JPS61289885A - コラゲナ−ゼおよびコラゲナ−ゼの製造方法 - Google Patents
コラゲナ−ゼおよびコラゲナ−ゼの製造方法Info
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- JPS61289885A JPS61289885A JP13062885A JP13062885A JPS61289885A JP S61289885 A JPS61289885 A JP S61289885A JP 13062885 A JP13062885 A JP 13062885A JP 13062885 A JP13062885 A JP 13062885A JP S61289885 A JPS61289885 A JP S61289885A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規のコラゲナーゼおよびその製造方法に関す
る。
る。
コラゲナーゼはコラーゲンのみに作用し、卵アルブミン
、カゼイン、フィブリン等には作用しない性質を有して
おり、古くには火傷や褥疹の創面浄化、今日では動物組
織からの細胞の分散等、生化学試薬等として広く利用さ
れている。
、カゼイン、フィブリン等には作用しない性質を有して
おり、古くには火傷や褥疹の創面浄化、今日では動物組
織からの細胞の分散等、生化学試薬等として広く利用さ
れている。
これまで、コラゲナーゼを得るには嫌気性のクロストリ
ジウム属〔例えば、クロストリジウムヒストリチクム（
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ
）を嫌気的条件下で培養し、採取する方法がとられてい
る。嫌気的条件を満たすためには、培地の重層や空気排
除または窒素ガスもしくは二酸化炭素置換などの手段が
考えられるが、いずれにしても煩雑な過程を必要とする
。また、得ようとするコラゲナーゼの収率を上げるため
には、天然栄養分を添加することが端的ではあるが、夾
雑物の多様化により抽出分離工程が複雑になり、経済的
にみても好ましくない等の問題点がある。
ジウム属〔例えば、クロストリジウムヒストリチクム（
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ
）を嫌気的条件下で培養し、採取する方法がとられてい
る。嫌気的条件を満たすためには、培地の重層や空気排
除または窒素ガスもしくは二酸化炭素置換などの手段が
考えられるが、いずれにしても煩雑な過程を必要とする
。また、得ようとするコラゲナーゼの収率を上げるため
には、天然栄養分を添加することが端的ではあるが、夾
雑物の多様化により抽出分離工程が複雑になり、経済的
にみても好ましくない等の問題点がある。
これらの問題点を解消するためにストレプトマイセスＣ
−５１株を好気的に培養してコラゲナーゼを採取する方
法を開示している〔農芸化学５９要旨集２０４頁（１９
８４）、農芸化学第２巻２３３頁（１９８５） ）。
−５１株を好気的に培養してコラゲナーゼを採取する方
法を開示している〔農芸化学５９要旨集２０４頁（１９
８４）、農芸化学第２巻２３３頁（１９８５） ）。
しかして、上記公知のコラゲナーゼは、それぞれ分子量
約７万、等電点ｐ＋４．ｓ付近ならびに分子量約１０万
および９〜１１万、等電点ＰＩ５．２である。
約７万、等電点ｐ＋４．ｓ付近ならびに分子量約１０万
および９〜１１万、等電点ＰＩ５．２である。
本発明者らは、好気的条件下で培養して新規なコラゲナ
ーゼを産生しうる菌株を得るために、多数の土壌微生物
を分離し、それが産生ずるコラゲナーゼについて検討し
たところ、好気性菌であるストレプトマイセス属の菌株
が新規コラゲナーゼ産生能を有することを見い出した。
ーゼを産生しうる菌株を得るために、多数の土壌微生物
を分離し、それが産生ずるコラゲナーゼについて検討し
たところ、好気性菌であるストレプトマイセス属の菌株
