KR102642381B1 - 개선된 콜라게나제 생성 방법 - Google Patents
개선된 콜라게나제 생성 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 콜라게나제 생산 및 콜라게나제 생성물의 분야, 특히 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 조성물의 재현성, 순도, 및 안정성을 개선시키는 것에 관한 것으로, 여기서 조성물은 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 측정시 면적 기준 적어도 95% 순수하고 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
Description
관련 출원
본 출원은 2017년 3월 28일자 미국 가출원 일련 번호 제62/477,846호를 우선권 주장하며, 그 전문이 법률에 의해 허용되는 전체 한도로 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 콜라게나제 생산 및 콜라게나제 생성물의 분야, 특히 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 조성물의 재현성, 순도, 및 안정성을 개선시키는 것에 관한 것으로, 여기서 조성물은 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 측정시 면적 기준 적어도 95% 순수하고 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
씨. 히스톨리리쿰(C. histolyticum)의 발효로부터 고도로 순수한(적어도 95% 순수한) 콜라게나제를 제조하는 공정은 이전에 미국 특허 제7,811,560호에 기재되었다. 콜라게나제 I 및 II는 포유동물에서 가장 풍부한 구조 단백질인 콜라겐을 분해하는 효소이다. 이 효소는 다양한 콜라겐-매개 질환, 예를 들어 듀피트렌 구축증(Dupuytren's contracture), 페이로니병(Peyronie's disease), 지방종 및 유착성 관절낭염의 치료에 사용된다. 미국 특허 제6,086,872호 및 제5,589,171호는 듀피트렌병의 치료에서 콜라게나제 제제의 사용을 개시하고 있다. 미국 특허 제6,022,539호는 페이로니병의 치료에서 콜라게나제 제제의 사용을 개시하고 있다. 미국 특허 제6,958,150호 및 제7,842,673호는 지방종의 치료를 위한 콜라게나제의 사용을 개시하고 있다. 미국 특허 출원 공개 제2006/020448A1호는 유착성 관절낭염의 치료에서 콜라게나제의 사용을 개시하고 있다. 미국 특허 출원 공개 제2014/0335072호 및 제2016/0279046호는 셀룰라이트를 치료하기 위한 콜라게나제의 사용을 개시하고 있다.
콜라게나제의 주요 공급원은 씨. 히스톨리리쿰의 발효로부터 유래된다. 씨. 히스톨리리쿰 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 주사용 제형은 상표명 XIAFLEX®로 판매되며 듀피트렌 구축증 및 페이로니병의 치료를 위해 미국 식품의약국의 승인을 받았다. 주사용 제형은 유럽 및 다른 국가에서 XIAPEX®라고 불린다. 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 아미노산 서열은 각각 colG 및 colH 유전자에 의해 코딩된다. colG에 대한 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 D87215 및 문헌[Matsushita et al. (1999), Journal of Bacteriology 181(3):923-933]에 기재되어 있고, colH에 대한 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 D29981 및 문헌[Yoshihara et al. (1994), Journal of Bacteriology 176(21): 6489-6496]에 기재되어 있다. 콜라게나제 AUX I은 약 113 kDa의 분자량을 갖는 대략 1000개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩티드 쇄를 갖는다. 콜라게나제 AUX II 또한 약 112 kDa의 분자량을 갖는 약 1000개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩티드 쇄를 갖는다.
콜라게나제 I 및 콜라게나제 II는 메탈로프로테아제이며, 이들의 활성을 위해 단단하게 결합된 아연 및 느슨하게 결합된 칼슘을 필요로 한다(Eddie L. Angleton and H. E. Van Wart, Biochemistry 1988, 27, 7406-7412). 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다 모든 유형의 콜라겐에 대해 광범위한 특이성을 갖는다(Steinbrink, D; Bond, M and Van Wart, H; (1985), JBC, 260 p 2771-2776). 이들 콜라게나제는 생리학적 조건 하에 콜라겐의 삼중-나선 영역을 가수분해함으로써 콜라겐을 소화시킨다(Steinbrink, D; Bond, M and Van Wart, H; (1985), JBC, 260 p 2771-2776). 비록 각각의 콜라게나제가 상이한 특이성을 나타낼지라도(즉, 각각은 절단에 대해 상이한 바람직한 아미노 서열을 가짐), 결합하여 이들은 콜라겐에 대해 상승적인 활성을 갖는다(Mandl, I, (1964), Biochemistry, 3: p. 1737-1741; Vos-Scheperkeuter, G H, (1997), Cell Transplantation, 6: p. 403-412).
치료에 사용하기 위한 콜라게나제는 포유동물, 진균 및 박테리아 공급원을 포함하여 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 미가공 콜라게나제의 일반적인 공급원 중 하나는 박테리아 발효 공정, 특히 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)(씨. 히스톨리티쿰)의 발효로부터 유래된다. 씨. 히스톨리티쿰으로부터 수득된 미가공 콜라게나제는 임의의 다수의 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 그러나, 콜라게나제 외에 많은 다른 효소는 다양한 독소를 포함하여 발효액으로 분비된다.
이전에 U.S. 2015/0010532에 기재된 바와 같이, 콜라게나제를 생성하는 발효에서 이들 독소의 기능성을 조사하기 위해 씨. 히스톨리티쿰 균주 004로부터의 분비된 독소의 게놈 시퀀싱 및 분석을 수행하였다. 조사된 독소는 알파 독소(치사 인자), 베타 독소(유형 I 및 유형 II 콜라게나제), 감마 독소(클로스트리파인), 델타 독소(중성 프로테아제), 및 입실론 독소(산소 불안정성 헤몰리신)이었다. 게놈 서열 분석에 기초하여, 단지 콜라게나제 및 클로스트리파인만이 균주 004의 기능적 독소인 것으로 생각되었다. 다른 독소는 씨. 히스톨리티쿰 단백질 및 각각의 모델 단백질 사이에서 중요한 아미노산 서열 차이에 기초하여 비-기능적인 것으로 간주되었다.
중성 프토테아제(NP)로도 알려진 델타 독소는 씨. 히스톨리티쿰으로부터의 메탈로프로테아제이다. 중성 프로테아제는 메탈로프로테아제의 M4 패밀리의 구성원이고 MEROPS 펩티다제 데이터베이스에 따라, 중성 프로테아제는 공통 서열 모티프, 기질 특이성, 및 보조인자 요건을 포함하는 M4 패밀리에 대한 구조적 유사성을 갖는다. 써몰리신은 M4 패밀리에서 가장 연구되고 이해된 효소이다. 이 연구와 관련하여, 바실러스 써모프로테올리티쿠스(Bacillus thermoproteolyticus)로부터의 써몰리신은 이전에 클로닝 및 시퀀싱되었고, 정보는 수탁 번호 CAA54291로 진뱅크에 기탁되었다. 써몰리신은 34.6 kDa의 성숙 효소 분자량을 갖는 아연 메탈로프로테아제이다. 써몰리신 및 M4 펩티다제 패밀리의 모든 구성원은 신호 펩티드, 프로서열, 및 성숙 서열로 구성된다.
써몰리신이 세포에 의해 생성될 때, 이는 성숙 효소 서열에 앞서 단백질 프로서열이 써몰리신을 억제하기 때문에 불활성 효소(전구효소)로서 시작한다. 프로서열은 분비된 프로-효소 크기의 2/3을 나타내는 반면, 성숙 효소는 1/3을 나타낸다. 써몰리신에서 프로서열은 자가촉매적으로 절단되어, 목적 환경에서 성숙 효소의 활성화를 초래한다. 써몰리신 분비 전략은 중성 프로테아제와 공유되며, 씨. 히스톨리티쿰 중성 프로테아제가 또한 불활성 프로테아제로 시작되었다는 결론의 근거가 되었다. 마찬가지로, 성숙 형태의 씨. 히스톨리티쿰 중성 프로테아제는 U.S. 2015/0010532(Herber) 및 문헌[Maedaef al., Cloning a neutral protease of Clostridium histolyticum, determining its substrate specificity, and designing a specific substrate, Appl.Microbiol.Biotech., 99:10489-99 (2015)]에 기재된 바와 같이, 써몰리신과 유사한 분자량을 갖는다.
써몰리신의 합성, 분비, 활성화, 및 기질 특이성에서의 유사성은 써몰리신을 씨. 히스톨리티쿰 균주 004로부터의 중성 프로테아제에 대한 모델로 만든다. 써몰리신 및 중성 프로테아제 사이의 이러한 속성은 공유된 구조적 특성에 근거하여 비교할 수 있지만, 두 효소 사이에 서열 차이가 존재한다. 본 발명과 관련하여, U.S. 2015/0010532(Herber)에서 델타 독소의 이전 게놈 분석 및 써몰리신에 대한 상동성 비교는 중성 프로테아제가 성장 배지로 분비될 가능성이 있지만, 자가촉매작용 부위에서 분기 공통 서열로 인해 활성이 아니었다고 결론내렸다.
써몰리신(및 모든 중성 프로테아제)의 특징적인 특성은 작용할 수 있는 광범위한 단백질이라는 점이다. 의약품, 특히 신체에 주사되는 의약품에서 비-특이적 프로테아제의 존재는 그들이 소량으로 존재할 때에도 신체에서 표적되지 않은 효소, 세포 및 조직을 바람직하지 않게 분해하기 때문에 문제가 된다.
콜라게나제를 제조하기 위한 이전의 공정은 때때로 비정형 콜라게나제 분해를 초래할 수 있다. 콜라게나제의 효율적이고 효과적인 상업적 제조를 위해, 독소가 없는 고도로 순수한 콜라게나제의 재현가능한 제조가 필요하다.
본 개시내용은 콜라게나제 I 및 II 생성물로부터 검출가능한 양의 중성 프로테아제를 제거하는 개선된 콜라게나제 제조 공정을 제공한다. 본 개시내용은 분해에 덜 취약하고, 의학 용도를 위한 이전의 콜라게나제 조성물보다 더 순수한 콜라게나제 생성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 제조 공정 동안 씨. 히스톨리티쿰으로부터 비정형 콜라게나제 I 및 II 분해의 원인을 식별하기 위한 조사를 수행하였다. 씨. 히스톨리티쿰으로부터의 중성 프로테아제가 씨. 히스톨리티쿰의 발효에서 활성인 성숙한 형태로 존재한다는 것이 발견되었다. 또한, 이 중성 프로테아제는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II에 대해 고도로 활성이며, 두 콜라게나제의 상당한 분해를 유발할 수 있다. 정제 과정 동안 이의 계속된 존재는 또한 두 콜라게나제를 분해할 수 있다.
이전에 불활성인 것으로 생각된 중성 프로테아제는 상승된 양의 하나 이상의 금속(예를 들어, 니켈 및 아연)의 존재 하에 예기치않게 광범위하게 보다 활성이 된다. 이 금속-매개 활성은 콜라게나제 제조 공정 동안 이러한 금속의 백만분율 수준의 존재 하에 상승된 수준의 콜라게나제 생성물 단편을 생성하여, 공정의 적어도 이온 교환(IEX) 크로마토그래피 단계에서 순도 실패를 야기한다.
본 발명은 또한 제조 공정으로부터 중성 프로테아제를 단리하는 방법, 공정으로부터 이를 제거하는 방법, 및 제조 공정 전체에 걸쳐 이의 존재 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 고도로 정제된 콜라게나제의 개선된 반복성 및 안정성을 제공하고, 중성 프로테아제가 본질적으로 없는(즉, 검출치 미만) 콜라게나제 I 및 II 생성물을 제공하고, 중성 프로테아제가 본질적으로 없는 더 안전하고 보다 순수한 콜라게 제 조성물을 제공한다.
제조 반복성은 발효 및 정제 공정 동안 금속을 제어함으로써 개선된다. 놀랍게도, 씨. 히스톨리티쿰으로부터 콜라게나제 I 및 II의 정제 동안 특정 금속의 존재 또는 부재는 콜라게나제 생성물의 순도에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 일 실시양태에서, 약 80 ppm 이상의 아연 수준, 또는 약 1 ppm 이상의 니켈 수준은 SDS-PAGE(나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)에 의해 측정시 상승된 수준에서 콜라게나제 I 생성물 및 콜라게나제 II 생성물 불순물을 초래하여, 약물 생성물에 대한 허용되지않는 수준의 불순물을 초래한다.
또 다른 실시양태에서, 아연 수준이 약 2.75 ppm 초과 및 약 80 ppm 미만인 경우, 콜라게나제는 단편으로 분해되지 않는다. 또한 정제 공정의 적어도 하나의 단계에서 니켈 수준이 약 0.4 ppm 초과 및 약 1 ppm 미만인 경우, 콜라게나제는 단편으로 분해되지 않는다. 또한, 약 3 ppm 이하에서 아연 수준을, 또는 약 0.5 ppm 이하의 니켈 수준을 유지하도록 약물 정제 공정을 제어하는 것은 고순도에서 콜라게나제 생성물 제조의 신뢰성 및 반복성을 개선시킨다. 상승된 수준의 콜라게나제 분해를 유발하지 않는 미량으로 금속 아연 및 니켈(또는 다른 금속)을 사용하여 콜라게나제 제조 공정을 작동하는 것은 이전의 공정에 비해 상당히 개선된 신뢰성 및 반복성을 초래한다.
특정 실시양태에서, 니켈 또는 아연이 콜라게나제 제조 공정의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계를 위한 완충제에 존재하는 경우, 중성 프로테아제는 콜라게나제 I 및 II를 더 작은 단편으로 능동적으로 분해하고 낮은 순도(SDS-PAGE로 측정 시 95% 미만 순수)를 초래한다. 일부 실시양태에서, 니켈(약 0.4 ppm 내지 약 1 ppm의 양) 및 아연(약 2.8 ppm 내지 84 ppm의 양)은 HIC 및 십자류 여과 방식(TFF) 단위 작동에서 중성 프로테아제 특이적 활성을 증폭시키지 않으며, IEX 단위 작동에서 상당히 증가된 생성물 분획 불순물을 야기하지 않는다. 일 실시양태에서, 니켈 또는 아연 수준을 위해 콜라게나제 제조 공정을 제어하는 것은 고순도 콜라게나제 I 및 II 생성물을 수득하는데 중요하다.
콜라게나제 조성물이 중성 프로테아제가 본질적으로 없도록 콜라게나제 제조 공정에서 중성 프로테아제를 제거하거나 적어도 감소시키는 것은 생성물의 안전성을 개선시키고 중성 프로테아제에 의한 생성물 내 콜라게나제의 분해를 방지한다. 콜라게나제 조성물은 제조 공정에서 적어도 하나의 중성 프로테아제 제거 단계를 첨가함으로써 개선된다. 콜라게나제 생성물의 제조에서 중성 프로테아제를 감소 또는 제거하는 것은 하기 제거 단계 중 하나 이상에 의해 달성될 수 있다: (a) SDS PAGE 겔 또는 HPLC에 의해 측정시 약 90% 미만의 콜라게나제 I 또는 II 함량 및 약 7% 초과의 임의의 단일 불순물을 갖는 임의의 분획을 배제하는 단계; (b) SDS PAGE 겔 또는 자이모그래피에 의해 측정시 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 갖는 임의의 분획을 배제하는 단계; 또는 (c) 초과 수준의 중성 프로테아제를 함유하는 것으로 계산된 임의의 분획을 배제하는 단계. 각각은 개별적으로 또는 조합하여 이용될 수 있다.
보다 특히, 제거 단계는 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II 분획을 풀링하기 전에, 콜라게나제가 분리 칼럼 또는 필터(또는 다른 분리 매질)를 통과한 후 수집되고 SDS-PAGE 또는 자이모그래피 검정에 의해 시험시 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 함유하는 분획의 거부를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분획은 상당한 양의 콜라게나제를 함유하는 경우에도 거부될 수 있다. 제거는 또한 SDS PAGE 또는 HPLC에 의해 측정시 약 90% 미만의 콜라게나제 I 또는 II 함량 및 약 7% 초과의 임의의 단일 불순물 함량을 갖는 임의의 콜라게나제 I 또는 II 분획을 거부 또는 폐기하는 것을 수반할 수 있다. 제거 단계는 콜라게나제 I 분획이 콜라게나제 I 생성물에 대해 풀링된 것을 제어하는 공정에서 생성된 추정량의 콜라게나제 II를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 이들 단계 중 어느 것이라도 콜라게나제 제조 공정에 이용되어 중성 프로테아제가 본질적으로 없는 콜라게나제 I 및 II 생성물을 생성할 수 있다.
중성 프로테아제 제거의 일 실시양태는 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 분획 순도에 대한 공정 제어를 시행하며, 여기서 각 분획은 순도 및 가장 풍부한 불순물 둘 다에 대해 분석되고, 각 분획은 전방 처리될 분획(풀링, 약물 생성물, 및 제약 제형용으로 허용됨)을 위해 이 기준을 충족해야 한다. 이 실시양태에서, IEX 단계의 콜라게나제 I 피크의 끝에서 중성 프로테아제 용리의 위치 특성은 SDS-PAGE, 밀도측정이 있는 SDS-PAGE, 또는 자이모그래피(밀도측정이 있거나 없음) 검정에 의해 중성 프로테아제의 검출가능한 한계를 제시하는 분획(들)을 자동거부함으로써 중성 프로테아제의 제거를 위한 효과적인 메커니즘을 제공한다. 다른 실시 양태에서, IEX 용리로부터 수집된 콜라게나제 I 분획의 피크 분획은 원하는 순도 및 불순물 기준을 충족하는 분획에 기초하여, 풀링된 콜라게나제 I의 근사치 양이 공정에 의해 생성된 콜라게나제 II의 근사치 양과 일치할 때까지 콜라게나제 I 피크 분획만 풀링하는 것과 함께 전방 처리된다. 이 제어 전략은 콜라게나제 I 피크의 추가 끝 분획을 제거하여, 콜라게나제 I의 풀링된 분획이 중성 프로테아제가 본질적으로 없도록 한다.
본 발명은 본 발명에 따른 제약 제형을 제조하는 방법, 및 본 발명의 콜라게나제 조성물을 사용하여 콜라겐-매개 질환을 앓고있는 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 예를 들어, 콜라겐-매개 질환을 치료하는 방법은 유효량의 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 이들의 조합을 투여함으로써 고려된다. 일 실시양태에서, 본 개시내용은 콜라겐-매개 상태(예를 들어, 셀룰라이트)의 치료를 필요로 하는 환자에서 콜라겐-매개 상태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 유효량의 콜라게나제 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 콜라게나제 조성물은 약 0.6:1.4 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II 내지 약 1.4:0.6 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 질량비로 조합된 콜라게나제 I 생성물 및 콜라게나제 II 생성물을 포함하고, 조성물은 중성 프로테아제가 본질적으로 없다. 또한, 본 개시내용은 더 안정하고 안전한 제약 제형을 제공한다.
본 발명의 조성물 및 방법 등의 추가 실시양태는 하기 설명, 도면, 실시예 및 청구범위로부터 분명할 것이다. 상기 및 하기의 설명으로부터 이해될 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 각각 및 모든 특성, 및 그러한 특성 중 둘 이상의 각각 및 모든 조합은 그러한 조합에 포함된 특성이 상호 일관성이 없는 한 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 또한, 임의의 특성 또는 특성의 조합은 임의의 실시양태 또는 측면으로부터 구체적으로 배제될 수 있다. 추가의 측면 및 실시양태는 특히 첨부된 실시예 및 도면과 함께 고려될 때 하기 설명 및 청구 범위에 제시되어 있다.
유색 도면에 대한 참조
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도면의 간단한 설명
전술한 실시양태의 특성은 첨부 도면을 참조하여 하기 상세한 설명을 참조함으로써 보다 용이하게 이해될 것이며, 여기서:
도 1은 AUX-I/AUX-II 밴드에 대한 반응의 선형성을 나타내는 플롯의 예이다. 이는 미량의 콜라게나제 대 최소 1.125 마이크로그램 내지 1.875 마이크로그램의 범위에 걸쳐 알려진 기준 표준의 플롯이며 98% 초과의 R2값을 갖는다.
도 2는 Bio-Rad Quantity One 소프트웨어에 의해 생성된 주석이 달린 이미지 보고서의 예이다. 레인 1은 알려진 분자량의 밴드를 갖는 분자량 표준을 함유한다. 레인 2는 적절한 AUX 중간체 기준 표준을 함유한다. 나머지 레인은 각 IEX 분획으로부터의 샘플을 함유한다. 주요 생성물 밴드는 각 레인의 상단 밴드이고 각 추가의 하단 밴드는 불순물을 나타낸다.
도 3은 AUX-I 33 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 4은 AUX-I 45 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 5은 AUX-I 55 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 6은 AUX-I 80 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 7은 AUX-I 90 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 8은 AUX-I 96 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 9은 AUX-II 25 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 10은 AUX-II 38 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 11은 AUX-II 50 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 12은 AUX-II 60 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 13은 AUX-II 80 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 14은 AUX-II 90 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 15은 AUX-II 92 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 16은 AUX-II 96 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 17은 IEX 분획 당 단백질의 전형적인 그램을 예시한다.
도 18은 IEX 분획 당 90 kD 불순물의 전형적인 추정된 그램을 예시한다.
도 19는 AUX 피크 당 단백질 그램에 대한 90 kD 불순물의 추정된 그램을 제시한다.
도 20은 AUX-I 불순물에 대한 관리도를 제시한다.
도 21a 및 21b는 AUX-II 불순물에 대한 관리도를 제시한다.
도 22는 아연 스파이킹 연구로부터의 대조군 실행 동안 IEX 칼럼 후 AUX-II 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(DEV-25C). IEX 칼럼으로부터의 AUX-II 피크를 6개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 AUX-II 분획의 전형적인 순도 및 생성물-관련 불순물의 전형적인 패턴을 제시한다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 II
레인 3: 분획 #1 - 94.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #2 - 98.1% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #3 - 98.4% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #4 - 97.3% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #5 - 96.3% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #6 - 89.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 블랭크
레인 10: 콜라게나제 I
레인 11: 콜라게나제 I 피크의 분획 #16(1.5 μg/레인)
도 23은 아연 스파이킹 연구에서 대조군 실행 동안 IEX 칼럼 후 AUX-I 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25C). IEX 칼럼으로부터의 AUX-I 피크를 10개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 AUX-I 분획의 전형적인 순도 및 생성물-관련 불순물의 전형적인 패턴을 제시한다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I
레인 3: 분획 #7 - 87.7% 순도
레인 4: 분획 #8 - 86.5% 순도
레인 5: 분획 #9 - 92.0% 순도
레인 6: 분획 #10 - 95.8% 순도
레인 7: 분획 #11 - 97.8% 순도
레인 8: 분획 #12 - 97.1% 순도
레인 9: 분획 #13 - 97.0% 순도
레인 10: 분획 #14 - 96.8% 순도
레인 11: 분획 #15 - 96.5% 순도
도 24는 아연이 84 ppm으로 스파이킹된 아연 스파이킹 연구로부터 IEX 칼럼 후 AUX-II 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25B). IEX 칼럼으로부터의 AUX-II 피크를 8개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 불순물의 수 및 강도에서의 증가 및 AUX-II 분획의 순도에서의 감소와 함께 아연의 존재에 의해 유발된 분해 패턴을 제시한다. 이 겔에서, 어떠한 AUX-II 분획도 순도에 대한 풀링 기준을 충족시키지 않았다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 II
레인 3: 분획 #1 - 66.4% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #2 - 75.5% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #3 - 79.5% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #4 - 76.7% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #5 - 72.1% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #6 - 63.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 분획 #7 - 52.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 10: 분획 #8 - 45.0% 순도(1.5 μg/레인)
도 25는 아연이 84 ppm으로 스파이킹된 아연 스파이킹 연구로부터 IEX 칼럼 후 AUX-I 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25B). IEX 칼럼으로부터의 AUX-I 피크를 10개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 불순물의 수 및 강도에서의 증가 및 AUX-I 분획의 순도에서의 감소와 함께 아연의 존재에 의해 유발된 분해 패턴을 제시한다. 이 겔에서, 어떠한 AUX-II 분획도 순도에 대한 풀링 기준을 충족시키지 않았다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I
레인 3: 분획 #9 - 54.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #10 - 50.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #11 - 56.2% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #12 - 65.2% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #13 - 70.4% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #14 - 70.0% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 분획 #15 - 67.5% 순도(1.5 μg/레인)
레인 10: 분획 #16 - 62.4% 순도(1.5 μg/레인)
레인 11: 분획 #17 - 58.8% 순도(1.5 μg/레인)
레인 12: 분획 #18 - 52.6% 순도(1.5 μg/레인)
도 26은 니켈 스파이킹 연구에서 대조군 실행으로부터 IEX 칼럼 후 AUX-II 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25A). IEX 칼럼으로부터의 AUX-II 피크를 6개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 AUX-I 분획의 전형적인 순도 및 생성물-관련 불순물의 전형적인 패턴을 제시한다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 II
레인 3: 분획 #1 - 95.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #2 - 97.1% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #3 - 99.1% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #4 - 98.2% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #5 - 96.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #6 - 92.3% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 블랭크
레인 10: 콜라게나제 I
레인 11: 콜라게나제 I 피크의 분획 #16(1.5 μg/레인)
도 27은 니켈 스파이킹 연구에서 대조군 실행으로부터 IEX 칼럼 후 AUX-I 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25A). IEX 칼럼으로부터의 AUX-I 피크를 10개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 AUX-II 분획의 전형적인 순도 및 생성물-관련 불순물의 전형적인 패턴을 제시한다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I
레인 3: 분획 #7 - 85.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #8 - 85.2% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #9 - 90.7% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #10 - 95.5% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #11 - 96.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #12 - 97.0% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 분획 #13 - 96.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 10: 분획 #14 - 96.8% 순도(1.5 μg/레인)
레인 11: 분획 #15 - 96.8% 순도(1.5 μg/레인)
도 28은 니켈이 1.2 ppm으로 스파이킹된 아연 스파이킹 연구로부터 IEX 칼럼 후 AUX-II 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25D). IEX 칼럼으로부터의 AUX-II 피크를 7개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 불순물의 수 및 강도에서의 증가 및 AUX-II 분획의 순도에서의 감소와 함께 니켈의 존재에 의해 유발된 분해 패턴을 제시한다. 이 겔에서, 어떠한 AUX-II 분획도 순도에 대한 풀링 기준을 충족시키지 않았다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 II
레인 3: 분획 #1 - 74.8% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #2 - 81.8% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #3 - 84.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #4 - 85.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #5 - 83.0% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #6 - 72.3% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 분획 #7 - 64.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 10: 블랭크
레인 11: 콜라게나제 I
레인 12: 콜라게나제 I 피크로부터의 분획 #8 - 62.7% 순도(1.5 μg/레인)
도 29는 니켈이 1.2 ppm으로 스파이킹된 니켈 스파이킹 연구로부터 IEX 칼럼 후 AUX-I 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25D). IEX 칼럼으로부터의 AUX-I 피크를 10개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 불순물의 수 및 강도에서의 증가 및 AUX-I 분획의 순도에서의 감소와 함께 니켈의 존재에 의해 유발된 분해 패턴을 제시한다. 이 겔에서, 어떠한 AUX-I 분획도 순도에 대한 풀링 기준을 충족시키지 않았다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I
레인 3: 분획 #9 - 60.3% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #10 - 67.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #11 - 81.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #12 - 84.7% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #13 - 84.1% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #14 - 82.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 분획 #15 - 82.0% 순도(1.5 μg/레인)
레인 10: 분획 #16 - 72.4% 순도(1.5 μg/레인)
레인 11: 분획 #17 - 68.6% 순도(1.5 μg/레인)
도 30은 Q-세파로즈 고성능(Q-HP) 크로마토그램 및 쿠마시 염색 겔 이미지로 나타낸 SDS-PAGE이다. 로드 및 병합된 AUX I 및 AUX II 풀링된 분획이 제시된다. Q HP 크로마토그램은 IEX 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 HIC 크로마토그래피 단계의 폐수 스트림으로부터 중성 프로테아제의 정제를 나타낸다. 겔 이미지는 IEX 로드 및 정제에 걸쳐 수집된 분획을 도시한다. 중성 프로테아제는 구배 말단에서 용리되고 분획 3에서 관찰된다. 모든 불순물의 N-말단은 정제된 생성물 단편을 사용하여 에드만 분해 및 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS)에 의해 결정되었다. 써몰리신을 모델 프로테아제로 사용하여 절단 말단이 http://expasy.org의 단백질 분석 프로그램 펩티드 컷터에서 써몰리신 절단 부위와 일치하는지 여부를 결정하였다. 모든 경우에 절단 말단은 써몰리신 절단에 대해 적중되었다. 정제된 중성 프로테아제는 에드만 분해 및 LC-MS에 의해 시퀀싱되어 현재 공정 중성 프로테아제 N-말단을 식별하였다. 이는 또한 공정 단리된 중성 프로테아제가 기능적(활성)임을 확인하는 분해 연구에 사용되었다.
