CN109355222B - 对水稻白叶枯病菌具有拮抗作用的芽孢杆菌及分离与应用 - Google Patents

对水稻白叶枯病菌具有拮抗作用的芽孢杆菌及分离与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对水稻白叶枯病菌具有拮抗作用的芽孢杆菌及分离与应用。该菌株在中国典型培养物保藏中心(武汉)的保藏编号为CCTCC NO:M 2018573。该菌株分离自我国福建省三明市采集的大白菜根际土壤。该菌株在培养基上可以对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)呈现广谱抑菌效果，对香蕉细菌性青枯病菌(X.campestris pv.musacearum)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、核桃黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)共4种病原细菌也具有一定抑菌能力，因而对防治水稻白叶枯病菌和条斑病有潜在的价值。

Description

对水稻白叶枯病菌具有拮抗作用的芽孢杆菌及分离与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及一株对水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae,Xoo)具有显著拮抗作用的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)及其分离方法与应用。
背景技术
水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)的两个致病变种，水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola，Xoc)，可分别引起水稻白叶枯病(Bacterial leaf blight,BLB)和水稻条斑病(Bacterial leaf streak,BLS)。水稻白叶枯病是三大水稻灾害之一，也是亚洲稻区水稻的主要病害之一。该病在日本、印度、菲律宾、印度尼西亚和泰国等高产水稻的东亚和东南亚国家和地区均有分布，同时也对我国除新疆和东北北部以外的稻区水稻产量和粮食安全造成威胁(沈颖，王华弟.叶建人，等.水稻白叶枯病发生流行动态与防治技术研究[J].浙江农业科学，2016，57(4)：600-603.)。水稻细菌性条斑病是水稻生产中一种重要的检疫性病害，在亚热带稻区分布广泛。该病具有传播速度快，传播途径多的传播特征(臧继贞,厉洪俭.水稻细菌性条斑病的综合防控措施[J].安徽农学通报,2008,(7):204,67.DOI:10.3969/j.issn.1007-7731.2008.07.101.)。因此，在适宜的气候条件下，该病可严重影响我国南方稻区的水稻产量(张荣胜,刘永锋,陈志谊.水稻细菌性条斑病菌拮抗细菌的筛选、评价与应用研究[J].中国生物防治学报,2011,27(04):510-514.)。
生物防治是指利用一种或多种微生物来抑制病原菌生命活力和繁殖能力的病害防治方法(李兴龙,李彦忠.土传病害生物防治研究进展[J].草业学报,2015,24(03):204-212.)。目前在生产上应用较多的生防微生物有芽孢杆菌属(Bacillus)、木霉菌(Trichoderma)、链霉菌属(Streptonyces)。目前防治水稻条斑病主要使用化学杀虫剂，但长期使用化学杀虫剂将导致病原菌耐药性逐年增强，同时还存在生态环境、食品安全等方面的风险。与依赖化学农药的传统防治方法相比，生物防治方法，具有环境污染小、成本低、效率高、无药物残留等明显优点。因此,利用拮抗菌防治水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病有巨大的应用前景。
芽孢杆菌(Bacillus)，是一种具有鞭毛，大多数运动性较强，可产芽孢，抗逆性较高的一类微生物，可用于生物防治作用。生防芽孢杆菌可通过营养和空间位点竞争、抗菌物质产生、溶菌作用、诱导植物抗病性等途径控制植物病害、直接或间接促进植物生长，有对人畜安全、环境相容性好、植物病原菌不易产生抗性、促进植物生长等优点(陈志谊,刘永峰,刘邮洲,张荣胜.植物病害生防芽孢杆菌研究进展[J].江苏农业学报,2012,28(05):999-1006.)。对于芽孢杆菌在防治稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)方面的应用，国内也已展开广泛研究。林东等于2001年表明发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SO113的分泌蛋白对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)表现出良好的广谱抗性以及丰富的抗菌活性峰(林东,徐庆,刘忆舟,等.枯草芽孢杆菌SO113分泌蛋白的抑菌作用及抗菌蛋白的分离纯化[J].农业生物技术学报,2001,(1):77-80.DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2001.01.018.)。张荣胜等于2011年筛选出了一株对水稻条斑病具有显著防效的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(张荣胜.水稻细菌性条斑病菌遗传多样性研究与生防菌剂研发[D].南京农业大学,2012.)。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一株对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)具有显著拮抗作用的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)及其分离方法与应用。
本发明所述的芽孢杆菌对黄单胞菌有显著抑制作用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一株芽孢杆菌，该芽孢杆菌菌株已于2018年8月29日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，样品名称为溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)512，保藏编号为CCTCC No:M 2018573。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心。
