ES2855423T3 - Método de tratamiento y producto para fibromas uterinos que utiliza colagenasa purificada - Google Patents

Abstract

Formulación para la utilización en el tratamiento de fibromas uterinos, comprendiendo dicha formulación colagenasa de Clostridium histolyticum como agente de tratamiento de fibromas uterinos en una cantidad eficaz para causar el encogimiento de los fibromas uterinos; en la que la formulación se administra en el paciente mediante inyección en un fibroma uterino a una dosis de hasta 1 mg de colagenasa por cada 1 cm3 de tejido de fibroma uterino.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de tratamiento y producto para fibromas uterinos que utiliza colagenasa purificada

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional US n° 61/790.070, presentada el 15 de marzo de 2013.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y productos para el tratamiento médico diseñados para reducir, encoger o cambiar las propiedades viscoelásticas, y ablandar o eliminar tejido no deseado, tal como tejido de fibroma uterino.

Antecedentes de la invención

Los tumores de fibroma uterino (también denominados "fibromas uterinos" o "leiomiomas") son tumores del músculo liso no cancerosos de la pared uterina que se producen en 20% a 50% de las mujeres y presentan una incidencia acumulativa enormemente alta. Los estudios actuales demuestran que, a los 50 años de edad, 70% a 80% de las mujeres han desarrollado fibromas uterinos, con una incidencia más elevada en mujeres afroamericanas, quienes desarrollan comúnmente fibromas antes que otros grupos étnicos. Un número significativo de las personas con fibromas uterinos desarrolla dolor pélvico debilitante, sangrado fuerte y prolongado (que puede conducir a anemia y deficiencia de hierro), disfunción intestinal y de la vejiga e infertilidad. Los fibromas uterinos causan además síntomas tales como dolor lumbar, frecuencia y urgencia urinarias, dolor durante el coito (dispareunia) y un impacto negativo sobre la fertilidad. Se asocian a elevada morbilidad por sangrado y dolor uterinos y también a costes sanitarios, que se estiman entre 2100 y 34400 millones de dólares al año en solo los Estados Unidos. Por lo tanto, los fibromas uterinos presentan un impacto significativo sobre la salud y el bienestar de las mujeres en edad reproductora y sobre la economía. Tras la menopausia, generalmente los fibromas encogen y sólo raramente causan síntomas problemáticos.

La etiología de esta enfermedad sigue siendo desconocida, por lo que no existen métodos de prevención de los fibromas uterinos. Se encuentran disponibles varios tratamientos, aunque la histerectomía es el único tratamiento que puede eliminar permanentemente los fibromas. La mayoría de las histerectomías realizadas en los Estados Unidos cada año se deben a fibromas uterinos. Resulta evidente, aunque raramente señalado en la literatura, que las histerectomías conducen a una pérdida irrevocable de la fertilidad. Dicha cirugía invasiva también presenta un coste elevado, económico, social y de otros tipos. Se asocia a tiempos de recuperación largos, potencialmente con complicaciones postoperatorias en ocasiones graves, y molestias físicas. De esta manera, esta solución está lejos de ser ideal.

Se utilizan comúnmente otros métodos quirúrgicos, tales como la miomectomía (extirpación quirúrgica del tejido fibroso, dejando intacto el resto del útero), aunque pueden no resultar adecuados en el caso de que los fibromas sean excesivamente grandes o numerosos para preservar suficiente tejido normal. Además, con frecuencia los fibromas recurren. Se añade que aproximadamente tres cuartos de las cirugías de miomectomía son cirugías abiertas que implican una incisión abdominal. Por lo tanto, dicho método también está asociado a complicaciones, molestias, una recuperación larga y potencialmente también la pérdida de la fertilidad. La miolisis y la criomiolisis, en la que los fibromas uterinos se queman o se congelan mediante cirugía laparoscópica, pueden utilizarse para causar que los fibromas encojan y mueran con el tiempo. Sin embargo, se requieren múltiples punciones de los fibromas para tratar el tumor entero y el tratamiento puede causar adhesiones postquirúrgicas. También se utilizan los ultrasonidos focalizados guiados por IRM en el tratamiento de los fibromas uterinos, aunque este procedimiento es muy caro y no elimina permanentemente los fibromas. La embolización de la arteria uterina, durante la que se inserta un catéter en una arteria femoral y se guía a una arteria de fibroma uterino para la inyección de pequeñas partículas en la arteria del fibroma, bloquea el riego sanguíneo, resultando en la muerte del tejido del fibroma. Aunque dicho procedimiento resulta menos invasivo que la cirugía tradicional, el dolor postquirúrgico es un problema frecuente. Además, dicha terapia, al igual que la histerectomía, se considera un tratamiento estándar para mujeres in deseo de futura fertilidad. Alternativamente, MRgFUS proporciona una terapia no invasiva específica de los fibromas que utiliza ultrasonografía de alta intensidad a través de la pared abdominal para causar la necrosis por coagulación en fibromas específicos. Se proporciona guía y monitorización térmica mediante la obtención de imágenes de resonancia magnética en tiempo real dinámicas. Los procedimientos quirúrgicos para destruir los fibromas uterinos que preservan simultáneamente el útero también adolecen de desventajas importantes y con frecuencia no presentan un éxito completo, debido al nuevo crecimiento de los tumores fibroides.

Se encuentran disponibles terapias médicas no quirúrgicas basadas en fármacos. Los fibromas con frecuencia se tratan con medicaciones destinadas a tratar los síntomas en lugar de los tumores fibroides mismos. En los estadios tempranos, el médico utiliza un enfoque de "esperar y ver", sin tratamiento o con tratamiento sintomático hasta que la condición impacte en la capacidad del paciente de desempeñarse en su vida normal. La mayoría de fibromas no se tratan a menos que causen síntomas. Sin embargo, incluso en ausencia de histerectomía, los fibromas, particularmente los fibromas subserosos, también pueden conducir a infertilidad.

Las farmacoterapias que están destinadas a encoger los tumores fibroides o a prevenir el incremento de tamaño han sido decepcionantes y con frecuencia presentan efectos secundarios significativos. Se han estudiado fármacos y en ocasiones resultan eficaces para encoger los fibromas uterinos, aunque muchas de dichas terapias no quirúrgicas se han asociado a efectos secundarios sistémicos y, por lo tanto, no han sido autorizados para el uso clínico. Por ejemplo, los moduladores selectivos de receptores de progesterona (SPRM, por sus siglas en inglés) no han sido autorizados por la FDA debido a sus efectos sobre el endometrio. Únicamente se ha autorizado un fármaco para la utilización en el encogimiento de los fibromas uterinos: el acetato de leuprólido. Dicho fármaco se utiliza como tratamiento a corto plazo que suprime la función ovárica (y, por lo tanto, causa efectos secundarios menopáusicos significativos), encogiendo los fibromas antes de la cirugía. Se han sugerido otras terapias médicas en el pasado reciente, tales como los moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERM), aunque los resultados de los ensayos clínicos han sido decepcionantes.

Las opciones de tratamiento actuales para los fibromas uterinos resultan inadecuadas. Por lo tanto, existe una necesidad continua en la técnica de terapias alternativas para el tratamiento de los fibromas uterinos que no son procedimientos abiertos y que preserven el útero del paciente. En particular, debido a que el tratamiento de los fibromas uterinos cuesta miles de millones de dólares en atención sanitaria cada año y sin embargo dicha condición sigue constituyendo un problema significativo, existe una necesidad de métodos de tratamiento que reduzcan o eliminen los síntomas, proporcionen alivio sin procedimientos altamente invasivos y que preserven la fertilidad.

Jayes et al., Treatment of Uterine Fibroids with highly purified clostridial collagenase, Fertility and Sterility 98(3):S232, 2012 da a conocer la inyección in vitro en tejido fibroso; el documento n° WO 2006/121968 da a conocer diversas formulaciones inyectables en fibromas uterinos, y Darlene et al ., Treatment for uterine fibroids: searching for effective drug therapies, Drug Dis. Today: Therapeutic strategies 9(1) e41-e49, 2012, proporciona una revisión de diversas terapias.

Descripción resumida de la invención

La breve descripción resumida a continuación no pretende incluir todas las características y aspectos de la presente invención, ni implica que la invención debe incluir todas las características y aspectos comentados en la presente descripción resumida.

Las realizaciones de la invención están diseñadas para proporcionar la ventaja de formulaciones, composiciones y métodos para el tratamiento de los fibromas uterinos que no requieren procedimientos quirúrgicos abiertos y que preservan el útero del paciente. Otra ventaja de la presente invención es que se proporcionan formulaciones inyectables que muestra una retención mejorada de agentes dentro del tejido del fibroma uterino, mejorando de esta manera la eficiencia de la administración, minimizando simultáneamente los efectos adversos, tales como el daño no específico y los efectos sistémicos. Entre dichas formulaciones se incluyen la colagenasa de Clostridium histolyticum como agente de tratamiento de fibromas uterinos en una cantidad eficaz para encoger o eliminar los fibromas que están expuestos a la formulación, tal como se define en la reivindicación 1.

Los objetos, características y ventajas anteriormente indicados y otros de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción más particular siguiente de realizaciones preferentes de la invención, tal como se ilustra en los dibujos adjuntos, en los que caracteres iguales se refieren a partes iguales en todas las diferentes vistas. Los dibujos no se proporcionan necesariamente a escala; por el contrario, se enfatiza la ilustración de los principios de la invención.

Breve descripción de los dibujos

El archivo de la solicitud contiene por lo menos un dibujo ejecutado en color. La Oficina proporcionará copias de cualquier publicación de patente o solicitud de patente de la presente solicitud que contengan uno o más dibujos de color bajo pedido y tras el pago de las tasas obligatorias.

Las figuras 1A y 1B son micrografías electrónicas (x31000) que muestran fibrillas de colágeno en un fibroma uterino (1A) y en el miometrio correspondiente (1B).

La figura 2 es una fotografía de cubos de tejido uterino.

Las figuras 3A y 3B son fotografías de un cubo de tejido uterino sometido a inyección (figura 3A) y cubos de tejido uterino inyectados sometidos a incubación (figura 3B).

Las figuras 4A y 4B son fotografías de un útero extirpado, que muestra un fibroma uterino (figura 4A) y un fibroma uterino sometido a inyección (figura 4B).

La figura 5 es una pareja de fotografías que muestra cubos de tejido de fibroma inyectados con vehículo (control) o colagenasa tras 48 horas de incubación.

La figura 6 es una micrografía electrónica de barrido del andamiaje OPLA® BD 3D.

La figura 7 es una micrografía que muestra la tinción de H+E de células de fibroma sembradas en un andamiaje de OPLA y cultivadas durante 9 días (microscopía de fluorescencia de campo ancho Zeiss Axio Imager®).

La figura 8 es una imagen de campo brillante (8A) con superposición de imagen fluorescente (8B) que muestra cultivos primarios de células de fibroide 8 días después de la siembra estática (imagen estereoscópica Zeiss Lumar®, teñida con fluoresceína-faloidina para actina F).

La figura 9 es una micrografía que muestra células de fibroma primario cultivadas en andamiajes de OPLA y fijadas in situ. Las imágenes 9A y 9B se obtuvieron del mismo campo de visión cada 10 micrómetros.

La figura 10 es un gráfico de columnas que muestra los porcentajes de los tipos de colágeno presentes en los fibromas.

La figura 11 es un análisis de SDS-PAGE del contenido de colágeno en una muestra de fibroma (NydeaAviles y Sergey Leikin, NIH). La figura 11A muestra el colágeno total bajo condiciones no reductoras. La figura 11B muestra el colágeno total bajo condiciones reductoras. La figura 11C muestra una muestra empobrecida en colágeno de tipo V mediante precipitación salina selectiva. La figura 11D ilustra una muestra enriquecida en colágeno de tipo V mediante precipitación salina selectiva (Feng L, Leikin S et al., presentada en la 22° reunión de la Federación Europea de Sociedades del Tejido Conectivo (FECTS), 3-7 de julio, 2010).