도 31은 씨. 히스톨리티쿰(CCH) 중성 프로테아제(δ-독소, CHL_2576)의 추론된 게놈 서열이다. 청색 강조표시는 에드만 분해 시험에 의해 식별된 바와 같은 씨. 히스톨리티쿰 균주 004로부터의 성숙 중성 프로테아제의 N-말단을 식별하고 청색으로 강조표시된다. 녹색 강조표시는 Lys-C/트립신 LC-질량 스펙트럼에 의해 검출된 씨. 히스톨리티쿰의 성숙 중성 프로테아제의 부분을 식별한다.
도 32는 Schechter 및 Berger 프로테아제 하위부위 명명법을 기재한다.
도 33은 두 효소 사이의 완전한 상동성을 나타내는 rnpr A 및 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(약칭 CCH) 중성 프로테아제(CLH_2576)의 서열 정렬이다.
도 34는 씨. 히스톨리티쿰(CCH) 공정중 생성물 스트림의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다: 로트 100808로부터의 Mustang-Q 여과액(MQF), HIC 로드, HIC 용리액 및 AUX-II 풀. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 로트 100808을 생성한 제조 공정은 고 수준의 불순물을 생성하고 기존의 공정 제어 방법을 사용하였다. 중성 프로테아제 활성은 이 이미지에서 MQF, HIC 로드, 및 HIC 용리액에서 관찰되었지만, AUX-II 풀에서는 관찰되지 않았다. HIC 용리액 샘플에서 관찰된 저 신호는 HIC 단계에서 중성 프로테아제의 1차 클리어런스가 발생함을 나타낸다.
레인 1: + 대조군(써몰리신), 1 ng
레인 2: 분자량 기준
레인 3: 블랭크
레인 4: MQF Dev-25A, 2 μg
레인 5: 블랭크
레인 6: HIC 로드 Dev-13, 3 μg
레인 7: 블랭크
레인 8: 블랭크
레인 9: HIC 용리액 Dev-25A, 4 μg
레인 10: 블랭크
레인 11: Aux II 풀 1000808, 10 μg
레인 12: 블랭크
도 35는 씨. 히스톨리티쿰(CCH) 공정중 생성물 스트림의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다: 제1 십자류 여과방식(TFF-1) 농축물, AUX-I 풀, AUX-I 중간체, AUX-II 중간체, 아연 및 니켈 함량이 높은 HIC 완충제에 의해 영향받은 로트로부터의 약물 생성물. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 이 경우, 중성 프로테아제는 TFF-1 농축물 및 저 수준의 AUX-I 및 약물 생성물에서 관찰되었지만, AUX-II에서는 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 AUX-I로 용리하면서 IEX 단계에 걸쳐 생성물로부터 중성 프로테아제 분리를 입증한다.
레인 1: + 대조군(써몰리신), 1 ng
레인 2: 분자량 기준
레인 3: 블랭크
레인 4: TFF-1 농축물 10000808, 10 μg
레인 5: 블랭크
레인 6: AUX-I 풀 10000808, 10 μg
레인 7: 블랭크
레인 8: AUX-I 중간체 10000808, 10 μg
레인 9: 블랭크
레인 10: AUX-II 중간체 10000808, 10 μg
레인 11: 블랭크
레인 12: 약물 물질 10000808, 10 μg
도 36은 로트 1000414 AUX-II 분획의 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) IEX 분획 보유물의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 이들 분획은 공정에서 활성 중성 프로테아제의 발견 전에 생성된 제조 로트로부터 유래하였다. 중성 프로테아제는 임의의 AUX-II 분획에서 검출되지 않았다.
레인 1: + 대조군(써몰리신), 1 ng
레인 2: 분자량 기준
레인 3: AUX-II Fxn 1 1000414, 6.4 μg
레인 4: AUX-II Fxn 2 1000414, 14.4 μg
레인 5: AUX-II Fxn 3 1000414, 10 μg
레인 6: AUX-II Fxn 4 1000414, 10 μg
레인 7: AUX-II Fxn 5 1000414, 10 μg
레인 8: AUX-II Fxn 6 1000414, 11.2 μg
레인 9: AUX-II Fxn 7 1000414, 6.2 μg
레인 10: AUX-II Fxn 8 1000414, 5.8 μg
도 37은 로트 1000414 AUX-I 분획의 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) IEX 분획 보유물의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 이들 분획은 공정에서 활성 중성 프로테아제의 발견 전에 생성된 제조 로트로부터 유래하였다. 중성 프로테아제는 이 방법을 사용하여 임의의 AUX-I 분획에서 검출되지 않았다.
레인 1: 분자량 기준
레인 2: AUX-I Fxn 9 1000414, 8.8 μg
레인 3: AUX-I Fxn 10 1000414, 10 μg
레인 4: AUX-I Fxn 11 1000414, 10 μg
레인 5: AUX-I Fxn 12 1000414, 10 μg
레인 6: AUX-I Fxn 13 1000414, 10 μg
레인 7: AUX-I Fxn 14 1000414, 10 μg
레인 8: AUX-I Fxn 15 1000414, 10 μg
레인 9: AUX-I Fxn 16 1000414, 14 μg
레인 10: AUX-I Fxn 17 1000414, 10 μg
도 38은 로트 1000414 AUX-II 분획 1, 7 및 AUX-I 분획 8, 17의 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) IEX 분획 보유물의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 로트 1000414를 생성한 제조 공정은 고 수준의 불순물을 생성하고 기존의 공정 제어 방법을 사용하였다. 이 겔에서, 분획은 원래 겔에서보다 더 높은 농도에서 실행되었다(도 16 및 17). 중성 프로테아제는 AUX-I 피크의 마지막 분획(분획 17)에서만 검출되었으며, 이는 피크의 끝에서 용리시 위치 특성을 입증한다.
레인 1: + 대조군(써몰리신), 1 ng
레인 2: 분자량 기준
레인 3: AUX-II Fxn 1 1000414 Tris-Gly, 10 μg
레인 4: AUX-II Fxn 1 1000414 LDS, 10 μg
레인 5: AUX-II Fxn 7 1000414 Tris-Gly, 9.3 μg
레인 6: AUX-II Fxn 7 1000414 LDS, 9.3 μg
레인 7: AUX-I Fxn 8 1000414 Tris-Gly, 6.5 μg
레인 8: AUX-I Fxn 8 1000414 LDS, 6.5 μg
레인 9: AUX-I Fxn 17 1000414 Tris-Gly, 11 μg
레인 10: AUX-I Fxn 17 1000414 LDS, 11 μg
Tris-Gly 및 LDS는 SDS-PAGE를 위한 두 가지 완충제 시스템이다. 이 겔은 하나의 시스템이 다른 시스템보다 우수했는지를 평가하기 위해 실행되었다. 차이점은 언급되지 않았다.
도 39는 로트 001138 AUX-I 꼬리 분획 17, 18, 19의 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) IEX 분획 보유물의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 이 겔은 AUX-I 피크의 끝에서 거부된 분획을 도시한다. 3개의 거부된 분획은 각각 검출가능한 중성 프로테아제를 함유하였다. 분획 17 및 18은 공정중 풀링 기준을 통과했지만 1:1 수율 표적 풀링 전략에 기초하여 거부되었다. 이는 AUX-I 및 약물 생성물로부터 잔류 중성 프로테아제를 제거하는 공정 제어를 입증한다.
레인 1: TFF-1 농축물 Dev-25A, 34 μg
레인 2: 분자량 기준
레인 3: 블랭크
레인 4: AUX-1 Fxn 7 Dev-25A, 4.5 μg
레인 5: 블랭크
레인 6: AUX-I Fxn 17 Dev-25A, 5 μg
레인 7: 블랭크
레인 8: AUX-I Fxn 17 001138, 14.8 μg
레인 9: 블랭크
레인 10: AUX-I Fxn 18 001138, 10.3 μg
레인 11: 블랭크
레인 12: AUX-I Fxn 19 001138, 8.1 μg
도 40a-b는 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) 제조 공정 로트 0010987의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 SDS PAGE 이미지이다. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 이 겔은 AUX-I 피크의 끝에서 거부된 분획을 도시한다. 3개의 거부된 분획은 각각 검출가능한 중성 프로테아제를 함유하였다. 분획 17 및 18은 공정중 풀링 기준을 통과했지만 1:1 수율 표적 풀링 전략에 기초하여 거부되었다. 이는 AUX-I 및 약물 생성물로부터 잔류 중성 프로테아제를 제거하는 공정 제어를 입증한다. 도 40a는 공정 전체에 걸쳐 AUX-I에 대한 정제 상태를 제시한다. 도 40b는 공정 전체에 걸쳐 AUX-II에 대한 정제 상태를 제시한다.
도 40a
레인 1: 양성 대조군(TL)
레인 2: 분자량 기준
레인 3: 비어있음
레인 4: Mustang Q 여과액, 2.1 μg 로드
레인 5: 비어있음
레인 6: HIC 용리액, 4.9 μg 로드
레인 7: 비어있음
레인 8: AUX-I 풀, 10 μg 로드
레인 9: 비어있음
레인 10: AUX-I 중간체, 10 μg 로드
레인 11: 비어있음
레인 12: 검정 블랭크
도 40b
레인 1: 양성 대조군(TL)
레인 2: 분자량 기준
레인 3: 비어있음
레인 4: TFF-1 농축물, 10 μg 로드
레인 5: 비어있음
레인 6: AUX-II 풀, 10 μg 로드
레인 7: 비어있음
레인 8: AUX-II 중간체, 10 μg 로드
레인 9: 비어있음
레인 10: 벌크 약물 물질(약물 생성물), 10 μg 로드
레인 11: 비어있음
레인 12: 검정 블랭크
도 41은 콜라게나제 I 분획 및 콜라게나제 II의 수집물 및 순도 기준 충족에 기초하여 그들의 전방 처리를 도시한다.
도 42는 각 AUX 용리 피크에서 총 단백질의 양에 대한 AUX-I 생성물의 퍼센트 순도를 제공한다.
도 43는 각 AUX 용리 피크에서 총 단백질의 양에 대한 AUX-II 생성물의 퍼센트 순도를 제공한다.
도 44는 AUX-I 90 kDa 불순물의 관리도를 나타낸다. 도 42에 보여진 AUX-I 용리 피크의 퍼센트 순도 수준에서의 감소는 주로 AUX-I 90 kDa 불순물의 상승된 수준에 기인한다.
도 45는 AUX-II 96 kDa 불순물의 관리도를 나타낸다. 도 43에 보여진 AUX-II 용리 피크의 퍼센트 순도 수준에서의 감소는 주로 AUX-II 96 kDa 불순물의 상승된 수준에 기인한다.
도 46a-46d는 다양한 AUX 피크 및 밴드에 대한 생성물 피크의 추정된 퍼센트를 제공한다. 이들 도면에 의해 제공된 데이터는 편차 3797과 관련된 교정 및 예방 조치의 시행 후 IEX 분획 불순물의 평가를 위한 통계 분석에 사용되었다.
본 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 본 특허 출원 간행물과 컬러 도면의 사본은 요청시 필요한 요금을 지불하면 사무소에서 제공될 것이다.
도면의 간단한 설명
전술한 실시양태의 특성은 첨부 도면을 참조하여 하기 상세한 설명을 참조함으로써 보다 용이하게 이해될 것이며, 여기서:
도 1은 AUX-I/AUX-II 밴드에 대한 반응의 선형성을 나타내는 플롯의 예이다. 이는 미량의 콜라게나제 대 최소 1.125 마이크로그램 내지 1.875 마이크로그램의 범위에 걸쳐 알려진 기준 표준의 플롯이며 98% 초과의 R2값을 갖는다.
도 2는 Bio-Rad Quantity One 소프트웨어에 의해 생성된 주석이 달린 이미지 보고서의 예이다. 레인 1은 알려진 분자량의 밴드를 갖는 분자량 표준을 함유한다. 레인 2는 적절한 AUX 중간체 기준 표준을 함유한다. 나머지 레인은 각 IEX 분획으로부터의 샘플을 함유한다. 주요 생성물 밴드는 각 레인의 상단 밴드이고 각 추가의 하단 밴드는 불순물을 나타낸다.
도 3은 AUX-I 33 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 4은 AUX-I 45 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 5은 AUX-I 55 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 6은 AUX-I 80 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 7은 AUX-I 90 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 8은 AUX-I 96 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 9은 AUX-II 25 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 10은 AUX-II 38 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 11은 AUX-II 50 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 12은 AUX-II 60 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 13은 AUX-II 80 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 14은 AUX-II 90 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 15은 AUX-II 92 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 16은 AUX-II 96 kD 불순물에 대한 분획에 의한 불순물 발생 빈도 및 분획에 의한 불순물의 평균 양 및 상대 퍼센트 양의 범위를 나타낸다.
도 17은 IEX 분획 당 단백질의 전형적인 그램을 예시한다.
도 18은 IEX 분획 당 90 kD 불순물의 전형적인 추정된 그램을 예시한다.
도 19는 AUX 피크 당 단백질 그램에 대한 90 kD 불순물의 추정된 그램을 제시한다.
도 20은 AUX-I 불순물에 대한 관리도를 제시한다.
도 21a 및 21b는 AUX-II 불순물에 대한 관리도를 제시한다.
도 22는 아연 스파이킹 연구로부터의 대조군 실행 동안 IEX 칼럼 후 AUX-II 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(DEV-25C). IEX 칼럼으로부터의 AUX-II 피크를 6개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 AUX-II 분획의 전형적인 순도 및 생성물-관련 불순물의 전형적인 패턴을 제시한다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 II
레인 3: 분획 #1 - 94.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #2 - 98.1% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #3 - 98.4% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #4 - 97.3% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #5 - 96.3% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #6 - 89.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 블랭크
레인 10: 콜라게나제 I
레인 11: 콜라게나제 I 피크의 분획 #16(1.5 μg/레인)
도 23은 아연 스파이킹 연구에서 대조군 실행 동안 IEX 칼럼 후 AUX-I 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25C). IEX 칼럼으로부터의 AUX-I 피크를 10개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 AUX-I 분획의 전형적인 순도 및 생성물-관련 불순물의 전형적인 패턴을 제시한다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I
레인 3: 분획 #7 - 87.7% 순도
레인 4: 분획 #8 - 86.5% 순도
레인 5: 분획 #9 - 92.0% 순도
레인 6: 분획 #10 - 95.8% 순도
레인 7: 분획 #11 - 97.8% 순도
레인 8: 분획 #12 - 97.1% 순도
레인 9: 분획 #13 - 97.0% 순도
레인 10: 분획 #14 - 96.8% 순도
레인 11: 분획 #15 - 96.5% 순도
도 24는 아연이 84 ppm으로 스파이킹된 아연 스파이킹 연구로부터 IEX 칼럼 후 AUX-II 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25B). IEX 칼럼으로부터의 AUX-II 피크를 8개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 불순물의 수 및 강도에서의 증가 및 AUX-II 분획의 순도에서의 감소와 함께 아연의 존재에 의해 유발된 분해 패턴을 제시한다. 이 겔에서, 어떠한 AUX-II 분획도 순도에 대한 풀링 기준을 충족시키지 않았다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 II
레인 3: 분획 #1 - 66.4% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #2 - 75.5% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #3 - 79.5% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #4 - 76.7% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #5 - 72.1% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #6 - 63.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 분획 #7 - 52.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 10: 분획 #8 - 45.0% 순도(1.5 μg/레인)
도 25는 아연이 84 ppm으로 스파이킹된 아연 스파이킹 연구로부터 IEX 칼럼 후 AUX-I 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25B). IEX 칼럼으로부터의 AUX-I 피크를 10개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 불순물의 수 및 강도에서의 증가 및 AUX-I 분획의 순도에서의 감소와 함께 아연의 존재에 의해 유발된 분해 패턴을 제시한다. 이 겔에서, 어떠한 AUX-II 분획도 순도에 대한 풀링 기준을 충족시키지 않았다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I
레인 3: 분획 #9 - 54.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #10 - 50.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #11 - 56.2% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #12 - 65.2% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #13 - 70.4% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #14 - 70.0% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 분획 #15 - 67.5% 순도(1.5 μg/레인)
레인 10: 분획 #16 - 62.4% 순도(1.5 μg/레인)
레인 11: 분획 #17 - 58.8% 순도(1.5 μg/레인)
레인 12: 분획 #18 - 52.6% 순도(1.5 μg/레인)
도 26은 니켈 스파이킹 연구에서 대조군 실행으로부터 IEX 칼럼 후 AUX-II 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25A). IEX 칼럼으로부터의 AUX-II 피크를 6개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 AUX-I 분획의 전형적인 순도 및 생성물-관련 불순물의 전형적인 패턴을 제시한다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 II
레인 3: 분획 #1 - 95.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #2 - 97.1% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #3 - 99.1% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #4 - 98.2% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #5 - 96.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #6 - 92.3% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 블랭크
레인 10: 콜라게나제 I
레인 11: 콜라게나제 I 피크의 분획 #16(1.5 μg/레인)
도 27은 니켈 스파이킹 연구에서 대조군 실행으로부터 IEX 칼럼 후 AUX-I 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25A). IEX 칼럼으로부터의 AUX-I 피크를 10개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 AUX-II 분획의 전형적인 순도 및 생성물-관련 불순물의 전형적인 패턴을 제시한다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I
레인 3: 분획 #7 - 85.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #8 - 85.2% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #9 - 90.7% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #10 - 95.5% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #11 - 96.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #12 - 97.0% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 분획 #13 - 96.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 10: 분획 #14 - 96.8% 순도(1.5 μg/레인)
레인 11: 분획 #15 - 96.8% 순도(1.5 μg/레인)
도 28은 니켈이 1.2 ppm으로 스파이킹된 아연 스파이킹 연구로부터 IEX 칼럼 후 AUX-II 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25D). IEX 칼럼으로부터의 AUX-II 피크를 7개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 불순물의 수 및 강도에서의 증가 및 AUX-II 분획의 순도에서의 감소와 함께 니켈의 존재에 의해 유발된 분해 패턴을 제시한다. 이 겔에서, 어떠한 AUX-II 분획도 순도에 대한 풀링 기준을 충족시키지 않았다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 II
레인 3: 분획 #1 - 74.8% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #2 - 81.8% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #3 - 84.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #4 - 85.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #5 - 83.0% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #6 - 72.3% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 분획 #7 - 64.9% 순도(1.5 μg/레인)
레인 10: 블랭크
레인 11: 콜라게나제 I
레인 12: 콜라게나제 I 피크로부터의 분획 #8 - 62.7% 순도(1.5 μg/레인)
도 29는 니켈이 1.2 ppm으로 스파이킹된 니켈 스파이킹 연구로부터 IEX 칼럼 후 AUX-I 분획에서 불순물을 나타내는 SDS-PAGE 쿠마시-염색된 겔이다(Run DEV-25D). IEX 칼럼으로부터의 AUX-I 피크를 10개 분획으로 수집하였다. 이 겔은 불순물의 수 및 강도에서의 증가 및 AUX-I 분획의 순도에서의 감소와 함께 니켈의 존재에 의해 유발된 분해 패턴을 제시한다. 이 겔에서, 어떠한 AUX-I 분획도 순도에 대한 풀링 기준을 충족시키지 않았다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I
레인 3: 분획 #9 - 60.3% 순도(1.5 μg/레인)
레인 4: 분획 #10 - 67.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 5: 분획 #11 - 81.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 6: 분획 #12 - 84.7% 순도(1.5 μg/레인)
레인 7: 분획 #13 - 84.1% 순도(1.5 μg/레인)
레인 8: 분획 #14 - 82.6% 순도(1.5 μg/레인)
레인 9: 분획 #15 - 82.0% 순도(1.5 μg/레인)
레인 10: 분획 #16 - 72.4% 순도(1.5 μg/레인)
레인 11: 분획 #17 - 68.6% 순도(1.5 μg/레인)
도 30은 Q-세파로즈 고성능(Q-HP) 크로마토그램 및 쿠마시 염색 겔 이미지로 나타낸 SDS-PAGE이다. 로드 및 병합된 AUX I 및 AUX II 풀링된 분획이 제시된다. Q HP 크로마토그램은 IEX 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 HIC 크로마토그래피 단계의 폐수 스트림으로부터 중성 프로테아제의 정제를 나타낸다. 겔 이미지는 IEX 로드 및 정제에 걸쳐 수집된 분획을 도시한다. 중성 프로테아제는 구배 말단에서 용리되고 분획 3에서 관찰된다. 모든 불순물의 N-말단은 정제된 생성물 단편을 사용하여 에드만 분해 및 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS)에 의해 결정되었다. 써몰리신을 모델 프로테아제로 사용하여 절단 말단이 http://expasy.org의 단백질 분석 프로그램 펩티드 컷터에서 써몰리신 절단 부위와 일치하는지 여부를 결정하였다. 모든 경우에 절단 말단은 써몰리신 절단에 대해 적중되었다. 정제된 중성 프로테아제는 에드만 분해 및 LC-MS에 의해 시퀀싱되어 현재 공정 중성 프로테아제 N-말단을 식별하였다. 이는 또한 공정 단리된 중성 프로테아제가 기능적(활성)임을 확인하는 분해 연구에 사용되었다.
도 31은 씨. 히스톨리티쿰(CCH) 중성 프로테아제(δ-독소, CHL_2576)의 추론된 게놈 서열이다. 청색 강조표시는 에드만 분해 시험에 의해 식별된 바와 같은 씨. 히스톨리티쿰 균주 004로부터의 성숙 중성 프로테아제의 N-말단을 식별하고 청색으로 강조표시된다. 녹색 강조표시는 Lys-C/트립신 LC-질량 스펙트럼에 의해 검출된 씨. 히스톨리티쿰의 성숙 중성 프로테아제의 부분을 식별한다.
도 32는 Schechter 및 Berger 프로테아제 하위부위 명명법을 기재한다.
도 33은 두 효소 사이의 완전한 상동성을 나타내는 rnpr A 및 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(약칭 CCH) 중성 프로테아제(CLH_2576)의 서열 정렬이다.
도 34는 씨. 히스톨리티쿰(CCH) 공정중 생성물 스트림의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다: 로트 100808로부터의 Mustang-Q 여과액(MQF), HIC 로드, HIC 용리액 및 AUX-II 풀. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 로트 100808을 생성한 제조 공정은 고 수준의 불순물을 생성하고 기존의 공정 제어 방법을 사용하였다. 중성 프로테아제 활성은 이 이미지에서 MQF, HIC 로드, 및 HIC 용리액에서 관찰되었지만, AUX-II 풀에서는 관찰되지 않았다. HIC 용리액 샘플에서 관찰된 저 신호는 HIC 단계에서 중성 프로테아제의 1차 클리어런스가 발생함을 나타낸다.
레인 1: + 대조군(써몰리신), 1 ng
레인 2: 분자량 기준
레인 3: 블랭크
레인 4: MQF Dev-25A, 2 μg
레인 5: 블랭크
레인 6: HIC 로드 Dev-13, 3 μg
레인 7: 블랭크
레인 8: 블랭크
레인 9: HIC 용리액 Dev-25A, 4 μg
레인 10: 블랭크
레인 11: Aux II 풀 1000808, 10 μg
레인 12: 블랭크
도 35는 씨. 히스톨리티쿰(CCH) 공정중 생성물 스트림의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다: 제1 십자류 여과방식(TFF-1) 농축물, AUX-I 풀, AUX-I 중간체, AUX-II 중간체, 아연 및 니켈 함량이 높은 HIC 완충제에 의해 영향받은 로트로부터의 약물 생성물. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 이 경우, 중성 프로테아제는 TFF-1 농축물 및 저 수준의 AUX-I 및 약물 생성물에서 관찰되었지만, AUX-II에서는 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 AUX-I로 용리하면서 IEX 단계에 걸쳐 생성물로부터 중성 프로테아제 분리를 입증한다.
