada a partir do sistema de Roche/454 GS-FLX com química de titânio (sequenciamento de fragmento) acompanhado com Analisador de Genoma Illumina/Solexa. O ANI 3730xl foi empregado para realizar o acabamento do genoma por primer walking. A sequência de todo o genoma de 2.842.906 pares de base com um conteúdo de 29.44% de GC foi concluída e estes valores eram típicos do tamanho do genoma e conteúdo GC obtidos para outros genomas Clostridial. Cada um dos 2.887 quadros de leitura abertos (ORFs) identificados foi atribuído um número exclusivo de CLH. Cada um dos genes putativos 2.887 foi ainda investigado utilizando análise BLAST do GenBank e bancos de dados SwissProt que resultaram na atribuição provisória dos loci para toxinas épsilon, gama, alfa e beta. Os resultados da avaliação inicial são apresentados na Tabela 1. Assim, a atribuição do modelo de proteínas foi concluída como resultado de uma análise automatizada através de uma pesquisa abrangente de dois bancos de dados. A atribuição do modelo da proteína não foi influenciada pela interpretação do operador. Tabela 1: Atribuições das Proteínas Modelo para Toxinas CLH Putativas com base na Comparação com Dois Bancos de Dados de Sequências

[00116] Uma inspeção dos resultados da análise BLAST do genoma de C. histolyticum não revelou um ORF que codifica por uma elastase. No entanto, proteases foram classificadas pelo MEROPS (http://MEROPS.sanger.ac.uk/), baseado no critério do grupo funcional mais proeminente no sítio ativo dessas proteases. Usar este MEROPS baseado na abordagem funcional, um elastase cai na família peptidase M4, do qual termolisina (EC-3.4.24.27) é o melhor membro estudado da família e é o modelo clássico para tais proteases. Usando este conhecimento, uma reinspeção da análise BLAST de saída sugeriu que C. histolyticum possui um único ORF que compartilha a homologia significativa com termolisina. Portanto, o gene de toxina delta putativa dentro do C. histolyticum foi atribuído como um homólogo de termolisina de B. proteolyticus.

[00117] Os resultados da avaliação inicial são apresentados na Tabela 2 abaixo com base na comparação com dois bancos de dados de sequências. Tabela 2: Atribuições das Proteínas Modelo para Toxinas CLH Putativas

ii. Análise e Alinhamentos da Sequência das Proteínas

[00118] Para identificar as sequências de peptídeo, a amostra e controle de sinal foram analisados em um programa denominado SignalP para identificar potenciais sequências de peptídeo sinal (Nielsen (2004), J. Glasgow et al., eds., Proc. Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, 122-130. AAAI Press, 1998). Um peptídeo sinal é geralmente localizado dentro dos primeiros setenta aminoácidos (ou na região do terminal N) da sequência de proteínas e age como uma sequência de sinal para a enzima ser secretada. O sinal peptídeo é clivado e a sequência da proteína resultante é a proteína madura. Usando SignalP, o usuário pode identificar o local de sítio de clivagem do sinal peptídeo para identificar o terminal N da proteína madura. Para algumas sequências da amostra, nomeadamente toxina alfa e toxina beta (AUX-I), no entanto, apenas a proteína madura foi identificada, não a sequência de proteína inteira, incluindo a sequência do sinal peptídeo. Novo exame revelou que o processo de fragmentação de sequência empregada separados da sequência do sinal peptídeo da proteína madura. A proteína madura e sequências de sinal foram reagrupadas e processadas através da ferramenta de alinhamento.

[00119] Uma vez que todas as sequências das proteínas foram coletadas, alinhamentos da sequência emparelhada foram construídas usando MATLAB 7.0.10 (The MathWorks, Inc., 2010). Alinhamentos da sequência emparelhada são comparações diretas de duas sequências para determinar as semelhanças e diferenças entre duas sequências. Ambas sequências de controle e amostra foram carregadas em MATLAB e um alinhamento foi feito usando o algoritmo de Needleman-Wunsch e matriz de pontuação de BLOSUM50. A matriz de pontuação e algoritmo auxiliar na montagem do alinhamento, como o algoritmo determina o valor de cada aminoácido combinado ou incompatibilidade baseado fora da matriz de pontuação e incorpora os valores da abertura, quando necessário. Falhas podem ocorrer por várias razões, incluindo, mas não limitado às duas sequências tendo diferentes comprimentos e para garantir que os aminoácidos apropriados estejam se combinando um ao outro. A matriz de pontuação é baseada fora das taxas de substituição observadas frequentemente entre as sequências e serve para avaliar a similaridade ou dissimilaridade entre duas sequências (National Center for Biotechnology Information).