が新規コラゲナーゼ産生能を有することを見い出した。
従って、本発明の目的は新規コラゲナーゼを提供するこ
とである。
とである。
また、本発明の他の目的は上記新規コラゲナーゼの製造
方法を提供することである。
方法を提供することである。
本発明は、ストレプトマイセス属に属する菌株が産生じ
得、ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷゲルを用る高速液体クロ
マトグラフィーによって測定した分子量が約５２０００
である新規コラゲナーゼに関する。特に、本発明は以下
の理化学的性質を有するコラゲナーゼに関する。
得、ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷゲルを用る高速液体クロ
マトグラフィーによって測定した分子量が約５２０００
である新規コラゲナーゼに関する。特に、本発明は以下
の理化学的性質を有するコラゲナーゼに関する。
■外観：淡黄色粉末（凍結乾燥）
■基質特異性：
（ｉ）コラーゲン（分子量３０００００） １モル相当
のコラゲナーゼ消化物のＮ末端アミノ酸残基数は９３で
グリシンのみである。
のコラゲナーゼ消化物のＮ末端アミノ酸残基数は９３で
グリシンのみである。
（ｉｉ）コラーゲン（分子量３０００００） １ モル
相当のコラゲナーゼ消化物のＣ末端アミノ酸残基数は次
の通りである： ヒドロキシプロリン １９．２４ アスパラギン酸 ０．４５ トレオニン ２．０４ セリン ４．８７ グルタミン酸 ０．４８ プロリン １．４４グリシン
４．９５ アラニン １５．０８ バリン ２．２４ イソロイシン ０．７１ ロイシン ２．７１ ヒドロキシリジン ２．８６ リジン ３．９４ ■至適温度： ３０℃（０，００２％水溶液）、５５℃以上では不活性
となる。
相当のコラゲナーゼ消化物のＣ末端アミノ酸残基数は次
の通りである： ヒドロキシプロリン １９．２４ アスパラギン酸 ０．４５ トレオニン ２．０４ セリン ４．８７ グルタミン酸 ０．４８ プロリン １．４４グリシン
４．９５ アラニン １５．０８ バリン ２．２４ イソロイシン ０．７１ ロイシン ２．７１ ヒドロキシリジン ２．８６ リジン ３．９４ ■至適温度： ３０℃（０，００２％水溶液）、５５℃以上では不活性
となる。
■至適ｐ！（：
ｐＨ７，０〜８．０（但し、ｐ１４４以下、ｐＨ１１以
上では不活性となる） ■鉄イオンの存在により酵素活性が促進され、水銀イオ
ン、カドミウムイオン、ＥＤＴＡの存在により酵素活性
が阻害される。
上では不活性となる） ■鉄イオンの存在により酵素活性が促進され、水銀イオ
ン、カドミウムイオン、ＥＤＴＡの存在により酵素活性
が阻害される。
■分子量：
ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ ゲルを用いる高速液体ク
ロマトグラフィーによって測定した分子量は約■等電点
：約ｐＩ５．４ さらに、本発明はストレプトマイセス属に属する菌株を
培養し、培養物から前記の性質を有するコラゲナーゼを
採取することによる前記コラゲナーゼの製造方法である
。
ロマトグラフィーによって測定した分子量は約■等電点
：約ｐＩ５．４ さらに、本発明はストレプトマイセス属に属する菌株を
培養し、培養物から前記の性質を有するコラゲナーゼを
採取することによる前記コラゲナーゼの製造方法である
。
本発明で使用されるコラゲナーゼ生産菌は、ストレプト
マイセス属に属し、本発明コラゲナーゼを生産する能力
を有するものであれば如何なる微生物でもよい。たとえ
ば、大阪府八尾市二俣、新田ゼラチン社内の土壌から分
離したストレプトマイセス パルブルス Ｎ−１株＜以
ｅｔ、ｒＮ−を株」と略称する）、ストレプトマイセス
アルボグリセオルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｌｂｏｇｒｉｃｅｏｌｕｓ ）、ストレプトマイセス
フミダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｕｍｉｄｕｓ
）等が挙げられる。好ましくはＮ−１株が使用され、こ
のＮ−１株の細菌学的性質は次の通りである。
マイセス属に属し、本発明コラゲナーゼを生産する能力
を有するものであれば如何なる微生物でもよい。たとえ
ば、大阪府八尾市二俣、新田ゼラチン社内の土壌から分
離したストレプトマイセス パルブルス Ｎ−１株＜以
ｅｔ、ｒＮ−を株」と略称する）、ストレプトマイセス
アルボグリセオルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｌｂｏｇｒｉｃｅｏｌｕｓ ）、ストレプトマイセス
フミダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｕｍｉｄｕｓ
）等が挙げられる。好ましくはＮ−１株が使用され、こ
のＮ−１株の細菌学的性質は次の通りである。
（１）形態
イースト・麦芽寒天培地に生育した細胞は以下の形態を
示す。
示す。
＋ａ）胞子形成菌糸は単純分枝しており、螺旋状で
。
。
１０以上の胞子を有する。胞子の表面構造は鞭毛、胞子
のう共に存在しない。また、胞子柄は気菌糸上に着生し
、菌核は形成しない。
のう共に存在しない。また、胞子柄は気菌糸上に着生し
、菌核は形成しない。
（ｂｌ各種培地における生育状態
■シュクロース・硝酸塩寒天培地
２７℃、１４日間培養の集落では生育は弱い。
気菌糸の生育は認められず、基土菌糸の色はナチュラル
（Ｎａｔｕｒａｌ）。水溶性色素はなし。
（Ｎａｔｕｒａｌ）。水溶性色素はなし。
■グルコース・アスパラギン寒天培地
２７℃、１４日間培養の集落では生育は良好。
気菌糸の色はシェルピンク（Ｓｈｅｌｌ Ｐｉｎｋ）。
基土菌糸の色はカナリア色（Ｃａｎａｒｙ Ｙｅｌｌｏ
ｗ）水溶性色素はなし。
ｗ）水溶性色素はなし。
■グリセリン・アスパラギン寒天培地
２７℃、１４日間培養の集落では生育は良好。
気菌糸の色は白色。基土菌糸の色はバンブ（Ｂａｍｂｏ
ｏ）。水溶性色素はなし。
ｏ）。水溶性色素はなし。
■スターチ寒天培地
２７℃、１４日間培養の集落では生育は良好。
気菌糸、基土菌糸の色は共に白色。水溶性色素はなし。
■チロシン寒天培地
２７℃、１４日間培養の集落では生育は良好。
気菌糸の色はパティ−（Ｐｕｔｔｙ）。基土菌糸の色は
ハニーゴールド（Ｈｏｎｅｙ Ｇｏｌｄ）。水溶性色素
はなし。
ハニーゴールド（Ｈｏｎｅｙ Ｇｏｌｄ）。水溶性色素
はなし。
■栄養寒天培地
２７℃、１４日間培養の集落では生育は良好。
気菌糸の色は白色。基土菌糸の色はダスティーイエロー
（Ｄｕｓｔｙ Ｙｅｌｌｏｗ）。水溶性色素はなし。
（Ｄｕｓｔｙ Ｙｅｌｌｏｗ）。水溶性色素はなし。
■イースト・麦芽寒天培地
２７°Ｃ１１４日間培養の集落では生育は良好。
気菌糸の色は暗灰色。基土菌糸の色はメロンイエロー（
Ｍｅｌｏｎ Ｙｅｌｌｏｕ）。水溶性色素はサンライト
イエロー（Ｓｕｎ Ｌｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ）。
Ｍｅｌｏｎ Ｙｅｌｌｏｕ）。水溶性色素はサンライト
イエロー（Ｓｕｎ Ｌｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ）。
■オートミール寒天培地
２７℃、１４日間培養の集落では生育は良好。
気菌糸の色は白色。基土菌糸の色はアイポリ−ティント
（Ｉｖｏｒｙ Ｔｉｎｔ）。水溶性色素はりトル ホイ
ート （Ｌｔ ｗｈｅａｔ） 。
（Ｉｖｏｒｙ Ｔｉｎｔ）。水溶性色素はりトル ホイ
ート （Ｌｔ ｗｈｅａｔ） 。
なお、色の記載についてはカラー・ハーモニー・マニ、
ｘアル（Ｃｏｌｏｒ Ｈａｒｍｏｎｙ Ｍａｎｕａｌ）
に従った。
ｘアル（Ｃｏｌｏｒ Ｈａｒｍｏｎｙ Ｍａｎｕａｌ）
に従った。
（以下余白）
１Ｃ）生理学的性質