레인 1: + 대조군(써몰리신), 1 ng
레인 2: 분자량 기준
레인 3: 블랭크
레인 4: TFF-1 농축물 10000808, 10 μg
레인 5: 블랭크
레인 6: AUX-I 풀 10000808, 10 μg
레인 7: 블랭크
레인 8: AUX-I 중간체 10000808, 10 μg
레인 9: 블랭크
레인 10: AUX-II 중간체 10000808, 10 μg
레인 11: 블랭크
레인 12: 약물 물질 10000808, 10 μg
도 36은 로트 1000414 AUX-II 분획의 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) IEX 분획 보유물의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 이들 분획은 공정에서 활성 중성 프로테아제의 발견 전에 생성된 제조 로트로부터 유래하였다. 중성 프로테아제는 임의의 AUX-II 분획에서 검출되지 않았다.
레인 1: + 대조군(써몰리신), 1 ng
레인 2: 분자량 기준
레인 3: AUX-II Fxn 1 1000414, 6.4 μg
레인 4: AUX-II Fxn 2 1000414, 14.4 μg
레인 5: AUX-II Fxn 3 1000414, 10 μg
레인 6: AUX-II Fxn 4 1000414, 10 μg
레인 7: AUX-II Fxn 5 1000414, 10 μg
레인 8: AUX-II Fxn 6 1000414, 11.2 μg
레인 9: AUX-II Fxn 7 1000414, 6.2 μg
레인 10: AUX-II Fxn 8 1000414, 5.8 μg
도 37은 로트 1000414 AUX-I 분획의 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) IEX 분획 보유물의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 이들 분획은 공정에서 활성 중성 프로테아제의 발견 전에 생성된 제조 로트로부터 유래하였다. 중성 프로테아제는 이 방법을 사용하여 임의의 AUX-I 분획에서 검출되지 않았다.
레인 1: 분자량 기준
레인 2: AUX-I Fxn 9 1000414, 8.8 μg
레인 3: AUX-I Fxn 10 1000414, 10 μg
레인 4: AUX-I Fxn 11 1000414, 10 μg
레인 5: AUX-I Fxn 12 1000414, 10 μg
레인 6: AUX-I Fxn 13 1000414, 10 μg
레인 7: AUX-I Fxn 14 1000414, 10 μg
레인 8: AUX-I Fxn 15 1000414, 10 μg
레인 9: AUX-I Fxn 16 1000414, 14 μg
레인 10: AUX-I Fxn 17 1000414, 10 μg
도 38은 로트 1000414 AUX-II 분획 1, 7 및 AUX-I 분획 8, 17의 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) IEX 분획 보유물의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 로트 1000414를 생성한 제조 공정은 고 수준의 불순물을 생성하고 기존의 공정 제어 방법을 사용하였다. 이 겔에서, 분획은 원래 겔에서보다 더 높은 농도에서 실행되었다(도 16 및 17). 중성 프로테아제는 AUX-I 피크의 마지막 분획(분획 17)에서만 검출되었으며, 이는 피크의 끝에서 용리시 위치 특성을 입증한다.
레인 1: + 대조군(써몰리신), 1 ng
레인 2: 분자량 기준
레인 3: AUX-II Fxn 1 1000414 Tris-Gly, 10 μg
레인 4: AUX-II Fxn 1 1000414 LDS, 10 μg
레인 5: AUX-II Fxn 7 1000414 Tris-Gly, 9.3 μg
레인 6: AUX-II Fxn 7 1000414 LDS, 9.3 μg
레인 7: AUX-I Fxn 8 1000414 Tris-Gly, 6.5 μg
레인 8: AUX-I Fxn 8 1000414 LDS, 6.5 μg
레인 9: AUX-I Fxn 17 1000414 Tris-Gly, 11 μg
레인 10: AUX-I Fxn 17 1000414 LDS, 11 μg
Tris-Gly 및 LDS는 SDS-PAGE를 위한 두 가지 완충제 시스템이다. 이 겔은 하나의 시스템이 다른 시스템보다 우수했는지를 평가하기 위해 실행되었다. 차이점은 언급되지 않았다.
도 39는 로트 001138 AUX-I 꼬리 분획 17, 18, 19의 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) IEX 분획 보유물의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 PAGE 이미지이다. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 이 겔은 AUX-I 피크의 끝에서 거부된 분획을 도시한다. 3개의 거부된 분획은 각각 검출가능한 중성 프로테아제를 함유하였다. 분획 17 및 18은 공정중 풀링 기준을 통과했지만 1:1 수율 표적 풀링 전략에 기초하여 거부되었다. 이는 AUX-I 및 약물 생성물로부터 잔류 중성 프로테아제를 제거하는 공정 제어를 입증한다.
레인 1: TFF-1 농축물 Dev-25A, 34 μg
레인 2: 분자량 기준
레인 3: 블랭크
레인 4: AUX-1 Fxn 7 Dev-25A, 4.5 μg
레인 5: 블랭크
레인 6: AUX-I Fxn 17 Dev-25A, 5 μg
레인 7: 블랭크
레인 8: AUX-I Fxn 17 001138, 14.8 μg
레인 9: 블랭크
레인 10: AUX-I Fxn 18 001138, 10.3 μg
레인 11: 블랭크
레인 12: AUX-I Fxn 19 001138, 8.1 μg
도 40a-b는 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) 제조 공정 로트 0010987의 12% Tris-글리신 Novex® 카세인 자이모그래피 SDS PAGE 이미지이다. 사용된 겔은 12% Tris-글리신 Novex® 자이모그램 카세인 겔이다. 이 겔은 AUX-I 피크의 끝에서 거부된 분획을 도시한다. 3개의 거부된 분획은 각각 검출가능한 중성 프로테아제를 함유하였다. 분획 17 및 18은 공정중 풀링 기준을 통과했지만 1:1 수율 표적 풀링 전략에 기초하여 거부되었다. 이는 AUX-I 및 약물 생성물로부터 잔류 중성 프로테아제를 제거하는 공정 제어를 입증한다. 도 40a는 공정 전체에 걸쳐 AUX-I에 대한 정제 상태를 제시한다. 도 40b는 공정 전체에 걸쳐 AUX-II에 대한 정제 상태를 제시한다.
도 40a
레인 1: 양성 대조군(TL)
레인 2: 분자량 기준
레인 3: 비어있음
레인 4: Mustang Q 여과액, 2.1 μg 로드
레인 5: 비어있음
레인 6: HIC 용리액, 4.9 μg 로드
레인 7: 비어있음
레인 8: AUX-I 풀, 10 μg 로드
레인 9: 비어있음
레인 10: AUX-I 중간체, 10 μg 로드
레인 11: 비어있음
레인 12: 검정 블랭크
도 40b
레인 1: 양성 대조군(TL)
레인 2: 분자량 기준
레인 3: 비어있음
레인 4: TFF-1 농축물, 10 μg 로드
레인 5: 비어있음
레인 6: AUX-II 풀, 10 μg 로드
레인 7: 비어있음
레인 8: AUX-II 중간체, 10 μg 로드
레인 9: 비어있음
레인 10: 벌크 약물 물질(약물 생성물), 10 μg 로드
레인 11: 비어있음
레인 12: 검정 블랭크
도 41은 콜라게나제 I 분획 및 콜라게나제 II의 수집물 및 순도 기준 충족에 기초하여 그들의 전방 처리를 도시한다.
도 42는 각 AUX 용리 피크에서 총 단백질의 양에 대한 AUX-I 생성물의 퍼센트 순도를 제공한다.
도 43는 각 AUX 용리 피크에서 총 단백질의 양에 대한 AUX-II 생성물의 퍼센트 순도를 제공한다.
도 44는 AUX-I 90 kDa 불순물의 관리도를 나타낸다. 도 42에 보여진 AUX-I 용리 피크의 퍼센트 순도 수준에서의 감소는 주로 AUX-I 90 kDa 불순물의 상승된 수준에 기인한다.
도 45는 AUX-II 96 kDa 불순물의 관리도를 나타낸다. 도 43에 보여진 AUX-II 용리 피크의 퍼센트 순도 수준에서의 감소는 주로 AUX-II 96 kDa 불순물의 상승된 수준에 기인한다.
도 46a-46d는 다양한 AUX 피크 및 밴드에 대한 생성물 피크의 추정된 퍼센트를 제공한다. 이들 도면에 의해 제공된 데이터는 편차 3797과 관련된 교정 및 예방 조치의 시행 후 IEX 분획 불순물의 평가를 위한 통계 분석에 사용되었다.
다양한 측면 및 실시양태가 이제 본원에 완전히 기재될 것이다. 그러나, 이러한 측면 및 실시양태는 많은 상이한 형태로 시행될 수 있고 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며; 오히려, 이들 실시양태는 본 개시내용이 철저하고 완전하며, 본 주제의 범위를 당업자에게 완전히 전달할 수 있도록 제공된다. 상기 또는 하기에 관계없이 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어 및 어구는 용어 또는 어구가 사용되는 문맥으로부터 명백하게 반대되거나 명확하게 표시되지 않는 한, 해당 용어 및 어구가 관련 기술분야에서 달성한 의미를 포함한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있을지라도, 특정 방법 및 물질이 이제 기재된다.
달리 언급되지 않는 한, 개별 수치 값의 사용은 값이 "약" 또는 "대략"이라는 단어에 선행되었듯이 근사치로 언급된다. 유사하게, 달리 명시적으로 지시되지 않는 한, 본 출원에 명시된 다양한 범위의 수치는 언급된 범위 내의 최소값 및 최대값이 모두 단어 "약" 또는 "대략"을 앞세우고 근사치로 언급된다. 이러한 방식으로, 언급된 범위의 위 및 아래의 변경은 범위 내의 값과 실질적으로 동일한 결과를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 수치를 언급할 때 용어 "약" 및 "대략"은 개시된 주제가 가장 밀접하게 관련되거나 문제가 되는 범위 또는 요소에 대하여 당업자에게 평범하고 통상적인 의미를 가질 것이다. 엄격한 수치 경계에서 확장되는 양은 많은 요인에 따른다. 예를 들어, 고려될 수 있는 일부 요인은 요소의 중요성 및/또는 주어진 변경량이 청구된 주제의 수행에 미치는 영향, 뿐만 아니라 당업자에게 알려진 다른 요건을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 상이한 수치값에 대해 상이한 양의 유효 숫자의 사용은 단어 "약" 또는 "대략"의 사용이 특정 수치값 또는 범위를 넓히는데 어떻게 작용하는지를 제한하지 않는다. 따라서, 일반적으로, "약" 또는 "대략"은 수치값을 넓힌다. 또한, 범위의 개시는 최소값 및 최대값 사이의 모든 값과 용어 "약" 또는 "대략"의 사용에 의해 제공되는 범위 확장을 포함하는 연속 범위로 의도된다. 결과적으로, 본원의 값의 범위에 대한 언급은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 역할을 하도록 의도되며, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다.
본원에 사용된 "콜라게나제"는 표준 콜라게나제 검정, 예를 들어 콜라게나제 I 및/또는 콜라게나제 II에서 콜라게나제 활성을 나타내는 하나 이상의 단백질을 포함하는 것을 의미한다. 콜라게나제 조성물은 때때로 AUX I 및 AUX II로 불리는 2개의 미생물 콜라게나제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 용어 "콜라게나제 I", "ABC I", "AUX I", "AUX-I", "콜라게나제 AUX I" 및 "콜라게나제 ABC I"은 동일한 아미노산 서열을 갖는 동일한 효소를 의미하며 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 유사하게, 용어 "콜라게나제 II", "ABC II", "AUX II", "AUX-II", "콜라게나제 AUX II" 및 "콜라게나제 ABC II"는 동일한 효소를 지칭하며 또한 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 이들 콜라게나제는 박테리아 세포에 의해 분비된다. 특정 측면에서, 콜라게나제는 크로마토그래피 방법에 의해 씨. 히스톨리티쿰 배양 상청액으로부터 단리 및 정제된다. 다른 측면에서, 콜라게나제는 재조합적으로 단리 및 정제되고/되거나, 포유동물, 진균 및 박테리아 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터 수득된다. 두 콜라게나제는 특별한 프로테아제이며 동일한 EC 번호(E.C 3.4.24.3)를 공유한다. 다른 측면에서, 콜라게나제 조성물은 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II를 포함한다. 다른 실시양태에서, 콜라게나제 조성물은 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 "콜라겐 매개 상태"는 콜라겐을 수반하는 임의의 질환 또는 질병을 의미한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 콜라겐 매개 상태의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 듀피트렌 구축증; 페이로니병; 오십견(유착성 관절낭염), 켈로이드; 비후성 반흔; 염증성 여드름으로 인한 흉터와 같은 함몰 흉터; 수술후 유착; 여드름; 지방종, 및 주름, 셀룰라이트 및 종양성 섬유증과 같은 외관손상 상태.
어구 "콜라게나제 I 생성물"은 발효로부터 정제된 콜라게나제 I을 의미하며, 여기서 정제 단계에서 콜라게나제 I의 용리는 분획으로 수집되었고, 이들 분획의 임의의 수는 함께 풀링되었다.
어구 "콜라게나제 II 생성물"은 발효로부터 정제된 콜라게나제 II를 의미하며, 여기서 정제 단계에서 콜라게나제 II의 용리는 분획으로 수집되었고, 이들 분획의 임의의 수는 함께 풀링되었다.
어구 클로스트리듐 히스톨리티쿰"으로부터 유래된"은 씨.히스톨리티쿰에서 기원하는 콜라게나제를 의미한다. 이는 씨. 히스톨리티쿰의 발효 및 재조합 콜라게나제를 갖는 다른 유기체를 사용하는 발효로부터 수득된 콜라게나제를 모두 포괄한다.
용어 "약물 물질", "약물 생성물" 또는 "콜라게나제 조성물"은 상호교환가능하게 사용될 수 있으며 어떠한 임의적인 동결건조가 발생하기 전에 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다를 지칭한다.
본원에 사용된 "중성 프로테아제가 본질적으로 없다"는 이용된 특정한 검출 검정(예를 들어, SDS PAGE, 자이모그래피, HPLC 등)의 검출가능한 한계 미만을 의미한다.
본원에 사용된 "전방 처리된"은 최종 콜라게나제 I 약물 물질 또는 콜라게나제 II 약물 물질을 생성하기 위해 풀링에 사용되는 고도로 정제된 콜라게나제 I 또는 II의 분획을 의미한다.
본원에 사용된 "고도로 정제된" 또는 "고순도" 또는 "고도로 순수한" 콜라게나제 I 또는 II, 또는 콜라게나제 I 및 II의 조합은 역상 HPLC(RP-HPLC)에 의해 측정시 면적 기준 적어도 95% 순도, 또는 면적 기준 적어도 96% 순수한, 또는 면적 기준 적어도 97% 순수한, 또는 면적 기준 적어도 98% 순수한, 또는 면적 기준 적어도 99% 순수한, 또는 면적 기준 약 100% 순수한 콜라게나제를 의미한다. 추가로 명확하게 하기 위해, 이는 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 적어도 95% 내지 면적 기준 약 100% 순도에 대한 모든 수치값을 포함한다.
본원에 사용된 "가장 풍부한 불순물"은 밀도측정이 있거나 없는 SDS-PAGE 겔에 의해 측정시, 또는 또 다른 허용가능한 방법에 의해 측정시 주어진 단계에서(예를 들어, IEX 후) 가장 높은 존재를 갖는 콜라게나제 단편을 의미한다. 콜라게나제 단편은 정제 공정 전반에 걸쳐 발견될 수 있고 임의의 크기일 수 있지만, 콜라게나제 I 단편의 경우 약 33 kDa, 45 kDa, 55 kDa, 80 kDa, 또는 90 kDa, 콜라게나제 II 단편의 경우 약 25 kDa, 38 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 92 kDa, 92 kDa, 또는 96 kDa의 분자량에서 가장 빈번하게 발견된다.
본원에 사용된 "중성 프로테아제 제거" 또는 "중성 프로테아제 제거 단계"는 콜라게나제 여과액이 분리 칼럼 또는 필터를 통과한 후 제조 동안 수집된 분획의 제거 또는 거부를 의미한다.
"임의적" 또는 "임의적으로"는 이후에 기재되는 요소, 성분 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있어서, 기재내용이 요소, 성분 또는 상황이 발생하는 경우 및 그렇지 않은 경우를 포함하도록 하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "부형제"는 무독성, 불활성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제를 의미한다. 약제학적으로 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화된 크라가칸드; 맥아; 젤라틴; 활석; 글리콜 예컨대 프로필렌 글리콜; 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제 예컨대 마그네슘 히드록시드 및 알루미늄 히드록시드; 알긴산; 발열성-무함유 물; 등장성 식염수; 링커 용액; 에틸 알코올, 및 포스페이트 완충 용액, 뿐만 아니라 다른 무독성 상용성 윤활제 예컨대 나트륨 라우릴 술페이트 및 마그네슘 스테아레이트이며, 뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 방향제, 방부제 및 산화방지제가 고안자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 "정제된 분획"은 분해되지 않은 콜라게나제 I이 SDS-PAGE 겔 밀도측정에 의해 측정시 적어도 약 90% 순도를 가지며, 가장 풍부한 분해된 콜라게나제 I 또는 II 불순물이 7.5% 미만임을 의미한다. "정제된 분획"으로 정량화하기 위한 콜라게나제 제조 공정 단계로부터의 콜라게나제 II 분획의 경우, 분해되지 않은 콜라게나제 II는 SDS-PAGE 겔 밀도측정에 의해 측정시 적어도 약 90% 순도를 가지며, 가장 풍부한 분해된 콜라게나제 I 또는 II 불순물은 7.5% 미만이다. 예를 들어, 정제된 콜라게나제 I 분획은 SDS-PAGE 겔 밀도측정에 의해 측정시 적어도 약 90% 또는 약 91.2%의 분해되지 않은 AUX-I을 가질 수 있으며, 가장 풍부한 분해된 AUX-I 또는 AUX-II 불순물은 SDS-PAGE 겔 밀도측정에 의해 측정시 약 5% 미만 또는 약 5.8%이다. 제2 예로써, 정제된 분획으로 정량화하기 위한 AUX-II 분획의 경우, 분획은 SDS-PAGE 겔 밀도측정에 의해 측정시 적어도 약 90% 또는 약 91.2% 순도를 가질 수 있으며, 가장 풍부한 분해된 AUX-I 또는 AUX-II 불순물은 SDS-PAGE 겔 밀도측정에 의해 측정시 약 5% 미만 또는 약 5.8%이다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 본원에 상호교환가능하게 사용되며 인간 또는 다른 포유동물을 지칭한다.
II. 도입
콜라게나제는 당업자에게 알려진 다양한 발효 방법에 의해 생성될 수 있다. 씨. 히스톨리티쿰으로부터 수득된 미가공 콜라게나제는 이전에 염료 리간드 친화성 크로마토그래피, 헤파린 친화성 크로마토그래피, 암모늄 술페이트 침전, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 및 금속 킬레이트화 크로마토그래피를 포함하는 다양한 방법에 의해 정제되었다. 미가공 및 부분적으로 정제된 콜라게나제는 Sigma Aldrich(SIAL-Millipore) 및 뉴욕 린브룩 소재의 Advance Biofactures Corp.을 포함하는 많은 공급처로부터 상업적으로 입수가능하다. 씨. 히스톨리티쿰으로부터 수득된 미가공 콜라게나제의 발효 및 정제 방법은 또한 미국 특허 제7,811,560호에 기재되어 있다.
하기에 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 (a) 정제 동안 금속 함량을 제어하는 단계; 및 (b) 최종 콜라게나제 생성물, 예를 들어 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 약물 물질로부터 중성 프로테아제를 감소 또는 제거하는 단계에 의해 콜라게나제 생성물을 제조하는 개선된 방법을 제공한다. 본 개시내용은 공급원에 관계없이 콜라게나제의 제조 및 사용에 대한 일반적인 적용가능성을 갖는다. 이는 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 II로 제한되도록 의도되지 않는다.
III.
콜라게나제의 개선된 제조
고도로 순수한 콜라게나제(예를 들어, 콜라게나제 I 및 II 약물 물질)를 제조하는 본 발명의 방법의 일반적인 측면에서, 방법은 하기 단계를 포함한다: (1) 적어도 콜라게나제(들) 및 중성 프로테아제를 액체 발효 배지로 분비하는 박테리아를 발효시키는 단계; (2) 상기 배지로부터 콜라게나제를 정제하는 단계(임의적으로 고염 조성물로의 처리 포함); (3) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 서로 분리하는 단계; (4) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 부분이 중성 프로테아제가 본질적으로 없도록 그들 중 하나 또는 둘 다로부터 중성 프로테아제를 감소 또는 제거하는 단계; 및 (5) 중성 프로테아제의 제거후 고도로 순수한 콜라게나제 약물 물질을 생성하는 단계. 임의적으로, 약제학적으로 허용되는 부형제를 그러한 약물 물질에 첨가하여 본원의 다른 곳에 기재된 제약 제형을 형성한다.
A. 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II와 같은 콜라게나제를 생성하기 위한 발효
본 개시내용은 콜라게나제를 발효 배지로 분비하는 임의의 박테리아의 발효를 포괄한다. 그러한 발효의 예는 악티노마두라 마두레(Actinomadura madurae), 악티노바실루스 악티오마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리듐 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스타필로코쿠스 종(Staphylococcus spp.), 비브리오 알기놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)로부터의 것들을 포함한다. 이 목록은 완전하지 않으며 당업자에게 알려진 콜라게나제를 분비하는 다른 박테라아 유기체가 사용될 수 있다. 미국 특허 제7,811,560호를 참조한다. 씨. 히스톨리티쿰에 의해 분비된 단백질은 유형 I 및 유형 II 콜라게나제, 및 다양한 독소(예를 들어, 중성 프로테아제, 클로스트리파인, 에롤리신-유사 헤몰리신, 및 산소 불안정한 헤몰리신)를 포함한다.
발효 배지는 콜라게나제가 분비된 임의의 배지일 수 있다. 발효 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량영양소 및 물을 포함할 수 있다. 탄소원은 당 또는 다른 탄수화물을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 질소원은 대두박과 같은 으깬 곡물을 포함할 수 있거나, 또는 효모 추출물과 같은 추출물을 포함할 수 있거나, 또는 펩톤 또는 트립톤과 같은 소화전 폴리펩티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 펩톤은 소-유래 배지 또는 돼지-유래 배지와 같이 동물로부터 유래될 수 있다. 펩톤은 식물성-유래 또는 다른 식물-유래와 같이 동물 이외의 공급원으로부터 유래될 수 있다.
B. 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 정제
일반적인 정제 기술은 여과, 크로마토그래피, 및 침전을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 씨. 히스톨리티쿰으로부터 콜라게나제 I 및 II의 정제의 특정 측면은 당업계에 알려진 바와 같이 수행될 수 있다. 미국 특허 제7,811,560호를 참조한다.
콜라게나제 정제 공정은 하기 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다: (1) 적어도 제1 음이온 교환 단계, HIC 단계 및 제1 완충제 교환 단계에서 아연 및/또는 니켈 농도를 제어하는 단계; (2) 음이온 교환 단계로부터 AUX-I의 나중 분획을 폐기하는 단계; (3) 콜라게나제 II로부터 콜라게나제 I를 분리한 후, 피크 분획으로부터 풀링된 콜라게나제 I의 양이 제조 공정으로부터의 콜라게나제 II의 양과 대략 동일할 때까지만 콜라게나제 I의 피크 분획을 풀링하는 단계, 및 (4) 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다의 풀링 단계에 대한 순도 기준을 설정하는 단계. 이들 단계의 이용은 중성 프로테아제가 본질적으로 없는 콜라게나제 I 생성물을 생성한다. 마찬가지로, 콜라게나제 II 생성물은 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
배지로부터 콜라게나제 및 독소의 여과는 깊이 필터, 원심분리, 미세원심분리, 십자류 여과방식, 규조토 여과층, 및 진공 여과의 사용을 통해 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 일 실시양태에서, 여과는 깊이 필터 이어서 0.2 미크론 멸균 등급 필터를 사용하여 수행된다.
일 실시양태에서, 정제 공정은 깊이 필터(예를 들어, Millipore Millistak HC POD), 이어서 음이온 교환 여과(예를 들어, Mustang Q 필터), 이어서 여과(예를 들어 0.45μ 필터) 및 여과액을 약 0.8 M - 1.2 M 농도의 고염 조성물(예를 들어, 암모늄 술페이트)에 노출시킴으로써 조정, 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼(예를 들어, 페닐 SFF 낮은-치환), 이어서 완충제-교환(예를 들어, 십자류 여과방식 또는 투석), 이어서 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, Q 세파로즈 HP 음이온 교환 칼럼 사용), 이어서 완충제-교환(예를 들어, 십자류 여과방식 또는 투석)을 통해 발효된 씨. 히스톨리티쿰(예를 들어, 돼지-유래 배지 예컨대 프로테아제 펩톤)으로부터 콜라게나제를 수확하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 류펩틴이 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계에 첨가되고 이온 교환 단계를 통해 유지될 수 있다.
고염 조성물은 용해도에 기초하여 단백질의 분리를 허용하는 것이다. 호프마이스터 시리즈(친핵성 시리즈)로부터의 염이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 암모늄 술페이트, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 술페이트 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용액이다. 고염 조성물은 다양한 농도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 암모늄 술페이트는 약 0.8 M 내지 약 1.2 M, 또는 약 0.9 M 내지 약 1.1 M, 또는 약 1M의 농도에서 사용될 수 있다.