进一步的，所述芽孢杆菌对水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)有广谱性抑制作用。
进一步的，所述芽孢杆菌能够拮抗香蕉细菌性青枯病菌(X.campestrispv.musacearum)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、核桃黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)3种病原黄单胞菌。
进一步的，所述芽孢杆菌能够拮抗番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)。
进一步的，所述芽孢杆菌具有下述性质：
1.形态特征
在肉汤琼脂培养基28℃培养2天后，用光学显微镜和电子显微镜进行观察，长3-5μm，宽1μm以上，呈杆状，革兰氏阳性，产芽孢；
2.培养特征
在NA培养基上28℃培养24小时后，菌落呈乳白色，不透明，表面突起，边缘圆整；
3.生理生化特征
所述芽孢杆菌的生理生化特征为：能够分泌精氨酸双水解酶和明胶酶，不能水解脲酶和β-半乳糖甙酶；能够利用柠檬酸钠、硫代硫酸钠；能够同化葡萄糖、苦杏仁苷，不能同化甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、密二糖、阿拉伯糖；能够利用包括核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰-葡糖胺在内的13种碳源。
4菌种鉴定结果
通过生理生化测定和16S rRNA基因序列分析，显示其属于芽孢杆菌属(Bacillus)，但不能准确鉴定到种，然后利用其gyrB基因测序、BLAST分析结果建立gyrB进化树，最终将芽孢杆菌512鉴定为蜡样芽孢杆菌，样品名称为Bacillus proteolyticus512。
本发明还提供所述芽孢杆菌的分离方法，首次从福建省三明市大白菜根际采集土壤，然后制成土壤菌悬液原液，稀释后涂布于含有水稻条斑病菌RS105的NA平板上培养，分离出拮抗菌，然后对拮抗菌进行纯化与保存，再筛选出抑菌效果好的拮抗菌。
本发明还提供所述芽孢杆菌的应用，首先，所述芽孢杆菌作为对水稻条斑病菌和水稻白叶枯病菌均具有广谱的抑菌活性的拮抗菌的应用。即所述芽孢杆菌作为水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)拮抗菌的作用。
所述水稻白叶枯病菌包括：YN04-1、YC18、PXO99A、YC11、AH1、YC7、XZ35、LYG46、YC2、8569、JL1、JL4、JL3、YC6；
所述水稻条斑病菌包括：HANB1-19、YNB01-3、RS85、AHB1-58、HANB12-26、ZJB01-25、RSGD10、JSB1-39、HNB07-3、JSB3-28、HNB3-17、AHB3-7、YNB0-17、HNB8-47、RS105。
本发明还提供所述芽孢杆菌的应用，菌作为香蕉细菌性青枯病菌(X.campestrispv.musacearum)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、核桃黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)的拮抗菌的应用。
所述芽孢杆菌对香蕉细菌性青枯病菌(X.campestris pv.musacearum)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、核桃黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)有一定拮抗作用。
本发明还提供所述芽孢杆菌的应用，所述芽孢杆菌作为棉花细菌性角斑病菌(X.campestris pv.malvacearum)、菜豆细菌性疫病菌(X.campestris pv.phaseoli)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodis pv.vignicola)、大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)、洋葱细菌性叶枯病菌(X.axonopodispv.allii)的拮抗菌的应用。
其中本发明所述芽孢杆菌对棉花细菌性角斑病菌(X.campestrispv.malvacearum)、菜豆细菌性疫病菌(X.campestris pv.phaseoli)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodis pv.vignicola)、大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)、洋葱细菌性叶枯病菌(X.axonopodis pv.allii)有微弱拮抗作用。
与现有技术相比，本发明为防治水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)提供了一种新的思路。本发明提供的芽孢杆菌对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)呈现广谱抑菌效果，对香蕉细菌性青枯病菌(X.campestris pv.musacearum)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、核桃黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)共4种病原黄单胞菌也具有一定抑菌能力，因而对防治水稻白叶枯病菌和条斑病有潜在的价值。
附图说明
图1.芽孢杆菌512的显微镜(1000X)观察照片及菌落形态。
图2.芽孢杆菌512基于16S rRNA基因构建的系统发育树。
图3.芽孢杆菌512的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
其中M代表Marker；1代表16S rRNA基因产物。
图4.芽孢杆菌512的gyrB基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
左1孔为Marker；左2为送检菌株。
图5.芽孢杆菌512基于gyrB基因构建的系统发育树。
图6.芽孢杆菌512对15种不同的水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola,Xoc)：A-O依次为HANB1-19、YNB01-3、RS85、AHB1-58、HANB12-26、ZJB01-25、RSGD10、JSB1-39、HNB07-3、JSB3-28、HNB3-17、AHB3-7、YNB0-17、HNB8-47、RS105的拮抗效果图。