（表中、「＋」は陽性、「−」は陰性を意味する。）！
ｄ＋炭素源の同化性 （表中、「＋」は同化、「−」は同化しなかった。）以
上の培養所見に基づいて、バージイズ マニュアル オ
フ ディタミネイティブ バクテリオロジー（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅ Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版およびイ
ンターナショナル ストレプトマイセス プロジェクト
（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｐｒｏｊｅｃｔ）の指針を参考に、近縁菌種を検
討するとストレプトマイセス パルブルス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｍｙｃｅＳｐａｒｖｕｌｌｕｓ）があげられる。しか
し、前記した培養所見を比較すると、形態はほぼ一致す
るものの、生理学的性質においてＮ−１株は１０％塩化
ナトリウムで生育しない。硝酸塩を還元する。Ｌ−ラム
ノースを同化しない。また、グルコース・アスパラギン
寒天培地において、集落の基体菌糸の色が黄色であるの
に対し、パルブルスは茶色い等の点で相違する。
ｄ＋炭素源の同化性 （表中、「＋」は同化、「−」は同化しなかった。）以
上の培養所見に基づいて、バージイズ マニュアル オ
フ ディタミネイティブ バクテリオロジー（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅ Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版およびイ
ンターナショナル ストレプトマイセス プロジェクト
（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｐｒｏｊｅｃｔ）の指針を参考に、近縁菌種を検
討するとストレプトマイセス パルブルス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｍｙｃｅＳｐａｒｖｕｌｌｕｓ）があげられる。しか
し、前記した培養所見を比較すると、形態はほぼ一致す
るものの、生理学的性質においてＮ−１株は１０％塩化
ナトリウムで生育しない。硝酸塩を還元する。Ｌ−ラム
ノースを同化しない。また、グルコース・アスパラギン
寒天培地において、集落の基体菌糸の色が黄色であるの
に対し、パルブルスは茶色い等の点で相違する。
以上のことから、Ｎ−１株は相違点はあるものの、基本
的には、ストレプトマイセス パルブルス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｍｙｃｅｓ ｐａｒｖｕｌｌｕｓ ）と一致するので
、ストレプトマイセス パルブルス サブスピーシズ
シトリナス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｐａｒｖｕｌｌ
ｕｓ ｓｕｂ ５ｐｃｉｔｒｆｎｕｓ ）と命名した。
的には、ストレプトマイセス パルブルス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｍｙｃｅｓ ｐａｒｖｕｌｌｕｓ ）と一致するので
、ストレプトマイセス パルブルス サブスピーシズ
シトリナス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｐａｒｖｕｌｌ
ｕｓ ｓｕｂ ５ｐｃｉｔｒｆｎｕｓ ）と命名した。
木菌は、通産省工業技術院微生物工業研究所へ、昭和６
０年４月３０日に第８２２４号として受託されている。
０年４月３０日に第８２２４号として受託されている。
本閑においては、分子量約５２０００のコラゲナーゼを
生産する性質を失わない限り、他の生理学的生化学的性
状が変異しても本発明に使用することができる。もちろ