[00120] A revisão de Hatheway (1990) (Clin Microbiol Rev 3: 66-98) indicou que todas as cinco toxinas foram proteínas segregadas (exossubstâncias) e todas as cinco toxinas tinham funcionalidade identificável. Esta informação foi usada para realizar a análise das toxinas CLH putativas. Para analisar a função da proteína das toxinas CLH putativas, um número de modelo proteínas foram selecionadas com base na literatura descoberta e resultados BLAST. Os controles foram baixados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) no formato Fasta.

1. Toxina alfa (α)

[00121] Informações esparsas relacionadas com a toxina alfa de C. histolyticum seguindo o trabalho de Bowen (1952) (Yale J Biol Med 25:124138) existe na literatura. Assim, a interrogação da sequência do genoma para os genes da toxina putativa foi de interesse. Uma análise preliminar do genoma sugeriu que C. histolyticum possuía um único ORF que compartilha a homologia do aminoácido significativo com toxina alfa de C. septicum conforme determinado pela análise BLAST de dois bancos de dados. Portanto, o gene da toxina alfa putativa dentro de C. histolyticum foi atribuído como um homólogo da toxina alfa de C. septicum. Estudou extensivamente pelo laboratório Rodney K. Tweten, toxina alfa de C. septicum foi classificada como um membro da família tipo aerolisina de toxinas. Nomeadamente, toxina alfa de C. septicum possui atividade hemolítica (Ballard et al. (1992), Infect Immun 60: 784-790; Melton-Witt et al. (2006), Biochem 45: 14347-14354) e é diferente de hemolisinas lábeis de oxigênio conforme descrito pela toxina ε de C. histolyticum (Hatheway (1990), Clin Microbiol Rev 3:66-98).

[00122] A toxina alfa de C. septicum é elaborada como um pré-pro- proteína inativa que é processada para o meio extracelular como uma pró- toxina inativa. A pró-toxina então se liga aos receptores na membrana da célula onde eles são clivados em suas estruturas ativas por proteases (geralmente furina). Um sítio de consenso da furina dentro da toxina é essencial para a ativação de proteases eucarióticas. A ativação envolve a clivagem de 40-45 aminoácidos do terminal C. A clivagem ausento do terminal C da toxina alfa de C. septicum não é funcional. Comprimento total da toxina alfa de C. septicum é hemolítica (Ballard et al. 1992). A toxina ativa é aproximadamente 41,3 kDa (Gordon et al. 1997). Uma vez ativada, a oligomerização das toxinas na superfície da célula em um complexo pré- poro, seguido por inserção de um barril beta na membrana.

[00123] O modelo da toxina alfa de C. septicum consiste de três domínios distintos denominados: D1, D2, e D3. O domínio de D1 está envolvido com a ligação ao receptor e oligomerização, enquanto o domínio D2 contribui para estrutura para anfipáticas de hairpin. O domínio D3 tem uma região pró-péptida D3 que inclui um curto peptídeo terminal carboxila clivado no conhecido sítio de ativação AT (R398) e funções como uma acompanhante intramolecular que impede oligomerização prematura da toxina alfa. Usando o mutagênese de saturação, substituições de aminoácidos únicos dentro de cada domínio permitiram a determinação daqueles resíduos essencial para atividade biológica (Melton-Witt et al., 2006). Importantemente, o ensaio funcional utilizado um ensaio da viabilidade celular para determinar as dosesLD50. Assim, o efeito relativo das substituições de aminoácidos únicos dentro de toda a região de codificação foi avaliado usando um ensaio funcional.

[00124] Para entender melhor a estrutura primária da toxina alfa CLH, o alinhamento de proteína, realizada em MATLAB, da proteína modelo (toxina alfa de C. septicum) foi feita com a toxina alfa CLH. Os resultados são apresentados na FIG. 1.

[00125] A traduzida toxina alfa putativa CLH tem uma sequência de sinal identificável e tem uma grande probabilidade de ser uma proteína secretada. Assim, o primeiro critério de um exossubstância é alcançado. Existe uma homologia de 75% positiva entre a sequência da proteína da toxina alfa C. septicum e a sequência da proteína da toxina alfa CLH. Identificaram-se várias regiões de alta homologia entre a toxina alfa modelo e a toxina alfa putativa de CLH. Tais regiões e resíduos de aminoácidos essenciais são destacados em sombreamento verde na FIG. 1.