图7.芽孢杆菌512对14种不同的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)：A-N依次为YN04-1、YC18、PXO99A、YC11、AH1、YC7、XZ35、LYG46、YC2、8569、JL1、JL4、JL3、YC6的拮抗效果图。
图8.A-J依次为芽孢杆菌512对香蕉细菌性青枯病菌(X.campestrispv.musacearum)、棉花细菌性角斑病菌(X.campestris pv.malvacearum)、大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、菜豆细菌性疫病菌(X.campestris pv.phaseoli)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodis pv.vignicola)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)、洋葱细菌性叶枯病菌(X.axonopodispv.allii)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、核桃黑斑病菌(X.campestrispv.juglandis)的拮抗效果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中所用的菌种培养基如下：
牛肉膏蛋白胨培养基NA(g/L)：牛肉浸膏3g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，酵母粉1g，琼脂粉15g，加入水溶解，最后定容至1000mL，调节pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌(121℃、20min)。
实施例1：芽孢杆菌的获得
1、土壤来源
福建省三明市大白菜根际土壤。
2、菌株的筛选
(1)拮抗菌分离
采用平板稀释法：称取10g上述福建省三明市的大白菜根际土样于无菌锥形瓶中，加入90mL无菌水，于200rpm、28℃摇床中振荡15min，然后室温静置5min，制成土壤菌悬液原液。吸取土壤菌悬液原液上清液于离心管中，进行梯度稀释，分别得到100、10-1、10-2、10-3、10-4共5个梯度的菌悬液稀释液，每个梯度各取200μL均匀涂布于含有水稻条斑病菌RS105的NA平板上。将平板倒置于28℃恒温培养箱，培养24h后，观察是否形成抑菌圈。
(2)拮抗菌纯化与保存
纯化：取具有抑菌圈的单菌落，采用平板划线法纯化，编号保存。
短期保存：将接种在NA平板上，于4℃冰箱中暂时保存。
长期保存：将菌株接种在液体NA培养基中，28℃、200rpm摇床中培养12h后，取1mL菌液于2mL保菌管中，与1mL 50％的无菌甘油混匀，置于-80℃长期保存。
(3)拮抗菌的筛选
采用滤纸片法，以Xoc RS105为指示菌，对待测菌株进行抑菌圈实验：将XocRS 105和待测菌朱分别接种于NA液体培养基中，28℃、200rpm摇床中振荡培养6-10h；取200μL XocRS 105菌悬液与NA固体培养基均匀混合，制作含RS105的培养基。取滤纸片贴在培养基表面，在滤纸片上滴加5μL待测菌株菌悬液，每种待测菌株重复实验三次。将平板倒置于28℃恒温培养箱，培养24-48h后观察滤纸片周围是否出现抑菌圈，记录出现抑菌圈的菌株编号和对应的抑菌圈大小，从中筛选抑菌效果明显的菌株进行进一步实验。
筛选抑菌效果明显的菌株即为芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)512。
芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)512在琼脂培养基28℃培养2天后，用光学显微镜和电子显微镜进行观察，如图1所示，长3-5μm，宽1μm以上，呈杆状，革兰氏阳性，产芽孢。在NA培养基上28℃培养24小时后，菌落呈乳白色，不透明，表面突起，边缘圆整。
实施例2：芽孢杆菌的鉴定
1.16S rRNA基因鉴定
提取细菌基因组DNA。以总DNA为模板，利用特异引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')/1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')扩增16S rRNA基因。本实验采用的50μL的反应体系如下表：
表1 Taq聚合酶链式反应体系
Figure GDA0002412625250000091
PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸8min。反应结束后，PCR产物均通过1％琼脂糖凝胶电泳检验，利用凝胶成像仪检测并记录结果(见附图3)。PCR产物送铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序。根据获得16S rRNA序列(见序列1)，在GenBank中Blast搜索同源序列。根据16S rRNA基因序列比对结果以Marinococcus halophilus DSM 20408(X90835.1)为外枝构建Neighbor-Joining系统发育树(见附图2)。
2.生理生化鉴定
本发明的芽孢杆菌的生理生化特征为：能够分泌精氨酸双水解酶和明胶酶，不能分泌脲酶和β-半乳糖甙酶；能够利用柠檬酸钠、硫代硫酸钠；能够同化葡萄糖、苦杏仁苷，不能同化甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、密二糖、阿拉伯糖；能够利用核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰-葡糖胺等13种碳源，见表2和表3。
表2菌株512生理生化特性–酶活、碳源氧化
Figure GDA0002412625250000092
Figure GDA0002412625250000101
+：阳性反应；-：阴性反应；
表3菌株512生理生化特性—利用碳源产酸
Figure GDA0002412625250000111
Figure GDA0002412625250000121
+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
3.gyrB基因测定
(1)细菌提取DNA