고염 조성물이 금속 오염물이 없거나, 낮은 금속 함량을 갖는 것이 유리하다. 일부 실시양태에서, 고염 조성물은 하기 사양 중 하나 이상을 충족한다:
금속
사양
니켈 ≤0.1 ppm
아연 ≤1 ppm
알루미늄 ≤0.75 ppm
비소 ≤0.2 ppm
칼슘 ≤10 ppm
카드뮴 ≤1 ppm
크로뮴 ≤0.75 ppm
구리 ≤1 ppm
철 ≤2 ppm
마그네슘 ≤5 ppm
납 ≤2 ppm
다른 실시양태에서, 고염 조성물은 약 85 ppm 미만, 또는 80 ppm, 또는 75 ppm, 또는 70 ppm, 또는 65 ppm, 또는 60 ppm, 또는 55 ppm, 또는 50 ppm, 또는 45 ppm, 또는 40 ppm, 또는 35 ppm, 또는 30 ppm, 또는 25 ppm, 또는 20 ppm, 또는 15 ppm, 또는 10 ppm, 또는 9 ppm, 또는 8 ppm, 또는 7 ppm, 또는 6 ppm, 또는 5 ppm, 또는 4 ppm, 또는 3 ppm, 또는 2 ppm, 또는 1 ppm의 양으로 존재하는 아연을 가질 수 있다. 니켈은 약 1.5 ppm 미만, 또는 1.4 ppm, 또는 1.3 ppm, 또는 1.2 ppm, 또는 1.1 ppm, 또는 1.0 ppm, 또는 0.9 ppm, 또는 0.8 ppm, 또는 0.7 ppm, 또는 0.6 ppm, 또는 0.5 ppm, 또는 0.4 ppm, 또는 0.3 ppm, 또는 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm의 양으로 고염 조성물에 존재할 수 있다.
원료 물질의 금속 함량은 자격이 있는 판매업자로부터 초순수 원료 물질을 얻음으로써 제어될 수 있다. 일 측면에서, 니켈 농도는 약 1.2 ppm 미만이거나, 아연 농도는 약 84.4 ppm 미만이거나, 니켈 농도는 약 1.2 ppm 미만이고 아연 농도는 약 84.4 ppm 미만이다. 다른 측면에서, 니켈 농도, 아연 농도, 또는 니켈 및 아연 농도 둘 다는 약 0.1 ppm 미만이다.
일 실시양태에서, 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II는 단리 및 정제되고, 정제 공정은 금속 수준에 대해 제어된다. 추가 실시양태에서, 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II는 단리 및 정제되고, 정제 공정은 니켈, 아연, 알루미늄, 비소, 칼슘, 카드뮴, 크로뮴, 구리, 철, 마그네슘, 납, 또는 그의 조합의 수준에 대해 제어된다.
추가 실시양태에서, 개시내용은 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 단리 및 정제 방법에 관한 것이고, 정제 공정은 니켈 및/또는 아연 수준에 대해 제어된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 콜라게나제 I 및/또는 II의 제조 공정 및 약물 생성물의 형성 동안 니켈 농도는 약 100 ppm 미만, 또는 약 75 ppm 미만, 또는 약 50 ppm 미만, 또는 약 40 ppm 미만, 또는 약 30 ppm 미만, 또는 약 20 ppm 미만, 또는 약 10 ppm 미만, 또는 약 5 ppm 미만, 또는 약 3.0 ppm 미만, 또는 약 2.9 ppm 미만, 또는 약 2.8 ppm 미만, 또는 약 2.7 ppm 미만, 또는 약 2.6 ppm 미만, 또는 약 2.5 ppm 미만, 또는 약 2.4 ppm 미만, 또는 약 2.3 ppm 미만, 또는 약 2.2 ppm 미만, 또는 약 2.1 ppm 미만, 또는 약 2.0 ppm 미만, 또는 약 1.9 ppm 미만, 또는 약 1.8 ppm 미만, 또는 약 1.7 ppm 미만, 또는 약 1.6 ppm 미만, 또는 약 1.5 ppm 미만, 또는 약 1.4 ppm 미만, 또는 약 1.3 ppm 미만, 또는 약 1.2 ppm 미만, 또는 약 1.1 ppm 미만, 또는 약 1.0 ppm 미만, 또는 약 0.9 ppm 미만, 또는 약 0.8 ppm 미만, 또는 약 0.7 ppm 미만, 또는 약 0.6 ppm 미만, 또는 약 0.5 ppm 미만, 또는 약 0.4 ppm 미만, 또는 약 0.3 ppm 미만, 또는 약 0.2 ppm 미만, 또는 약 0.1 ppm 미만, 또는 약 0.09 ppm 미만, 또는 약 0.08 ppm 미만, 또는 약 0.07 ppm 미만, 또는 약 0.06 ppm 미만, 또는 약 0.05 ppm 미만, 또는 약 0.04 ppm 미만, 또는 약 0.03 ppm 미만, 또는 약 0.02 ppm 미만, 또는 약 0.01 ppm 미만이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 콜라게나제 I 및/또는 II의 제조 공정 및 약물 생성물의 형성 동안 아연 농도는 약 1000 ppm 미만, 또는 약 950 ppm 미만, 또는 약 900 ppm 미만, 약 850 ppm 미만, 또는 약 800 ppm 미만, 또는 약 750 ppm 미만, 또는 약 700 ppm 미만, 또는 약 650 ppm 미만, 또는 약 600 ppm 미만, 또는 약 550 ppm 미만, 또는 약 500 ppm 미만, 또는 약 450 ppm 미만, 또는 약 400 ppm 미만, 또는 약 350 ppm 미만, 또는 약 300 ppm 미만, 또는 약 250 ppm 미만, 또는 약 200 ppm 미만, 또는 약 150 ppm 미만, 또는 약 125 ppm 미만, 또는 약 100 ppm 미만, 또는 약 95 ppm 미만, 또는 약 90 ppm 미만, 또는 약 85 ppm 미만, 또는 약 84 ppm 미만, 또는 약 80 ppm 미만, 약 75 ppm 미만, 또는 약 70 ppm 미만, 또는 약 65 ppm 미만, 또는 약 60 ppm 미만, 또는 약 55 ppm 미만, 또는 약 50 ppm 미만, 또는 약 45 ppm 미만, 또는 약 40 ppm 미만, 또는 약 35 ppm 미만, 또는 약 30 ppm 미만, 또는 약 25 ppm 미만, 또는 약 20 ppm 미만, 또는 약 15 ppm 미만, 또는 약 10 ppm 미만, 또는 약 9 ppm 미만, 또는 약 8 ppm 미만, 또는 약 7 ppm 미만, 또는 약 6 ppm 미만, 또는 약 5 ppm 미만, 또는 약 4 ppm 미만, 또는 약 3 ppm 미만, 또는 약 2 ppm 미만, 또는 약 1 ppm 미만, 또는 약 0.9 ppm 미만, 또는 약 0.8 ppm 미만, 또는 약 0.7 ppm 미만, 또는 약 0.6 ppm 미만, 또는 약 0.5 ppm 미만, 또는 약 0.4 ppm 미만, 또는 약 0.3 ppm 미만, 또는 약 0.2 ppm 미만, 또는 약 0.1 ppm 미만이다.
C. 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 분리
콜라게나제 I 및 II는 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 콜라게나제 I 및 II는 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 서로 분리될 수 있다. 다른 유형의 이온-교환 크로마토그래피는 Q-세파로즈 칼럼과 같은 음이온-교환 칼럼일 수 있다.
D. 중성 프로테아제의 감소 또는 제거
일반적인 측면에서, 중성 프로테아제를 제거하는 단계는 다중 콜라게나제가 존재하는 경우, 콜라게나제를 서로 분리한 후 발생한다. 콜라게나제는 용리 단계 동안 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리된다. 콜라게나제 용리는 일반적으로 콜라게나제 I이 하나의 피크에 있고 콜라게나제 II가 제2 피크에 있는 피크에서 발생한다. 각 피크는 각 용리 피크의 시간에 걸쳐 분획으로 수집될 수 있다.
콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 생성물로부터 중성 프로테아제를 감소 또는 제거하는 것은 하기 제거 단계 중 하나 이상에 의해 달성될 수 있다: (a) SDS PAGE 겔 또는 HPLC에 의해 측정시 약 90% 미만의 콜라게나제 I 또는 II 함량 및 약 5% 초과의 임의의 단일 불순물 함량을 갖는 임의의 분획을 배제하는 단계; (b) SDS PAGE 겔 또는 자이모그래피에 의해 측정시 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 갖는 임의의 분획을 배제하는 단계; 또는 (c) 초과 수준의 중성 프로테아제를 함유하는 것으로 계산된 임의의 분획을 배제하는 단계. 각각은 하기 기재되어 있으며, 개별적으로 또는 조합하여 이용될 수 있다.
분획은 크기가 제한되지는 않지만, 예시적인 산업용 크기는 약 200 mL 미만, 또는 300 mL, 또는 400 mL, 또는 500 mL, 또는 600 mL, 또는 700 mL, 또는 800 mL, 또는 900 mL, 또는 1000 mL, 또는 1100 mL, 또는 1200 mL, 또는 1300 mL, 또는 1400 mL, 또는 1500 mL, 또는 1600 mL, 또는 1700 mL, 또는 1800 mL, 또는 그 초과일 수 있다.
분획 당 콜라게나제의 양은 제한되지 않지만, 예시적인 산업용 크기 분획은 약 0.1 g/L 내지 약 5 g/L 또는 그 초과, 예컨대 약 0.2 g/L, 또는 0.5 g/L, 또는 0.8 g/L, 또는 1.1 g/L, 또는 1.4 g/L, 또는 1.7 g/L or 2.0 g/L or 2.3 g/L, 또는 2.6 g/L, 또는 2.9 g/L, 또는 3.2 g/L, 또는 3.5 g/L, 또는 3.8 g/L, 또는 4.1 g/L, 또는 4.4 g/L, 또는 4.7 g/L, 또는 5.0 g/L, 또는 6 g/L, 또는 7 g/L, 또는 8 g/L, 또는 9 g/L 또는 10 g/L, 또는 그 초과의 단백질 농도를 포함할 수 있다.
콜라게나제의 퍼센트 순도는 당업자에게 알려진 임의의 방법을 사용하여 각 분획에 대해 결정될 수 있다. 일 예시적인 방법은 SDS-PAGE 또는 SDS-PAGE 및 밀도측정을 사용하는 순도 측정이다. 밀도측정 소포트웨어는 겔 상의 SDS-PAGE 밴드를 강도 양으로 전환하는 임의의 소프트웨어일 수 있다. 그러한 소프트웨어의 일 예는 Quantity One®이다. SDS-PAGE 겔은 임의의 수의 레인을 가질 수 있으며, 일반적인 레인의 수는 10개 레인 또는 15개 레인을 포함한다. 각 레인의 웰 크기는 달라질 수 있으며, 일반적인 웰 크기는 15 내지 50 마이크로리터를 보유한다. 일반적으로, 웰에 맞는 임의의 양의 단백질이 로딩될 수 있지만, 관심 생성물의 분해에 충분한 전형적인 양은 약 0.5 내지 약 5 마이크로그램의 단백질이다.
분획 내 중성 프로테아제의 존재에 대한 검정이 또한 수행될 수 있다. 분획 내 중성 프로테아제의 존재를 결정하는 임의의 방법은 당업자에게 알려진 방법을 사용할 수 있다. 예시적인 방법은 방금 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 또는 밀도측정이 있는 SDS-PAGE를 포함한다. 다른 예시적인 방법은 카세인 자이모그래피 또는 밀도측정이 있는 카세인 자이모그래피를 포함한다. 카세인 자이모그래피는 전형적으로 중성 프로테아제가 작용할 수 있지만 콜라게나제는 작용할 수 없는 겔에 내장된 소 우유 카세인을 함유한 SDS-PAGE 겔이다. 따라서, 중성 프로테아제를 함유하는 자이모그래피 겔에서의 밴드는 콜라게나제 또는 다른 불순물을 함유하는 밴드와 상이한 컬러를 보인다. 일반적으로, 본 개시내용과 관련된 자이모그래피 검정에 대한 검출 한계(LOD)는 밀도측정 소프트웨어를 사용하여 단백질의 약 0.5 ng 및 시각적으로 약 0.2-0.3 ng이다. 그러나, 사용된 정확한 방법에 따라, 더 적은 양이 검출될 수 있다.
일반적으로, 불순물에 대해 시험할 때, 관심 1차 생성물(들)을 분해하는데 사용되는 것보다 더 많은 양의 단백질이 웰에 로딩된다. 불순물은 관심 1차 생성물에 대해 사용된 것과 동일한 양의 단백질을 사용하여 검출될 수 있지만, 관심 1차 생성물을 분해 또는 검출하기 위해 웰에 로딩된 양의 적어도 약 2배 또는 3배 또는 4배 또는 5배 또는 6배 또는 7배 또는 8배 또는 9배 또는 10배 또는 12배 또는 14배 또는 20배 또는 그 이상의 로딩이 필요할 수 있다. 이는 관심 생성물의 순도가 증가할 때 특히 그렇다. 일반적으로, 본 개시내용와 관련된 중성 프로테아제를 검출하기 위해 웰에 로딩된 단백질의 양은 약 1 마이크로그램 내지 약 100 마이크로그램, 예컨대 약 5 마이크로그램, 8 마이크로그램, 또는 10 마이크로그램, 또는 12 마이크로그램, 또는 15 마이크로그램, 또는 20 마이크로그램, 또는 30 마이크로그램, 또는 50 마이크로그램, 또는 75 마이크로그램, 또는 그 이상이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 중성 프로테아제를 감소 또는 제거하는 3가지 상이한 방식을 제공한다:
1. 제거 전략 1
이 전략에 따르면, 순도에 대해 선택된 사양을 충족하지 않는 분획은 따로 설정되고 추가 전방 처리에서 배제된다. 각 분획은 SDS-PAGE 또는 밀도측정이 있는 SDS-PGAE를 사용하여 검정되며, 겔 상의 레인의 각 밴드는 레인 위의 웰에 로딩된 총 단백질의 퍼센트에 상응한다. 밴드는 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II에 상응할 수 있거나, 또는 콜라게나제의 단편 또는 다른 단백질(예컨대 중성 프로테아제) 형태의 불순물에 상응할 수 있다. 콜라게나제 I 생성물 또는 콜라게나제 II 생성물 각각을 생성하기 위한 풀링 단계에 대해 허용되는 수준의 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II는 SDS-PAGE에 의해 측정시 면적 기준 적어도 80%이다.
다른 실시양태에서, 콜라게나제 I 생성물을 생성하기 위한 풀링 단계에 대해 허용되는 수준의 콜라게나제 I은 SDS-PAGE에 의해 측정시 면적 기준 적어도 약 81%, 또는 82%, 또는 83%, 또는 84%, 또는 85%, 또는 86%, 또는 87%, 또는 88%, 또는 88.5%, 또는 89.0%, 또는 89.5%, 또는 90%, 또는 90.5%, 또는 91%, 또는 91.5%, 또는 92%, 또는 92.5%, 또는 93%, 또는 93.5%, 또는 94%, 또는 94.5%, 또는 95%, 또는 95.5%, 또는 96%, 또는 96.5%, 또는 97%, 또는 97.5%, 또는 98%, 또는 98.5%, 또는 99%, 또는 99.5%, 또는 100%이다.
일 실시양태에서, 콜라게나제 II 생성물을 생성하기 위한 풀링 단계에 대해 허용되는 수준의 콜라게나제 II는 SDS-PAGE에 의해 측정시 면적 기준 적어도 약 81%, 또는 82%, 또는 83%, 또는 84%, 또는 85%, 또는 86%, 또는 87%, 또는 88%, 또는 88.5%, 또는 89.0%, 또는 89.5%, 또는 90%, 또는 90.5%, 또는 91%, 또는 91.5%, 또는 92%, 또는 92.5%, 또는 93%, 또는 93.5%, 또는 94%, 또는 94.5%, 또는 95%, 또는 95.5%, 또는 96%, 또는 96.5%, 또는 97%, 또는 97.5%, 또는 98%, 또는 98.5%, 또는 99%, 또는 99.5%, 또는 100%이다.
일 실시양태에서, 콜라게나제 I 약물 물질(콜라게나제 II로부터 정제 및 분리 후 그러나 콜라게나제 II와 혼합되기 전)에 대해 허용되는 수준의 가장 풍부한 불순물은 SDS-PAGE에 의해 측정시 콜라게나제 I 약물 물질의 약 20% 미만, 또는 19%, 또는 18%, 또는 17%, 또는 16%, 또는 15%, 또는 14%, 또는 13%, 또는 12%, 또는 11%, 또는 10%, 또는 9%, 또는 8%, 또는 7%, 또는 6 %, 또는 5%, 또는 4%, 또는 3%, 또는 2%, 또는 1%, 또는 0.75%, 또는 0.5%, 또는 0.25%, 또는 0.1%(w/w)이다. 가장 풍부한 불순물의 양은 또한 밀도측정이 있는 SDS-PAGE에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 콜라게나제 II 약물 물질(콜라게나제 I로부터 정제 및 분리 후 그러나 콜라게나제 I과 혼합되기 전)에 대해 허용되는 수준의 가장 풍부한 불순물은 SDS-PAGE에 의해 측정시 약물 물질의 약 20% 미만, 또는 19%, 또는 18%, 또는 17%, 또는 16%, 또는 15%, 또는 14%, 또는 13%, 또는 12%, 또는 11%, 또는 10%, 또는 9%, 또는 8%, 또는 7%, 또는 6 %, 또는 5%, 또는 4%, 또는 3%, 또는 2%, 또는 1%, 또는 0.75%, 또는 0.5%, 또는 0.25%, 또는 0.1%(w/w)이다. 가장 풍부한 불순물의 양은 또한 밀도측정계가 있는 SDS-PAGE에 의해 측정될 수 있다.
또한, 혼합된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 약물 물질에 대한 허용되는 수준의 가장 풍부한 불순물은 SDS-PAGE에 의해 측정시 약물 물질의 약 5% 미만, 또는 4%, 또는 3%, 또는 2%, 또는 1%, 또는 0.75%, 또는 0.5%, 또는 0.25%, 또는 0.1%(w/w)이다. 가장 풍부한 불순물의 양은 또한 밀도측정이 있는 SDS-PAGE에 의해 측정될 수 있다.
또한, 특정 실시양태에서, 선택된 분획이 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II 생성물로 풀링되면, 그러한 풀링된 분획의 전체 순도는 RP-HPLC에 의해 측정시 적어도 약 95%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다. 다른 실시양태에서, 그러한 풀링된 분획에 대한 전체 순도는 RP-HPLC에 의해 측정시 약 80% 내지 100%이다.
2. 제거 전략 2
이 전략에 따르면, SDS-PAGE, 밀도측정계가 있는 SDS-PAGE, 카세인 자이모그래피, 밀도측정이 있는 카세인 자이모그래피, 또는 그의 조합에 의해 측정시 검출가능한 수준의 중성 프로테아제가 있는 경우, 분획은 추가 처리(전방 처리)로부터 거부된다. 각 분획에서 단백질의 농도는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 결정된다. 겔의 각 웰은 임의의 양의 단백질로 로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 로딩된 단백질의 양은 약 0.1 마이크로그램 내지 약 100 마이크로그램, 예컨대 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 마이크로그램이다. 겔 상에 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 함유하는 임의의 분획은 풀링된 것으로부터 거부된다.
3. 제거 전략 3
이 전략에 따르면, 콜라게나제 I 분획은 용리 피크에 대한 분획의 위치 및 풀링된 콜라게나제 II의 추정량에 기초하여 풀링된다. 다시 말해, 콜라게나제 II의 용리 피크는 콜라게나제 I 분획이 풀링될 수 있는 식별자로서 사용된다.
풀링된 콜라게나제 I의 분획은 콜라게나제 I 용리 피크의 임의의 분획(들)으로부터 유래될 수 있다. 다중 분획이 풀링될 때, 분획은 연속 분획 또는 비연속 분획일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분획은 콜라게나제 I 분획의 최대 용리 피크에서 시작하여 피크의 양측에서 꼬리 쪽으로 고르게 이동한다. 다른 실시양태에서, 분획은 콜라게나제 I 순도 또는 가장 풍부한 불순물, 또는 둘 다에 대해 명시된 순도 기준을 충족하는 제1 분획에서 시작하고, 이어서 콜라게나제 I 최대 용리 피크쪽으로 이동한다. 일부 실시양태에서, 분획은 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 함유하지 않은 임의의 분획(당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 측정시)에서 시작하고 콜라게나제 I 용리 피크의 시작쪽으로 이동하여 수집된다.
풀링된 콜라게나제 I의 양은 추정된 콜라게나제 II의 양(총 콜라게나제 II 용리 피크, 풀링된 콜라게나제 II 양, 또는 다른 것)과 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라게나제 II의 추정량은 추정된 콜라게나제 I의 양의 약 2배, 또는 추정된 콜라게나제 I의 양의 약 1.5배, 또는 추정된 콜라게나제 I의 양의 약 3배일 수 있다. 임의의 특정 비, 예컨대 약 1:1.2의 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II, 또는 약 1:1.1, 또는 1:1.3, 또는 1:1.4, 또는 그 이상의 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II로 작동할 것이다.
예를 들어, 전략은 다음을 포함한다: (a) 상기 언급된 순도 요건을 통과하는 분획에 함유된 용리된 콜라게나제 II의 대략적인 양을 계산하는 것, (b) 대략 1:1 질량비의 (a)에서 계산된 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 양을 생성하는 콜라게나제 I 용리 피크로부터 콜라게나제 II의 근사치 양을 넘는 꼬리 분획을 폐기하는 것, 여기서 콜라게나제 I 분획의 풀링은 콜라게나제 I 용리 피크 꼬리의 대략 제1 통과 분획에서 시작하여 최종 콜라게나제 I 분획 쪽으로 이동한다. 이 방법에 의해 생성된 콜라게나제 조성물은 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
또 다른 실시양태에서, 개시내용은 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 제조 공정에 관한 것이며, 상기 공정은 (a) 크로마토그래피를 사용하여 콜라게나제 II로부터 콜라게나제 I을 분리하는 단계, (b) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II에 대해 개별적으로 단계 (a)로부터의 용리 분획을 수집하는 단계, (c) 밀도측정 분석으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 분획 내 단백질의 총량이 약 91.8% 미만인 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II를 갖는 임의의 분획을 폐기하며, 임의의 단일 불순물은 밀도측정 분석으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 분획 내 단백질의 총량의 약 5.8% 초과인 단계, 및 (d)(c)의 순도 요건을 통과하는 분획에 함유된 용리된 콜라게나제 II의 근사치 양을 계산하고, 대략 1:1 질량비의 (d)에서 계산된 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II 양을 생성하는 콜라게나제 I 용리 피크로부터 콜라게나제 II의 근사치 양을 넘는 꼬리 분획을 폐기하는 단계를 포함하며, 여기서 꼬리 콜라게나제 I 분획의 폐기는 콜라게나제 I 용리 피크의 꼬리 부근에서 시작하여 최대 피크 쪽으로 이동한다. 이 방법에 의해 생성된 콜라게나제 조성물은 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
E. 중성 프로테아제의 제거후, 약물 생성물 및 제형의 마무리
중성 프로테아제 제거 단계 후 및 콜라게나제 II와 혼합되기 전의 콜라게나제 I 약물 물질은 밀도측정이 있거나 없는 카세인 자이모그래피에 의해 측정시 콜라게나제 I 약물 물질의 mg 당 약 50 ng 미만의 중성 프로테아제를 가질 수 있다. 대안적으로, 이는 밀도측정이 있거나 없는 카세인 자이모그래피에 의해 측정시 콜라게나제 I 약물 물질의 mg 당 약 40 ng 미만, 또는 30 ng, 또는 20 ng, 또는 10 ng, 또는 5 ng, 또는 1 ng, 또는 그 이하의 중성 프로테아제를 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, 중성 프로테아제 제거 단계 후 및 콜라게나제 I과 혼합되기 전의 콜라게나제 II 약물 물질은 밀도측정이 있거나 없는 카세인 자이모그래피에 의해 측정시 콜라게나제 II 약물 물질의 mg 당 약 50 ng 미만의 중성 프로테아제를 가질 수 있다. 대안적으로, 이는 밀도측정이 있거나 없는 카세인 자이모그래피에 의해 측정시 콜라게나제 II 약물 물질의 mg 당 약 40 ng 미만, 또는 30 ng, 또는 20 ng, 또는 10 ng, 또는 5 ng, 또는 1 ng, 또는 그 이하의 중성 프로테아제를 가질 수 있다.
또한, 최종 혼합된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 약물 물질은 밀도측정이 있거나 없는 카세인 자이모그래피에 의해 측정시 콜라게나제 I 및 II 약물 물질의 mg 당 약 50 ng 미만의 중성 프로테아제를 가질 수 있다. 대안적으로, 이는 밀도측정이 있거나 없는 카세인 자이모그래피에 의해 측정시 콜라게나제 I 및 II 약물 물질의 mg 당 약 40 ng 미만, 또는 35 ng, 또는 30 ng, 또는 25 ng, 또는 20 ng, 또는 15 ng, 또는 10 ng, 또는 5 ng, 또는 4 ng, 또는 3 ng, 또는 2 ng, 또는 1 ng, 또는 그 이하의 중성 프로테아제를 가질 수 있다.
다른 실시양태에서, 콜라게나제 약물 물질은 밀도측정이 있거나 없는 카세인 자이모그래피에 의해 측정시 콜라게나제의 mg 당 약 1000 ng 미만, 또는 750 ng, 또는 500 ng, 또는 250 ng, 또는 100 ng, 또는 75 ng, 또는 50 ng, 또는 40 ng, 또는 35 ng or 30 ng, 또는 25 ng, 또는 20 ng, 또는 15 ng, 또는 10 ng, 또는 5 ng, 또는 4 ng, 또는 3 ng, 또는 2 ng, 또는 1 ng 또는 그 이하의 중성 프로테아제를 갖는다.
일 예에서, 존재하는 중성 프로테아제의 양은 약 5 마이크로그램 내지 약 20 마이크로그램의 콜라게나제를 갖는 웰에서 측정된 중성 프로테아제의 양을 비교함으로써 결정된다. 예를 들어, 자이모그래피 실험 방법을 위한 샘플은 샘플 uL 당 0.5 ug AUX-I로 준비되고 SDS-PAGE 겔 위에 20 uL로 로딩된다. 이는 겔 상에 10 ug AUX-I 로드를 산출한다. 자이모그래피 실험 방법은 0.5 ng 중성 프로테아제의 검출 한계를 갖는다. 따라서 검출 한계는 10 ug AUX-I 당 0.5 ng NP이다.