La figura 12 muestra cómo TGF-p podría participar en la fibrosis, que puede considerarse una forma de reparación alterada del tejido. El daño celular en las células miometriales conduce a la activación de la reparación. En los fibromas, la cicatrización de heridas se detiene en el estadio de proliferación y se acumula colágeno. (Leppert et al., A new hypothesis about the origin of uterine fibroids based on gene expression profiling with microarrays. Am. J. Obstet. Gyn. 95: 415-20, 2006).

La figura 13 muestra cambios estructurales asociados a los fibromas uterinos. El cambio de forma celular de músculo liso a célula de fibroma aparentemente es una célula de tipo miofibroblasto, lo que sugiere que la mecanotransducción desempeña un papel en la formación del fibroma. La figura 13A muestra células de fibroma con tinción de faloidina a una ampliación de 40X. La figura 13B muestra tinción de faloidina de una sección de una muestra miometrial correspondiente a una ampliación de 40X. La figura 13C muestra un espécimen de fibroma y ampliación de 21.000X y la figura 13D muestra un espécimen de miometrio correspondiente a una ampliación de 21.000X. Obsérvese la forma celular angular, el citoplasma reducido y el núcleo con muescas en el fibroma (C) en comparación con el miometrio (D).

La figura 14 es un esquema modificado de la figura 3 de Hinz and Gabbiani (Current Opinions in Biotechnology 2003, 14:38-46) que muestra cómo TGF-p es un mediador clave en la fibrosis. TGF-p estimula la diferenciación de los fibroblastos en miofibroblastos, estimula la transcripción del colágeno y estimula la acumulación de matriz extracelular (MEC). El esquema muestra además el papel de la mecanotransducción y el papel de la MEC en el desarrollo del fibroma. La acumulación de MEC ejerce compresión sobre las células. El producto de las células incrementó la MEC, conduciendo a la mecanotransducción de síntesis y depósito incrementados de colágeno. No se produce la apoptosis de las células de fibroma y las células producen todavía más colágeno.

La figura 15 es un conjunto de geles representativos de productos procedentes de reacciones de PCR-transcriptasa inversa para decorina, TGF-p¹, TGF-p3 e interleuquina-4. Las muestras emparejadas de leiomioma (fibroide) y miometrio son tal como se ilustra. Las parejas de leiomioma-miometrio están dispuestas en diluciones de 10 veces de ARN total en cada reacción. El control negativo era una reacción que contenía cebadores, aunque no contenía ARN molde. Se amplificó la GAPDH como control interno para la evaluación de la amplificación y cantidades similares de ARN en las muestras. Los marcadores de carril se muestran en el extremo izquierdo del gel. (Catherino et al. Genes, Chromosomes & Cancer 40:204-217, 2004)

La figura 16 muestra el módulo de cizallamiento complejo (rigidez) del tejido fibroide humano tratado con colagenasa clostridial purificada.

Descripción detallada de la invención

El colágeno es el constituyente estructural principal de los organismos mamíferos y constituye una gran parte del contenido de proteínas totales de la piel y de otras partes del cuerpo animal. Diversos traumatismos en la piel, tales como quemaduras, cirugía, infección y accidentes, con frecuencia se caracterizan por la acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno y que presenta un contenido incrementado de proteoglicanos. Además de la sustitución del tejido normal que ha resultado dañado o destruido, en ocasiones se forman depósitos excesivos o desfigurantes de nuevo tejido durante el proceso de cicatrización. Algunas enfermedades y condiciones están asociadas a un depósito excesivo de colágeno y a la acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno. Dichas enfermedades y condiciones se denominan colectivamente en la presente memoria "enfermedades mediadas por el colágeno".

Ahora se ha encontrado que los fibromas uterinos son una enfermedad mediada por el colágeno asociada a un depósito excesivo de colágeno y la acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno. La considerable variación en las tasas de crecimiento con el tiempo de los fibromas individuales y los estudios con micromatrices que revelan que los genes codificantes de las proteínas de la MEC o relacionadas con la síntesis y secreción de la MEC explican una gran parte de los cambios de expresión génica en los fibromas en comparación con el miometrio, convierten a la desregulación de la MEC (matriz extracelular) en un posible factor contribuyente de dicha condición.

El factor de crecimiento transformante (TGF) desempeña un papel en el desarrollo de los fibromas. Los fibromas crecen mediante deposición de colágeno alterado. De manera similar, la expresión de otras moléculas se encuentra alterada en los fibromas. Por ejemplo, la expresión de la dermatopontina se encuentra reducida, la fibronectina y los glucosaminoglicanos (GAG) se encuentran incrementados, y se expresa integrina alfa-11, una integrina de unión al colágeno. Además, los fibromas son resistentes a la apoptosis.

Estudios recientes indican que los fibromas se forman mediante la acumulación de matriz extracelular (MEC), así como mediante proliferación celular. Ver la figura 1; se observan fibrillas de colágeno desordenadas en el tejido fibroide. La apariencia y orientación espacial de las fibrillas de colágeno en los fibromas uterinos son de fibras más cortas, alineadas aleatoriamente y ampliamente dispersadas en comparación con las del miometrio. Se encontraban no alineadas y eran no paralelas, mientras que, en el miometrio contiguo, las fibrillas se encontraban bien empaquetadas y eran de orientación paralelas unas respecto a otras; un resultado que es característico del tejido que contiene colágeno. También se han observado células de tipo miofibroblasto (apariencia alargada, núcleo con muescas) en los fibromas uterinos. La apariencia dentada del núcleo de la célula de fibroide representa los pliegues y evaginaciones de la membrana nuclear debidos a la contracción celular por fibras de estrés.

Por lo tanto, la presente invención aprovecha la colagenasa, un enzima que presenta la capacidad específica de digerir el colágeno, para tratar los fibromas uterinos. La degradación del colágeno no sólo causa colagenolisis, sino que reduce además la compresión celular incrementada que conduce a mecnaotransducción. De etsa manera, se rompe el ciclo de secreción incrementada de colágeno y agrandamiento del fibroma uterino. En resumen, los fibromas uterinos contienen una abundancia de colágeno alterado consistente con fibrosis y rigidez. Una matriz extracelular (MEC) rígida ejerce fuerza contra las células individuales. La mecanotransducción altera la señalización celular e impide la apoptosis y, de esta manera, continúa la acumulación de colágeno. (ver la fig. 15) Los fibromas uterinos crecen a tasas individuales, lo que sugiere que la transducción mecánica de los tumores es responsable de la variación en las tasas de crecimiento.

La presente especificación describe realizaciones de la invención referidas a tratamientos para reducir los síntomas de los fibromas uterinos, encoger los fibromas uterinos, reducir la rigidez y estrés mecánico del tejido fibroide sobre el útero y/o eliminar los fibromas uterinos mediante la administración local de una composición de colagenasa purificada para evitar efectos secundarios sistémicos y dañar otros tejidos. En general, algunos de los métodos preferentes utilizan una jeringa y una aguja bajo ultrasonidos u otra visualización para la inyección guiada de colagenasa purificada directamente en el tejido de fibroma uterino que debe tratarse. El producto de colagenasa preferentemente se encuentra en un vehículo para la administración, tal como un nanoportador u otro portador protector o de liberación sostenida.

Debido a que el centro de los fibromas es más fibrótico y contiene lechos capilares vasculares más pequeños que la periferia, y debido a que una cápsula vascular densa circunda el tumor fibrótico, la terapia sistémica es probable que no proporcione niveles tisulares terapéuticos del fármaco en el centro del fibroma, lo que probablemente conlleva la posibilidad de efectos sistémicos. De esta manera, la farmacoterapia no ha tenido éxito con los fibromas uterinos. La inyección local de un agente de tratamiento bajo guía de imágenes permite la administración tisular exacta del fármaco y reduce en gran medida la probabilidad de efectos sistémicos.

Los fibromas uterinos se clasifican en varios tipos, según su localización, entre ellos: subseroso, intramural, submucosal, submucosal pedunculado, fibroma in statu nascendi y fibroma del ligamento ancho. Todos y cada uno de dichos fibromas uterinos se encuentran contemplados para el tratamiento utilizando la invención.

La hiperplasia miometrial (HMM) es una condición que puede mimetizar los síntomas de fibromas uterinos y puede ser una lesión precursora de dichos tumores. Es una variación estructural con zonas irregulares de hipercelularidad y proporción núcleo/célula incrementada, que provoca un útero agrandado, firme y protuberante. La condición con frecuencia conduce a histerectomía. La h Mm más profunda presenta una celularidad más baja y tiende a presenta un contenido incrementado de colágeno. Por lo tanto, dicha condición también puede tratarse utilizando los métodos y composiciones de la invención.

El tratamiento local de los fibromas uterinos mediante inyección de colagenasa puede llevarse a cabo en una oficina o visita clínica bajo guía de ultrasonidos con una probabilidad mínima de secuelas. Dicho método puede utilizarse para tratar fibromas de tamaño pequeño a moderado o fibromas asintomáticos, que actualmente no se tratan en absoluto, permitiendo al médico evitar síntomas potencialmente debilitantes y la preservación de la fertilidad en las mujeres en los años de edad fértil, y también fibromas de mayor tamaño, eliminando la necesidad de histerectomía para esta enfermedad. De esta manera, se contempla que los métodos de la presente invención resulten útiles para tratar cualquier estadio o tipo de enfermedad de fibromas uterinos.

La colagenasa para la utilización según la invención puede obtenerse a partir de la fermentación de Clostridium histolyticum. La colagenasa en bruto obtenida de C. histolyticum puede purificarse utilizando cualquiera de entre varias técnicas conocidas de purificación de proteínas, incluyendo técnicas cromatográficas. Las composiciones de colagenasa útiles para la invención también pueden prepararse utilizando cualquier actividad de colagenasa disponible comercialmente o aislada, o mediante la mezcla de dichas actividades. Por ejemplo, la colagenasa purificada la puede proporcionar Biospecifics Technologies, Lynbrook, NY.

Las colagenasas preferentes para la utilización en la invención son las colagenasas de clases I y II de C. histolyticum. Una ventaja práctica de la utilización de C. histolyticum para la producción de colagenasas es que puede cultivarse en grandes cantidades en medios líquidos simples y produce regularmente cantidades de enzimas proteolíticos que se secretan al medio de cultivo. Se han utilizado productos bovinos en medios de cultivo en la fermentación de C. histolyticum, aunque estos corren el riesgo de contaminarse con agentes que causan encefalopatías espongiformes transmisibles (EET, p.ej., priones asociados a la encefalopatía espongiforme bovina o "enfermedad de las vacas locas"). Por lo tanto, resulta preferente evitar dichos productos bovinos. Resulta preferente un sistema libre de productos animales. La cepa H4 de Clostridium histolyticum, desarrollada originalmente en 1956, puede servir como fuente de células para el cultivo. Dicha cepa, y una cepa derivada de la cepa H4, que han dado nombre al banco de células maestras ABC de Clostridium histolyticum (depositadas como ATCC n° 21000), se desarrollaron utilizando productos animales, aunque resultan adecuados para la utilización en la invención.

La patente US n° 7.811.560 da a conocer métodos para producir colagenasas. Mediante la utilización de medio de fermentación derivado de soja, los métodos indicados en la presente memoria generaron separadamente colagenasas I y II altamente purificadas. Dicha patente da a conocer además métodos de producción de colagenasas altamente purificadas utilizando medio de cultivo que contiene productos de origen porcino. Cualquiera de dichos métodos resulta adecuado para la utilización con la invención. La publicación de patente US n° 2010/0086971 da a conocer numerosas recetas de fermentación que se basan en peptona vegetal, incluyendo peptona derivada de soja o peptona derivada de vegetales más gelatina de pescado. Los métodos indicados en dicha publicación resultan adecuados para producir el crecimiento de Clostridium y actividades de colagenasa. Dichos métodos también resultan adecuados y se contemplan para la utilización con la invención; sin embargo, puede utilizarse cualquier método conocido de la técnica para producir actividad de enzima colagenasa.