[00126] Notavelmente, o alinhamento mostra várias diferenças nos resíduos dos aminoácidos essenciais que, baseado na obra de Melton-Witt et al. (2006) (Biochem 45: 14347-14354), processar individualmente a proteína não funcional CLH _2834 & 2835. Começando com a região terminal N da proteína madura, uma região de sequência de aminoácidos 17 está faltando na sequência da toxina alfa CLH, que está localizada a cerca de 20 aminoácidos a jusante do sítio de clivagem do sinal peptídeo putativo. Dentro desta faixa de aminoácidos 17, um resíduo W74 na toxina alfa de C. septicum foi identificado como um resíduo crítico em loop 1 (L1). A falta de aminoácidos 17 do domínio D1 na versão de sequência CLH sugere uma estrutura alterada para este domínio em relação a um tipo selvagem e uma perturbação a funcionalidade de ligação do receptor.

[00127] Dentro da região do terminal C da proteína, várias mudanças de resíduo do aminoácido também processa a proteína CLH não funcional. O aminoácido T302 na toxina alfa C. septicum foi substituída pela Prolina na toxina alfa CLH. Resíduo E303 na toxina alfa de C. septicum é substituída pela Treonina na toxina alfa CLH. Os estudos de Melton-Witt et al. (2006) (Biochem 45: 14347-14354) indicou que cada uma destas modificações individualmente resultará em 0% de letalidade. Digno de nota é a comparação do sítio de ativação ou sítio de clivagem furina, entre as duas sequências. A toxina alfa de C. septicum apresenta um sítio de clivagem consenso furina começando com K391 e terminando na R398. Nesta região se encaixa sequência consenso de clivagem furina Arg-X- Lys/Arg-Arg, embora a sequência mínima de clivagem é Arg-X-X-Arg. A toxina alfa putativa de CLH tem um resíduo de glutamina em vez de Arginina na posição análoga do R398. Assim, o sítio de ativação de C. septicum possui a sequência de aminoácidos, DKKRRGKRSVDS, com R398, identificado como um resíduo crítico. A sequência de homólogos da toxina alfa CLH em peptídeo D3 é NTSST-EQNVEV. Portanto, a toxina alfa putativa de C. histolyticum de sítio de clivagem furina parece ser não funcional, e esta proteína, mesmo se expressa, não poderia ser processada pelo contato com protease furina das células eucarióticas para gerar uma toxina funcional. As conclusões da análise comparativa da sequência do aminoácido estão resumidas na Tabela 3. Tabela 3: Resumo de Comparação de Alinhamento das Sequências de Aminoácidos para toxina alfa CLH Putativa

[00128] O resumo da análise de alinhamento de sequência sugere que a toxina alfa putativa de CLH possui um número significativo de diferenças de resíduos de aminoácidos que fariam a proteína madura não funcional. A ligação fenotípica de funcionalidade para toxina alfa é a demonstração da atividade hemolítica. Importante, a cepa da produção de Colagenase de Clostridium Histolyticum não apresenta atividade hemolítica quando banhada no ágar sangue. Os resultados de uma avaliação de ágar sangue hemolítica são ilustrados na FIG. 2.

[00129] Painel A da FIG. 2 mostra os resultados obtidos quando uma amostra da expansão de célula do Clone 004 de C. histolyticum é cultivada em ágar sangue. Não existem provas de qualquer fenótipo hemolítico beta. Em contraste, painel B da FIG. 2 mostra os resultados obtidos quando uma amostra de C. septicum é cultivada em ágar sangue. Não existe evidência clara de hemólise beta que se estende bem além da área de aplicação de amostra, conforme indicado no Painel C. As imagens apresentadas não representam adequadamente a diferença qualitativa observada quando um vê os artigos do teste. O aparecimento de hemólise beta é facilmente discernível e a completa falta de qualquer hemólise na placa de C. histolyticum está em contraste com a ampla zona de hemólise observada quando a cultura de C. septicum (produtor da toxina α) é inspecionada.

2. Toxina Delta (δ)

[00130] Hatheway et al. (1990) (Clin Microbiol Rev 3: 66-98) definiu a toxina δ de C. histolyticum como um elastase, principalmente baseado na comunicação da investigação inicial de Takahashi, et al. (1970) (BBRC 39: 1058-1064). Sem mais estudos de substanciais sobre essa toxina aparentemente foram publicados desde então. Quatro frações, demonstrando a atividade da elastase foram isoladas de C. histolyticum por Takahashi et al. utilizando ultrafiltração diferencial. O foco principal foi uma fração que passou através das membranas das membranas de corte nominal 50 kDa mas foi mantido por membranas com um corte nominal de 10 kDa.