또 다른 실시양태에서, 개시내용은 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 조성물에 관한 것이며, 여기서 콜라게나제 조성물은 콜라게나제 I 생성물 및 콜라게나제 II 생성물을 포함하고, 콜라게나제 생성물은 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 측정시 면적 기준 적어도 95% 순수하고, 콜라게나제 I 생성물은 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
일부 실시양태에서, 콜라게나제 조성물 또는 제약 제형은 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 대략 1 대 1의 질량 비를 갖는다. 그러나, 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 다른 질량비가 고려된다. 질량비는 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 약 1:10 내지 약 10:1의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 질량비는 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 약 1:3 내지 약 3:1이다. 보다 바람직하게는, 질량비는 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 약 0.9:1 내지 약 1:1.4이다. 예를 들어, 질량비는 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 약 1:1, 또는 1:1.5, 또는 1.5:1, 또는 2.4:1, 1:2.1, 또는 1:1.3, 또는 1:1.4 또는 1.4:1 또는 1.3:1일 수 있다. 일 측면에서, 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 질량비는 약 1:1이다. 일 실시양태에서, 콜라게나제 농축물은 1.528의 흡광 계수를 갖는다.
또한, 본 발명은 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 콜라게나제 조성물을 제공하며, 여기서 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II는 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 약 0.9:1 내지 약 1:1.4의 질량비를 갖고(예를 들어, 약 1:1), 콜라게나제 조성물은 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 적어도 90%의 순도, 또는 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 적어도 약 95%의 순도, 또는 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 적어도 97%의 순도, 또는 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 적어도 98%의 순도, 또는 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 적어도 99%의 순도를 갖는다.
본 발명의 제약 제형은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제형화된 치료 유효량의 본 발명의 콜라게나제 조성물을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 아연 및/또는 니켈의 농도는 콜라게나제 생성물에 대해 약 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 공정 반복도, 또는 RP-HPLC(역상 고압 액체 크로마토그래피)에 의해 측정시, 면적 기준 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 콜라게나제 I 생성물 또는 콜라게나제 II 생성물 순도를 초래하는 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다의 제조 공정 및 약물 생성물의 형성 동안 제어된다.
일 실시양태에서, 개시내용은 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 단리 및 정제 방법에 관한 것이며, 여기서 니켈 수준 및 아연 수준은 약 95% 초과의 순수한 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II의 개선된 공정 반복도를 초래하는 콜라게나제 정제 공정 동안 제어된다.
일 예에서, 정제 공정은 필터(예를 들어, Millipore Millistak HC POD)를 통해 발효된 씨. 히스톨리티쿰 배지로부터(예컨대 돼지-유래 배지(바람직하게는 프로테오스 펩톤)로부터) 콜라게나제를 수확하고, 이어서 암모늄 술페이트 농도(예를 들어, 60% 포화에서 암모늄 술페이트)를 사용하여 Mustang Q 여과액을 1 M로 조정하여 HIC 칼럼에 콜라게나제의 결합을 촉진시킨 다음, 암모늄 술페이트에서 침전된 콜라게나제를 재현탁 또는 용해하고, 이어서 음이온 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Mustang Q 칼럼 사용), 이어서 여과(예를 들어, 0.45μ 필터), 이어서 완충제-교환(예를 들어, 투석 또는 십자류 여과방식)한 다음 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼(예를 들어, Q-세파로즈) 위에 여과액을 실행하고, 이어서 류펩틴을 첨가하고 이어서 완충제를 교환하는 것을 포함한다.
또 다른 예에서, 정제 공정은 깊은 필터(예를 들어, Millipore Millistak HC POD)를 통해 발효된 씨. 히스톨리티쿰(예컨대 식물성-유래 배지에서 발효됨)으로부터 콜라게나제를 수확하고, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피(예컨대 Mustang Q 여과), 이어서 약 0.8 M 내지 약 1.2 M의 농도로 염(바람직하게는 암모늄 술페이트)의 첨가(예를 들어, 약 1 M 암모늄 술페이트), 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼(예를 들어, 페닐 세파로즈), 이어서 완충제 교환(예를 들어, TFF 사용 및 암모늄 술페이트 제거, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, Q-세파로즈 칼럼 사용), 이어서 AUX-I 및 AUX-II에 대해 개별적으로 음이온 교환 크로마토그래피로부터 여과액의 분획을 수집한 다음 AUX-I의 분획과 함께 풀링하고 AUX-II의 분획과 함께 풀링하는 것을 포함한다. 류펩틴은 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계, 제1 완충제 교환 단계, 및 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 정제 공정에 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 정제 공정의 일 예는 필터(예를 들어, Millipore Millistak HC POD)를 통해 발효된 씨. 히스톨리티쿰으로부터 콜라게나제를 수확하고, 이어서 적어도 하나의 0.2 미크론 필터를 통해 여과, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, Mustang Q 여과), 여기서 유출액은 약 0.8 M 내지 약 1.2 M 암모늄 술페이트 농도를 갖도록 조정되며, 이어서 소수성 상호작용(HIC) 칼럼(예를 들어, 페닐 세파로즈), 이어서 완충제 교환(예를 들어, TFF 사용 및 암모늄 술페이트 제거), 이어서 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, Q-세파로즈), 이어서 AUX-I 및 AUX-II에 대해 개별적으로 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용리액의 분획을 수집한 다음 AUX-I의 분획과 함께 풀링하고 AUX-II의 분획과 함께 풀링하고, 이어서 제약 제형 완충제로 완충제 교환(예를 들어 십자류 여과방식을 사용하여 pH 8에서 10 mM Tris, 60 mM 수크로즈)을 포함한다. 류펩틴은 임의적으로 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계, 제1 완충제 교환 단계, 및 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 정제 공정에 첨가된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 콜라게나제 정제 과정은 a) 미가공 수확물을 음이온 교관 크로마토그래피를 사용하여, 바람직하게는 음이온-교환 캡슐 필터(예컨대 MUSTANG Q)로 여과하는 단계; b) 암모늄 술페이트를, 바람직하게는 약 1M의 최종 농도로 첨가하는 단계; c) 미가공 수확물을, 바람직하게는 0.45 μm 필터를 통해 여과하는 단계; d) 여과액을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 통해, 바람직하게는 페닐 세파로즈 6FF(낮은 치환) 칼럼에 적용하는 단계; e) 류펩틴을 용리액에, 바람직하게는 약 0.2 mM의 최종 농도로 HIC후 용리된 생성물에 첨가하는 단계; f) 바람직하게는 십자류 여과방식(TFF)에 의한 완충제 교환을 사용하여 암모늄 술페이트를 제거하고 류펩틴을 유지하는 단계; g) 단계 (f)의 혼합물을, 바람직하게는 0.45 μm 필터를 통해 여과하는 단계; h) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 바람직하게는 Q-세파로즈 고성능(Q HP) 칼럼을 사용하여 분리하는 단계; 및 i) 중성 프로테아제 제거 단계를 수행하는 단계를 포함한다. 임의적으로, 추가 단계는 j) 단계 (i) 후 바람직하게는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II에 대해 개별적으로 TFF 농도 및 제형을 준비함으로써 콜라게나제 I 및 II의 완충제 교환을 개별적으로 수행하며, 여기서 TFF는 10 및/또는 30 K MWCO(분자량 컷오프) PES 또는 RC-폴리에테르술폰 또는 재생된 셀룰로스 필터 막을 갖는 십자류 여과방식인 단계(TFF는 선택 단백질을 보유 및 농축하고 하나의 완충 용액에서 다른 것으로 단백질을 교환하는 수단을 제공함); 및 k) 완충제 교환된 콜라게나제 I 및 II를, 바람직하게는 0.2 μm 여과 시스템을 통해 개별적으로 여과하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다를 제조하는 방법을 포함하며, 여기서 아연 및/또는 니켈의 농도는 공정에서 제어되어 제조 공정 동안 니켈의 농도가 약 0.2 ppm 미만이고/이거나 제조 공정 동안 아연의 농도가 약 1 ppm 미만이고 이들 금속 농도가 약 90% 초과의 공정 반복도를 초래하고 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다에 대해 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 약 95% 초과의 순도를 달성하도록 한다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 제조 공정에서 아연 및 니켈 수준의 모니터링을 포함하며, 여기서 제조 공정 동안 니켈의 농도는 약 0.2 ppm 미만에서 유지되고/되거나 제조 공정 동안 아연의 농도는 약 1 ppm 미만에서 유지되어 이들 금속의 농도가 약 95% 초과의 순수한 콜라게나제 조성물의 약 95% 초과의 공정 반복도를 초래하도록 한다.
개시내용은 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다를 제조하는 방법을 추가로 포함하며, 여기서 아연 및/또는 니켈의 농도는 공정에서 모니터링 및/또는 제어되어 제조 공정 동안 니켈의 농도가 약 0.2 ppm 미만이고/이거나 제조 공정 동안 아연의 농도가 약 1 ppm 미만이고 이들 금속 농도가 약 90% 초과의 공정 반복도를 초래하여 약 95% 초과의 순수한 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다를 달성하도록 한다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다의 제조 공정에서 아연 및 니켈 수준의 모니터링을 포함하며, 여기서 제조 공정 동안 니켈의 농도는 약 0.2 ppm 미만에서 유지되고/되거나 제조 공정 동안 아연의 농도는 약 1 ppm 미만에서 유지되어 이들 금속 농도가 약 95% 초과의 공정 반복도 및 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다에 대해 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 약 95% 초과의 순도를 초래하도록 한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다를 제조하는 방법을 포함하며, 여기서 아연 및/또는 니켈의 농도는 공정에서 모니터링 및/또는 제어되어 제조 공정 동안 니켈의 농도가 약 0.5 ppm 미만이고/이거나 제조 공정 동안 아연의 농도가 약 10 ppm이고 이들 금속 농도가 약 90% 초과의 공정 반복도를 초래하여 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다에 대해 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 약 95% 초과의 순도를 달성하도록 한다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다를 제조하는 방법을 포함하며, 여기서 아연 및/또는 니켈의 농도는 공정에서 모니터링 및/또는 제어되어 제조 공정 동안 니켈의 농도가 약 0.5 ppm 미만이고/이거나 제조 공정 동안 아연의 농도가 약 10 ppm 미만이고 이들 금속 농도가 약 95% 초과의 공정 반복도를 초래하여 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다에 대해 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 약 95% 초과의 순도를 달성하도록 한다.
본 발명의 추가 실시양태는 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다를 제조하는 방법을 포함하며, 여기서 아연 및/또는 니켈의 농도는 공정에서 제어되어 제조 공정 동안 니켈의 농도가 약 0.5 ppm 미만이고/이거나 제조 공정 동안 아연의 농도가 약 10 ppm 미만이고 이들 금속 농도가 약 95% 초과의 공정 반복도를 초래하여 콜라게나제 조성물에 대해 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 약 95% 초과의 순도를 달성하도록 한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다를 제조하는 방법을 포함하며, 여기서 아연 및/또는 니켈의 농도는 공정에서 제어되어 제조 공정 동안 니켈의 농도가 약 0.5 ppm 미만이고/이거나 제조 공정 동안 아연의 농도가 약 10 ppm 미만이고 이들 금속 농도가 약 95% 초과의 공정 반복도를 초래하여 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다에 대해 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 약 95% 초과의 순도를 달성하도록 한다.
콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다를 제조하는 방법이 추가로 개시되어 있으며, 여기서 아연 및/또는 니켈의 농도는 공정에서 제어되어 제조 공정 동안 니켈의 농도가 약 0.5 ppm 미만이고/이거나 제조 공정 동안 아연의 농도가 약 10 ppm 미만이고 이들 금속 농도가 약 90% 초과의 공정 반복도를 초래하여 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다에 대해 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 약 97% 초과의 순도를 달성하도록 한다.
개시내용은 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다를 제조하는 방법을 추가로 고려하며, 여기서 아연 및/또는 니켈의 농도는 공정에서 제어되어 제조 공정 동안 니켈의 농도가 약 0.5 ppm 미만이고/이거나 제조 공정 동안 아연의 농도가 약 10 ppm 미만이고 이들 금속 농도가 약 95% 초과의 공정 반복도를 초래하여 콜라게나제, 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 다에 대해 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 약 97% 초과의 순도를 달성하도록 한다.
또 다른 실시양태에서, 개시내용은 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 제조하는 공정에 관한 것이며, 상기 공정은 (a) 크로마토그래피를 사용하여 콜라게나제 II로부터 콜라게나제 I을 분리하는 단계; (b) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II에 대해 개별적으로 단계 (a)로부터의 용리 분획을 수집하는 단계, (c) 중성 프로테아제에 대한 각 분획을 SDS-PAGE, 밀도측정계가 있는 SDS-PAGE, 또는 자이모그래피를 사용하여 검정하는 단계, (d) 밀도측정 분석으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 분획 내 단백질의 총량이 약 91.8% 미만인 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II를 갖는 임의의 분획을 폐기하며, 임의의 단일 불순물은 밀도측정 분석으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 분획 내 단백질의 총량의 약 5.8% 초과이거나, (c)에서 시험된 바와 같이 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 나타내는 것인 단계, 및 (e) 콜라게나제 I 생성물에 대해 콜라게나제 I의 통과 분획만을 풀링하고 콜라게나제 II 생성물에 대해 콜라게나제 II의 통과 분획만을 풀링하는 단계를 포함하며, 여기서 풀링된 콜라게나제 I 생성물 또는 콜라게나제 II 생성물은 RP-HPLC에 의해 측정시 면적 기준 적어도 95%로 순수하다. 이 방법에 의해 생성된 콜라게나제 조성물은 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
또 다른 실시양태에서, 개시내용은 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 제조 공정에 관한 것이며, 상기 공정은 (a) 크로마토그래피를 사용하여 콜라게나제 II로부터 콜라게나제 I을 분리하는 단계, (b) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II에 대해 개별적으로 단계 (a)로부터의 용리 분획을 수집하는 단계, (c) 밀도측정 분석으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 분획 내 단백질의 총량이 약 91.8% 미만인 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II를 갖는 임의의 분획을 폐기하며, 임의의 단일 불순물은 밀도측정 분석으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 분획 내 단백질의 총량의 약 5.8% 초과인 단계, 및 (d) (c)의 순도 요건을 통과하는 분획에 함유된 용리된 콜라게나제 II의 근사치 양을 계산하고, 콜라게나제 I 용리 피크로부터 대략 1:1 질량비의 (d)에서 계산된 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II 양을 생성하는 콜라게나제 I의 근사치 양을 넘는 꼬리 분획을 폐기하는 단계를 포함하며, 여기서 콜라게나제 I 분획의 풀링은 콜라게나제 I 용리 피크의 꼬리의 제1 통과 분획 부근에서 시작하여 최종 콜라게나제 I 분획 쪽으로 이동한다. 이 방법에 의해 생성된 콜라게나제 조성물은 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
개시내용은 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 제조 공정에 관한 것이며, 상기 공정은 (a) 크로마토그래피를 사용하여 콜라게나제 II로부터 콜라게나제 I을 분리하는 단계, (b) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II에 대해 개별적으로 단계 (a)로부터의 용리 분획을 수집하는 단계, (c) 밀도측정 분석으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 분획 내 단백질의 총량이 약 91.8% 미만인 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II를 갖는 임의의 분획을 폐기하며, 임의의 단일 불순물은 밀도측정 분석으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 분획 내 단백질의 총량의 약 5.8% 초과인 단계, 및 (d) (c)의 순도 요건을 통과하는 분획에 함유된 용리된 콜라게나제 II의 근사치 양을 계산하고, 콜라게나제 I 용리 피크로부터 대략 1:1 질량비의 (d)에서 계산된 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II 양을 생성하는 콜라게나제 I의 근사치 양을 넘는 꼬리 분획을 폐기하는 단계를 포함하며, 여기서 꼬리 콜라게나제 I 분획의 폐기는 콜라게나제 I 용리 피크의 꼬리 부근에서 시작하여 최대 피크 쪽으로 이동한다. 이 방법에 의해 생성된 콜라게나제 조성물은 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
개시내용은 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 제조 공정에 관한 것이며, 여기서 (a) 중성 프로테아제는 제조 공정 동안 콜라게나제 I 생성물로부터 본질적으로 제거되고, (b) 니켈, 아연, 알루미늄, 비소, 칼슘, 카드뮴, 크로뮴, 구리, 철, 마그네슘, 납, 또는 그의 조합의 농도는 제조 공정 동안 제어된다.
또 다른 실시양태에서, 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 방법에 관한 것이다: (a) 음이온 교환 필터를 통해 씨. 히스톨리티쿰으로부터 발효액을 여과하는 단계; (b) 암모늄 술페이트를 단계 (a)의 여과액에 첨가하는 단계; (c) 단계 (b)의 여과액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계; (d) 류펩틴을 단계 (c)의 용리액에 첨가하는 단계; (e) 단계 (d)의 혼합물로부터 암모늄 술페이트를 제거하는 단계; (f) 단계 (e)의 혼합물을 여과하는 단계; 및 (g) 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 단계 (f)의 혼합물에서 콜라게나제 I 및 II를 분리하는 단계, 여기서 니켈, 아연, 알루미늄, 비소, 칼슘, 카드뮴, 크로뮴, 구리, 철, 마그네슘, 납, 또는 그의 조합의 농도는 정제 공정 동안 제어된다.
추가 실시양태에서, 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 방법에 관한 것이다: (a) 음이온 교환 필터를 통해 씨. 히스톨리티쿰으로부터 발효액을 여과하는 단계; (b) 암모늄 술페이트를 단계 (a)의 여과액에 첨가하는 단계; (c) 단계 (b)의 여과액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계; (d) 류펩틴을 단계 (c)의 용리액에 첨가하는 단계; (e) 단계 (d)의 혼합물로부터 암모늄 술페이트를 제거하는 단계; (f) 단계 (e)의 혼합물을 여과하는 단계; 및 (g) 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 단계 (f)의 혼합물에서 콜라게나제 I 및 II를 분리하는 단계, 여기서 니켈 수준 또는 아연 수준은 정제 공정 동안 제어된다.
개시내용은 또한 하기 단계를 포함하는, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 방법에 관한 것이다: (a) 음이온 교환 필터를 통해 씨. 히스톨리티쿰으로부터 발효액을 여과하는 단계; (b) 암모늄 술페이트를 단계 (a)의 여과 단계에 첨가하는 단계; (c) 단계 (b)의 여과액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계; (d) 류펩틴을 단계 (c)의 용리액에 첨가하는 단계; (e) 단계 (d)의 혼합물로부터 암모늄 술페이트를 제거하는 단계; (f) 단계 (e)의 혼합물을 여과하는 단계; 및 (g) 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 단계 (f)의 혼합물에서 콜라게나제 I 및 II를 분리하는 단계, 및 (h) 단계 (g)의 용리로부터 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II로부터의 중성 프로테아제를 제거하는 단계.
또한, 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 방법에 관한 것이다: (a) 음이온 교환 필터를 통해 씨. 히스톨리티쿰으로부터 발효액을 여과하는 단계; (b) 암모늄 술페이트를 단계 (a)의 여과액에 첨가하는 단계; (c) 단계 (b)의 여과액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계; (d) 류펩틴을 단계 (c)의 용리액에 첨가하는 단계; (e) 단계 (d)의 혼합물로부터 암모늄 술페이트를 제거하는 단계; (f) 단계 (e)의 혼합물을 여과하는 단계; 및 (g) 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 단계 (f)의 혼합물에서 콜라게나제 I 및 II를 분리하는 단계, 여기서 니켈 수준 및 아연 수준은 콜라게나제 정제 공정 동안 제어된다.
또 다른 실시양태에서, 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 단리 및 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II로 이루어진 약물 생성물을 생성하는 공정에 관한 것이며, 여기서 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II는 약 1 대1의 질량비를 갖고, 약물 생성물은 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 측정시 면적 기준 적어도 95% 순수하다: (a) 씨. 히스톨리티쿰을 발효시키는 단계; (b) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 미가공 발효물을 수확하는 단계; (c) 하기 단계를 포함하는, 여과 및 칼럼 크로마토그래피를 통해 미가공 수확물로부터 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 단계: (i) 음이온 교환 필터를 통해 씨. 히스톨리티쿰으로부터 발효액을 여과하는 단계; (ii) 암모늄 술페이트를 단계 (i)의 여과액에 첨가하는 단계; (iii) 단계 (ii)의 여과액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계; (iv) 류펩틴을 단계 (iii)의 용리액에 첨가하는 단계; (v) 단계 (iv)의 혼합물로부터 암모늄 술페이트를 제거하는 단계; (vi) 단계 (v)의 혼합물을 여과하는 단계; 및 (vii) 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 단계 (vi)의 혼합물에서 콜라게나제 I 및 II를 분리하는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 약 1 대 1의 비로 조합하는 단계, 여기서 니켈, 아연, 알루미늄, 비소, 칼슘, 카드뮴, 크로뮴, 구리, 철, 마그네슘, 납, 또는 그의 조합의 농도는 제조 공정 동안 제어된다.
또한, 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 단리 및 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II로 이루어진 약물 생성물을 생성하는 공정에 관한 것이며, 여기서 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II는 약 1 대 1의 질량비를 갖고, 약물 생성물은 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 측정시 면적 기준 적어도 95% 순수하다: (a) 씨. 히스톨리티쿰을 발효시키는 단계; (b) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 미가공 발효물을 수확하는 단계; (c) 하기 단계를 포함하는, 여과 및 칼럼 크로마토그래피를 통해 미가공 수확물로부터 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 단계: (i) 음이온 교환 필터를 통해 씨. 히스톨리티쿰으로부터 발효액을 여과하는 단계; (ii) 암모늄 술페이트를 단계 (i)의 여과액에 첨가하는 단계; (iii) 단계 (ii)의 여과액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계; (iv) 류펩틴을 단계 (iii)의 용리액에 첨가하는 단계; (v) 단계 (iv)의 혼합물로부터 암모늄 술페이트를 제거하는 단계; (vi) 단계 (v)의 혼합물을 여과하는 단계; 및 (vii) 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 단계 (vi)의 혼합물에서 콜라게나제 I 및 II를 분리하는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 약 1 대 1의 비로 조합하는 단계, 여기서 니켈 수준 또는 아연 수준, 또는 아연 및 니켈 수준은 제조 공정 동안 제어된다.
개시내용은 하기 단계를 포함하는, 씨. 히스톨리티쿰으로부터 유래된 단리 및 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II로 이루어진 약물 생성물을 생성하는 공정에 관한 것이며, 여기서 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II는 약 1 대 1의 질량비를 갖고, 약물 생성물은 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 측정시 면적 기준 적어도 95% 순수하다: (a) 씨. 히스톨리티쿰을 발효시키는 단계; (b) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 미가공 발효물을 수확하는 단계; (c) 하기 단계를 포함하는 여과 및 칼럼 크로마토그래피를 통해 미가공 수확물로부터 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 단계: (i) 음이온 교환 필터를 통해 씨. 히스톨리티쿰으로부터 발효액을 여과하는 단계; (ii) 암모늄 술페이트를 단계 (i)의 여과액에 첨가하는 단계; (iii) 단계 (ii)의 여과액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계; (iv) 류펩틴을 단계 (iii)의 용리액에 첨가하는 단계; (v) 단계 (iv)의 혼합물로부터 암모늄 술페이트를 제거하는 단계; (vi) 단계 (v)의 혼합물을 여과하는 단계; 및 (vii) 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 단계 (vi)의 혼합물에서 콜라게나제 I 및 II를 분리하는 단계; 여기서 분리 단계는 (a) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II에 대해 개별적으로 단계 (vii)로부터의 용리 분획을 수집하는 단계, (b) 중성 프로테아제에 대한 각 분획을 SDS-PAGE 또는 자이모그래피를 사용하여 검정하는 단계, (c) 밀도측정 분석으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 분획 내 단백질의 총량이 약 91.8% 미만인 콜라게나제 I 또는 콜라게나제 II를 갖는 임의의 분획을 폐기하고, 임의의 단일 불순물은 밀도측정 분석으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 분획 내 단백질의 총량의 약 5.8% 초과이거나, (b)에서 시험된 바와 같이 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 나타내는 단계; 및 (d) 콜라게나제 I 생성물에 대해 콜라게나제 I의 통과 분획만을 풀링하고 콜라게나제 II 생성물에 대해 콜라게나제 II의 통과 분획만을 풀링하는 단계. 이 방법에 의해 생성된 콜라게나제 조성물은 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
IV.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 특정 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 구체적 실시양태에서 변형이 이루어질 수 있고 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 여전히 유사한 결과를 수득할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서 제시된 모든 문제는 예시로서 해석되어야 하며 제한의 의미가 아니다.
실시예 1 ― 최적화된 SDS-PAGE 방법에 의해 분석될 때 IEX 분획 불순물의 카테고리 분류 및 경향
IEX 분획을 표 1에 제시된 바와 같이 씨. 히스톨리티쿰으로부터 수득된 13개의 상이한 로트의 제조된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II로부터 시험하였다. 각 로트에서 IEX 용리액으로부터 수집된 각 콜라게나제 분획을 SDS-PAGE 겔 상에 실행하고 Bio-Rad 밀도측정계를 갖는 겔 밀도측정 및 수반하는 밀도측정 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각 로트의 각 분획에 대해, 분해되지 않은 콜라게나제 I 또는 II의 퍼센트 순도 및 각각의 가시적인 불순물(콜라게나제 단편 또는 다른 것)의 퍼센트를 결정하였다.
표 1: 최적화된 SDS-PAGE
방법에 대한 분획 불순물
분류를 결정하는데 사용된
로트
불순물은 소프트웨어에 의해 보고된 분자량 값 및 불순물의 수직 위치와 분자량 마커 레인에 위치된 알려진 분자량 밴드의 수직 위치의 비교를 사용하여 4가지 주요 카테고리(90kD, 80kD, 55kD, 및 40kD)로 계층화된다. 카테고리에 맞지 않는 불순물은 "기타"로 분류하였다. 겔 밀도측정을 활용하는 SDS-PAGE 방법은 단지 현재 SDS-PAGE 방법 단독보다 더 많은 불순물 밴드를 분해할 수 있다.