En métodos de cultivo preferentes, la peptona es de origen vegetal seleccionado del grupo que consiste en soja, haba, guisante, patata y una mezcla de los mismos. La peptona puede seleccionarse del grupo que consiste en peptona vegetal Oxoid VG100 n° 1 de guisante (VG100), caldo de fosfato de peptona vegetal Oxoid VG200 de guisante (VG200), Merck TSB CASO-Bouillion de origen no animal (TSB), digerido papaínico de peptona de soja Invitrogen n° 110 (SP6), peptona de haba Fluka (BP), peptona vegetal Organotechnie E1 de patata (E1P), Phytone™ BD Difco Select.

En una realización preferente de la invención, se encuentra presente un único tipo de peptona en la composición de nutrientes de la invención, de manera que la peptona se selecciona del grupo que consiste en BP E1P, peptona de soja E110 VG100 y VG200, y en el que la concentración de la peptona en la composición es de aproximadamente 5% en peso en volumen. En todavía otra realización muy preferente de la invención, se encuentra presente un único tipo de peptona en la composición de nutrientes de la invención, en la que la peptona es peptona de fitona BBL o Phytone™ Difco Select UF y en la que la concentración de la peptona en la composición es de aproximadamente 10% a 13% en peso en volumen.

Los métodos preferentes de aislar colagenasa evitan proteasas contaminantes no deseables, tales como la clostripaína. La clostripaína, una cisteína proteasa, se cree que es la causa principal de degradación e inestabilidad de la colagenasa, y se encuentra presente en el cultivo de Clostridium. En el caso de que dichas proteasas se encuentren presentes en una mezcla de colagenasa en bruto, debe procurarse especialmente neutralizar las proteasas, incluyendo la utilización de inhibidores de proteasa, tales como leupeptina, y realizar todas las etapas de la purificación en salas frías especialmente diseñadas con soluciones de refrigeración para reducir la actividad de las proteasas. Por lo tanto, los métodos preferentes de aislamiento aprovechan uno de dos posibles enfoques para evitar la clostripaína: eliminar la clostripaína tan pronto como resulte posible en el método de purificación o reducir la producción de clostripaína durante la etapa de fermentación.

Las composiciones de colagenasa preferente se producen mediante la fermentación de C. histolyticum en medio libre de ingredientes de origen animal y están sustancialmente libres de clostripaína y de esta manera son altamente estables. La expresión "sustancialmente libre" indica que la colagenasa contiene menos de 10 U de clostripaína por mg de colagenasa total, más preferentemente menos de 5 U/mg y lo más preferentemente, aproximadamente 1 U/mg o menos, y/o que no aparecen bandas visibles que representan la clostripaína y/o colagenasa degradada en el gel de SDS-PAGE en comparación con un estándar de referencia.

Los métodos preferentes de purificación de colagenasa implican la utilización de un medio "pobre en glucosa" tal como se indica en la presente memoria, que contiene menos de aproximadamente 5 g/l de glucosa, más preferentemente menos de aproximadamente 1 g/l, todavía más preferentemente menos de aproximadamente 0,5 g/l de glucosa o se encuentra libre de glucosa, para el cultivo de C. histolyticum. Las concentraciones salinas elevadas en el medio de crecimiento pueden reducir la cantidad de clostripaína producida en cultivo; de esta manera, los medios preferentes para el cultivo de C. histolyticum contienen más de aproximadamente 5 g/l (o 0,5% p/v) de sales totales, más preferentemente más de aproximadamente 7,5 g/l (o 7,5%) de sales totales y más preferentemente, aproximadamente 9 g/l (o 9%) o más. Se encuentra contemplado que pueda utilizarse en la presente invención cualquier sal que es conocido que resulta adecuada para la utilización en medios de fermentación microbiológica. En una realización preferente, pueden utilizarse sales cloruro, fosfato o sulfato. En una realización más preferente, las sales pueden ser cloruro sódico, cloruro potásico, fosfato monosódico, fosfato disódico, fosfato sódico tribásico, monofosfato potásico, difosfato potásico, fosfato tripotásico, cloruro cálcico, sulfato de magnesio o diversas combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, el difosfato de potasio puede ser aproximadamente al 0,1%-0,3%, el fosfato de potasio puede ser de aproximadamente al 0,75% a 0,175%, el fosfato sódico puede ser de aproximadamente al 0,2% a 0,5% y/o el cloruro sódico puede ser de aproximadamente al 0,15% a 0,35%. Preferentemente, el medio comprende además sulfato de magnesio y vitaminas, incluyendo riboflavina, niacina, pantotenato cálcico, ácido pimélico, piridoxina y tiamina.

En otra realización preferente, la composición de nutrientes puede contener 0,5% a 5% de extracto de levadura, más preferentemente, aproximadamente 1% a 4% y lo más preferentemente, aproximadamente 1,5% a 2,5%. El extracto de levadura se encuentra disponible de una diversidad de proveedores, incluyendo Cole Parmer (Vernon Hills, Illinois) y Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).

En una realización todavía preferente de la invención, el pH del medio es de entre 7 y 8. Todavía más preferentemente, es un pH de entre aproximadamente 7,2 y aproximadamente 7,7; lo más preferentemente, de aproximadamente 7,4.

La colagenasa contemplada para la utilización con la invención puede ser cualquier colagenasa que se encuentre activa bajo las condiciones necesarias. Sin embargo, las composiciones preferentes contienen una proporción en masa de colagenasa I y colagenasa II que está modificada u optimizada para producir un efecto sinérgico deseado o incluso máximo. Preferentemente, la colagenasa I y la colagenasa II se purifican por separado a partir de la mezcla de colagenasa en bruto producida en cultivo, y la colagenasa I y la colagenasa II se recombinan en una proporción de masas fija optimizada. Las realizaciones preferentes contienen una proporción de masas de colagenasa I a colagenasa II de entre aproximadamente 0,5 y 1,5, más preferentemente de entre 0,6 y 1,3, todavía más preferentemente de entre 0,8 y 1,2, y lo más preferentemente de entre 1 y 1; sin embargo, puede utilizarse cualquier combinación o cualquier actividad colagenasa individual.

Un método preferente de producción de colagenasa que se encuentra contemplado para la utilización con la invención implica la fermentación de C. histolyticum en un medio no de mamífero o no animal, en el que el sobrenadante del cultivo se encuentra sustancialmente libre de clostripaína. Las colagenasas producidas de esta manera pueden aislarse, purificarse y agruparse para proporcionar una composición para la utilización en la invención, que comprende una mezcla de colagenasa I y colagenasa II en una proporción de masas fija optimizada que se encuentra sustancialmente libre de clostripaína. La colagenasa en bruto obtenida de la fermentación de C. histolyticum puede purificarse mediante una diversidad de métodos conocidos por el experto en la materia, incluyendo la cromatografía de afinidad de ligando de pigmento, la cromatografía de afinidad de heparina, la precipitación con sulfato amónico, la cromatografía en hidroxilapatito, la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de intercambio iónico y/o la cromatografía de quelatos metálicos. Adicionalmente, se conocen métodos de purificación, tales como, por ejemplo, los indicados en la patente US n° 7.811.560.

Tanto la colagenasa I como la colagenasa II son metaloproteasas y requieren cinc unido estrechamente y calcio unido laxamente. Ambas colagenasas presentan una amplia especificidad para todos los tipos de colágeno. La colagenasa I y la colagenasa II digieren el colágeno mediante hidrólisis de la región de triple hélice del colágeno bajo condiciones fisiológicas. Cada colagenasa muestra diferente especificidad (p.ej., cada una presenta una secuencia de aminoácido diana preferente para el corte que es diferente) y juntas presentan actividad sinérgica hacia el colágeno. La colagenasa II presenta una actividad más elevada hacia todos los tipos de sustrato de péptido sintético que la colagenasa I, tal como se ha informado para las colagenasas de clase II y clase I en las referencias de la literatura.

La colagenasa preferente consiste en dos colagenasas microbianas, denominadas colagenasa ABC I y colagenasa ABC II. Los términos "colagenasa I", "ABC I" y "colagenasa ABC I" se refiere a lo mismo y pueden utilizarse intercambiablemente. De manera similar, los términos "colagenasa II", "ABC II" y "colagenasa a Bc II" se refieren al mismo enzima y también pueden utilizarse intercambiablemente. Dichas colagenasas pueden aislarse y purificarse a partir del sobrenadante del cultivo de Clostridium histolyticum mediante métodos cromatográficos. Ambas colagenasas son proteasas especiales y comparten el mismo número EC (E.C. 3.4.24.3). Sin embargo, se contempla para la utilización con la invención una colagenasa o una combinación de colagenasas de otras fuentes. La colagenasa ABC I presenta una única cadena polipeptídica que consiste en aproximadamente 1000 aminoácidos con un peso molecular de 115 kDa. La colagenasa ABC II presenta una única cadena polipeptídica que consiste en aproximadamente 1000 aminoácidos con un peso molecular de 110 kDa.

La colagenasa actúa mediante hidrólisis del enlace peptídico entre Gly-Pro-X, en donde X es con frecuencia prolina o hidroxiprolina. La colagenasa I actúa en los loci de los extremos de los dominios de triple hélice, mientras que la colagenasa II corta internamente. La hidrólisis continua durante el tiempo hasta que se han cortado todos los enlaces.

Preferentemente, el producto de la colagenasa es una o más colagenasas puras por lo menos al 95% y se encuentra sustancialmente libre de cualesquiera proteasas contaminantes. Más preferentemente, el producto colagenasa es 97% puro y, lo más preferentemente, 98% puro o más, según se determina mediante uno o más de los siguientes: electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), HPLC de fase inversa o mediante ensayos enzimáticos. El producto de colagenasa preferente se encuentra esencialmente libre de clostripaína y la purificación preferentemente se lleva a cabo en ausencia de leupeptina. El producto colagenasa preferente para la utilización con la invención presenta por lo menos una especificación seleccionada de la Tabla 1, a continuación.

Tabla 1. Especificaciones preferentes para productos de colagenasa.

Los productos de colagenasa indicados para la utilización en la presente memoria resultan útiles para el tratamiento de los fibromas uterinos.

Las composiciones de colagenasa según la presente invención están diseñadas para administrar en el paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de colagenasa tal como se describe, o una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación de colagenasa farmacéutica tal como se describe. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto, composición o formulación es una cantidad del compuesto que proporciona un efecto terapéutico al sujeto tratado, en una razón beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Un efecto terapéutico incluye, aunque sin limitación, un encogimiento o reducción del tamaño de uno o más fibromas uterinos (incluyendo la eliminación del fibroma), la licuefacción, la licuefacción parcial, o la reducción de la rigidez (incremento de la blandura) o la presión dentro o en torno al fibroma uterino, un cambio de las propiedades viscoelásticas, o la reducción de los síntomas, tales como el dolor, la hemorragia y similares.

El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible mediante algún ensayo o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto proporciona una indicación o siente un efecto) y puede ser determinado por el médico o por el paciente. Las dosis eficaces también variarán según la vía de administración, así como la posibilidad de coutilización con otros agentes. Sin embargo, se entenderá que la utilización diaria total de las composiciones de la presente invención será decidida por el médico responsable dentro del alcance del criterio médico responsable. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una diversidad de factores, entre ellos el trastorno bajo tratamiento y la gravedad del trastorno, la actividad del compuesto específico utilizado, la composición específica utilizada, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y dieta del paciente, el momento de la administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico utilizado, la duración del tratamiento, los fármacos utilizados en combinación o simultáneamente con el compuesto específico utilizado, y factores similares bien conocidos de la técnica médica.

El término "paciente" o "paciente que lo necesita" comprende cualquier mamífero que posea un útero y fibromas uterinos o síntomas de los mismos. Entre dichos "pacientes" o "pacientes que lo necesitan" se incluyen seres humanos o cualquier mamífero, incluyendo animales de granja, tales como caballos y cerdos, animales de compañía, tales como perros y gatos, y animales experimentales, tales como ratones, ratas y conejos. Los pacientes preferentes son hembras humanas en edad fértil.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran mediante inyección directamente en el tejido del fibroma uterino que debe tratarse, es decir, administración local en el tejido que debe tratarse.