[00131] Termolisina é uma metaloprotease de zinco com um peso molecular de enzima madura de 34,6 kDa. Importantemente, termolisina é uma proteína de modelo para uma classe de proteínas que contêm uma pré-sequência empregada na secreção (peptídeo sinal), mas também uma longa pró-sequência de aproximadamente 200 resíduos de aminoácidos que é dois terços do tamanho da proteína madura. Enzimas com termolisinas são elaboradas como pré-pro-proteínas inativas com a pró- sequência servindo um papel como um inibidor da enzima madura e também como acompanhante para garantir a dobragem adequada da enzima (O'Donohue et al.(1996), JBC 271:26477-26481). A pró-sequência é autocataliticamente removida pela parte da enzima madura da molécula no meio extracelular. Assim, o percurso de maturação pelas enzimas como termolisinas incluem: uma etapa de secreção, da presença de uma forma pró-madura na matriz extracelular, a clivagem da pró-sequência e a presença de uma enzima madura, ativa.

[00132] O alinhamento da sequência do gene para termolisina e CLH_2576, a toxina delta putativa de C. histolyticum, é ilustrado na FIG. 3. Esta imagem mostra a sequência de aminoácidos pré-pro-maduros de comprimento total como uma unidade única que teoricamente é transcrito como um único polipeptídeo. Os iniciais 28 aminoácidos no terminal N da termolisina são mostrados justapostos do sombreado verde da pró- sequência que termina em Ser232. A sequência de aminoácido maduro sem sombra começa com Ile233. Usando o programa SignalP, a termolisina e os polipeptídeos CLH_2576 são preditos para ser secretado. A toxina delta putativa traduzida de C. histolyticum tem uma sequência de sinal identificável e uma grande probabilidade de ser uma proteína secretada. Existe uma homologia de 65% positiva entre a sequência de proteínas termolisina e a sequência de proteína da toxina delta CLH.

[00133] Para compreender a natureza das formas pro e maduras de ambas as proteínas, as regiões foram analisadas como sequências distintas com relação à funcionalidade. O alinhamento de pro-sequência é retratado na FIG. 4. Existe uma homologia positiva de 57% entre as duas formas pro-sequências. Uma recente revisão da análise estrutural primária das pro-sequências de mais de 100 proteases como termolisina foi realizada por Demidyuk et al. (2008) (Protein J 27: 343-354). Esses pesquisadores observaram que a variabilidade considerável existia dentro das pro-sequências, alternativamente, denominados precursores ou pro- peptídeos. As pro-sequências foram mais tolerantes a mutações em comparação com as enzimas maduras correspondentes. No entanto, as regiões exibindo um elevado grau de conservação e substituições nos resíduos chaves foi observado que pode alterar drasticamente a função. Os resíduos em sombra verde na FIG. 3 identificam os resíduos de aminoácidos que são críticos para a pro-sequência da função. Não existem diferenças que são notadas entre a termolisina e as sequências CLH_2756. Dois resíduos correspondentes a Ile183 e Arg184 na sequência de termolisina estão sombreados de amarelo; no entanto, as substituições na sequência de CLH_2756 são semelhantes aos aminoácidos que provavelmente não resultaram em qualquer alteração de função.

[00134] Importantemente, existe uma região não homologia no terminal C das pro-sequências como ilustrado pelo sombreamento amarelo do início da sequência de CLH_2756 com Ser185. Esta região é o sítio da autocatálise e sugere que a sequência de CLH_2756 não é um substrato aceitável para a segmentação pelo sítio ativo da enzima madura. A criticidade dos resíduos de aminoácidos ao redor do local de clivagem foi investigada por Wetmore et al. (1994) (Mol Microbiol 12:747-759), utilizando protease neutra semelhante à termolisina de Bacillus cereus como a enzima modelo. Esses pesquisadores determinaram que o processamento foi particularmente sensível à natureza dos três aminoácidos resíduos a montante do sítio de clivagem. Uma sequência de consenso foi identificada para a sequência ao redor do sítio de processamento pro-proteína e alterações nas chaves resíduos resultaram na não exportação ou não processamento da proteína de uma enzima funcional, madura. Características-chave da sequência de consenso foram: a presença de um resíduo não polar na posição P3 (Gly, Ala, Ile, Leu ou Val), um resíduo polar ou Pro na posição P1 (Pro, Ser, His, Glu) e um resíduo não polar na posição P1'. Além disso, a maturação de pro-termolisina foi mostrada para ocorrer entre um resíduo de serina e isoleucina (O'Donohue et al. (1994), Biochem J. 300: 599-603). Para explorar o alinhamento da sequência ao redor do sítio de clivagem, uma avaliação comparativa da sequência dos sítios pro- proteína de processamento da termolisina e de CLH_2576 podem ser feitas por inspeção. É evidente que a sequência de aminoácidos CLH_2576 na área de processamento pro-proteína não contém o arranjo do aminoácido apropriado para permitir autocatálise. Quando um realiza um exercício teórico para interrogar a sequência de aminoácidos CLH_2576 para determinar se o sítio de processamento pro-proteína é razoavelmente próximo ao local previsto com base no alinhamento da sequência, é claro que nenhum ajuste permite que a sequência de aminoácidos adequado seja identificado. Deslocando os 2 resíduos do sítio de processamento pro- proteína para o lado do terminal C permite a disposição adequada dos aminoácidos que não violam as regras Wetmore et al. No entanto, a regra de Ser-Ile de O'Donohue et al. (1994) (Biochem J. 300: 599-603) não está presente. Assim, conclui-se que a forma da pro-proteína do polipeptídeo CLH_2576 não é um substrato apropriado para autocatálise. O efeito final é que a enzima madura, ativa não está presente no caldo da célula de C. histolyticum (Clone 004).