选择新鲜的细菌斜面培养物，用巴氏管向其中加入ddH2O约1mL，刮取少量菌体至1.5mL的EP管中，12000rpm离心2min，去上清；加入100μL ddH2O重悬，12000rpm离心2min，去上清；重复上一步骤，即加入100μL ddH2O重悬，12000rpm离心2min，去上清；向1.5mL的EP管中加入适量ddH2O，加入玻璃珠，震荡破碎1min，然后将EP管放入沸水中煮沸10min；将EP管置于冷水中冷却，取出EP管，12000rpm离心2min，取上清作PCR模板备用。
(2)PCR反应
PCR反应体系：
表4 gyrB基因扩增PCR体系
Figure GDA0002412625250000122
反应条件：94℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30cycles；72℃10min，10℃∞。
引物序列：
表5 gyrB基因测序PCR引物序列
Figure GDA0002412625250000131
芽孢杆菌512的gyrB基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图4所示。芽孢杆菌512基于gyrB基因构建的系统发育树如图5所示。
(3)测序
PCR扩增产物的测序同16S rRNA测序方式。所得基因序列见序列表序列2。
实施例3.抑菌谱测定
将病原菌和供试芽孢杆菌分别接种于NA液体培养基中，于28℃、200rpm摇床中培养10-16h；每种病原菌分别吸取200μL菌悬液与NA固体培养基充分混匀，倒板；在NA平板中心放置外径约8mm的牛津杯，牛津杯中加入15μL芽孢杆菌菌悬液，于28℃生化培养箱中培养48-96h，每种病原菌进行三次重复实验，观察、记录抑菌圈大小，并进行抑菌率计算。抑菌率＝(抑菌圈直径-牛津杯直径)/抑菌圈直径*100％。
芽孢杆菌512对15种不同的水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)的拮抗效果图如图6所示。
芽孢杆菌512对14种不同的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的拮抗效果图如图7所示。
芽孢杆菌512对香蕉细菌性青枯病菌(X.campestris pv.musacearum)、棉花细菌性角斑病菌(X.campestris pv.malvacearum)、大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、菜豆细菌性疫病菌(X.campestris pv.phaseoli)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodis pv.vignicola)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)、洋葱细菌性叶枯病菌(X.axonopodis pv.allii)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、核桃黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)的拮抗效果图如图8所示。
芽孢杆菌对不同水稻条斑病菌的抑菌效果数据如表6所示，芽孢杆菌对不同水稻白叶枯病菌的抑菌效果数据如表7所示，芽孢杆菌对不同植物致病黄单胞菌的抑菌效果数据如表8所示。
表6芽孢杆菌对不同水稻条斑病菌的抑菌效果
Figure GDA0002412625250000141
表7芽孢杆菌对不同水稻白叶枯病菌的抑菌效果
Figure GDA0002412625250000151
表8芽孢杆菌对不同植物致病黄单胞菌的抑菌效果
Figure GDA0002412625250000152
Figure GDA0002412625250000161
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 对水稻白叶枯病菌具有拮抗作用的芽孢杆菌及分离与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
aatacatgca agtcgagcga atggattaag agcttgctct tatgaagtta gcggcggacg 60
ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcccata agactgggat aactccggga aaccggggct 120
aataccggat aacattttga actgcatggt tcgaaattga aaggcggctt cggctgtcac 180
ttatggatgg acccgcgtcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg 240
atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc 360
gcgtgagtga tgaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaagtgcta 420
gttgaataag ctggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg taaagcgcgc 540
gcaggtggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag ggtcattgga 600
aactgggaga cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagagatatg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct ggtctgtaac tgacactgag 720
gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctga agttaacgca ttaagcactc 840
cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960
tctgaaaacc ctagagatag ggcttctcct tcgggagcag agtgacaggt ggtgcatggt 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080
cttagttgcc atcattaagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140
ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200
ggacggtaca aagagctgca agaccgcgag gtggagctaa tctcataaaa ccgttctcag 1260
ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320
gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380
ttgtaacacc cgaagtcggt ggggtaacct ttttggagcc agccgcc 1427
<210> 1
<211> 368
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
tattggtgac cccgatcaaa caggaacaat aactcgattt aaaccagatc cggaaatttt 60
ccaagaaaca acagtatacg attttgatac gctagcaact cgtatgcgtg aattagcgtt 120
tttaaatcgt aatattaaat taacaattga agataaacgt gaacataagc aaaagaaaga 180
attccattac gaaggtggaa ttaaatcata cgttgagcat ttaaatcgct caaaacaacc 240
gattcatgaa gagcctgtgt acgtagaagg ttcaaaagat ggtattcagg ttgaggtttc 300
tcttcaatat aacgagggat acacaaataa tatttactca tttacgaata acatcataac 360
gtatgaaa 368

Claims (9)

1.一株芽孢杆菌，其特征在于，该芽孢杆菌菌株已于2018年8月29日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，样品名称为溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)512，保藏编号为CCTCC No:M 2018573。
2.根据权利要求1所述芽孢杆菌，其特征在于，其对水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)有广谱性抑制作用。
3.根据权利要求1所述芽孢杆菌，其特征在于，其能够拮抗香蕉细菌性青枯病菌(X.campestris pv.musacearum)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、核桃黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)4种病原黄单胞菌。
4.根据权利要求1所述芽孢杆菌，其特征在于，其对水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)有广谱性抑制作用的同时，还能够拮抗香蕉细菌性青枯病菌(X.campestrispv.musacearum)、辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、核桃黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)4种病原黄单胞菌。
5.根据权利要求1所述芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌具有下述性质：
1.形态特征
在肉汤琼脂培养基28℃培养2天后，用光学显微镜和电子显微镜进行观察，长3-5μm，宽1μm以上，呈杆状，革兰氏阳性，产芽孢；
2.培养特征
在NA培养基上28℃培养24小时后，菌落呈乳白色，不透明，表面突起，边缘圆整；
3.生理生化特征
所述芽孢杆菌的生理生化特征为：能够分泌精氨酸双水解酶和明胶酶，不能水解脲酶和β-半乳糖甙酶；能够利用柠檬酸钠、硫代硫酸钠；能够同化葡萄糖、苦杏仁苷，不能同化甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、密二糖、阿拉伯糖；能够利用包括核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰-葡糖胺在内的碳源。
6.如权利要求1-5中任一项所述芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌作为对水稻条斑病菌和水稻白叶枯病菌均具有广谱的抑菌活性的拮抗菌的应用。
7.如权利要求6所述芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述水稻白叶枯病菌包括：YN04-1、YC18、PXO99A、YC11、AH1、YC7、XZ35、LYG46、YC2、8569、JL1、JL4、JL3、YC6；
所述水稻条斑病菌包括：HANB1-19、YNB01-3、RS85、AHB1-58、HANB12-26、ZJB01-25、RSGD10、JSB1-39、HNB07-3、JSB3-28、HNB3-17、AHB3-7、YNB0-17、HNB8-47、RS105。
8.如权利要求1-5中任一项所述芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌作为香蕉细菌性青枯病菌(X.campestris pv.musacearum)、辣椒斑点病菌(X.campestrispv.vesicatoria)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、核桃黑斑病菌(X.campestris pv.juglandis)的拮抗菌的应用。
9.如权利要求1-5中任一项所述芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌作为棉花细菌性角斑病菌(X.campestris pv.malvacearum)、菜豆细菌性疫病菌(X.campestrispv.phaseoli)、豇豆枯萎病菌(X.axonopodis pv.vignicola)、大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)、洋葱细菌性叶枯病菌(X.axonopodis pv.allii)的拮抗菌的应用。
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