Las formulaciones de la presente invención se inyectan en el tejido uterino de una diversidad de formas, por una diversidad de vías, utilizando una diversidad de aparatos. En algunas realizaciones, la formulación se inyecta utilizando un aparato que consiste en una aguja simple (p.ej., una aguja de calibre 10 o más pequeña) y empujador de muestra (p.ej., un mandril u obturador modificado). Por ejemplo, según una realización, se introduce una formulación (p.ej., una formulación sólida o semisólida en forma de barra o de otra forma, perlas, suspensión, gel, polímero o similar) en la aguja o en una jeringa u otra cámara fijada a la aguja. Una vez ha penetrado la aguja hasta la profundidad y sitio deseados en el tejido, se utiliza el empujador para empujar la muestra por la aguja y hacia el interior del tejido. En algunas realizaciones, el empujador de muestra se proporciona con un clip de sujeción o se proporciona con un extremo cóncavo para fijar la muestra hasta el tiempo de administración.

En todavía otras realizaciones, las formulaciones de acuerdo con la presente invención se inyectan mediante inyección de chorro sin un canal de administración físico, tal como una aguja, tal como es conocido de la técnica. Típicamente, se utiliza un sistema de compresión (p.ej., un sistema mecánico o un gas, tal como helio, nitrógeno, dióxido de carbono, etc.) para acelerar las formulaciones hasta una velocidad suficientemente elevada para que la formulación pueda penetrar en el tejido hasta la profundidad deseada. Los dispositivos de inyector de presión pueden ser, por ejemplo, desechables o reutilizables con cartuchos de medicación que son cartuchos de medicación prellenos o no prellenos. Entre los ejemplos de inyectores de presión se incluyen Biojector® de Bioject, N.J., EE.UU. y el sistema PowderJect7 de PowderJect, Reino Unido. En otras realizaciones, se utiliza un dispositivo que extrae una sección del fibroma (p.ej., un dispositivo de biopsia o morcelador de tejidos o radiación láser), dejando atrás de esta manera un hueco para la inserción de una forma de dosis.

Se contempla que las formulaciones para la administración de colagenasa en un paciente generalmente comprendan formulaciones inyectables, o cualquier fluido, líquido, sólido, semisólido, gel u otra composición que resulte adecuada para la administración de la colagenasa en el tejido que debe tratarse tal como se indica en la presente memoria. Las formulaciones según la presente invención pueden formularse mediante cualquier método conocido de la técnica farmacéutica. De esta manera, puede utilizarse cualquier formulación inyectable conocida de la técnica y consistente con la actividad de colagenasa. Se encuentran contempladas las formulaciones que crean un depósito o la liberación prolongada del agente de colagenasa activa. En particular, resultan preferentes las composiciones de liberación extendida o prolongada inyectables. Dichas composiciones producen o forman un efecto de depósito, en el que se encuentra presente agente activo en el tejido en donde el agente activo administrado y liberado durante un periodo de tiempo trata continuamente el tejido. Las formulaciones inyectables de liberación inmediata, en las que el agente activo es inmediatamente liberado para la actividad con la administración, también se encuentran contempladas para la utilización con la invención. Dichas formulaciones son conocidas de la técnica y pueden ser adaptadas para la utilización con la presente invención por cualquier experto en la materia.

En algunas realizaciones, las formulaciones inyectables de la presente invención son sólidos, semisólidos o líquidos de alta viscosidad. Lo anterior mejora la retención de la dosis en el tejido, mejorando de esta manera la eficiencia de la administración de los agentes de tratamiento y/o minimizando los efectos adversos, tales como el daño no específico no deseado a los tejidos. la expresión "alta viscosidad" y otros términos similares se utilizan en la presente memoria para indicar líquidos con viscosidades superiores a 1000 cps medidas mediante cualquiera de entre varias técnicas estándares, entre ellas, por ejemplo, un viscosímetro cinemático Brookfield, modelo HBDV-II+CP con un husillo de cono CPE-40, configurado a 37°C y utilizando un parámetro de velocidad de 0,5 rpm. Los líquidos de "baja viscosidad" presentan viscosidades inferiores a dicho valor.

En algunas realizaciones, una formulación según la presente invención se inyecta en el paciente en un estado fluido, de manera que se convierte (o es convertido) in vivo en una forma más fácilmente retenida, por ejemplo una forma sólida (que incluye la conversión de un líquido inyectado en un sólido; la conversión de un semisólido inyectado en un sólido y la conversión de un líquido en un gel), en una forma semisólida (que incluye la conversión de un líquido inyectado en un semisólido; la conversión de un semisólido inyectado en un semisólido que presenta un límite elástico y/o viscosidad incrementado y la conversión de un líquido en un gel) o en un líquido de alta viscosidad (que incluye la conversión de un líquido de baja viscosidad en un líquido de alta viscosidad, y la conversión de un líquido de alta viscosidad en un líquido de viscosidad más alta).

Las formulaciones preferentes para la inyección en un fibroma uterino utilizan un portador o nanoportador. Entre los portadores apropiados se incluyen pellets sólidos o semisólidos, perlas o polímeros formadores de gel, líquidos de alta viscosidad y similares para mantener la colagenasa activa en el tejido, protegiendo el enzima activo de la acción del tejido o componentes del tejido que podrían inactivar la colagenasa y permitir la liberación uniforme del enzima en el tejido para el tratamiento. Puede utilizarse cualquier forma de dosis inyectable que pueda proteger y contener el compuesto o compuestos activos en su sitio. En mamíferos, la colagenasa de C. histolyticum resulta rápidamente inhibida en el torrente sanguíneo por el suero. Por lo tanto, la administración sistémica, o la administración bajo condiciones en las que la colagenasa puede desactivarse, o por vía oral, en la que la colagenasa puede resultar degradada por enzimas digestivos, resulta problemática.

Los nanoportadores están diseñados para administrar y proteger los terapéuticos farmacéuticos (p.ej., proteínas) de la degradación. Una formulación de nanoportador también resulta preferente debido a que este método impide la difusión y distribución del fármaco lejos del fibroma inyectado, prolonga la liberación, retrasa la inactivación y, por lo tanto, reduce la frecuencia de las inyecciones repetidas. Cualquiera de dichos nanoportadores conocidos de la técnica puede utilizarse con la invención. Algunos de dichos nanoportadores también se denominan sistemas de administración termosensibles.

Atrigel® comprende un polímero biodegradable insoluble en agua (p.ej., ácido poli(láctico-co-glicólico, PLGA) disuelto en un solvente orgánico miscible en agua biocompatible (p.ej., N-metil-2- pirrolidona, NMP). Durante la utilización, se añade colagenasa para formar una solución o suspensión. Tanto el peso molecular de PLGA como la proporción molar de láctido-glicólido (relación L:G) controlan la administración del fármaco. Mediante la utilización de una relación L:G de 50:50 a 85:15 y una concentración de polímero de entre 34% y 50%, algunos estudios clínicos han demostrado que se mantenía un reservorio durante más de 3 meses.

ReGel® es un copolímero tribloque de 4000 Da formado a partir de PLGA y polietilenglicol (PEG, 1000 Da o 1450 Da) en repeticiones de PLGA-PEG-PLGA o PEG-PLGA-PEG. ReGel® se formula en forma de una solución de copolímero al 23% en peso en medios acuosos. Se añade un fármaco a la solución y al elevar la temperatura a 37°C, todo el sistema gelifica. La degradación de ReGel® en los productos finales de ácido láctico, ácido glicólico y PEG se produce a lo largo de 1 a 6 semanas, según la composición molar del copolímero. Pueden incorporarse fármacos químicamente diferentes, como la hormona del crecimiento porcina y el péptido 1 similar al glucagón (GLP-1), uno cada vez, y liberarse a partir de ReGel®.

LiquoGel™ puede funcionar mediante vías de administración de fármaco mecánicamente independientes: atrapamiento y enlace covalente. Pueden administrarse dos o más fármacos en el sitio tumoral utilizando dicho portador. LiquoGel™ es un copolímero tetramérico de N-isopropilacrilamida termogelificada; macrómero biodegradable de poli(ácido láctico) y metacrilato de 2-hidroxietilo; ácido acrílico hidrofílico (para mantener la solubilidad de los productos de descomposición) y poliglicerol hiperramificado multifuncional para unir fármacos covalentemente. LiquoGel™ generalmente se formula en forma de una solución de copolímero al 16,9% en peso en medio acuoso. La solución gelifica bajo condiciones fisiológicas y se degrada, liberando el contenido de fármaco a lo largo de 1 a 6 días.

Cualquiera de los portadores anteriormente indicados puede utilizarse como nanoportador con la invención. Sin embargo, un nanoportador preferente contiene poligliceroles hiperramificados (HPG), que presentan muchas características deseables. Los HPG crecen mediante generaciones imperfectas de unidades ramificadas y se producen en una única y cómoda etapa de reacción. Se han superado los problemas anteriores de polidispersidad elevada del peso molecular durante su producción. Los polímeros resultantes contienen un gran número de grupos funcionales de superficie modificables, así como cavidades internas para la interacción de fármacos. Otros enfoques de polímeros no pueden proporcionar fácilmente dichas propiedades sin incrementar significativamente el número de etapas sintéticas y, en consecuencia, el coste. Los polímeros HPG se basan en el glicerol y debido a su similitud estructural con el polietilenglicol, son biocompatibles.

Opcionalmente pueden añadirse componentes adicionales al polímero, por lo tanto, se encuentran contemplados polímeros de HPG y copolímeros de HPG. Entre dichos componentes o monómeros adicionales pueden incluirse, por ejemplo, enlaces cruzados, fracciones biodegradables y fracciones termosensibles. Por ejemplo, los hidrogeles térmicamente sensibles resultan atractivos para la terapia de inyección, ya que resulta posible inyectar el volumen de líquido necesario a partir de una jeringa mantenida a una temperatura inferior a la corporal y, con el calentamiento, incrementar las propiedades mecánicas, restringiendo de esta manera el material en el sitio de inyección. La poli(N-isopropilacrilamida) (poli-NIPAAm) es un polímero térmicamente sensible con una temperatura de solución crítica más baja (LCST), de aproximadamente 32°C. Por lo tanto, se encuentran contemplados los copolímeros de HPG con NIPAAm para la utilización con la invención, y resultan preferentes. Dicho nanoportador presenta un tamaño de malla versátil y puede personalizarse para atrapar moléculas de fármaco pequeñas, proteínas grandes, o una mezcla de componentes, y gelifica a la temperatura corporal, permitiendo la liberación lenta a medida que se biodegrada el nanoportador.

En realizaciones preferentes de la invención, existen formulaciones en forma de un líquido a una temperatura inferior a la temperatura corporal y en forma de un gel a la temperatura corporal. La temperatura a la que se produce una transición de líquido a gel en ocasiones se denomina LCSt , y puede ser un intervalo de temperaturas pequeño, y no una temperatura específica. Los materiales que poseen una LCST se denominan materiales LCST. Las LCST típicas para la práctica de la presente invención se encuentran comprendidas entre, por ejemplo, 10°C y 37°C. Como resultado, una formulación inyectada a menos de la LCST se calienta dentro del cuerpo hasta una temperatura que es igual o superior a la LCST, experimentando de esta manera una transición de líquido a gel.