[00135] Para explorar as formas maduras de ambas as proteínas, o alinhamento da sequência comparativa é retratado na FIG. 5. Uma inspeção do alinhamento de sequência na FIG. 5 sugere que muitos aminoácidos essenciais foram conservados. Notavelmente, o início de sequência AHELTHAVTD com Ala140 foi identificado como um componente do sítio ativo para termolisina e a alta homologia exibida pelo CLH_2576 sugere que a toxina delta CLH é um membro da classe termolisina de proteases (Kooi et al. (1996), J Med Microbiol 45:219-225 ; Kooi, et al., (1997), Infect Immun 65 :472-477). Vários resíduos sombreados em verde foram identificados como essenciais para a ligação ou catálise. Uma diferença notável entre as sequências das duas moléculas é o começo de região GGI com G135 na termolisina. Este trecho de resíduos de aminoácidos é altamente conservado nas proteases como termolisina com nenhuma função definida atribuída (Frigerio et al. (1997), Protein Eng 10:223-230.). A região correspondente do CLH _2576 possui várias diferenças significativas nesta sequência. Não obstante, o total de alto grau de homologia e a conservação dos resíduos de aminoácidos essenciais confirma a seleção de CLH_2576 como a toxina delta com massa molecular predita aproximadamente 35 kDa. Esta avaliação se alinha com as informações apresentadas por Takahashi et al (1970) (BBRC 39: 10581064).

[00136] Em resumo, a toxina delta putativa CLH foi identificada usando a análise da sequência do genoma. No entanto, o interrogatório da sequência sugere que a clivagem da pró-proteína não irá ocorrer, tornando esta molécula não funcional. Portanto, ele é deduzido que a toxina δ, se expressa e secretada no Clone 004 derivado de C. histolyticum ATCC 21000, não é funcional.

3. Toxina Épsilon (ε)

[00137] MacLennan et al. (1962) (Bact Rev 26:176-274) e Hatheway descreveu a toxina ε do C. histolyticum como uma hemolisina do oxigênio lábil sorologicamente similares àqueles produzidos por outras cepas de Clostridium, como C. tetani, C. novyi, e C. septicum. Bowen (1952) (Yale J Biol Med 25:124-138) demonstrou que a toxina ε foi expressa durante a fase exponencial e degradada durante a fase estacionária, como observado para a atividade de toxina α e da mesma forma foi degradada por protease in vitro.

[00138] Uma inspeção dos resultados da análise BLAST do genoma de C. histolyticum identificou uma ORF que codifica uma hemolisina que estava na mesma classe, como perfringolisina e tetanolisina, que são membros ativados por tiol, proteínas formando poros com afinidade para o colesterol. Essas proteínas são parte de uma família de Citolisinas Dependente de Colesterol (CDC) e todos apresentam sequências de proteínas distintas e estruturas únicas. Mais de 25 proteínas CDC foram identificadas com as sequências da proteína completa disponível. As CDCs são um grupo de toxinas formadoras de poros de β-barril secretadas por várias espécies de bactérias de Gram positivas está na faixa do peso molecular de 50-60 kDa. A CDC prototípica é perfringolisina que serve como uma proteína de modelo para todas as CDCs (Heuck et al. 2007, JBC 282: 22629-22637). A organização típica de um CDC inclui uma sequência do sinal clivável para facilitar as exportações para o meio extracelular, como proteínas monoméricas solúveis em água. Posteriormente, a forma monomérica dobrada liga-se a uma membrana eucarióticas alvo, mediada pela ligação de colesterol e então oligomeriza na superfície da membrana para estruturas como anel que são responsáveis para a citólise e forma arcos. As CDCs são também conhecidas como as citolisinas ativadas por tiol e foram originalmente descritos como hemolisinas (Billington et al., 2000).