ん、それらの変異株が自然の原因に由来するものであっ
ても、人工的に行われるものであってもさしつかえない
。
生産する性質を失わない限り、他の生理学的生化学的性
状が変異しても本発明に使用することができる。もちろ
ん、それらの変異株が自然の原因に由来するものであっ
ても、人工的に行われるものであってもさしつかえない
。
本発明の方法においては、好ましくは上記のようなＮ−
１株が培養される。ｌ’ｌ−１株は、適当な培養条件下
で発育させると、後記の特性を有する新規コラゲナーゼ
を生産する。
１株が培養される。ｌ’ｌ−１株は、適当な培養条件下
で発育させると、後記の特性を有する新規コラゲナーゼ
を生産する。
培地には、Ｎ−１株は同化しうる炭素源、消化しうる窒
素源および無機塩などを含有させることができる。さら
にこの培地に０．１重量％〜５重量％程度、好ましくは
０．５重量％〜２重量％程度のゼラチンを含有させるこ
とが望ましい。また、必要に応じて微量栄養促進物質、
前駆物質などの微量有効物質を培地に添加してもよい。
素源および無機塩などを含有させることができる。さら
にこの培地に０．１重量％〜５重量％程度、好ましくは
０．５重量％〜２重量％程度のゼラチンを含有させるこ
とが望ましい。また、必要に応じて微量栄養促進物質、
前駆物質などの微量有効物質を培地に添加してもよい。
Ｎ−１株が同化しうる炭素源としては、グルコ−ス、マ
ンニット、デンプン、フルクトースなどが挙げられる。
ンニット、デンプン、フルクトースなどが挙げられる。
消化しうる窒素源としては、肉エキス、ペプトンなどの
有機窒素化合物または硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウ
ムなどの無機窒素化合物が挙げられるが、コラゲナーゼ
の分離精製工程を鑑み、無機窒素化合物が望ましい。
有機窒素化合物または硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウ
ムなどの無機窒素化合物が挙げられるが、コラゲナーゼ
の分離精製工程を鑑み、無機窒素化合物が望ましい。
培養を行う場合、Ｎ−１株を適切な培地に接種し、好気
的条件下で培養する。培地は中性付近が良く、培養時の
温度は１０〜３７℃で生育可能であるが、２７〜３３℃
に保つのがよい。培養は４〜５日で終了する。
的条件下で培養する。培地は中性付近が良く、培養時の
温度は１０〜３７℃で生育可能であるが、２７〜３３℃
に保つのがよい。培養は４〜５日で終了する。
培養物から当該コラゲナーゼを採取する方法としては、
微生物の生産する代謝産物を採取するのに通常用いられ
る手段を適宜に利用すればよい。
微生物の生産する代謝産物を採取するのに通常用いられ
る手段を適宜に利用すればよい。
すなわち、濾過、濃縮、活性炭、シリカゲル、アルミナ
および合成吸着剤などによる吸着クロマトグラフィー、
各種溶剤による転溶、沈澱、不純物の除去、あるいは透
析などの手段が単独または、組み合わせて利用される。
および合成吸着剤などによる吸着クロマトグラフィー、
各種溶剤による転溶、沈澱、不純物の除去、あるいは透
析などの手段が単独または、組み合わせて利用される。
特に好ましくは、デアニートヨパール（ＤＥＡＥ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＰＬ）などの陰イオン交換樹脂を使用するク
ロマトグラフィーが使用される。
ＹＯＰＥＡＰＬ）などの陰イオン交換樹脂を使用するク
ロマトグラフィーが使用される。
具体的な方法としては、例えば、培養後遠心分離をし、
陰イオン交換樹脂系の充填剤（例えば、ＤＥＡＥ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬ Ｇ−６５０Ｍなど）を使用したカラ
ムクロマトグラフィーで溶出分離して所望のコラゲナー
ゼを得ることができる。