Entre los materiales LCST adecuados para la utilización con la invención se incluyen los copolímeros en bloque de polioxietileno-polioxipropileno (PEO-PPO). Dos compuestos aceptables son el ácido plurónico F127 y F108, que son copolímeros en bloque de PEO-PPO con pesos moleculares de 12.600 y 14.600, respectivamente. Cada uno de dichos compuestos se encuentra disponible de BASF (Mount Olive, N.J.). El ácido plurónico F108 a una concentración de 20% a 28%, en solución salina tamponada con fosfato (PBS) es un ejemplo de un material LCST adecuado. Una preparación beneficiosa es el ácido plurónico F108 al 22,5% en PBS. Una preparación de ácido plurónico F108 al 22% en PBS presenta una LCST de 37°C. El ácido plurónico F127 a una concentración de 20% a 35% en PBS es otro ejemplo de un material LCST adecuado. Una preparación de ácido plurónico F127 al 20% en PBS presenta una LCST de 37°C. Los pesos moleculares típicos se encuentran comprendidos entre 5.000 y 25.000 y, para los dos compuestos específicos identificados anteriormente, son de 12.600 y 14.600. Más generalmente, también pueden utilizarse según la presente invención materiales, incluyendo otros copolímeros en bloque de PEO-PPO, que son biodesintegrables, y que existen en forma de un gel a temperatura corporal y en forma de un líquido a una temperatura inferior a la temperatura corporal. Puede encontrarse más información respecto a los materiales LCST en los documentos de patente US n° 6.565.530 B2 y n° 6.544.227 B2.

Entre las formulaciones farmacéuticas de los compuestos de colagenasa para la invención se incluyen una composición de colagenasa formulada junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "portador o excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un relleno, diluyente, material de encapsulado, vehículo, solvente no tóxico, inerte, sólido, semisólido o líquido, o o auxiliar de formulación de cualquier tipo, y puede ponerse a disposición en formas de dosis individuales o a granel. Otras formas de dosis diseñadas para crear un depósito del compuesto activo también se encuentran contempladas para la utilización con la invención. Entre las formas de dosis para colagenasa adecuadas para la utilización con la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, polvos liofilizados u otros polvos secos para la reconstitución antes de la inyección, en cantidades de múltiples dosis o dosis individuales, unidades de dosis individual listas para la inyección (que preferentemente incluyen además uno o más conservantes), formas de dosis unitaria congeladas o cualquier modo de preparación conocido de la técnica. Las formulaciones pueden proporcionarse además en la forma de un kit, que puede contener la colagenasa en forma sólida, líquida o en solvente para la reconstitución e inyección, y cualquier equipo necesario para la administración, tal como una jeringa y aguja, particularmente una jeringa y/o aguja especializados para la administración en un fibroma uterino. Preferentemente, las formulaciones son estériles. Los productos pueden esterilizarse mediante cualquier método conocido de la técnica, tal como mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o se producen bajo condiciones asépticas. Entre otros métodos se incluyen la exposición de la formulación o componentes de la misma a calor, radiación o gas de óxido de etileno.

Algunos ejemplos de materiales que pueden servir de portadores farmacéuticamente aceptables, son solventes para inyección conocidos de la técnica. Entre los ejemplos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agua estéril, soluciones tamponadoras, soluciones salinas, tales como solución salina normal o solución de Ringer, agua libre de pirógenos, alcohol etílico, aceites no tóxicos y similares, o cualquier solvente compatible con la inyección u otras formas de administración, tal como se indica en la presente memoria para la utilización con la invención.

Además, pueden utilizarse con la invención cualesquiera excipientes sólidos conocidos de la técnica para la utilización en productos farmacéuticos, como vehículo o material de carga, por ejemplo. Pueden utilizarse azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; gomas; talco; glicoles, tales como propilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar, y similares. Se encuentran contemplados para la utilización agentes tamponadores compatibles con los compuestos activos y los métodos de utilización, incluyendo compuestos ácidos o alcalinos, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio, ácido cítrico, sales fosfato o carbonato, y similares. También pueden utilizarse excipientes compatibles no tóxicos, tales como lubricantes, emulsionantes, agentes humectantes, agentes de suspensión, ligantes, desintegrantes, conservantes o agentes antibacterianos, antioxidantes, excipientes de liberación sostenida, agentes de recubrimiento y similares (p.ej., laurilsulfato sódico y estearato de magnesio), así como agentes colorantes, agentes perfumantes, agentes potenciadores de la viscosidad, bioadhesivos, y similares, según el criterio del formulador.

Por ejemplo, puede incluirse uno o más ligantes biodesintegrables en las formulaciones de la presente invención, típicamente en relación a formas de dosis con características sólidas. En donde se utilicen puede utilizarse un amplio abanico de concentraciones de ligante biodesintegrable, variando las cantidades según, por ejemplo, las características físicas deseadas de la forma de dosis resultante y las características del agente de tratamiento de fibromas uterinos que se seleccione (p.ej., el grado de dilución, el retardo de la liberación, etc., que se desea/tolera), entre otras consideraciones. La concentración del ligante biodesintegrable típicamente se encuentra comprendida entre aproximadamente 1% y 80% en peso de ligante biodesintegrable, más típicamente entre aproximadamente 5% y 50% en peso. Un material "biodesintegrable" es uno que, una vez introducido en un tejido, tal como tejido uterino, experimenta disolución, degradación, resorción y/o otros procesos de desintegración. En donde se incluyen dichos materiales, las formulaciones de acuerdo con la presente invención típicamente experimentarán una reducción de peso de por lo menos 10% tras residir en un tejido, tal como tejido uterino, durante un periodo de 7 días, más típicamente una reducción de peso de 50% a 100% tras residir en el tejido durante un periodo de 4 días. Entre los ligantes biodesintegrables adecuados para la utilización en relación a la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, compuestos orgánicos biodesintegrables, tales como glicerina y polímeros biodesintegrables, o cualquier compuesto desintegrante conocido de la técnica farmacéutica.

En donde se utilicen, el agente o agentes ajustadores de la viscosidad se encuentran típicamente presentes en una cantidad eficaz para proporcionar a la formulación la viscosidad deseada, por ejemplo, convirtiendo la formulación en altamente viscosa, por ejemplo en una cantidad eficaz para proporcionar una viscosidad de entre aproximadamente 5.000 y 200.000 cps, más típicamente de entre aproximadamente 10.000 y 100.000 cps, y todavía más típicamente, entre aproximadamente 20.000 y 40.000 cps. Mediante la provisión de formulaciones que presentan viscosidades dentro de dichos intervalos, las formulaciones pueden inyectarse en tejidos, tales como tejido uterino, utilizando equipos de inyección convencionales (p.ej., jeringas). Sin embargo, debido a sus elevadas viscosidades, las formulaciones presentan una retención mejorada dentro del tejido en el sitio de inyección. La inyección del agente o agentes ajustadores de la viscosidad que se utiliza puede variar ampliamente. Comúnmente, la concentración total del agente o agentes ajustadores de la viscosidad es de entre aproximadamente 1% y 20% en peso. En muchas realizaciones, los agentes ajustadores de la viscosidad son polímeros, que pueden ser de origen natural o sintético y típicamente son biodesintegrables. Los polímeros también son típicamente solubles en agua y/o hidrofílicos. Sin embargo, en algunas realizaciones, por ejemplo en el caso de que se utilice un solvente orgánico, tal como dimetilsulfóxido (DMSO) como componente líquido, el agente ajustador de la viscosidad puede ser relativamente hidrofóbico. Entre los agentes ajustadores de la viscosidad poliméricos se incluyen homopolímeros, copolímeros y mezclas de polímeros.

Entre los ejemplos de agentes ajustadores de la viscosidad para la práctica de la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los siguientes: polímeros y copolímeros celulósicos, por ejemplo éteres de celulosa, tales como metilcelulosa (MC), hidroxetilcelulosa (HEC), hidroxipropilcelulosa (HPC), hidroxipropil-metilcelulosa (HPMC), metilhidroxietilcelulosa (MHEC), metilhidroxipropilcelulosa (MHPC), carboximetilcelulosa (CMC), y sus diversas sales, incluyendo, p.ej., la sal sódica, hidroxietilcarboximetilcelulosa (HECMC) y sus diversas sales, carboximetilhidroxietilcelulosa (CMHEC) y sus diversas sales, otros polisacáridos y derivados de polisacáridos, tales como almidón, hidroxietil-almidón (HES), dextrano, derivados de dextrano, quitosano y ácido algínico, y sus diversas sales, carragenano, diversas gomas, incluyendo goma xantana, goma guar, goma arábiga, goma karaya, goma ghatti, konjac y goma tragacanto, glucosaminoglicanos y proteoglicanos, tales como ácido hialurónico y sus sales, heparina, heparín sulfato, dermatán sulfato, proteínas tales como gelatina, colágeno, albúmina y fibrina; otros polímeros, por ejemplo, polímeros de carboxivinilo y sus sales (p.ej., carbómero), polivinilpirrolidona (PVP), ácido poliacrílico y sus sales, poliacrilamida, copolímero de ácido poliacrílico/acrilamida, óxidos de polialquileno, tales como óxido de polietileno, óxido de polipropileno y poli(óxido de etileno-óxido de propileno) (p.ej., ácido plurónico), polioxietileno (polietilenglicol), polietilenamina y polipirridina, poli-metafosfato (sales Kurrol), alcohol polivinílico, sales y copolímeros adicionales más allá de los específicamente indicados anteriormente, y mezclas de los anteriores (incluyendo mezclas de polímeros que contienen los mismos monómeros, aunque presentan diferentes pesos moleculares), y similares. Muchas de dichas especies también resultan útiles como ligantes.

En otras realizaciones de la invención, las formulaciones o portadores se entrecruzan, antes de la utilización o in vivo. El entrecruzamiento resulta ventajosa, por ejemplo, en que actúa mejorando la retención de la formulación (p.ej., al proporcionar un material más rígido/viscoso y/o haciendo que el polímero sea menos soluble en un medio particular). En donde la formulación se entrecruza in vivo, comúnmente se inyecta un agente entrecruzante en el tejido antes o después de la inyección de una formulación según la presente invención. Dependiendo de la naturaleza de la formulación y del agente entrecruzante, la formulación puede convertirse en, por ejemplo, un sólido, en un semisólido o en un líquido de alta viscosidad.

Entre los agentes entrecruzantes adecuados para la utilización en la presente invención se incluyen cualquier agente de entrecruzamiento no tóxico, incluyendo agentes entrecruzantes iónicos y covalentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se incluyen polímeros dentro de las formulaciones de la presente invención, que se entrecruzan iónicamente, por ejemplo con iones de metal polivalente. Entre los iones de entrecruzamiento adecuados se incluyen cationes polivalentes seleccionados del grupo que consiste en los cationes calcio, magnesio, bario, estroncio, boro, berilio, aluminio, hierro, cobre, cobalto, plomo y plata. Entre los aniones polivalentes se incluyen los aniones fosfato, citrato, borato, succinato, maleato, adipato y oxalato. Más ampliamente, los aniones entrecruzantes se derivan comúnmente de ácido orgánicos o inorgánicos polibásicos. El entrecruzamiento iónico puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos de la técnica, por ejemplo mediante la puesta en contacto de polimeros iónicamente entrecruzables con una solución acuosa que contiene iones disueltos.

En algunas realizaciones, se incluyen polímeros, que son covalentemente entrecruzables, por ejemplo utilizando un agente entrecruzante polifuncional que es reactivo con grupos funcionales en la estructura del polímero. El agente entrecruzante polifuncional puede ser cualquier compuesto que presenta por lo menos dos grupos funcionales que reaccionan con grupos funcionales en el polímero. Diversos polímeros indicados en la presente memoria pueden entrecruzarse tanto covalente como iónicamente.

Los polímeros adecuados para el entrecruzamiento iónico y/o covalente pueden seleccionarse de, por ejemplo, la lista no limitativa de los siguientes: poliacrilatos, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), poliacrilamidas, poli(N-alquilacrilamidas), óxidos de polialquileno, poli(óxido de etileno), óxido de polipropileno, poli(alcohol vinílico), poli(aromáticos de vinilo), poli(vinilpirrolidona), poli(etilenimina), poli(etilenamina), poliacrilonitrilo, poli(ácido vinilsulfónico), poliamidas, poli(L-lisina), poliuretanos hidrofílicos, polímeros de anhídrido maleico, proteínas, colágeno, polimeros celulósicos, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, dextrano, carboximetil-dextrano, dextrano modificado, alginatos, ácido algínico, ácido pectínico, ácido hialurónico, quitina, pululano, gelatina, gelano, xantano, carboximetilalmidón, hidroxietil-almidón, condroitín-sulfato, guar, almidón y sales, copolímeros, mezclas y derivados de los mismos.