[00139] O alinhamento de sequência do gene para perfringolisina e CLH_1920, a toxina épsilon putativa, é ilustrada na FIG. 6. Essa imagem exibe o comprimento total (pré, mais maduro) sequência de proteína como uma única unidade que teoricamente é transcrito como um único polipeptídeo. Os aminoácidos iniciais 29 no terminal N da perfringolisina são ilustrados com uma estrela azul acima Lys 29 do local de clivagem da peptidase sinal. A análise do SignalP da sequência CLH_1920 não identificou um local de clivagem do sinal peptídeo reconhecível e estava prevista para ser uma proteína não segregada. Existe uma homologia de 84% positiva entre a sequência das proteínas perfringolisina e a sequência da proteína toxina épsilon putativa CLH_1920.

[00140] Os resíduos dos aminoácidos sombreados em verde denotam os aminoácidos essenciais que são conservados entre as duas proteínas. Importantemente, as sequências dos aminoácidos 11 início com glutamina 458 (ECTGLAWEWWR) é uma região essencial que é denominado a sequência undecapeptídeo. Juntamente com o alto grau de homologia na sequência, designada como região da proteína madura, esta sequência undecapeptídeo serve para identificar a proteína CLH_1920 como uma CDC. Portanto, a proteína CLH_1920, se elaborado como uma proteína secretada, deveria ter funcionalidade hemolítica. Uma única região de não homologia entre as duas proteínas é realçada no sombreamento amarelo. Importante, o terminal Cl de CDCs foi mostrado para ser crítico para ligação de colesterol (Shimada et al., 1999, JBC 274: 18536-18542). O processo de hemólise por CDCs envolve duas etapas críticas antes da formação de poros: inserção de ligação e membrana. Shimada, et al. (1999) (JBC 274: 18536-18542) demonstrou que mudanças modestas para o terminal C afetado a etapa de ligação. Uma alteração de aminoácidos do terminal 3 'reduz severamente ligação de colesterol, medida pelo método ELISA. A correspondente atividade hemolítica em células vermelhas do sangue foi coordenada reduzida ou eliminada, dependendo da gravidade da alteração do aminoácido terminal C. Uma inspeção do terminal C da sequência CLH_1920 mostra algumas diferenças significativas em comparação com a sequência de perfringolisina.

[00141] Como resumido na Tabela 4, a atividade hemolítica da toxina épsilon putativa de C. histolyticu pode estar ausente devido a duas características da sequência de aminoácidos teóricos. Em primeiro lugar, a molécula está prevista a não ser secretada; assim, a molécula não estaria disponível para a interação com as células alvo. Em segundo lugar, o terminal C da proteína CLH_1920 não possuem uma região homóloga para ligação do colesterol, o que sugere que um elemento importante associado com hemólise pode estar com defeito. Tabela 4: Resumo de Comparação de Alinhamento das Sequências de Aminoácidos para toxina épsilon Putativa CLH

[00142] Estudos de toxicidade não clínicos não demonstraram indicações clínicas e morfológicas de efeitos hemolisina in vivo. Os dados gerados pelo apoio à administração local e bolus IV a ausência de toxinas hemolíticas como toxina ε.

[00143] Ausência de toxinas hemolíticas podem ser verificados pelo plaqueamento do material de teste em ágar sangue que é rotineiramente realizado no final de cada fermentação do Clone 004 de C. histolyticum, que também confirma a ausência de crescimento externo. A expressão das toxinas hemolíticas resulta na lise das células vermelhas, e assim, resultando na formação de halos distintos em torno de colônias produtoras de hemolisinas. A cepa de produção de Colagenase de C. histolyticum não produz halos ou zonas de afastamento (ver FIG. 2) suportam a ausência de toxina ε e outras entidades hemolíticas da cepa de produção. Para verificar a função hemolítica de um CDC, tetanolisina comercialmente disponível foi aplicada em ágar sangue para imitar a rotina do teste de plaqueamento. Os resultados são ilustrados na FIG. 7 que mostra o fenótipo hemolítico beta observado quando 10 μcL de uma solução de 10 μg/mL de tetanolisina em salina tamponada com fosfato é aplicada à superfície do ágar sangue, depois incubadas durante 24 horas a 37oC. Assim, se uma CDC funcional estava presente no material de teste, o fenótipo hemolítico beta deve ser observado.