A. 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 밀도 측정에 의한 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰 이온-교환 크로마토그래피 분획 내 주요 밴드 및 부 밴드의 정량화
이 방법은 4-12% NuPAGE 겔(MES 완충제) 및 콜로이드성 쿠마시 염색으로 나트륨 도데실 술페이트-폴라아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰 이온-교환 크로마토그래피 분획의 순도 및 불순물을 결정한다. 이 방법은 겔의 밀도측정 분석을 사용하여 주요 밴드(퍼센트 AUX-I, AUX-II, 또는 둘 다) 및 생성물-단편 또는 다른 불순물의 부 밴드(퍼센트 부 밴드)의 상대적 정량화를 허용한다.
일반적으로, SDS-PAGE를 위한 겔의 웰에 로딩된 콜라게나제의 양은 밀도측정 소프트웨어로 보여지는 밴드의 강도에 대해 선으로 표시된다. 예를 들어, 콜라게나제 밴드에 대한 반응의 선형성은 R2 값이 > 0.98인 1.123 - 1.875 μg(표적의 75%-125%) 콜라게나제에 대해 알려진 기준 표준의 ug에 대한 콜라게나제의 플롯으로 입증될 수 있다. 전형적인 선형성 플롯의 예는 도 1에 제시되어 있다.
분석중인 샘플에 대한 기준 표준을 사용해야 한다. 예를 들어, AUX-I 중간체 기준 표준은 IEX 단계로부터 AUX-I의 용리 분획을 분석하는데 사용될 수 있다. 겔에 대한 최종 샘플(C2 = 0.15 mg 단백질/mL)을 생성하는데 필요한 기준 표준 및 샘플의 양은 하기 식으로 계산된다: C1V1 = C2V2
C1 = 시험될 샘플의 초기 농도(mg/mL)
V1 = 초기 농도에서 샘플의 필요한 부피(μL)
C2 = 1 mg/mL(최종 샘플 제제의 농도)
V2 = 최종 샘플 제제의 부피(μL)
B. 불순물 카테고리 분류
i. 불순물 분류에 대한 접근
분획 불순물은 밀도측정이 있는 SDS-PAGE를 사용하여 분획의 샘플을 분석하여 생성된 겔의 분석에 기초하여 결정될 수 있다. 각 겔을 밀도측정계에 배치하고 겔 이미지를 밀도측정계(예를 들어, Bio-Rad 밀도측정계)를 사용하여 밀도측정계 소프트웨어(예를 들어, Bio-Rad Quantity One 소프트웨어)로 스캔한다. 분석가는 소프트웨어가 겔 레인 및 적절한 밴드를 정확하게 식별함을 보장한다. 소프트웨어는 도 2에 제시된 대표 이미지와 같이 주석이 달린 이미지 보고서를 생성한다.
도 2에서, 레인 1은 알려진 분자량의 밴드를 갖는 분자량 표준을 함유한다. 레인 2는 적절한 AUX 중간체 참조 표준을 함유한다. 나머지 레인은 각 IEX 분획으로부터의 샘플을 함유한다. 주요 생성물 밴드는 각 레인의 상부 밴드이고 각 추가의 하부 밴드는 불순물을 나타낸다.
IEX 분획에서 관찰된 불순물의 경향 분석은 중요한 공정 수행 정보를 제공할 수 있다. 불순물은 성공적인 경향 분석을 위해 로트별로 분자량에 기초하여 일관되게 카테고리화되어야 한다. 밀도측정 소프트웨어는 각 불순물에 대한 겉보기 분자량을 보고할 수 있지만, 보고된 겉보기 분자량에 기초한 카테고리는 겔 이미지에서 일부 정상적인 변동을 가지며, 인접한 밴드와 결합된 변동은 모호하고 중첩된 분류 범위로 이어질 수 있다. 대신에, AUX-I 및 AUX-II 불순물에 대한 권장된 분자량 카테고리는 알려진 분자량 레인에서 밴드의 수직 위치에 대한 분획 불순물의 수직(y-축) 위치의 시각적 비교에 기초할 수 있다.
총 128개의 AUX-I 분획 및 99개의 AUX-II 분획을 분석하였다. 13개의 배치 중 3개 이상에서 보여진 불순물을 카테고리로 할당하였다. 각 카테고리의 설명은 하기 제공된다.
ii. 불순물 분류 결과
AUX-I
AUX-I 분획 불순물 카테고리는 하기를 포함한다: 33 kD, 45 kD, 55 kD, 80 kD, 90 kD, 및 96 kD. 각 불순물 카테고리의 설명은 도 3 내지 도 8에 제공된다. 각 도면은 다음을 포함한다:
· 첫번째 패널: 평가에 포함된 13개 로트의 각 분획에서 주어진 불순물이 관찰된 퍼센트 빈도.
· 두번째 패널: 분획 번호에 의해 주어진 불순물에 대한 상대량(퍼센트로 보고됨)의 평균(도트) 및 범위(오차 막대).
· 세번째 패널: 분자량 표준에 대한 밴드의 시각적 수직 위치의 설명.
· 네번째 패널: 소프트웨어에 의해 주어진 밴드에 대해 보고된 겉보기 분자량의 범위
AUX-II
AUX-II 분획 불순물 카테고리는 하기를 포함한다: 25 kD, 38 kD, 50 kD, 60 kD, 80 kD, 90 kD, 92 kD, 및 96 kD. 각 불순물 카테고리의 설명은 도 9 내지 도 16에 제공된다. 도면 패널은 AUX-I에 기재된 바와 동일하다.
분석된 877개의 불순물 밴드 중, 3개의 밴드는 상기 카테고리에 적합하지 않았고 "기타"로 분류하였다. 이들 불순물에 대한 상세한 설명은 표 2에 포함되어 있다.
표 2: "기타"로 분류된 불순물
C. 불순물 경향
i. 불순물 경향에 대한 접근
불순물을 카테고리화한 후, 이들을 경향화하여 공정 성능을 모니터링할 수 있다. 분획 불순물 경향은 다수의 불순물, 상이한 단백질 농도에서 다수의 IEX 분획이 존재하고, 결과가 상대량으로 보고되기 때문에 복잡할 수 있다. 그러나, 경향은 하기 기재된 바와 같이 AUX 피크 당 총 단백질에 대한 관심 불순물의 퍼센트로 분획 불순물을 보고함으로써 단순화할 수 있다.
각 IEX 분획 내 단백질의 양은 분획 부피를 UVA280에 의한 분획 단백질 농도와 곱하여 결정할 수 있다. 결과 값은 분획 당 단백질 그램이다. 분획 당 단백질 그램의 전형적인 프로파일은 도 17에 제공된다.
기재된 바와 같이 SDS-PAGE 및 밀도측정 방법을 활용하면, 각 SDS-PAGE 겔 분획 레인에서 검출된 총 단백질에 대한 퍼센트로서 IEX 분획 불순물을 초래한다. 동일한 양의 단백질(1.5 μg 단백질/레인)을 각 분획 레인에 로딩하며; 따라서 각 분획 내 각 불순물 그램은 불순물 백분율을 10진수로 변환하고(100으로 나눔), 이어서 분획 당 단백질 그램을 곱하여 추정할 수 있다. 예를 들어, 도 18은 90 kD 불순물의 전형적인 프로파일을 제시하며, 그램으로 표시된 AUX-I 및 AUX-II 분획 둘 다에서 일반적으로 관찰된다.
각 AUX I, AUX II, 또는 불순물에 대한 단백질 그램은 분수로 계산될 수 있다. 대안적으로, 분획 당 단백질 그램 및 관심 불순물은 AUX 피크에 의해 합산될 수 있다. 이러한 수학 연산의 시각적 표현은 도 19에 제공된다.
이어서 AUX 피크 당 단백질의 양에 대한 관심 불순물의 퍼센트는 관심 불순물 그램을 단백질의 총 AUX 피크 그램으로 나눈 다음 100을 곱하여 값을 백분율로 변환하여 계산할 수 있다. AUX 피크 당 총 단백질에 대한 관심 불순물의 퍼센트로 표시되는 최종 값을 얻는 방정식은 하기와 같이 요약된다:
여기서,
[단백질]
ij
는 j번째 불순물을 함유하는 i번째 분획의 단백질 농도이다.
V
ij
는 j번째 불순물을 함유하는 i번째 분획의 리터 단위 부피이다.
불순물 값
ij
는 i번째 분획에서 j번째 불순물의 퍼센트 불순물이다.
[단백질]
i
는 UV
A280
에 의한 i번째 분획의 단백질 농도이다.
V
i
는 i번째 분획의 리터 단위 부피이다.
L은 1리터이다.
상기 방정식을 사용하여 공정 성능을 평가하기 위해 검출된 각 불순물의 정량을 경향화할 수 있다. 상기 방정식을 또한 용이하게 변형시켜 전방 처리된 분획에서만 관심 불순물의 상대량을 표현할 수 있다.
경향은 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 한 가지 방법은 개별 값에 대해 Shewhart 관리도를 사용한다. 개별 값에 대한 Shewhart 관리도는 일상적인 변동(관리도 한계 내에서)으로 인한 결과와 예외적인 변도(관리 한계 이외)으로 인한 결과 사이를 구별하는데 사용되는 통계적 도구이다. 관리 한계는 공정 변동성을 추정하기 위해 2개의 연속 관측치의 이동 범위를 사용하여 계산된다. 관리도에서 녹색 수평선은 평균 결과를 나타낸다. 적색 수평선은 하기와 같이 계산된 상한 및 하한 관리도 한계를 나타낸다:
, 여기서 는 평균이고, 는 평균 이동 범위이다.
개별 값에 대해 Shewhart 관리도를 사용하여 생성된 한계는 생성물 품질을 나타내도록 의도되지 않는다. 따라서, 관리 한계를 벗어난 결과는 자동적으로 품질 영향을 나타내지 않으며, 모든 이용가능한 데이터과 관련하여 전체적으로 평가해야 한다.
ii. 불순물 경향 결과
개별 값에 대한 Shewhart 관리도를 사용하여 표 1에 나열된 로트의 불순물을 경향화하였다. AUX-I 불순물은 도 20에서 경향화되고, AUX-II 불순물은 도 21a 및 21b에서 경향화된다. 로트는 제조 현장에 의해 단계화된다. 각 관리도에 대해 상이한 x-축을 사용하였다. 이 보고서에 제시된 평가에 근거하여 권장된 불순물 카테고리는 표 3에 포함되어 있다.
표 3: 최적화된 SDS-PAGE 방법을 사용하여 분해된 일반적인
IEX
분획 불순물 카테고리
IEX 분획 불순물의 경향은 중요한 공정 수행 정보를 제공할 수 있다. 불순물 경향을 단순화하기 위해 AUX 피크 당 총 단백질에 대한 관심 불순물의 퍼센트로 불순물을 보고하는 것이 권장된다.
실시예 2 ― 정제 공정에서의 금속
A. 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 생성물의 제조에서 비정상 불순물 수준
콜라게나제 I 및 II 생성물의 순도에서 실질적인 감소는 정상 정제 제조 공정 동안 발생하였다. 제조 공정의 이온-교환 크로마토그래피(IEX) 단계 후 보여진 불순물의 동일성을 결정하는 것을 포함하여 분석을 수행하였다. 콜라게나제 I 생성물은 약 113 kDa의 분자량(MW)을 갖고, 콜라게나제 II 생성물은 약 112 kDa의 MW를 갖는다. 콜라게나제의 일상적인 제조 동안, IEX 단계로부터 분명이 설명할 수 없는 고 수준의 불순물이 발생하였다. 이러한 고 수준의 불순물은 최적화된 SDS-PAGE 겔 상의 40 kDa, 50 kDa, 55 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 및 96 kDa에서 나타났다.
B. 증가된 불순물 생성물의 잠재적 원인
이어서 고수준의 불순물의 원인을 조사하였다. 씨. 히스톨리티쿰은 콜라게나제(AUX-I 및 AUX-II) 이외에 두 프로테아제, 즉 클로스트리파인 및 중성 프로테아제를 생성한다. 두 프로테아제 모두 활성을 위해 금속 보조인자가 필요하다. 칼슘은 클로스트리파인에 대한 보조인자이고 활성을 위해 필요하다. 칼슘은 또한 중성 프로테아제에 대한 보조인자이지만, 단지 구조적 안정성을 위해 필요하다. 칼슘이 중성 프로테아제의 결합 부위에서 제거되는 경우, 효소는 자가촉매작용을 통해 분해된다. 아연은 중성 프로테아제에 대한 보조인자이고 중성 프로테아제 활성을 위해 필요하다.
제조 실행 동안 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단위 작동 후 제조 공정 스트림에서 광범위한 생성물 분해가 처음 검출되었다. 조사된 HIC 공정 완충제 원료 물질은 하기를 포함하였다: 암모늄 술페이트(AS), Tris-Base(트로메타민 또는 "Tris") 및 약 37%의 농축된 염산(HCl). 조사는 원료 물질에서 금속 성분의 결정을 포함하였다. 이온 커플링된 플라즈마 질량 분광법(ICP-MS)을 선택하여 검출하고 정량화할 수 있는 금속의 광범위한 패널 및 감도로 인해 금속 함량을 측정하였다. ICP-MS는 칼슘 및 아연을 포함하여 34개 금속 이온을 측정하기 위한 10억 부(ppb) 감도를 갖는다.
ICP-MS에 의해 시험된 미량 금속은 칼슘, 니켈 및 아연의 수준과 관련하여 상기 원료 물질 각각에 대해 하기에 제시되어 있다. 이러한 특정 금속 수준은 Tris 로트(표 7) 및 HCl 로트(표 8)와 비교하여 시험된 암모늄 술페이트의 일부 로트(표 4-6)에서 현저히 높은 농도로 발견되었다. Tris-계 및 농축된 HCl은 검출된 저 수준의 아연, 칼슘 및 니켈 금속, 뿐만 아니라 공정 완충제에 사용된 상대적으로 낮은 농도에 기초하여 추가 시험을 위해 배제하였다.
I. 암모늄 술페이트 시험:
표 4: 암모늄
술페이트
로트에
대한 ICP-MS 미량 금속 데이터
저 수준의 불순물(SDS-PAGE에 의해 측정시 면적 기준 약 5% 이하)을 생성하는 암모늄 술페이트 로트의 칼슘 수준이 고 수준의 불순물(SDS-PAGE에 의해 측정시 면적 기준 약 5% 초과)을 야기하는 암모늄 술페이트의 로트보다 더 높았기 때문에 불순물을 야기하는 칼슘을 배제하였다. 이들 데이터는 제조 실행에서 관찰된 불순물에 대한 콜라게나제 I 및 II 분해의 잠재적인 원인으로서 칼슘 오염을 배제하였다. 콜라게나제 제조에서 고 수준의 불순물을 생성하는 시험된 암모늄 술페이트의 로트는 존재하는 아연 및 니켈의 수준을 증가시켰다. 이들 데이터는 니켈 오염과 관찰된 생성물 분해 사이에 가능한 연결을 시사하였다. 두 로트 모두 필적할만한 고 수준의 니켈을 함유하고 있기 때문에 제조 공정에 대한 아연의 영향은 이들 데이터에 의해 명확하지 않았다. 아연 및 니켈 이온 수준의 잠재적인 영향은 하기 추가로 논의된 스파이킹 연구에서 탐구하였다.
암모늄 술페이트의 유사 로트를 또한 조사하였다.
표 5: 유사 암모늄
술페이트
로트에
대한 ICP-MS 미량 금속 데이터
표 6:
EMD
Millipore
Emprove
® ACS,
NF
등급 암모늄
술페이트에
대한 ICP-MS 미량 금속 데이터
5개의 유사 암모늄 술페이트 로트(표 5)에 대한 칼슘 수준은 240-870 ppb 범위였다. 다시, 임의의 상승된 칼슘 수준은 제조 공정 이상에서 보여진 고 수준의 불순물을 생성하지 않았다. 아연 함량은 약 130-2980 ppb 범위였다. 유사 로트의 니켈 함량은 약 140-180 ppb 범위였다. 이들 데이터를 각각 약 1150 ppb 및 약 1020 ppb의 고 수준의 생성물 불순물을 생성하는 2개의 암모늄 술페이트 로트의 니켈 함량과 비교하면, 니켈 오염에 대한 허용오차는 낮다. 암모늄 술페이트 로트 사이의 니켈의 상대적인 차이는 6 내지 8배이지만, 이 차이는 유사 암모늄 술페이트 로트 내에서 10배 초과로 달라지는 아연과 같은 다른 금속보다 훨씩 낮다. 또한 Avantor 암모늄 술페이트 로트 99428(250 ppb)의 낮은 아연 함량은 제조 공정에서 보여진 고 수준의 불순물이 니켈에 고도로 민감하다는 것을 시사한다. 요약하면, 상기 조사는 정제 공정의 생성물이 공정에서 니켈 및 아연 수준 둘 다에 대해 민감하지만, 공정에서 아연에 대한 허용오차는 니켈에 대한 허용오차보다 더 크다는 것을 입증하였다.
EMD-Millipore 암모늄 술페이트 로트(표 6)에서 칼슘 수준은 시험된 암모늄 술페이트 로트와 관련된 편차보다 낮았고 유사 암모늄 술페이트 로트 칼슘 수준과 필적할만하였다(표 5). EMD-Millipore 암모늄 술페이트 로트에서 아연 이온 수준은 일반적으로 시험된 Avantor 로트보다 낮았다(표 3). 니켈 이온 수준은 시험된 4개의 개발 암모늄 술페이트 로트 EMD-Millipore에 대해 100 ppb의 정량 한계(LOQ) 미만이었다.
ii. Tris 시험:
Tris-Base의 2개의 로트는 고 수준의 불순물에서 초래된 제조 공정 이전에 및 제조 공정을 통해 상업적 생산에서 사용된 원료 물질(Avantor 로트 61712), 및 실험실 규모 조사 연구에 사용된 개발 물질(Fisher 로트 126928)을 나타낸다. 표 7에 제시된 바와 같이, Tris-Base는 배치 사이에 필적할만한 수준의 칼슘 및 니켈을 함유하였다. 2개 로트 사이의 현저한 차이는 아연 함량이었고, 개발 물질 아연 함량은 LOQ, 100 ppb 미만이었다. 고 수준의 불순물 및 저 수준의 불순물을 생성하는 제조 공정에 존재하는 니켈 및 아연의 수준은 매우 유사하였기 때문에 콜라게나제 분해에 기여하는 원료 물질로서 Tris는 무시하였다.
표 7:
Tris
-Base에 대한 ICP-MS 미량 금속 데이터
iii. HCl 시험:
2개의 HCl 로트는 고 수준의 불순물을 생성하는 제조 공정 동안 사용된 원료 물질이었다. 표 8은 칼슘 수준이 AS 로트에서 검출된 수준과 필적할만하였지만, 아연 및 니켈 함량은 LOQ(100 ppb) 미만이었음을 나타낸다. 고 수준의 불순물 및 저 수준의 불순물을 생성하는 제조 공정에 존재하는 니켈 및 아연의 수준은 매우 유사하고 검출가능한 한계 미만이었기 때문에 콜라게나제 분해에 기여하는 원료 물질로서 HCl은 무시하였다.
표 8: 농축된 HCl에 대한 ICP-MS 미량 금속 데이터
C. 아연 및 니켈
스파이킹
연구
아연 또는 니켈이 본질적으로 없는 것으로 알려진 2개의 상이한 암모늄 술페이트 로트(Fisher 로트 1476214A, 표 4 및 EMD 로트 AMO556316, 표 5)를 사용한 실험실 규모 정제 연구는 실행하여 암모늄 술페이트 로트 관련된 편차에서 검출된 관련 농도에서 아연 또는 니켈의 존재가 고 수준의 불순물을 생성하는 제조 공정에서 관찰된 생성물 분해를 담당했는지 여부를 결정하였다. 암모늄 술페이트 Fisher 로트 1476214A를 사용한 실험실 규모에서의 초기 조사 연구는 전형적인 수의 통과 AUX-I 및 AUX-II 분획을 생성하였으며, 여기서 거의 모든 AUX-I 및 AUX-II 분획은 SDS-PAGE 겔 밀도측정에 의해 측정시 적어도 91.2%의 분해되지 않은 AUX-I/AUX-II 순도를 가졌으며 가장 풍부한 분해된 AUX-I 또는 AUX-II 불순물은 SDS-PAGE 겔 밀도측정에 의해 측정시 5.8% 이하이다. EMD 암모늄 술페이트 로트의 시험은 LOQ 미만(<100 ppb)의 아연 및 니켈 함량을 제시하였다.
연구를 위해 이러한 암모늄 술페이트 로트를 사용하여, 고 수준의 불순물을 생성하는 제조 공정으로부터 사전에 동결된 Mustang Q 여과액(MQF)을 출발 물질로서 해동시켜 정량화된 HIC 및 IEX 소규모 모델로 이루어진 대조군 실행을 시행하였다. MQF는 HIC, TFF, 및 IEX 단계를 통해 처리하였다. HIC 및 IEX 단계 둘 다 크로마토그래피 단계에 대해 검증된 로드 범위의 중간지점에서 로딩하였다. 모든 단위 작동을 HIC 단계의 경우 10℃로 및 IEX 단계의 경우 4℃로 설정된 크로마토그래피 캐비닛을 사용하여 냉각된 조건하에 시행하였다. IEX 분획을 밀도측정으로 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 풀링을 위해 통과한 분획은 91.2% 순도에서 분해되지 않은 콜라게나제 I 또는 II를 요구하거나, 5.8% 이하에서 가장 풍분하게 분해된 콜라게나제 I 또는 II 불순물을 요구하였다.
아연 스파이킹 연구는 Fisher 로트 476214A로부터의 암모늄 술페이트를 활용하였다. 이 연구는 EMD 로트 AMO556316으로부터의 암모늄 술페이트를 활용하는 니켈 스파이킹 연구에 선행하였다. 두 암모슘 술페이트 로트는 100 ppb 미만 수준의 아연 및 니켈을 갖는 것으로 결정되었다.
아연 스파이킹 연구에서, Fisher 로트 1476214A로부터의 암모늄 술페이트를 ZnCl2로 스파이킹하여 HIC 완충제 내 아연 농도를 약 84 ppm으로 올렸다. 아연 스파이크된 완충제로 처리된 물질로부터의 IEX 분획 결과를 추가 아연을 공정 완충제에 첨가하지 않고 처리된 물질로부터의 IEX 분획 결과와 비교하였다. 니켈 스파이킹 연구를 위해, EMD 로트 AMO556316으로부터의 암모늄 술페이트를 NiCl2로 약 1.2 ppm으로 스파이크하였다. 연구는 하기에 별도로 논의된다.
i. 아연 스파이킹 연구:
대조군 실행 DEV-25C는 IEX 분획의 SDS-PAGE 분석에 의해 측정시 전형적인 결과를 생성하였다. 아연 스파이크된 완충제를 사용하여 시행된 DEV-25B는 AUX-I 및 AUX-II의 상당한 분해를 초래하였다.
대조군 실행 DEV-25C에 대한 IEX SDS-PAGE 이미지는 도 22 및 23에 제시되어 있다. 이들 도면에 대한 밀도측정 데이터는 하기 표 9 및 10에 표로 정리되어 있다. AUX-II 피크는 6개의 분획으로 구성되며, 이 중 1부터 5까지는 풀링 기준을 충족하였다. 마지막 분획은 풀링 기준에 실패했으며, 이는 전형적인 공정 수행과 일치한다(도 22 및 표 9 참조). AUX-I 피크는 10개의 분획(분획 7-16)으로 구성되며, 이 중 9부터 15까지는 풀링 기준을 충족하였다. AUX-I 분획이 풀링 기준을 충족하기 위해서, 분획은 분해되지 않은 AUX-I에 대해 적어도 91.2% 순도이도록 요구되고, 가장 풍부한 분해된 AUX-I 또는 AUX-II 불순물은 5.8% 이하의 순도이도록 요구된다. 유사하게, AUX-II 분획이 풀링 기준을 충족하기 위해서, 분획은 분해되지 않은 AUX-I에 대해 적어도 91.2% 순도이도록 요구되고, 가장 풍부한 분해된 AUX-I 또는 AUX-II 불순물은 5.8% 이하의 순도이도록 요구된다. 이러한 특정 요건 하에, 처음 2개의 AUX-I 분획(7 및 8) 및 마지막 AUX-I 분획(16)은 풀링 기준에 실패하였다(도 23 및 표 10 참조). 분획은 정제되는 AUX-I 또는 AUX-II의 피크를 나타내므로, 분획에 걸쳐 종형 순도 곡선이 일반적이다.
표 9:
DEV
-25C
AUX
-II 분획 밀도측정법 결과
표 10:
DEV
-25C
AUX
-I 분획 밀도측정법 결과
대조적으로, 84 ppm 아연 스파이크 실행 DEV-25B로부터 생성된 IEX 분획의 SDS-PAGE/밀도측정 분석은 < 5.8%의 최대 허용 한계(% 가장 풍부한 불순물)를 초과하는 콜라게나제 불순물 단편 웰을 함유하였다. AUX-I 또는 AUX-II 분획은 풀링 기준을 충족하지 않았다(도 24 및 25, 표 11 및 12). 이 연구는 Avantor 로트 70339로부터의 암모늄 술페이트에서 발견된 수준까지 HIC 완충제의 아연 오염이 제조 공정에서 관찰된 것과 같은 콜라게나제 분해를 촉진시키고 고 수준의 불순물을 생성한다는 것을 제시한다.
표 11:
DEV
-25B
AUX
-II 분획 SDS-PAGE 밀도측정법 결과
표 12:
DEV
-25B
AUX
-I 분획 SDS-PAGE 밀도측정법 결과
ii. 니켈 스파이킹 연구:
대조군 실행 DEV-25A에 대한 IEX SDS-PAGE 이미지는 도 26 및 27에 제시되어 있다. 이들 도면에 대한 밀도측정 데이터는 하기 표 13 및 14에 표로 정리되어 있다. AUX-II 피크는 6개의 분획으로 구성된다. 모든 분획은 풀링 기준을 충족하였다(도 26 및 표 13 참조). AUX-I 피크는 10개의 분획으로 구성되며, 이 중 9부터 15까지는 풀링 기준을 충족하였다. 처음 3개의 AUX-I 분획(분획 7 내지 9) 및 마지막 AUX-I 분획(분획 16)은 풀링 기준에 실패하였다(도 27 및 표 14 참조). 다시, 분획은 정제되는 AUX-I 또는 AUX-II의 피크를 나타내므로, 분획에 걸쳐 종형 순도 곡선이 일반적이다.