En una realización preferente, la colagenasa se formula en forma de una composición inyectable liofilizada formulada con lactosa, sacarosa o cualquier azúcar adecuado. Una composición de colagenasa preferente es una composición inyectable liofilizada formulada con sacarosa, Tris a un nivel de pH de aproximadamente 8,0. Lo más preferentemente, se formula 1,0 mg de la sustancia de fármaco de la invención en sacarosa 60 mM, Tris 10 mM, a un pH de aproximadamente 8,0 (p.ej., aproximadamente 20,5 mg/ml de sacarosa y 1,21 mg/ml de Tris en el tampón de formulación).

Las composiciones de colagenasa preferentes para la utilización en la invención comprenden una mezcla de colagenasa I y colagenasa II presentan una actividad específica de por lo menos aproximadamente 700 unidades SRC/mg, tales como por lo menos aproximadamente 1000 unidades SRC/mg, más preferentemente por lo menos aproximadamente 1500 unidades SRC/mg. Una unidad SRC solubilizará el colágeno de cola de rata en material de reacción con ninhidrina equivalente a 1 nanomol de leucina por minuto a 25°C, pH 7,4. La colagenasa también se ha descrito en unidades ABC. Dicho ensayo de potencia de la colagenasa se basa en la digestión de colágeno no desnaturalizado (de tendón bovino) a pH 7,2 y 37°C durante 20 a 24 horas. El número de enlaces peptídicos cortados se mide mediante la reacción con ninhidrina. Se restan los grupos amino liberados en una digestión de tripsina de control. Una unidad ABC neta de colagenasa solubilizará material reactivo con ninhidrina equivalente a 1,09 nanomoles de leucina por minuto. Una unidad SRC es igual a aproximadamente 6,3 unidades ABC o a 18,5 unidades GPA. En una realización, cada miligramo de colagenasa por inyección contendrá aproximadamente 2800 unidades SRC.

Las dosis contempladas para la administración mediante inyección directa en el tejido de fibroma uterino variarán dependiendo del tamaño del tejido que debe tratarse y el criterio del médico responsable del tratamiento. Sin embargo, las dosis generalmente son de entre aproximadamente 0,06 mg de colagenasa y aproximadamente 1 mg de colagenasa por cm3 de tejido que debe tratarse o de entre aproximadamente 0,1 mg de colagenasa y aproximadamente 0,8 mg de colagenasa por cm3 de tejido que debe tratarse, o de entre aproximadamente 0,2 mg de colagenasa y aproximadamente 0,6 mg de colagenasa por cm3 de tejido que debe tratarse.

Las formulaciones que contienen un agente activo o medicación adicional también se encuentran contempladas. Entre los agentes adicionales opcionales que pueden incluirse en la formulación para la administración concomitante, simultánea o separada se incluyen, por ejemplo, cualquier farmacéutico conocido de la técnica para el encogimiento, tratamiento o eliminación de fibromas uterinos o sus síntomas, o para ayudar en la ejecución de los presentes métodos de tratamiento. Por ejemplo, uno o más agentes de tratamiento de fibroma, tales como inhibidores de aromatasa (p.ej., letrozol, anastrozol y exemestande), agonistas y moduladores de receptores de progesterona (p.ej., progesterona, progestinas, mifepristona, levonoergestrel, norgestrel, asoprisnilo, ulipristal y acetato de ulipristal, telepristona), moduladores selectivos de los receptores de estrógeno (SERM) (p.ej., benzopirano, benzotiofenos, cromano, indoles, naftalenos, compuestos tri-feniletileno, arzoxifeno, EM-652, CP 336.156, raloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno y tamoxifeno), análogos de hormona de liberación de gonadotrofina (GnRHa) (p.ej., péptidos agonistas de GnRH o análogos con alteraciones de D-aminoácidos en la posición 6 y/o sustituciones etilamida para Gly10-amida carboxi-terminal, tal como triptorelina o antagonistas de GnRH, tales como cetrorelix, ganirelix, degarelix y ozarelix), moduladores de factor de crecimiento (p.ej., anticuerpos neutralizantes de TGFb), acetato de leuprólido, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, inhibidores de la ruta de mTOR, inhibidores de la ruta de señalización de WNT, vitamina D, metabolitos de vitamina D, moduladores de vitamina D, y/o compuesto antifibrótico adicional (p.ej., pirfenidona y halofuginona) pueden coadministrarse con colagenasa en la misma administración o en administraciones separadas.

También pueden incluirse agentes de ablación química en las formulaciones de la presente invención. En cantidades eficaces, dichos compuestos causan la necrosis o encogimiento del tejido con la exposición. Puede utilizarse cualquier agente de ablación conocido según la técnica, en concentraciones apropiadas a las condiciones, evitando simultáneamente la inactivación de la colagenasa, en donde las cantidades utilizadas serán determinadas por el experto ordinario en la materia. Los intervalos de concentración típicos son de entre aproximadamente 1% y 95% en peso de agente de ablación, más típicamente de entre aproximadamente 5% y 80% en peso. Entre los agentes de ablación adecuados para la utilización con la invención se incluyen, aunque sin limitación, agentes generadores de estrés osmótico (p.ej., una sal, tal como cloruro sódico o cloruro potásico), compuestos orgánicos (p.ej., etanol), agentes básicos (p.ej., hidróxido sódico e hidróxido potásico), agentes ácidos (p.ej., ácido acético y ácido fórmico), enzimas (p.ej., hialuronidasa, pronasa y papaína), agentes generadores de radicales libres (p.ej., peróxido de hidrógeno y peróxido de potasio), agentes oxidantes (p.ej., hipoclorito sódico, peróxido de hidrógeno y peróxido de potasio), agentes fijadores de tejido (p.ej., formaldehído, acetaldehído o glutaraldehído) y/o coagulantes (p.ej., gengpin). Dichos agentes pueden combinarse con colagenasa en la misma formulación, con la condición de que no afecten negativamente a la actividad enzimática de la colagenasa, o pueden administrarse por separado, simultáneamente o en diferentes tiempos.

Los métodos relacionados con la invención pueden utilizarse junto con cualesquiera tratamientos conocidos para controlar los síntomas causados por los fibromas. Por ejemplo, pueden utilizarse AINE u otros analgésicos para reducir las menstruaciones dolorosas; pueden recetarse píldoras anticonceptivas orales para reducir el sangrado uterino y la complementación de hierro puede administrarse para tratar la anemia. Puede utilizarse un dispositivo intrauterino con levonorgestrel para reducir la hemorragia y otros síntomas en el caso de que el estado del útero no resulte en la expulsión del dispositivo.

La capacidad de obtener imágenes no invasivamente de zonas en las que se están introduciendo formulaciones de la presente invención y donde se han introducido es una herramienta diagnóstica valiosa para la práctica de la presente invención. Por lo tanto, además de un agente de tratamiento de fibromas uterinos y cualquiera de los diversos componentes opcionales comentados anteriormente, las formulaciones de fibroma uterino de la presente invención también pueden incluir opcionalmente uno o más agentes de contraste de imágenes para ayudar a guiar al médico clínico en la administración del compuesto de colagenasa en el fibroma o tejido que debe tratarse o para determinar que la administración se ha localizado correctamente. Entre las técnicas de obtención no invasiva de imágenes se incluyen las imágenes de resonancia magnética (IRM), las imágenes por ultrasonidos, la fluoroscopía de rayos X, la medicina nuclear, y otras. Cualquier agente de contraste adecuado para la utilización con dichas técnicas y conocido de la técnica puede utilizarse como parte de las composiciones y formulaciones inventivas.

Puede utilizarse cualquier tecnología de obtención de imágenes en tiempo real para guiar la inyección en la invención. Por ejemplo, la fluoroscopia basada en rayos X es una técnica de obtención de imágenes diagnósticas que permite la monitorización en tiempo real del movimiento del paciente dentro del mismo. Para que resulten fluoroscópicamente visibles, las formulaciones típicamente se vuelven más absorbentes de los rayos X que el tejido circundante. En diversas realizaciones de la invención, lo anterior se acompaña de la utilización de agentes de contraste. Entre los ejemplos de agentes de contraste en relación a la fluoroscopía de rayos X se incluyen metales, sales y óxidos metálicos (particularmente sales y óxidos de bismuto) y compuestos yodados. Entre los específicos más específicos de dichos agentes de contraste se incluyen tungsteno, platino, tántalo, iridio, oro u otros metales densos; sulfato de bario, subcarbonato de bismuto, trióxido de bismuto, oxicloruro de bismuto, metrizamida, lopamidol, yotalamato sódico, yodomida sódica y meglumina.

Las imágenes de ultrasonidos y de resonancia magnética pueden proporcionar imágenes bidimensionales y/o tridimensionales de una parte del cuerpo. Los ultrasonidos y la IRM resultan ventajosos, entre otras cosas porque no exponen al paciente o al médico a radiación perjudicial y pueden proporcionar imágenes detalladas de la zona observada. Dichas imágenes detalladas son ayudas diagnósticas valiosas para los médicos y pueden utilizarse para controlar con mayor precisión la cantidad y localización de las formulaciones de la presente invención.

Entre los agentes de contraste de imágenes por ultrasonidos adecuadas para la utilización en relación a la presente invención se incluyen partículas sólidas de entre aproximadamente 0,01 y 50 micrómetros en la dimensión más grande (p.ej., el diámetro, en el caso de que se utilicen partículas esféricas), más típicamente de entre 0,5 y 20 micrómetros. Pueden utilizarse tanto partículas inorgánicas como orgánicas. Entre los ejemplos se incluyen micropartículas/microesferas de carbonato cálcico, hidroxiapatito, sílice, poli(ácido láctico) y poli(ácido glicólico). También pueden utilizarse microburbujas como agentes de contraste de obtención de imágenes por ultrasonidos, tal como es conocido en la técnica de obtención de imágenes. Los agentes de contraste de imágenes por ultrasonidos para la utilización en relación a la presente invención preferentemente son biocompatibles y estables en la formulación. Las concentraciones de los agentes de contraste de imágenes por ultrasonidos típicamente se encuentran comprendidas entre aproximadamente 0,01% en peso y 10% en peso de la formulación, más típicamente entre aproximadamente 0,05% y 2% en peso, en el caso de que se utilicen partículas sólidas.

Para la IRM potenciada con contraste, un agente de contraste adecuado presenta un gran momento magnético, con un tiempo de relajación electrónica relativamente largo. Basándose en dichos criterios, pueden utilizarse agentes de contraste, tales como Gd(III), Mn(II) y Fe(III). El gadolinio (III) presenta el momento magnético más grande de entre estos tres y es, por lo tanto, una especie paramagnética ampliamente utilizada para potenciar el contraste en la IRM. También resultan adecuados quelatos de iones paramagnéticos, tales como Gd-DTPA (ion gadolinio quelado con el ligando ácido dietilén-triamina-pentaacético). Puede encontrarse más información en, por ejemplo, la solicitud de patente US n° 2003-0100830, titulada "Dispositivos médicos implantables o insertables visibles en imágenes de resonancia magnética".

Las formulaciones de colagenasa indicadas en la presente memoria preferentemente se inyectan en uno o más tumores de fibroma uterino individuales utilizando un canal de administración cóncavo, tal como una aguja o cánula cóncava. Por ejemplo, la administración puede llevarse a cabo utilizando una aguja asociada a una jeringa, cánula, catéter y similar convencional o especialmente diseñado. Puede utilizarse una fuente de aplicación de presión manual, mecánica, hidráulica, neumática o de otro tipo (p.ej., un émbolo de jeringa convencional, una bomba, un aerosol, etc.) para inyectar la formulación en el fibroma. Alternativamente, las formulaciones pueden administrarse durante la cirugía, por ejemplo mediante un trócar durante cirugía laparoscópica y durante el tratamiento histeroscópico.