4. Clostripaína ou toxina gama(Y)

[00144] A toxina gama de C. histolyticum tem sido descrito como clostripaína, uma cisteína endopeptidase (EC 3.4.22.8). Dargatz, et al. (1993) (Mol Gen Genet 240:140-145) clonou e sequenciou o gene de C. histolyticum para clostripaína e esta informação foi depositado no GenBank sob o número de acesso X63673 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X63673.1). Para compreender a estrutura primária da toxina gama CLH_1861, o alinhamento da sequência da proteína a partir do MATLAB da proteína modelo (clostripaína de C. histolyticum) foi feito com a sequência teórica da toxina gama CLH_1861. Os resultados são apresentados na FIG. 8.

[00145] Uma inspeção da FIG. 8 mostra um alto grau de homologia (99%) entre o modelo clostripaína e a sequência obtidos a partir da análise do genoma. Na verdade, existem apenas 3 diferenças de aminoácido, nenhum dos quais são identificados como essenciais para a atividade de resíduos. Os aminoácidos críticos identificados nos estudos da literatura como essencial para a funcionalidade são mostrados em sombreamento verde. Análise SignalP de ambas as proteínas indicou que a pontuação de secreção alta e o sítio de clivagem de sinal representado com uma estrela azul (Labrou et al. (2004). Eur J Biochem 271 :983-992). Assim, um poderia prever que a molécula de CLH_1861 seria secretada e funcional. Uma análise de clostripaína residual foi realizada como parte da liberação de rotina.

[00146] A análise de clostripaína suporta os méritos da abordagem de alinhamento da sequência para as toxinas de C. histolyticum em geral. Um poderia prever que a presença de um gene da toxina funcional necessariamente se traduziria em uma sequência de aminoácidos que compartilhou um alto grau de homologia com uma proteína do modelo conhecido. Além disso, a conservação dos resíduos de aminoácidos essenciais também seria uma característica de um gene da toxina funcional.

[00147] As informações obtidas a partir da análise da sequência do genoma forneceram evidências que loci para toxinas alfa, delta e épsilon putativas estavam presentes. Uma análise mais profunda da estrutura teórica primária de cada toxina indicada que cada toxina de forma não funcional foi prevista como consequência defeitos chaves na sequência dos aminoácidos de cada toxina. Notavelmente, as toxinas alfa e épsilon podem ser atribuídas como homólogos para duas classes de moléculas formadoras de poros, hemolíticas. Como o fim da fermentação, amostras de cada lote são banhadas em ágar sangue como parte de uma rotina do teste de pureza. A falta de halos ou zonas de afastamento em torno das colônias confirma a ausência de atividade hemolítica na cultura e na fermentação. Consequentemente, a ausência de halos hemolíticos por volta da extremidade das amostras de fermentação demonstra a ausência das toxinas tanto α e ε numa base contínua.

[00148] A Tabela 5 mostra os resultados da análise de sequência e funcionalidade prevista. Os resultados confirmam por que Clone 004 tem demonstrado funcionalmente as ausências de toxicidade e a atividade hemolítica falta. Tabela 5. Resumo - Status Previsto do C. histolyticum Clone 4 Exossubstâncias

5. Análise da Sequência de C. histolyticum das Toxinas beta (colagenase I e colagenase II)

[00149] A análise da sequência dos loci da toxina beta putativo de C. histolyticum é apresentado nas FIGs. 9 e 10. Conforme mostrado na figura 9, a sequência dos aminoácidos da colagenase I madura do clone 004 (CLH_1768 e 1769; SEQ ID NO: 3) difere da sequência de colG traduzida (SEQ ID NO: 19) em três aminoácidos. A FIG. 10 que mostra a sequência dos aminoácidos da colagenase II madura do clone 004 (CLH_2116; SEQ ID NO: 4) difere da sequência de colH traduzida (SEQ ID NO: 20) em oito aminoácidos. Ambas as colagenases são totalmente funcionais.