표 13:
DEV
-25A
AUX
-II 분획 SDS-PAGE 밀도측정법 결과
표 14:
DEV
-25A
AUX
-I 분획 SDS-PAGE 밀도측정법 결과
대조적으로, 스파이크된 니켈을 사용한 실행 4에서, HIC 완충제는 1.2 ppm 니켈 클로라이드를 함유하였다. HIC 완충제에서 1.2 ppm의 니켈의 존재는 고 수준의 불순물을 생성하는 제조 공정에서 경험한 것과 필적할만한 AUX-I 및 AUX-II에서 생성물 분획을 생성하였다. AUX-I 또는 AUX-II 분획은 풀링 기준을 충족하지 않았다(도 28 및 29, 표 15 및 16). 이러한 결과는 암모늄 술페이트 로트에서 1.2 ppm의 니켈 오염이 비정상 제조 공정으로부터 보여진 고 수준의 불순물과 일치한 콜라게나제 분해를 촉진한다는 것을 입증한다.
표 15:
DEV
25D
AUX
-II 분획 SDS-PAGE 밀도측정 결과
표 16:
DEV
25D
AUX
-I 분획 SDS-PAGE 밀도측정 결과
D. HIP CIP 물 세척으로부터 중성 프로테아제의 단리 및 식별
본 발명 이전에, 콜라게나제 I 또는 II의 단편 형태의 불순물은 콜라게나제 정제 공정 동안 알려진 숙주 세포 오염물인 클로스트리파인 분해의 결과인 것으로 여겨졌다. 클로스트라파인은 콜라게나제 I 및 II를 단편으로 절단하는 것으로 여겨졌고 씨. 히스톨리티쿰 발효 뿐만 아니라 콜라게나제 정제 공정 동안 존재하고 활성인 것으로 알려져 있었다. 미국특허 2015/0010532(Herber)의 이전 상동성 모델링 및 게놈 서열 분석은 중성 프로테아제(또 다른 절단 효소)가 발효 동안 분비되었지만, 프로서열 영역의 C-말단 단부와 성숙 단백질의 N-말단 단부 사이의 자가촉매작용 영역에서의 상당한 돌연변이로 인해 비기능적이었음을 예측하였다.
일상적인 제조 공정에서 증가된 수준의 불순물은 추가 조사가 필요하였다. 이 조사는 불순물이 씨. 히스톨리티쿰으로부터 중성 프로테아제에 의해 생성된 콜라게나제 I(AUX-I) 및 콜라게나제 II(AUX-II)의 분획임을 확인하였다. AUX-I 및 AUX-II의 아미노산 서열은 생물정보학 자원 포털 ExPASy.org의 펩티드 커터 프로그램에서 사용하여 클로스트리파인 및 써몰리신 절단 규칙을 사용한 이론적인 단백질 절단 부위 목록을 생성하였다. 써몰리신은 M4 패밀리의 정기준 표본이므로 씨. 히스톨리티쿰으로부터 중성 프로테아제에 대한 모델 프로테아제로서 선택하였다. AUX-I 및 AUX-II 서열에서 클로스트리 파인 및 써몰리신에 의해 생성된 절단 부위의 의문은 IEX 분획에 함유된 대다수의 특징화된 일상적인 생성물 단편(40 kDa, 50 kDa, 55 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 및 96 kDa)에 대한 말단 절단 부위의 양성 일치를 초래하였다. 주요 생성물 단편의 특징 및 각각의 절단 효소에 대한 요약은 하기 표 17에 요약되어 있다:
표 17:
클로스트리파인
및
써몰리신
절단 규칙을 사용한
IEX
단편
특징화
데이터 및 절단 말단 일치
IEX 분획으로부터 IEX 분획 불순물 카테고리의 전체 목록은 표 3의 실시예 1에 기재되어 있다. 불순물은 표 3에 기록된 분자량(MW) 중 임의의 하나에서 발생할 수 있지만, 가장 일반적인 불순물은 AUX-I의 경우 45 kDa, 55 kDa, 80 kDa, 및 90 kDa에서 발생하고 AUX-II의 경우 38 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 80 kDa, 및 90 kDa에서 발생한다. 때때로, 표 3에 명시된 것 이외의 분자량의 불순물이 발생할 수 있다(표 3에 "기타"로 지정됨).
씨. 히스톨리티쿰으로부터 정제된 중성 프로테아제를 생성하기 위해, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계의 제자리 세정(CIP) 스트림으로부터 중성 프로테아제를 정제하는 방법을 개발하였다. HIC CIP 물 세척 유출액 중 2리터 분획을 피크에 걸쳐 수동으로 수집하였다. 최대 피크를 함유하는 분획은 5℃에서 10 mM Tris, 3 mM CaCl2, pH 8.0의 6 디아부피로 완충제 교환 전에 부피 기준 10배 농축하였다. 이 작동은 단일 0.1 m2 Pellicon® 5 kDa 공칭 분자량 컷오프 십자류 여과방식을 사용하여 수행하였다. 농축된 완충제 교환된 물 세척액을 10 mM Tris, 3 mM CaCl2, pH 8.0으로 평형화된 Q 세파로즈 고성능(Q HP) 칼럼 상에 로딩하였다. 0-50% 완충제 B(10 mM Tris, 3 mM CaCl2, 360 mM NaCl, pH 8.0)로부터 25 칼럼 부피 구배를 사용하기 전에 평형 완충제로 로딩 후 칼럼을 세척하였다. 병합된 피크의 2개 클러스터는 칼럼으로부터 용리되고 자동화 분획화에 의해 수집하였다. 쿠마시 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석은 두번째 피크 클러스터 내에서 34 kDa 단백질이 검출가능한 한계 내의 다른 단백질 종이 없이 용리됨을 제시하였다(도 30, 겔 레인 3). 최대 피크 샘플을 20 mM 칼륨 포스페이트로 완충제 교환하고 -70℃에서 냉동 보관하였다.
HIC 클린 제자리(CIP) 절차의 물 세척 단계인 이 폐기물 스트림은 CIP를 시작하기 위해 0.5 M NaOH로 칼럼을 플러싱하기 전에 HIC 단위 작동 완료 후 HIC 칼럼을 주입용 물(WFI)로 플러싱함으로써 생성된다. 물 세척은 HIC 칼럼으로부터 중성 프로테아제의 용리를 야기하였다. 이 폐기물 스트림으로부터 중성 프로테아제의 단리는 성공적이었으며, 콜라게나제 제조 공정에서 비록 HIC 공정 폐기물 스트림에서라도 효소의 존재를 확인한다. 단리된 중성 프로테아제는 34 kDa의 겉보기 분자량을 가졌다.
80 kDa 단편은 잠재적인 절단 부위의 P2' 위치에서 프롤린 잔기로 인해, 펩티드 컷터 프로그램을 사용한 프로테아제 절단 규칙과 일치하지 않는 유일한 특징화된 단편이었다. 그러나, 80 kDa 단편은 AUX-I을 공정 단리된 중성 프로테아제 또는 (Serva로부터의) 씨. 히스톨리티쿰 중성 프로테아제의 상업적인 버전과 혼합함으로써 재생성되었다. 또한, MEROPS 데이터베이스를 사용한 80 kDa 단편에 대한 절단 부위의 평가는 써몰리신이 AUX-I로부터 80 kDa 단편을 생성하기 위해 Thr-693-Gly694 펩티드 결합을 절단할 수 있음을 나타내었다. 따라서, 콜라게나제 생성물의 제조에서 전형적으로 보이는 모든 5개의 AUX-I 및 AUX-II 생성물 단편은 중성 프로테아제의 단백질분해 절단 생성물이다. 제조 조건 하에, 50 kDa 및 96 kDa 불순물은 또한 클로스트리파인 분해로부터의 절단 생성물일 수 있다.
AUX-II 분획에 존재하는 비-특징화된 96 kDa 단편은 클로스트리파인 및 중성 프로테아제에 대한 다중 절단 부위인 N-말단 및 C-말단 모두에 이론적으로 일치하였다. AUX-II를 중성 프로테아제에 노출시킴으로써 96 kDa 단편을 재생성하였다. 이러한 인-실리코 분석 및 중성 프로테아제 소화 연구는 씨. 히스토리티쿰 발효 및/또는 정제에서 생성물 단편 형성을 담당하는 효소로서 중성 프로테아제를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 콜라게나제 제조 공정으로부터 단리된 중성 프로테아제는 34 kDa의 겉보기 분자량을 갖는다. 이는 중성 프로테아제의 프로서열이 자가활성화에서든 또는 또 다른 숙주 효소에 의해서든 절단되었음을 나타내며, 중성 프로테아제가 씨. 히스톨리티쿰 제조 공정에서 활성임을 시사한다.
다음으로, 할 수 없을 것으로 예측되었음에도 불구하고 프로서열이 활성 및 성숙 중성 프로테아제를 생성하기 위해 그 자체로 자가절단되었는지 여부를 결정하기 위한 조사를 수행하였다. 중성 프로테아제의 N-말단의 식별은 써몰리신에 대한 공통 서열 요건을 씨. 히스톨리티쿰 중성 프로테아제의 N-말단을 플래킹하는 서열과 비교함으로써 전구효소의 자가촉매작용 능력을 평가하기 위한 주요 데이터를 제공할 수 있다. 후속적으로 정제된 중성 프로테아제를 N-말단 식별에 적용하여 효소의 N-말단으로서 잔기 Gln220을 식별하였다. 이 N-말단은 문헌[Maeda et al. in 2015]에 의해 최근에 공개된 씨. 히스톨리티쿰 중성 프로테아제의 N-말단과 일치한다.
추가적으로, 클로스트리파인이 아니라 중성 프로테아제가 콜라게나제 제조 공정 동안 관찰된 모든 일상적인 콜라게나제 단편을 생성하는 단백질분해 효소임을 발견하였다. AUX-I/AUX-II 소화 연구에서 HIC CIP 물 세척으로부터 단리된 중성 프로테아제의 사용은 SDS-PAGE 분석에 의해 측정시, 일상적인 단편 겉보기 분자량과 일치하는 생성물 단편을 생성하였다. 이들 소화 연구는 상기 기재된 바와 같은 제조 공정으로부터 단리된 중성 프로테아제를 사용하였다.
E. 씨. 히스톨리티쿰 중성 프로테아제 N-말단의 식별
사용된 N-말단 동일성 방법은 직교식이었으며 Lys-C/트립신으로 소화 후 LC-MS/MS에 의한 에드먼 분해 시퀀싱 및 N-말단 식별이었다. 두 시험을 위한 샘플은 동일한 정제 실행으로부터 제조하였고 중성 프로테아제 용리 피크의 상이한 분획을 나타내었다. 에드만 분해 분석은 중성 프로테아제의 N-말단 영역의 하기 5개 잔기를 식별하였다: Gln220-Ala224. LC-MS/MS 소화 분석은 분석에서 2개의 펩티드로 검출된 중성 프로테아제의 N-말단 영역의 더 큰 신장을 식별하였다: Gln220Ala-Arg227 및 Gly228-Lys236. 식별된 아미노산은 도 31에서 강조 표시되어 있다.
전구효소의 헥사펩티드 동시 서열 영역은 중성 프로테아제의 식별된 N-말단을 사용하여 검사하였다. 공통 서열은 써몰리신의 프로서열의 C-말단의 3개의 잔기에 상응하며 N-말단 및 후속하는 성숙 효소의 2개 잔기와 조합된다. 써몰리신의 경우, 공통 서열은 Val230LysSerIleTherGly236이다. Ile233은 써몰리신의 N-말단이다. Schechter & Berger의 프로테아제 하위부위 명명법은 공통 서열을 기재하는데 사용될 것이다(도 32 참조). 써몰리신의 자가촉매작용에 필요한 아미노산 특성은 위치 P3에서 비극성 잔기(Gly, Ala, Ile, Leu, 또는 Val), 위치 P1에서 극성 잔기 또는 프롤린(Ser, His, Glu, P) 및 위치 P1'에서 비극성 잔기이다. 써몰리신의 공통 서열의 조사는 모든 3가지 요건을 충족시키는 것으로 나타났다.
씨. 히스톨리티쿰 중성 프로테아제의 식별된 N-말단(Gln220)을 사용하면, 이론적 공통 서열은 Lys217SerCysGlnAlaThr222이다. 이 헥사펩티드 영역은 Cys219가 극성 잔기인 것을 제외하고 자가촉매작용을 위한 임의의 하위부위 특성을 따르지 않지만, 규칙에 적합한 잔기로 나열되지 않는다. P1 부위의 적합한 잔기로부터 시스테인의 구조적 특성을 배제하는지 또는 연구자에 의해 연구되지 않았는지는 문헌에 근거하여 명확하지 않다. 써몰리신의 자가촉매작용 서열 규칙에 근거하여, 씨. 히스톨리티쿰 중성 프로테아제는 자가촉매작용 적격이 아니어야 한다.
씨. 히스톨리티쿰 ATTC19401 중성 프로테아제의 전체 유전자 산물 서열(분비 서열, 프로서열, 및 성숙 서열)은 최근에 문헌[Maeda et al. 2015]에 공개되었다. 유전자 산물을 클로닝하고 발현시켜 중성 프로테아제 기질 특이성을 연구하도록 하여 활성 중성 프로테아제를 생성하였다. 재조합 중성 프로테아제(rnprA) 및 씨. 히스톨리티쿰 중성 프로테아제 유전자 산물 서열의 서열 정렬은 100% 상동성을 초래하였다(도 33 참조). 따라서, 이는 콜라게나제 씨. 히스톨리티쿰(CCH) 제조 공정에서 중성 프로테아제가 자가촉매작용 적격이고, 성장 배지에서 프로서열을 자가-절단하여 기능성 성숙 효소가 되는 비활성 프리-전구효소로서 분비되고, CCH 발효의 전형적인 특성임을 결정하였다.
F. 제조 공정 동안 중성 프로테아제의 존재 조사
활성 중성 프로테아제가 비정상 제조 공정 실행 또는 공정의 일상적인 특성에 대해 고유한지 여부를 결정하기 위한 조사를 수행하였다. 제조 공정에서 콜라게나제 단편 패턴을 분석하였다. 비정상 제조 공정 실행에서 AUX-I 및 AUX-II IEX 분획의 분해 패턴은 전형적인 제조 공정 실행에서 전형적인 단편 상대 분자량과 일치하지만, 훨씬 더 고 수준이었다. 클로스트리파인 및 중성 프로테아제 절단 규칙에 대하여 각각의 특징화된 생성물 단편의 절단 부위를 평가하는 것은 중성 프로테아제가 불순물로 식별된 생성물 단편을 생성함을 시사하였다. CIP 폐기물 스트림을 포함하여 전체 HIC 단위 작동의 SDS-PAGE 분석을 수행하여 대략 34 kDa의 단백질 밴드가 두 공정 스트림 모두에 존재하는지 결정하였다. CIP 방법의 물 세척 부분은 SDS-PAGE 평가에 의해 이러한 겉보기 분자량과 일치하는 밴드를 함유하였다. HIC 물 세척 샘플은 또한 분석적 스파이킹 연구에서 AUX-I 및 AUX-II를 분해함을 나타내었다(비정상 제조 공정 실행에서 관찰된 패턴과 유사함).
콜라게나제 제조 공정에서 이들 단계 이외에, 잔류 중성 프로테아제가 HIC 용리액 및 TFF-1 농축물 생성물 스트림에서 발견되었다. IEX 분획, AUX-I 및 AUX-II IEX 풀, AUX-I 중간체, AUX-II 중간체, 및 약물 생성물의 조사는 중성 프로테아제가 IEX 단위 작동의 꼬리 AUX-I 분획에 격리되어 있으며, AUX-I 피크 꼬리와 함께 동시용리되었음을 밝혀냈다. 이러한 분획은 SDS-PAGE/밀도측정 분석의 공정중 순도 한계에 실패한 분획으로 인해 생성물 스트림으로부터 제거될 수 있다.
실시예 3 - 공정 제어
중성 프로테아제 활성은 3가지 제조 공정 실행의 Mustang Q 여과액, HIC 용리액 및 십자류 여과방식(TFF) 농축물 공정 샘플에서 발견되었다. 일상적인 제조 실행의 IEX AUX-I 분획을 중성 프로테아제 자이모그래피 활성 검정에서 시험하였고, 프로테아제는 이들 샘플의 꼬리 분획에서 활성을 나타냈다. 이들 데이터는 HIC 칼럼으로부터의 동시용리된 잔류 중성 프로테아제가 IEX 칼럼으로부터 용리되는 꼬리 AUX-I 분획에서 격리됨을 시사한다. 꼬리 분획의 대부분은 SDS-PAGE 밀도측정 분획 시험의 공정중 순도 한계에 실패하므로 AUX-I 중간체를 생성하기 위해 풀링되지 않을 것이다. 그러나, 소량의 중성 프로테아제를 함유하는 분획이 전방 처리되지 않도록 하는 추가 절차적 제어를 시행하였다. 추가 절차는 전방 처리에서 추가 AUX-I 꼬리 분획을 거부한다. 자이모그래피 활성 분석에 의해 시사된 중성 프로테아제 용리의 명백한 위치 특성은 이들 절차가 약물 생성물을 제형화하기 전에 생성물 스트림으로부터 중성 프로테아제를 제거하는 작용을 한다는 것을 나타낸다. 이러한 공정 제어는 하기 논의될 것이다.
자이모그래피는 SDS-PAGE 겔 내에서 공중합된 기질(카세인)을 사용하는 전기영동 기반 효소 활성 검정이며 겔에서 SDS의 제거시 특정 효소의 능력을 재생한다. 재생된 효소는 SDS 제거 후 일정 기간 동안 배양되도록 하여 공중합된 카세인 기질의 분해를 허용한다. 효소의 겉보기 분자량에 상응하는 분해된 카세인 영역이 얼룩을 흡수하지 않는 백색 구역으로 보이는 경우 쿠마시 염색에 의해 활성이 검출된다. 겔의 나머지 부분은 겔에 함유된 카세인과 쿠마시 염료 착물에 의해 청색으로 염색된다. 카세인은 씨. 히스톨리티쿰 중성 프로테아제에 의한 단백질분해 공격에 취약한 소 우유 단백질이지만, 씨. 히스톨리티쿰 클로스트리파인 또는 콜라게나제에는 그렇지 않다. 따라서,이 PAGE 기반 활성 검정은 활성 중성 프로테아제의 존재에 대한 제조 생성물 스트림을 스크리닝하는 능력을 제공하였다.
검정은 Mustang Q 여과액, HIC 용리액, TFF-1 농축물 및 마지막 IEX AUX-I 꼬리 분획에서 중성 프로테아제 신호를 입증하였다. 중성 프로테아제는 주로 HIC 단계에서 제거되고, 칼럼에 강하게 결합된 상태로 유지되어 칼럼 세정 공정의 물 세척에서 융출된다. 미량의 중성 프로테아제는 콜라겐과 함께 HIC 칼럼으로부터 동시정제되고 IEX 칼럼에 결합한다. 이 미량의 중성 프로테아제는 마지막 AUX-I 분획에서 생성물 수집이 끝날 때 칼럼에서 탈착되기 시작한다. 중성 프로테아제는 콜라게나제 II로부터 콜라게나제 I을 분리하고 용리액 피크에 걸쳐 각각의 용리액을 분획으로 수집한 후 하기 제거 단계 중 적어도 하나를 시행함으로써 제거될 수 있다: (1) 풀링될 수 있는 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 분획 둘 다에 대한 개선된 기준 한계를 포함하는 단계, (2) SDS-PAGE 또는 자이모그래피 전기 영동에 의해 시험시 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 함유하는 분획을 거부하는 개선된 분획 풀링 전략을 포함하는 단계, 및 (3) AUX-I 및 AUX-II 정제 분획의 약 1:1(동일 수율) 풀링 전략을 포함하는 단계. 자이모그래피 데이터 및 IEX 공정 제어는 이제 논의될 것이다.
A. 풀링 개선 - 카세인 자이모그래피 전기영동으로 중성 프로테아제가 없는 분획만 수집
Mustang Q 여과액, HIC 용리액, TFF-1 농축액, AUX-I 및 AUX-II 중간체, 및 약물 생성물의 실험실 규모 실행 샘플을 자이모그래피 전기 영동에 의해 시험하였다. 데이터는 도 34 및 35에 제시되어 있다. 이들 샘플은 두 상이한 실행(Dev-13 및 Dev 25A)으로부터 유래되었다. 일부 샘플 유형이 낮은 중성 프로테아제 신호를 나타냈기 때문에 자이모그래피 이미지를 밀도측정으로 스캔하고 주석이 달린 이미지를 사용하여 중성 프로테아제 밴드를 강조하는데 도움을 주었다. 밴드 시각화를 돕기 위해, 겔의 역상을 사용하여 전형적인 쿠마시 겔 이미지를 생성하였다(단백질분해 밴드는 청색으로 염색됨). 중성 프로테아제를 MQF, HIC 로드, 및 HIC 용리액과 같은 초기 공정 샘플에서 검출하였다(도 34 참조). 중성 프로테아제 밴드는 MQF 및 HIC 로드 샘플에서 ~34 kDa 겉보기 분자량에서 용이하게 관찰된다. 이러한 3가지 샘플 유형에 대해 총 단백질 로드는 2 μg(MQF), 3 μg(HIC 로드) 및 4 μg(HIC 용리액)에서 증가하지만, HIC 용리액 중성 프로테아제 반응은 실질적으로 낮다는 것을 주목한다. HIC 용리액 샘플에서 중성 프로테아제 밴드는 밀도측정 소프트웨어의 '선택 밴드' 특성을 사용하여 강조표시해야 할 정도로 희미하였다. 이는 HIC 단계에 걸쳐 중성 프로테아제의 상당한 클리어런스를 입증한다.
10 μg 총 단백질의 더 높은 로딩 질량을 TFF-1 농축물, AUX-I 및 AUX-II 풀, 중간체 및 약물 생성물에 대해 사용하여 이들 샘플에서 잠재적 중성 프로테아제 신호를 증폭시켰다. TFF-1 농축물(Dev-25A) 샘플은 ~34 kDa에서 확산 밴드를 생성하기에 충분한 농도의 중성 프로테아제를 함유하였다. AUX-I 풀, AUX-I 중간체 및 약물 생성물은 밀도측정 소프트웨어에 의해 강조표시되고 레인 6, 8 및 12에서 관찰가능한 검출가능한 중성 프로테아제를 함유하였다(도 35 참조). 34 kDa 밴드는 겔에서 볼 수 있었지만, 결과 이미지는 밴드를 선명하게 볼 수 있을 정도로 충분히 충실하지 않았다. AUX-II 중간체는 검출가능한 중성 프로테아제를 함유하지 않았으며 이전 AUX-II 풀도 함유하지 않았다(도 34). 이들 데이터는 중성 프로테아제가 IEX 단계에 걸쳐 생성물로부터 분리되고 AUX-I 풀 및 AUX-I 중간체에서 명백한 바와 같이 AUX-I 피크에서 동시용리됨을 입증한다. 이들 데이터는 또한 자이모그래피에 의해 측정된 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 함유하는 임의의 분획이 거부되고 풀링 단계에 포함되지 않아야 함을 입증한다.
전형적인 제조 공정으로부터의 AUX-I 및 AUX-II 용리액 피크의 IEX 분획은 카세인 자이모그래피 검정을 실행하여 분획에서 중성 프로테아제가 검출가능한지 여부 및 특정 위치에 함유되어 있는지 여부를 결정한다. 도 36 및 37은 검정으로부터의 겔 이미지를 함유한다. 이 방법에 의해 검출가능한 농도에서 AUX-II의 분획 중 어떤 것도 중성 프로테아제를 함유하지 않았다. IEX 분획에서 중성 프로테아제 존재를 배제하기 위해 선별된 샘플을 보다 높은 농도에서 실행시켰다(도 38 참조).
이 전형적인 제조 실행의 마지막 AUX-I 분획(17)에서 낮은 중성 프로테아제 신호를 검출하였다. IEX 칼럼으로부터의 중성 프로테아제 용리의 이러한 위치 특성은 도 38(레인 9, 10) 및 도 39(레인 8, 10 및 12)에 예시되어 있다. 이 검출은 다시 잔류 중성 프로테아제(HIC 또는 TFF-1 단계에서 제거되지 않음)가 AUX-I 피크 수집의 끝에서 IEX 칼럼으로부터 부분적으로 탈착됨을 나타낸다. 해당 제조 실행의 AUX-I 피크 꼬리에서 중성 프로테아제 오염의 위치 특성 및 이전 제조 방법의 AUX-I 풀에서 마지막 AUX-I 분획의 포함은 도 35에 보여진 제조 실행의 AUX-I 풀, AUX-I 중간체 및 약물 생성물에서 검출된 중성 프로테아제의 존재를 설명한다. 따라서, 카세인 자이모그래피 검정에 의해 측정시 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 함유하지 않는 풀링 분획은 중성 프로테아제가 본질적으로 없는 콜라게나제 조성물을 산출할 수 있다.
본 발명은 또한 자가거부 특성을 포함할 수 있다. 본 발명 이전에, 이들 AUX-I 분획은 통과 AUX-I 분획의 혼합 동안 AUX-I 풀을 생성하기 위해 수동으로 거부하였다. 적어도 마지막 2개의 AUX-I 분획의 자가거부는 잔류 중성 프로테아제가 전형적으로 이들 분획에서 동시용리되기 때문에 AUX-I 중간체로 진입하는 것을 방지한다.
다음 섹션에서 기재된 바와 같이, 개선된 IEX 풀링 전략의 시행은 AUX-I 분획 및 AUX-II 분획을 풀링하는 동안 이러한 꼬리-끝 오염을 제거한다.
B. 풀링 개선 - SDS-PAGE에 의해 측정시 최소 순도 한계를 충족하는 분획 수집
콜라게나제, AUX-I 및 AUX-II는 먼저 AUX-II로 용리하는 구배 용리 동안 이산 피크로서 IEX 칼럼으로부터 용리되고, 이어서 AUX-I이 용리된다. 피크는 약 1 리터 분취량으로 수동 분별화로 수집한다. 이러한 분획을 밀도측정으로 SDS-PAGE를 사용하여 순도에 대해 시험한. 연속적인 AUX-I 또는 AUX-II 분획은 콜라게나제 I 생성물 또는 콜라게나제 II 생성물을 생성하기 위해 풀링할 수 있다. 유사하게, 밀도측정으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 면적 기준 적어도 88.5% 순수하고 밀도측정으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 면적 기준 10% 초과의 단일 불순물이 없는 AUX-I 또는 AUX-II의 분획을 풀링하여 콜라게나제 I 생성물 또는 콜라게나제 II 생성물을 생성하였다. 이러한 한계에 실패한 분획은 전방 처리되지 않았으므로 생성물 스트림에서 제거되었다.