Entre las vías de inyección se incluyen, por ejemplo, las vías transabdominal, transcervical y transvaginal. En el caso de que las formulaciones presenten atributos fluidos, el volumen de inyección variará según, por ejemplo, el tamaño del fibroma, el tipo y concentración del agente de tratamiento, y similares, y típicamente se encontrará comprendido entre 1,0 y 10,0 ml por inyección. De manera similar, en donde se utilicen formulaciones que presentan atributos sólidos (p.ej., pellets o polvos), la cantidad de formulación inyectada también dependerá, por ejemplo, del tamaño del fibroma, del tipo y concentración del agente de tratamiento utilizado, etc. Pueden administrarse múltiples pellets o dosis de composición de colagenasa en un único sitio de inyección. Con independencia de los atributos físicos de la formulación, pueden establecerse múltiples sitos de inyección dentro de un único fibroma, en donde el número de inyecciones dependerá del tamaño y forma del fibroma, así como del tipo y/o concentración del agente de tratamiento que se utilice. Pueden tratarse múltiples fibromas o un único fibroma.

En diversas realizaciones, el dispositivo de inyección se guía al sitio del fibroma bajo guía por imágenes. Entre las guías por imagen pueden incluirse, por ejemplo, la guía visual directa (p.ej., guía laparoscópica en procedimientos transabdominales y la guía histeroscópica en procedimientos transvaginales) y la guía visual no directa (p.ej., guía por ultrasonidos, guía fluoroscópica y/o guía por IRM).

A título de ejemplo específico, la guía visual del dispositivo de inyección se lleva a cabo laparoscópicamente utilizando una cámara que se posiciona en el abdomen (p.ej., mediante inserción a través de un trócar). De esta manera, un dispositivo (p.ej., una aguja o cánula de administración) puede insertarse por vía percutánea en el abdomen y guiarse bajo visión laparoscópica hasta el fibroma uterino. Una vez se ha alcanzado el fibroma, se utiliza preferentemente fluoroscopía, IRM o ultrasonidos (p.ej., ultrasonidos transvaginales, ultrasonidos transabdominales, ultrasonidos intraabdominales, etc.) para guiar la punta de la aguja de administración hasta una posición deseada dentro del fibroma, en cuyo punto se inyecta la formulación en el fibroma. En la medida en que hay suficiente contraste entre la formulación y el tejido circundante, también puede verse la localización de la formulación dentro del fibroma.

Las composiciones y procedimientos de la presente invención se entenderán mejor en relación a los ejemplos a continuación, que se proporcionan a título únicamente ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Producción general de colagenasa

Para preparar un banco celular de clostridios libre de materiales animales, se suspendieron células de Clostridium histolyticum en un medio que contenía una peptona vegetal y opcionalmente extracto de levadura. Por ejemplo, un método general para llevar a cabo lo anterior es el siguiente.

Tabla 2. Método general para producir un banco celular de Clostridium

Una vez se ha establecido el banco celular libre de materiales animales, las células pueden cultivarse o fermentarse en medios convenientes conocidos de la técnica, preferentemente en medio de origen no animal. El medio opcionalmente puede contener extracto de levadura. Son ejemplos no limitantes de dichos medios, M1, M2, M3 y M4, tal como se indican en la Tabla 3, a continuación. Además, ver la Tabla 4 para un ejemplo general no limitativo de las etapas del procedimiento de fermentación.

Tabla 3. Recetas de medios y preparación.

Tabla 4. Procedimiento de fermentación.

Tabla 4 (continuación)

Tras la preparación del "2° cultivo", la colagenasa I y la colagenasa II pueden aislarse y purificarse utilizando cualquier método capaz de producir cada enzima por separada hasta una pureza de por lo menos 95%. El método puede agrupar una o más de las etapas de precipitación con sulfato amónico, diálisis, cromatografía de hidroxiapatito (HA), filtración en gel e intercambio iónico, por ejemplo, preferentemente en ese orden. La filtración en gel es preferentemente filtración en gel G75. El intercambio de iones es preferentemente intercambio de aniones: Cromatografía de sefarosa Q. Además, en el caso de que se hayan cultivado clostridios en medio que contiene menos glucosa y más sales en comparación con la mayoría de cultivos bacterianos conocidos, tal como resulta preferente, no resultan necesarios los inhibidores de proteasa, tales como la leupeptina.

Ejemplo 2. Preparación de banco celular de clostridios libre de materiales animales.

El cultivo celular de inóculo era de Clostridium histolyticum ATCC 21000, cepa 004, que se creó originalmente con materiales derivados de bovinos. En primer lugar, las células se cultivaron en medio libre de materiales animales (M1, Tabla 3). Brevemente, la receta incluye: fitona 51,5 g, extracto de levadura 8,5 g y 1000 ml de agua. Se ajustó el pH a 7,30 con NaOH y se esterilizó el medio a 121°C durante 20 minutos. A continuación, se inoculó un mililitro del material de partida en 300 ml de M1 y se incubó durante 24 horas a 37°C (1° cultivo). Se transfirieron tres mililitros del 1° cultivo a 1000 ml de M1 y se incubaron durante 16 horas (2° cultivo). A continuación, el 2° cultivo se centrifugó asépticamente. El pellet se resuspendió en 5 ml de M1 con 5 ml de glicerol al 20%. Las alícuotas de suspensión celular se congelaron gradualmente y se almacenaron a -80°C.

Ejemplo 3. Procedimiento de fermentación.

Se inoculó Clostridium histolyticum ATCC 21000, cepa 004, en el cultivo de inóculo con M1 o M2 y se incubó a 37°C durante 16 horas. A continuación, diez mililitros del cultivo de inóculo (M1 o M2) y 10 ml de solución de Mg/vitaminas (preparada por separado mediante disolución de 8 g de MgSO4, 1,2 g de sulfato ferroso, 0,05 g de riboflavina, 0,1 g de niacina, 0,1 g de pantotenato cálcico, 0,1 g de ácido pimélico, 0,1 g de piridoxina y 0,1 g de tiamina en 1100 ml de agua, seguido de esterilización mediante filtración a través de 0,22 pm) se transfirieron a cada litro de M3 o M4 (o una variación de los mismos) y se incubó durante 22 horas. Clostridium histolyticum creció bien, alcanzando la DO600 > 2,5.

Ejemplo 4. Procedimiento general para el aislamiento y la purificación de la colagenasa I y la colagenasa II.

Tabla 5. Procedimiento ejemplar general no limitante de aislamiento y purificación de colagenasa I y colagenasa II.

Tabla 5 (continuación)

Ejemplo 5. Tratamiento ex vivo de tejido de fibroma uterino.

Se obtuvieron muestras de tejido de fibroma y miometrio post-histerectomía de mujeres con su consentimiento y se identificaron mediante evaluación por un patólogo quirúrgico. Las muestras de tejido se transportaron al laboratorio y se cortaron en cubos de 1 cm3. Ver la figura 2. En dichos cubos se inyectó colagenasa purificada (0,06 o 0,2 mg en 100 pl) disuelta en medio o suero y después se incubó durante 24, 48, 72 o 96 horas a 37°C. Ver la figura 3. Cada tratamiento se llevó a cabo en tejidos de tres pacientes diferentes con dos muestras de tejido por tratamiento debido a que el tejido de fibroma es extremadamente variable. En los cubos de fibroma de control y de miometrio se inyectó vehículo o se realizó una inyección simulada. Al final de la incubación, las muestras de tejido se fotografiaron para documentar la apariencia macroscópica. Se observó y documentó el grado de licuefacción y ablandamiento utilizando una escala subjetiva de 4 puntos.

Se congelaron las muestras para la evaluación biomecáncia (análisis de compresión). Las muestras se fijaron en formalina para la histología y tinción tricrómica de Masson y de rojo picrosirius. Se analizaron mediante microscopía óptica para la presencia o ausencia de colágeno y se evaluaron utilizando morfometría computerizada para determinar el grado de la degradación. En el caso de la tinción con rojo picrosirius, se llevó a cabo microscopía de luz polarizada para determinar la orientación de las fibras de colágeno. Las muestras se fijaron en glutaraldehído y se postfijaron con tetraóxido de osmio para la microscopía electrónica a fin de determinar la orientación de las fibrillas de colágeno y la evidencia de degradación de las mismas. Se llevaron a cabo inyecciones adicionales a una dosis de 0,58 mg/inyección (250 pl de 2,3 mg/ml).

Estos estudios ex vivo han demostrado la eficacia de la colagenasa purificada en el ablandamiento y licuefacción parcial de especímenes de fibroma post-histerectomía, así como una reducción del contenido de colágeno. Los especímenes de fibroma tratados eran macroscópicamente más blandos y presentaban centros parcialmente licuefactados. Las tinciones tricrómica de Masson y de rojo picrosirius de dichos tejidos mostraron una reducción subjetiva drástica del contenido de colágeno en comparación con el tejido de fibroma inyectado con vehículo.

Ejemplo 6. Tratamiento de fibromas uterinos enteros ex vivo.

Se obtuvo tejido donado de cuatro pacientes adultas de 18 años o más de edad que proporcionaron su consentimiento legal y que estaban planificando someterse al tratamiento definitivo para los fibromas mediante histerectomía. Tras la extirpación del espécimen de histerectomía, el útero fue observado macroscópicamente mediante procedimientos estándares por un patólogo quirúrgico. Se diseccionaron respecto del espécimen, fibromas completos (fibromas submucosales (contiguos al endometrio), intramurales (dentro del miometrio) y subserosos (contiguos a la membrana serosa uterina) o fibromas pedunculados (unidos a útero mediante un tallo) en caso de existir) de 1 a 4 cm (incluyendo la cápsula) junto con 1,5 cm del miometrio contiguo circundante y, en caso de encontrarse disponible, una sección de 0,5 cm de endometrio, y se introdujeron en solución salina normal.

Los tejidos se llevaron inmediatamente al laboratorio, se lavaron y se les inyectó colagenasa purificada de Clostridium histolyticum (PCHC) (0,1 mg/100 pl/cm3). Opcionalmente, se utilizó una concentración más elevada de la colagenasa para reducir el volumen de la inyección. Se diluyó la colagenasa purificada en 0,3 mg/ml de dihidrato de cloruro cálcico en cloruro sódico al 0,9%, opcionalmente combinada con azul de metileno al 1% como marcador a fin de evaluar visualmente la superficie de distribución del material inyectado dentro del fibroma y el útero. En los fibromas se inyectó PCHC o vehículo en el centro del espécimen obtenido. Ver las figuras 4A y 4B. La cantidad de colagenasa inyectada dependía del tamaño de los fibromas (1 a 4 cm). Generalmente, se inyectaron aproximadamente 818 pl de material en un fibroma con un diámetro de aproximadamente 2,5 cm. En el caso de que no resultase viable inyectar todo el volumen de tratamiento centralmente debido a la resistencia del tejido a la inyección u otros factores, se inyectaron múltiples localizaciones dentro del fibroma. A continuación, el tejido de fibroma se incubó en medio de cultivo DMEM/F12 a 37°C durante 24 horas. Por lo menos un fibroma con miometrio adherido sirvió de control. Dicho espécimen recibió una inyección de azul de metileno al 1% en vehículo sin colagenasa en forma de una inyección de placebo no aleatorizada, centralmente en el fibroma.

Se realizaron fotografías a color del útero y del fibroma y fragmentos miometrales antes y después de la inyección. Se midieron los diámetros de los fibromas con una regla métrica.

Al final de la incubación, se reevaluaron las muestras macroscópicamente para tamaño, consistencia y firmeza, y se obtuvieron fotografías a color, así como grabaciones opcionales de vídeo para registrar la distensibilidad manual de los fibromas y cualesquiera partes licuefactadas con el seccionado. Se observó y documentó el grado de licuefacción y ablandamiento utilizando una escala subjetiva de 4 puntos.