[00150] A literatura científica e patente referidos neste documento estabelecem o conhecimento que está disponível para aqueles versados na técnica. Todas as patentes dos Estados Unidos e publicadas ou inéditas no pedido de Patente Estados Unidos citados neste documento são incorporadas com referências. Todas as patentes estrangeiras publicadas e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporadas por referência. Todas as outras referências publicadas, documentos, manuscritos e literatura científica citados aqui por este meio são incorporados por referência. Referências 1. Nielsen et al. (2004) In J. Glasgow et al., eds., Proc. Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, 122-130. AAAI Press, 1998. 2. Hatheway (1990) Clin Microbiol Rev 3:66-98. 3. Ballard et al. (1992) Infect Immun 60:784-790. 4. Melton-Witt et al. (2006) Biochem 45:14347-14354. 5. Gordon et al. (1997) Infect immun 65:4130-4134. 6. Takahashi et al. (1970) BBRC 39:1058-1064. 7. O’Donohue & Beaumont (1996) JBC 271:26477-26481. 8. Demidyuk et al. (2008) Protein J 27:343-354. 9. Wetmore et al. (1994) Mol Microbiol 12:747-759. 10. O’Donohue et al. (1994) Biochem J. 300:599-603. 11. Kooi & Sokol (1996) J Med Microbiol 45:219-225. 12. Kooi etl a. (1997) Infect Immun 65:472-477. 13. Frigerio et al. (1997) Protein Eng 10:223-230. 14. MacLennan (1962) Bact Rev 26:176-274. 15. Bowen (1952) Yale J Biol Med 25:124-138. 16. Heuck et al. (2007) JBC 282:22629-22637. 17. Billington et al. (2000) FEMS Microbiol Lett 182 :197-205. 18. Shimada et al. (1999) JBC 274 :18536-18542 19. Dargatz et al. (1993) Mol Gen Genet 240:140-145. 20. Labrou & Rigden (2004) Eur J Biochem 271:983-992.

[00151] Embora esta invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referências às suas modalidades preferenciais, será compreendido por aqueles versados na técnica que várias alterações na forma e nos detalhes podem ser feitas, sem se desviar do escopo da invenção englobada pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Ácido nucleico recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo tendo a sequência: (a) da SEQ ID NO: 1 e uma sequência reguladora heteróloga operacionalmente ligada à SEQ ID NO: 1; ou (b) da SEQ ID NO: 2 e uma sequência reguladora heteróloga operacionalmente ligada à SEQ ID NO: 2.

2. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo com uma sequência da SEQ ID NO: 1 e uma sequência heteróloga reguladora operacionalmente ligada à SEQ ID NO: 1.

3. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo com uma sequência da SEQ ID NO: 2 e uma sequência reguladora heteróloga operacionalmente ligada à SEQ ID NO: 2.

4. Ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sequência reguladora é um promotor.

5. Cassette de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

7. Vetor, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é um plasmídeo.

8. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor conforme definido na reivindicação 6 ou 7, em que a célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo em uma célula bacteriana e uma célula fúngica.

9. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que é E. coli, Streptomyces, Pseudomonas, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, uma célula de levedura ou lactococcus lactis.

10. Método de produção da colagenase I ou colagenase II, caracterizado pelo fato de cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 8, sob condições adequadas para a expressão do ácido nucleico e recuperação da colagenase I ou colagenase II.

11. Método de produção da colagenase I ou colagenase II, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma célula hospedeira recombinante compreendendo um vetor ou plasmídeo, em que o vetor ou plasmídeo compreende um ácido nucleico tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou a sequência da SEQ ID NO: 2.

12. Colagenase I produzida de forma recombinante, caracterizada pelo fato de que tem a sequência da SEQ ID NO: 3 ou da SEQ ID NO: 5.

13. Colagenase II produzida de forma recombinante, caracterizada pelo fato de que tem a sequência da SEQ ID NO: 4 ou da SEQ ID NO: 6.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um carreador farmaceuticamente aceitável e a colagenase I ou colagenase II produzida de forma recombinante, conforme definida na reivindicação 12 ou 13, ou uma combinação das mesmas.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que é usada para tratar um paciente sofrendo de uma condição mediada por colágeno.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a condição é selecionada do grupo consistindo em contratura de Dupuytren, doença de Peyronie, capsulite adesiva, epicondilite lateral, síndrome do túnel do carpo, celulite e lipoma.

17. Método de produção de um produto de droga consistindo na colagenase I e colagenase II, caracterizado pelo fato de que a colagenase I e II são obtidas de C. histolyticum, e em que o método compreende as etapas de: a) fermentar uma cepa de C. histolyticum; b) colher a fermentação bruta compreendendo a colagenase I e a colagenase II; c) purificar a colagenase I e colagenase II da colheita bruta através de filtração e cromatografia em coluna; e d) combinar a colagenase I e colagenase II purificadas da etapa (c) numa razão de 1 para 1.