통과 분획에 대한 기준을 개선하면 콜라게나제 조성물의 전체 순도를 개선시킬뿐만 아니라 AUX-I 꼬리로부터 중성 프로테아제를 추가로 제거하는 역할을 한다. 통과 분획에 대한 한계를 증가시키면, AUX-I 및 AUX-II 분획이 밀도측정으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 면적 기준 적어도 91.2%의 AUX-I 또는 AUX-II 순도를 갖고 중성 프로테아제를 제거할 수 있으며, 가장 높은 단일 불순물은 밀도측정으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 5.8%를 초과하지 않을 때 중성 프로테아제를 제거할 수 있다.
조사의 일부로, 유사 배치 데이터를 기반으로 AUX-I 및 AUX-II 분획을 풀링하는 계획된 편차를 수행하였다. AUX-1 분획 12-16 및 AUX-II 분획 2-5를 풀링하고 전방 처리하여 약물 물질(때때로 벌크 약물 물질 또는 BDS라고 불림)을 생성하였다. 약물 생성물의 방출 시험은 SDS-PAGE에 의한 더 높은 한계의 기준일탈(OOS) 순도 및 역상 HPLC(RP-HPLC)에 의한 경향일탈(OOT) 순도를 초래하여 IEX 분획의 더 낮은 순도를 확인하였다. 이 계획된 편차는 도 35에 제시된 데이터를 초래하였다. 제조 실행으로부터 AUX-I 풀, AUX-I 중간체 및 약물 생성물에서 검출된 중성 프로테아제는 계획된 편차에 따라 풀링된 꼬리 AUX-I 분획(16)에 의해 기여하였다. 자이모그래피 전기영동 검정에 대한 검출 한계는 약 0.5 ng의 중성 프로테아제이다. 도 35의 밴드는 실제 카세인 자이모그래피 겔 그 자체에서 볼 수 있었지만, 10 마이크로그램의 로딩량의 콜라게나제 조성물을 사용하여 0.5 ng 한계 - 대략 0.2-0.3 ng의 중성 프로테아제의 바로 아래에 있었다.
C. 풀링 개선 - 초과 AUX-I 수율을 최소화하기 위해 AUX-II 수율 일치
본 발명은 또한 통과 AUX-II 분획을 풀링하고 통과 AUX-I 분획을 풀링하여 풀링 단계에서 약 1:1 질량 비의 AUX-I 대 AUX-II의 풀을 생성함으로써 생성된 AUX-II의 이론적인 그램 양을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 풀링된 AUX-I의 양은 AUX-II 그램의 1.3배일 수 있다. 벌크 약물 물질(콜라게나제 조성물)을 제조한 후 초과 AUX-I 또는 AUX-II를 폐기할 수 있다. 이는 전형적으로 AUX-I 풀에서 배제될 초기 공정중 한계를 충족하는 하나 이상의 꼬리 AUX-I 분획을 초래한다. 이러한 시행은 제조 공정에서 중성 프로테아제를 제거하기 위한 2차 공정 제어이다.
예로써, IEX 용리로부터 수집된 콜라게나제 I 분획의 피크 분획은 원하는 순도 및 불순물 기준을 충족시키는 분획에 기초하여, 풀링된 콜라게나제 I의 근사치 양이 공정에 의해 생성된 콜라게나제 II의 근사치 양과 일치할 때까지 콜라게나제 I 피크 분획만 풀링하는 것과 함께 전방 처리된다. 먼저, 최종 꼬리 분획을 제외하여, AUX-II 분획이 수집된 후 공정으로부터 총 AUX-II의 이론적 양을 계산할 수 있다. 둘째, 각 분획에서 이론적 양의 AUX-I을 결정한다. 이어서, 밀도측정으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 면적 기준 적어도 91.2% 순도를 함유하는 제1 AUX-I 분획 및 밀도측정으로 SDS-PAGE에 의해 측정시 약 5.8%를 초과하지 않는 단일 불순물로 시작하여, AUX-I 풀링된 양이 AUX-II에 대해 계산된 총량의 약 1.3배가 될 때까지 AUX-I에 대한 연속 분획을 풀링하였다. 이 방법에 의해 생성된 콜라게나제 조성물은 중성 프로테아제가 본질적으로 없다.
이 제어 전략은 콜라게나제 I 피크의 추가 말단 분획을 제거하여 콜라게나제 I의 풀링된 분획에 중성 프로테아제가 본질적으로 없도록 한다.
실시예 4 ― 공정에서 중성 프로테아제의 클리어런스
니켈 또는 아연으로 인한 고유한 중성 프로테아제 활성의 증폭은 상기 논의된 소규모 스파이킹 연구에 의해 입증되어 IEX 분획의 높은 불순물 수준을 초래하였다. 중요하게는, 중성 프로테아제 클리어런스 연구는 연구에 포함된 3개의 HIC 용리액 중 하나에서만 검출가능한 중성 프로테아제 활성을 발견하였지만(로트 0011338), 3개의 로트 모두 TFF-1 농축물 샘플에서 검출가능한 중성 프로테아제 활성을 함유하였다. 전형적인 HIC 용리액 및 TFF-1 농축물에 존재하는 미량 수준은 IEX 분획에서 상승된 생성물 단편을 촉진시키지 않지만, 제조 공정을 실행하여 고 수준의 불순물을 생성하고 소규모 스파이킹 연구를 실행하여 HIC 용리액, TFF-1 농축물 및 IEX 분획에 존재하는 증가된 단편을 함유하였다. 이러한 결과는 니켈 및 아연 이온이 HIC 및 TFF-1 단위 작동에서 중성 프로테아제 특이적 활성을 증폭시켜 IEX 단위 작동에서 생성물 단편 불순물을 증가 시킨다는 것을 시사한다.
약물 생성물을 생성하기 전에 콜라게나제 제조 공정의 생성물 스트림으로부터 효과적으로 제거되는 것을 확인하기 위해 중성 프로테아제 클리어런스 연구를 수행하였다. 이 연구는 최근 개발된 두 중성 프로테아제 활성 기반 시험 방법을 사용하여 다운스트림 공정의 샘플을 유지하는 생성물 스트림을 시험함으로써 3개의 유사 약물 생성물 로트에 대해 실행하였다: (1) SDS-PAGE 또는 자이모그래피 분석에 의해 측정시 검출가능한 수준의 중성 프로테아제를 함유하는 이온 교환 단계로부터 AUX I 용리 분획의 AUX-I 풀링 단계로부터의 거부, 및 (2) 이온 교환 단계로부터 풀링된 AUX I 기반 대략 1:1 질량비의 AUX II의 최대 피크 분획 풀링. 이 연구에서 시험된 생성물 스트림은 하기 표 19에 나열되어 있다. 제조 생성물 스트림에서 중성 프로테아제 활성의 검출을 위한 시험 방법은 형광 기반 마이크로플레이트 검정 및 SDS-PAGE 자이모그래피 방법이다. 이러한 각 실험 방법의 데이터는 하기 별도로 기재될 것이다:
표 19: 중성 프로테아제
클리어런스
연구에서
시험된
생성물
스트림
A. 형광 마이크로플레이트 중성 프로테아제 활성 검정
표 19에 나열된 샘플 유형을 반-정량적 형광 활성 분석을 사용하여 시험하였다. 이 검정은 중성 프로테아제의 유일한 상업적 공급원이 사용하기에 적합한 순도가 아니었기 때문에 표준 곡선에 대한 써몰리신(TL)의 상업적 제제를 이용한다. 검정에 대한 정량 한계(LOQ)는 0.0625 AU/mL(0.01866 AU/mg TL)이다. Mustang Q 여과액만 정량화가능한 수준의 중성 프로테아제 활성을 함유하였다. 모든 샘플 유형의 추가 다운스트림은 검정의 LOQ 미만이었다. 시험된 3개의 제조 로트에 대한 데이터는 하기 표 20에 제시되어 있다.
표 20: 형광 마이크로플레이트 검정에 의한 씨.
히스톨리티쿰
생성물
스트림의
중성 프로테아제 활성
B. 자이모그래피 검정
중성 프로테아제 활성에 대한 자이모그래피 검정은 모든 Mustang Q 여과액 샘플, 1개 로트의 HIC 용리액(로트 0011338) 및 모든 TFF-1 농축물 샘플에서 양성 중성 프로테아제 밴드 검출을 초래하였다. TFF-1 농축물의 샘플 유형 다운스트림은 중성 프로테아제 활성을 나타내지 않는다. 씨. 히스톨리티쿰 로트 0009749, 0010987 및 0011338의 데이터는 하기 표 21에 제시되어 있다. 로트 0010987의 자이모그래피 겔 이미지는 도 40에 제시되어 있다. 이미지는 낮은 진폭 신호 검출을 허용하도록 개선된 대비를 제공하는 역 쿠마시 얼룩 제시, 예를 들어 중성 프로테아제 밴드이다.
표 21:
중성 프로테아제
자이모그래피
검정으로부터의 정성적 활성 결과
중성 프로테아제 클리어런스 연구는 HIC 크로마토그래피 단계에서 중성 프로테아제가 주로 제거됨을 입증하는데, 마이크로플레이트 검정에서 Mustang Q 여과액 샘플 후 검출가능한 활성의 부재 및 자이모그래피 검정에 의해 평가된 바와 같이 HIC 용리액 샘플(로트 0011338) 중 하나에 존재하는 저 수준의 활성에 의해 명백하다. 자이모그래피 검정은 모든 3개의 TFF-1 농축물 샘플에서 낮은 중성 프로테아제 활성을 입증하였으며, 용리 단계 동안 중성 프로테아제가 HIC 칼럼에서 부분적으로 탈리되는 반면, 대부분의 효소는 칼럼에 결합된 상태로 남아있음을 확인하였다. 각각의 TFF-1 농축물에서 검출된 낮은 활성을 갖는 2개의 HIC 용리액 샘플에서 중성 프로테아제 활성의 부재는 이 단위 작동에서 시작되는 정용여과 전에 발생하는 6배의 농도로 인한 것이다. TFF-1 농축물에 존재하는 잔류 중성 프로테아제는 IEX 장치 작동 동안 생성물 스트림에서 제거되며, 이때 중성 프로테아제는 AUX-I 꼬리 분획과 함께 부분적으로 동시용리된다(도 39 참조). IEX 분획 순도 공정 한계 및 절차적 제어(동일한 질량의 중간체를 표적하는 마지막 2개의 AUX-I 분획의 자가 거부)는 AUX-I 중간체 및 약물 생성물을 생성하기 전에 제조 공정에서 잔류 중성 프로테아제를 제거하는 AUX-I 풀링에서 꼬리 AUX-I 분획을 배제한다.
실시예 5 ― 중성 프로테아제의 미량 제거 효과
실시예 4에 제시된 바와 같이, 콜라게나제 피크의 꼬리 단부에 더 적은 A280 콜라게나제 피크 분획을 풀링하는 것은 AUX I의 분획을 풀링함으로써 생성된 콜라게나제 I 생성물이 중성 프로테아제가 본질적으로 없도록 전부는 아니지만 대부분의 미량의 중성 프로테아제를 또한 제거한다. 풀링된 용리 분획의 정량적 평가는 개선된 제조 공정의 효과를 이전 제조 공정과 비교하기 위해 각 콜라게나제의 IEX 정제 단계 후에 수행하였다.
IEX 분획에서 관찰된 상대 순도 및 불순물 수준의 경향 분석은 중요한 공정 수행 정보를 제공한다. 상기 방법 중 하나는 실시예 1에 기재되어 있다. 이 실시예에서, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 하기 로트로부터 시험하였다:
표 22:
콜라게나제
I 및
콜라게나제
II 분획에서 순도 및 불순물을 비교하는데 사용된
로트
표 22에 열거된 각 제조 실행에 대해, 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성물의 순도 및 불순물의 백분율에 대해 AUX I 및 AUX II 용리 분획을 측정하였다. 각 분획에서 불순물의 백분율은 단편 당 기준 및 전체 불순물 기준 둘 다에 대해 측정하였다.
각 AUX I 또는 AUX II 용리 피크에서 총 단백질의 양에 대한 비정형 암모늄 술페이트 로트에 의해 영향을 받는 각 퍼센트 순도 및 각 불순물의 퍼센트는 개인 값에 대한 컴퓨터 프로그램 관리도를 사용하여 플롯팅하였다. 개별 값에 대한 관리도는 일상적인 변동(관리도 한계 내에서)으로 인한 결과와 예외적인 변도(관리도 한계 이외)으로 인한 결과 사이를 구별하는데 사용되는 통계적 도구이다. 관리 한계는 공정 변동성을 푸정하기 위해 2개의 연속 관측치의 이동 범위를 사용하여 계산된다. 관리도에서 녹색 수평선은 평균 결과를 나타낸다. 적색 수평선은 으로 계산된 상한 및 하한 관리도 한계를 나타내며, 여기서 는 평균이고 는 평균 이동 범위이다.
각 AUX 용리 피크에서 총 단백질의 양에 대한 AUX-I 및 AUX-II 생성물의 퍼센트 순도는 도 42 및 도 43에 제공된다. 도 42 및 43에 보여진 AUX-I 및 AUX-II 용리 피크의 퍼센트 순도 수준에서의 감소는 주로 각각 도 44 및 도 45에 제시된 바와 같이 AUX-I 90 kDa 및 AUX-II 96 kDa 불순물의 상승된 수준에 기인하였다.
전형적인 제조 실행에서 AUX I 및 AUX II 생성물 피크 백분율에 대한 미가공 데이터는 도 46a 및 46b에 도시되어 있고, AUX I 및 AUX II 1차 불순물 백분율에 대한 상응하는 미가공 데이터는 도 46b-46d에 도시되어 있다. 1차 불순물은 업스트림 제조 공정에서 중성 프로테아제 존재로 인해 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II로부터 90 kDa 및 96 kDa 분해 산물이다.
도 46a-46d에 도시된 바와 같이, 이전 처리 방법을 사용하여 정제된 콜라게나제 I에 대한 미가공 데이터는 94.5% +/- 1.0%의 평균 순도를 갖는다. 개선된 처리 방법을 사용하여 정제된 콜라게나제 I에 대한 미가공 데이터는 95.8% +/- 1.0%의 개선된 평균 순도를 갖는다. AUX I 풀링에 대해 0.3%의 통계적으로 유의한 개선은 중성 프로테아제가 본질적으로 없는 콜라게나제 I 생성물이 개선된 제조 방법을 사용함으로써 생성된다는 추가 증거이다. 당연하게도, 콜라게나제 II(AUX-II)의 순도는 중성 프로테아제가 이온 교환 칼럼으로부터 AUX II로 용리되지 않기 때문에 변하지 않은 채로 남아있다. 정제 생성물에서 90 kDa 및 96 kDa 콜라게나제 불순물 피크의 남아있는 존재는 개선된 공정으로도 예상치 못한 것이 아니며, 중성 프로테아제는 개선된 공정에서도 정제의 초기 단계에 남아있다.
상기 기재된 본 발명의 실시양태는 단지 예시로 의도되며, 많은 변경 및 변형이 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 모든 변경 및 변형은 첨부된 임의의 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
Claims (74)
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- 클로스트리디움 히스톨리티쿰으로부터 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 단리하고 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 1.2 ppm 미만의 니켈 및 84.4 ppm 미만의 아연의 존재 하에 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 알루미늄, 비소, 칼슘, 카드뮴, 크로뮴, 구리, 철, 마그네슘, 및 납으로 이루어진 군으로부터 선택된 저 수준의 금속의 존재 하에 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 니켈이 1.0 ppm 미만, 0.9 ppm 미만, 0.8 ppm 미만, 0.7 ppm 미만, 0.6 ppm 미만, 0.5 ppm 미만, 0.4 ppm 미만, 0.3 ppm 미만, 0.2 ppm 미만, 0.1 ppm 미만, 0.09 ppm 미만, 0.08 ppm 미만, 0.07 ppm 미만, 0.06 ppm 미만, 0.05 ppm 미만, 0.04 ppm 미만, 0.03 ppm 미만, 0.02 ppm 미만, 또는 0.01 ppm 미만의 양으로 존재하는, 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 아연이 80 ppm 미만, 50 ppm 미만, 25 ppm 미만, 10 ppm 미만, 5 ppm 미만, 3 ppm 미만, 또는 1 ppm 미만의 양으로 존재하는, 방법.
- 콜라게나제를 단리하고 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 1.2 ppm 미만의 니켈 및 84.4 ppm 미만의 아연의 존재 하에 콜라게나제를 정제하는 단계; 및
중성 프로테아제의 분획으로부터 콜라게나제의 다수의 고도로 순수한 분획을 분리하는 단계를 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서, 상기 콜라게나제가 콜라게나제 I이고, 상기 방법은 중성 프로테아제의 분획으로부터 콜라게나제 I의 분획을 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 콜라게나제가 콜라게나제 II이고, 상기 방법은 중성 프로테아제의 분획으로부터 콜라게나제 II의 분획을 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라게나제 I의 고도로 순수한 분획 및 콜라게나제 II의 고도로 순수한 분획을 혼합하는 단계를 포함하고, 혼합물이 상기 콜라게나제 혼합물의 mg 당 50 ng 미만의 중성 프로테아제를 갖는, 방법.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 알루미늄, 비소, 칼슘, 카드뮴, 크로뮴, 구리, 철, 마그네슘, 및 납으로 이루어진 군으로부터 선택된 저 수준의 금속의 존재 하에 콜라게나제를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제19항에 있어서, 니켈이 1.0 ppm 미만, 0.9 ppm 미만, 0.8 ppm 미만, 0.7 ppm 미만, 0.6 ppm 미만, 0.5 ppm 미만, 0.4 ppm 미만, 0.3 ppm 미만, 0.2 ppm 미만, 0.1 ppm 미만, 0.09 ppm 미만, 0.08 ppm 미만, 0.07 ppm 미만, 0.06 ppm 미만, 0.05 ppm 미만, 0.04 ppm 미만, 0.03 ppm 미만, 0.02 ppm 미만, 또는 0.01 ppm 미만의 양으로 존재하는, 방법.
- 제19항에 있어서, 아연이 80 ppm 미만, 50 ppm 미만, 25 ppm 미만, 10 ppm 미만, 5 ppm 미만, 3 ppm 미만, 또는 1 ppm 미만의 양으로 존재하는, 방법.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 단계가 콜라게나제의 각 분획을 SDS-PAGE 겔 상에서 시험하는 단계 및 상기 겔 상에서 검출가능한 양의 중성 프로테아제가 없는 콜라게나제의 분획만을 풀링(pooling)하는 단계를 포함하는, 방법.
- 클로스트리디움 히스톨리티쿰으로부터 콜라게나제를 단리하고 정제하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) 중성 프로테아제의 분획으로부터 콜라게나제의 다수의 고도로 순수한 분획을 분리하는 단계, 및
(b) 콜라게나제의 고도로 순수한 분획을 풀링하는 단계를 포함하며,
상기 콜라게나제가
1.2 ppm 미만의 니켈,
84.4 ppm 미만의 아연, 또는
1.2 ppm 미만의 니켈 및 84.4 ppm 미만의 아연의 존재 하에서 정제되는 것인, 방법. - 제23항에 있어서, 상기 콜라게나제가 콜라게나제 I인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 콜라게나제가 콜라게나제 II인 방법.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 단계가 콜라게나제의 각 분획을 자이모그래피를 사용하여 중성 프로테아제의 존재에 대해 시험하는 단계를 포함하고, 상기 풀링 단계가 자이모그래피 겔 상에서 검출가능한 양의 중성 프로테아제가 없는 콜라게나제를 함유하는 분획만을 풀링하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라게나제는 검출가능한 양의 중성 프로테아제가 없는, 방법.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라게나제는 콜라게나제의 mg 당 100 ng 미만, 75 ng 미만, 50 ng 미만, 25 ng 미만, 20 ng 미만, 또는 10 ng 미만의 중성 프로테아제를 포함하는, 방법.
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- 하기 단계를 포함하는, 클로스트리디움 히스톨리티쿰으로부터 콜라게나제 I을 단리 및 정제하는 공정:
a. 클로스트리디움 히스톨리티쿰을 발효시키는 단계;
b. 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 미가공 발효물을 수확하는 단계;
c. 하기 단계를 포함하는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 단계:
i. 상기 미가공 발효물을 음이온 교환 필터 상에서 여과하는 단계;
ii. 단계 (c)(i)로부터의 여과액을 80 ppm 미만의 아연 및 1.2 ppm 미만의 니켈을 포함하는 암모늄 술페이트 용액으로 침전시키는 단계;
iii. 단계 (c)(ii)로부터의 침전된 생성물을 재현탁하는 단계;
iv. 단계 (c)(iii)으로부터의 재현탁액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계;
v. 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 단계 (c)(iv)의 여과액으로부터 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 분리하는 단계; 및
vi. 단계 (c)(v)의 여과액을 분획으로 수집하는 단계;
d. 단계 (c)(vi)으로부터의 각 분획에서 수집된 콜라게나제 II의 총량을 추정하는 단계;
e. 단계 (c)(vi)으로부터의 각 분획에서 수집된 콜라게나제 I의 양을 추정하는 단계; 및
f. 콜라게나제 I의 풀링된 양이 단계 (d)에서 추정된 콜라게나제 II의 양과 동일할 때까지, 분획 내 콜라게나제 I의 피크로부터 분획 내 콜라게나제 I의 꼬리 쪽으로 콜라게나제 I을 함유하는 분획을 풀링하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 클로스트리디움 히스톨리티쿰으로부터 콜라게나제 I, 콜라게나제 II, 또는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 단리 및 정제하는 공정:
a. 클로스트리디움 히스톨리티쿰을 발효시키는 단계;
b. 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 미가공 발효물을 수확하는 단계;
c. 하기 단계를 포함하는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 단계;
i. 상기 미가공 발효물을 음이온 교환 필터 상에서 여과하는 단계;
ii. 단계 (c)(i)로부터의 여과액을 전이 금속이 실질적으로 없는 암모늄 술페이트 용액으로 침전시키는 단계로서, 상기 암모늄 술페이트 용액이 84.4 ppm 미만의 아연 및 1.2 ppm 미만의 니켈을 포함하는, 단계;
iii. 단계 (c)(ii)로부터의 침전된 생성물을 재현탁하는 단계;
iv. 단계 (c)(iii)으로부터의 재현탁액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계;
v. 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 단계 (c)(iv)의 여과액으로부터 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 분리하는 단계; 및
vi. 단계 (c)(v)의 여과액을 분획으로 수집하는 단계;
d. 중성 프로테아제의 분획으로부터 콜라게나제 I의 다수의 고도로 순수한 분획을 분리, 중성 프로테아제의 분획으로부터 콜라게나제 II의 다수의 고도로 순수한 분획을 분리, 또는 중성 프로테아제의 분획으로부터 콜라게나제 I의 다수의 고도로 순수한 분획을 분리하고 중성 프로테아제의 분획으로부터 콜라게나제 II의 다수의 고도로 순수한 분획을 분리하는 단계; 및
e. 콜라게나제 I의 고도로 순수한 분획을 풀링, 콜라게나제 II의 고도로 순수한 분획을 풀링, 또는 콜라게나제 I의 고도로 순수한 분획을 풀링하고 콜라게나제 II의 고도로 순수한 분획을 풀링하는 단계. - 제31항에 있어서, 상기 분리 단계 (d)가 콜라게나제의 각 분획을 SDS-PAGE 겔 상에서 시험하는 단계를 포함하고, 상기 풀링 단계 (e)가
겔 상에서 검출가능한 양의 중성 프로테아제가 없는 콜라게나제 I을 함유하는 분획만을 풀링하거나,
겔 상에서 검출가능한 양의 중성 프로테아제가 없는 콜라게나제 II를 함유하는 분획만을 풀링하거나, 또는
겔 상에서 검출가능한 양의 중성 프로테아제가 없는 콜라게나제 I을 함유하는 분획만을 풀링하고 겔 상에서 검출가능한 양의 중성 프로테아제가 없는 콜라게나제 II를 함유하는 분획만을 풀링하는 단계를 포함하는, 공정. - 하기 단계를 포함하는, 클로스트리디움 히스톨리티쿰으로부터 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 방법으로서, 상기 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II는 1:1의 질량비를 갖고, 상기 조성물은 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 측정시 면적 기준 적어도 95% 순수한, 방법:
a. 클로스트리디움 히스톨리티쿰을 발효시키는 단계;
b. 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 미가공 발효물을 수확하는 단계;
c. 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 단계로서, 상기 정제는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 80 ppm 미만의 아연 수준 및 1.2 ppm 미만의 니켈 수준을 갖는 암모늄 술페이트 용액으로 처리하는 것을 포함하는, 단계. - 제33항에 있어서, 상기 방법이 알루미늄, 비소, 칼슘, 카드뮴, 크로뮴, 구리, 철, 마그네슘, 및 납으로 이루어진 군으로부터 선택된 저 수준의 금속의 존재 하에서 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 니켈이 1.0 ppm 미만, 0.9 ppm 미만, 0.8 ppm 미만, 0.7 ppm 미만, 0.6 ppm 미만, 0.5 ppm 미만, 0.4 ppm 미만, 0.3 ppm 미만, 0.2 ppm 미만, 0.1 ppm 미만, 0.09 ppm 미만, 0.08 ppm 미만, 0.07 ppm 미만, 0.06 ppm 미만, 0.05 ppm 미만, 0.04 ppm 미만, 0.03 ppm 미만, 0.02 ppm 미만, 또는 0.01 ppm 미만의 양으로 존재하는, 방법.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 아연이 80 ppm 미만, 50 ppm 미만, 25 ppm 미만, 10 ppm 미만, 5 ppm 미만, 3 ppm 미만, 또는 1 ppm 미만의 양으로 존재하는, 방법.
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