Se determinó si la colagenasa podía penetrar en la cápsula y afectar al miometrio proximal. Se obtuvieron muestras, que incluían tejido del fibroma inyectado y tejido contiguo, más una sección que incluía fibroma y miometrio contiguo y/o endometrio todavía adherido, y de miometrio solo. Las muestras se fijaron en formalina para la histología y tinciones tricrómica de Masson, rojo picrosirius y hematoxilina-eosina. Las muestras se analizaron mediante microscopía óptica para la presencia o ausencia de colágeno y se evaluaron utilizando morfometría computerizada para determinar el grado de la degradación. Se utilizó la tinción con rojo picrosirius mediante microscopia óptica polarizada para determinar la orientación de las fibras de colágeno.

Esquemas de tratamiento ejemplares para cada paciente:

fibroide 1: inyección de 818 pl de colagenasa 1 mg/ml;

fibroide 2: inyección de 818 pl de colagenasa 1 mg/ml;

fibroide 3: inyección de 818 pl de vehículo de control.

Las inyecciones se realizaron a través de la cápsula del fibroma en el centro del mismo, a través del miometro hasta el centro del fibroma, o a través del endometrio hasta el centro del fibroma, simulando las vías de inyección in vivo. Los fibromas se licuefactaron de la misma manera que se ha mostrado en la figura 5 (ver posteriormente).

Ejemplo 7. Evaluación bioquímica de fibromas uterinos humanos tras la inyección de colagenasa clostridial purificada.

Las dos colagenasas aisladas a partir de Clostridium histolyticum (ABC I y ABC II) se agruparon en una proporción en masas de 1:1. Ambas colagenasas son metaloproteasas y presentan una amplia reactividad hidrolizante y degradan los colágenos de tipos I y III. Las propiedades biomecánicas del tejido del fibroma uterino se analizaron mediante reometría en especímenes de control y tratados con colagenasa.

Se ha mostrado que los fibromas uterinos contienen aproximadamente 70% de colágeno de tipo I en comparación con aproximadamente 80% en el miometrio; aproximadamente 28% de colágeno de tipo III en comparación con aproximadamente 20% en el miometrio y aproximadamente 5% de colágeno de tipo V en comparación con aproximadamente 2% en el miometrio. El tipo I/III es más escaso en el centro y el borde de los fibromas que en el miometrio. (Feng et al.,

Se obtuvo tejido de fibroma después la cirugía (histerectomía o miomectomía) de 4 pacientes diferentes y se cortó en cubos (1 cm3, n=43). En los cubos de tejido se inyectaron en el centro 100 pl de colagenasa purificada (0, 0,25, 0,5, 1,0 y 2,0 mg/ml, n=4 a 14 por dosis) y se incubaron a 37°C durante 24, 48 o 96 horas. Al final de periodo de incubación, los cubos se cortaron por la mitad y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Se observaron los diferentes grados de ablandamiento y licuefacción en el centro. Se utilizó un reómetro AR-G2 para medir la rigidez de la muestra dinámicamente (módulo de cizallamiento complejo (Pa) a 10 rad/s), considerando tanto el comportamiento viscoso como el comportamiento elástico del material. Se midieron por lo menos 2 especímenes (punzón de 5 mm de diámetro) de cada cubo de tejido. Los datos se analizaron mediante ANOVA de dos direcciones y pruebas de comparaciones múltiples de Dunnett.

Globalmente, la rigidez en los cubos de fibroma de control (6585 ± 707 Pa; n=13) era superior a la de los cubos tratados (2003 ± 275 Pa; n=30; p < 0,0001). Más específicamente, la rigidez en los tejidos de fibroma se redujo de una manera dependiente del tiempo y de la dosis. A las 48 horas, el tratamiento con 0,25 mg/ml no redujo la rigidez (5032 ± 1796 Pa), aunque el tratamiento con 0,5 mg/ml sí lo hizo (2014 ± 1331 Pa; p < 0,05). A las 96 horas, tanto la dosis de 0,25 como la dosis de 0,5 resultó eficaz (1720 ± 377 y 1072 ± 160 Pa; p < 0,01). Los tratamientos de 1,0 y 2,0 mg/ml redujeron la rigidez a las 24 horas, aunque no significativamente (2177 ± 37 y 2480 ± 984 Pa; n=4). Sin embargo, las dosis de 1,0 y 2,0 mg/ml resultaron eficaces a las 48 horas (3588 ± 637; p < 0,05 y 1254 ± 445 Pa; p < 0,01; n=6) y a las 96 horas (921 ± 305 y 1350 ± 571 Pa; p < 0,0001; n=10).

Mediante la utilización de un reómetro torsional, se cuantificó la rigidez del tejido en un intervalo amplio (muy firme a licuefactado). Los datos de los presentes inventores indican que el tratamiento del tejido de fibroma con dosis definidas de colagenasa clostridial purificada redujo significativamente la rigidez (módulo) del tejido. Ver la figura 5, que muestra la colagenolisis en el tejido de fibroma tras una incubación de 48 horas. La fotografía izquierda es tejido en el que se ha inyectado vehículo (control), y la fotografía derecha es tejido en el que se ha inyectado colagenasa.

Ejemplo 8. Tratamiento de fibromas uterinos humanos en un modelo de ratón desnudo.

El modelo de ratón de xenoinjerto, en el que se implantaron cultivos organotípicos tridimensionales de células de fibroma uterino humano bajo la piel de ratones desnudos hembra, se ha utilizado con éxito para estudiar queloides, un trastorno fibrótico de la piel con biología similar a la de los fibromas. Dicho modelo se utilizó para demostrar los efectos de la inyección de PCHC, en una formulación de nanoportador de HPG, sobre el tejido de fibroma in vivo.

Las esponjas de ácido poliláctico, otros andamiajes de ácido poliláctico sintéticos o cualquier andamiaje disponible comercialmente adecuado se inoculan con células de fibroma uterino humano para producir un cultivo 3-D organotípico de células de fibroma uterino que pueden implantarse en ratones desnudos. Dichos cultivos organotípicos tridimensionales (fibromas 3D) son representativos de fibromas humanos y producen y contienen matriz extracelular.

Las esponjas OPLA (por sus siglas en inglés, ácido poliláctico de celda abierta, BD Biosciences, figura 6) son andamiajes de polímero sintético que se sintetizan a partir de ácido D,D-L,L-poliláctico. Dicho material presenta una arquitectura de facetas que resulta eficaz para cultivar suspensiones celulares de alta densidad. Las células se siembran en andamiajes de tipo esponja 3D bajo condiciones dinámicas, conduciendo a una población celular uniforme en toda la esponja y un número celular más elevado por esponja que la siembra estática. Después de la esterilización, el peso molecular de OPLA es de 100 a 135 kD. Presentan un tamaño aproximado de 5 mm x 3 mm (0,04 cm3), con un tamaño medio de poro de 100 a 200 pm.

Las celdas y andamiajes se introducen en cámaras de cultivo celular de un biorreactor que consiste en una cámara giratoria llena de líquido (medio de cultivo) que permite la flotación constante de las células, minimizando simultáneamente las fuerzas de cizalla y la sedimentación por gravedad de las células y/o andamiajes (Synthecon, Inc.). Las células dentro de la cámara biorreactora giratoria se suspenden en ingravidez virtual.

Las células de fibroma humano primario de especímenes obtenidos en la histerectomía se siembran estática o dinámicamente en esponjas de OPLA y se cultivan durante 30 días para permitir la producción y ensamblaje de matriz extracelular. Las células crecen en todo el andamiaje y pueden fijarse con formalina, incluirse en parafina y cortarse en secciones delgadas para la observación, opcionalmente con tinción para marcadores múltiples. Ver la figura 7, que muestra la formación de la red de células siguiendo los contornos del andamiaje de tipo esponja.

La figura 8 muestra cultivos primarios de células de fibroma tras la siembra estática. Las células se fijan en el andamiaje y se observan in situ. Los andamiajes que contenían células se fijaron y se dejaron sin teñir (figura 8A) o se tiñeron para actina F con faloidina fluorescente (figura 8B). Las células se encontraban uniformemente distribuidas en todo el andamiaje. Los andamiajes en las imágenes eran de >1 mm de grosor y, por lo tanto, no todas las células se encuentran enfocadas, lo que indica que las células están creciendo no sólo sobre la superficie, sino también profundamente dentro de los andamiajes. La figura 9 muestra la población de células en la totalidad de los andamiajes de tipo esponja mediante microscopía confocal (figuras 9A y 9B).

Se extrajo ARN de alta calidad a partir de los cultivos 3D de células de fibroma sobre esponjas de OPLA y se utilizó para verificar la expresión de dos genes de interés. Es conocido que versican y TGFp3 se expresan a nivel elevado en el tejido y células de los fibromas. Los resultados en la Tabla 6 muestran que tanto una línea celular de fibroma como cultivos primarios de células de fibroma en dicho sistema de cultivo 3D expresan dichos dos genes en cantidades elevadas.

Tabla 6. Resultados de ensayo de PCR en tiempo real.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   i. Formulación para la utilización en el tratamiento de fibromas uterinos, comprendiendo dicha formulación colagenasa de Clostridium histolyticum como agente de tratamiento de fibromas uterinos en una cantidad eficaz para causar el encogimiento de los fibromas uterinos; en la que la formulación se administra en el paciente mediante inyección en un fibroma uterino a una dosis de hasta 1 mg de colagenasa por cada 1 cm3 de tejido de fibroma uterino.
2. 2. Formulación para la utilización según la reivindicación 1, en la que la colagenasa es una mezcla de colagenasa I y colagenasa II.
3. 3. Formulación para la utilización según la reivindicación 2, en la que la colagenasa I y la colagenasa II se encuentran presentes en una proporción de masas de 0,5 a 1,5.
4. 4. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que se administran entre 0,06 mg y aproximadamente 1 mg de colagenasa por cm3 de tejido que debe tratarse; preferentemente entre 0,1 mg y 0,8 mg de colagenasa por cm3 de tejido; más preferentemente, 0,2 mg a 0,6 mg de colagenasa por cm3 de tejido.
5. 5. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha formulación se inyecta en dicho fibroma transabdominal o transvaginalmente.
6. 6. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha formulación se inyecta en dicho fibroma bajo guía por imágenes.
7. 7. Formulación para la utilización según la reivindicación 6, en la que dicha imagen es por lo menos una de entre una imagen visual directa, preferentemente una imagen de cámara, y una imagen visual no directa, preferentemente una imagen de IRM, una imagen por ultrasonidos o una imagen fluoroscópica.
8. 8. Formulación para la utilización según la reivindicación 7, en la que dicha formulación comprende un agente de contraste de IRM, un agente de contraste de ultrasonidos o un agente de contraste de rayos X.
9. 9. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha formulación comprende además un agente de ablación química, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, un anticonceptivo oral, un agonista de GnRH, un antiprogestógeno o un modulador selectivo de receptor de progesterona.
10. 10. Formulación para la utilización según la reivindicación 9, en la que dicho agente de ablación química es una sal o se selecciona de entre un enzima, un ácido, una base o un agente oxidante.
11. 11. Formulación para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha formulación comprende una pluralidad de diferentes agentes de tratamiento de fibroma uterino.
12. 12. Formulación para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha formulación es una forma de dosis que presenta una dimensión máxima de entre 1 mm y 20 mm.
13. 13. Formulación para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha formulación se administra a través de un canal cóncavo en el interior de dicho fibroma.
14. 14. Formulación para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha formulación está encapsulada o son unos polvos.
15. 15. Formulación para la utilización según la reivindicación 14, en la que dichos polvos se introducen en dicho fibroma mediante inyección de chorro.
16. 16. Formulación para la utilización según la reivindicación 1, en la que se encuentra presente un agente ajustador de la viscosidad en una cantidad eficaz para proporcionar una viscosidad comprendida entre 10.000 cps y 50.000 cps.
17. 17. Formulación para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha formulación es iónicamente entrecruzable in vivo.
18. 18. Formulación para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha formulación comprende un polímero de alginato o gelatina.