陰イオン交換樹脂系の充填剤（例えば、ＤＥＡＥ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬ Ｇ−６５０Ｍなど）を使用したカラ
ムクロマトグラフィーで溶出分離して所望のコラゲナー
ゼを得ることができる。
さらに分子篩のできる充填剤（例えば、セファデックス
、トヨパール、セルロファインなど）を用いたゲル濾過
に付すのが望ましい。
、トヨパール、セルロファインなど）を用いたゲル濾過
に付すのが望ましい。
本発明の新規コラゲナーゼは、好気性菌であるストレプ
トマイセス属菌が産生しうるものであり、培養装置とし
て、嫌気培養装置を必要とせず、通常の振盪培養装置に
て培養して産生される。また、培地として高価な天然培
地を使用せずともよく、安価なゼラチンを含む合成培地
にて培養、産生される。
トマイセス属菌が産生しうるものであり、培養装置とし
て、嫌気培養装置を必要とせず、通常の振盪培養装置に
て培養して産生される。また、培地として高価な天然培
地を使用せずともよく、安価なゼラチンを含む合成培地
にて培養、産生される。
また、本発明の製造方法によれば、夾雑物が少ないので
、分離、精製が容易である。
、分離、精製が容易である。
本発明のコラゲナーゼは、動物組織からの細胞の分散、
コラーゲンゲル内培養におけるゲル消化、創面浄化等に
有用であり、その使用方法は従来既知のコラゲナーゼと
同様である。
コラーゲンゲル内培養におけるゲル消化、創面浄化等に
有用であり、その使用方法は従来既知のコラゲナーゼと
同様である。
次に、実施例にて本発明のコラゲナーゼの採取方法とコ
ラゲナーゼの性質について述べる。
ラゲナーゼの性質について述べる。
実施例ｌ
Ｎ−１株を次の成分を含有する培地：
デンプン １０ｇゼラチン
１０ｇリン酸水素カリウム
１ｇ硫酸マグネシウム・７水和物 １
ｇ塩化ナトリウム １ｇ硫酸アンモ
ニウム ２ｇ炭酸カルシウム
２ｇ硫酸第一鉄・７水和物
１ｍｇ塩化マンガン・４水和物 １ｍｇ硫
酸亜鉛・７水和物 １ｍｇ以上を水１１
２に熔解したもの （作成した培地はｐＨ７，０〜７．４である。）で、３
０℃で５日間振盪培養した。培養液に硫酸アンモニウム
５５％飽和分画を行い、１１００００ｒｐで１０分間遠
心分離をした。その上澄液を０．０２５モルイミダゾー
ル・塩酸溶液（ｐ）１７．０）に透析した。
１０ｇリン酸水素カリウム
１ｇ硫酸マグネシウム・７水和物 １
ｇ塩化ナトリウム １ｇ硫酸アンモ
ニウム ２ｇ炭酸カルシウム
２ｇ硫酸第一鉄・７水和物
１ｍｇ塩化マンガン・４水和物 １ｍｇ硫
酸亜鉛・７水和物 １ｍｇ以上を水１１
２に熔解したもの （作成した培地はｐＨ７，０〜７．４である。）で、３
０℃で５日間振盪培養した。培養液に硫酸アンモニウム
５５％飽和分画を行い、１１００００ｒｐで１０分間遠
心分離をした。その上澄液を０．０２５モルイミダゾー
ル・塩酸溶液（ｐ）１７．０）に透析した。
得られた透析液をデアニートヨバール（ＤＥＡＥ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬ）を充填したカラムに吸着させ、０．１
〜０．２５モルの塩化ナトリウム溶液で溶出した。溶出
液をセファデックスＧ−１００を用い、０．１モルリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）でゲル濾過を行なって目的とす
るコラゲナーゼを得た。かくして、得られたコラゲナー
ゼの特性は以下のとおりである。
ＹＯＰＥＡＲＬ）を充填したカラムに吸着させ、０．１
〜０．２５モルの塩化ナトリウム溶液で溶出した。溶出
液をセファデックスＧ−１００を用い、０．１モルリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）でゲル濾過を行なって目的とす
るコラゲナーゼを得た。かくして、得られたコラゲナー
ゼの特性は以下のとおりである。
■分子量
実施例で得たコラゲナーゼをさらに、クロマトフオーカ
シングによって精製し、それを０．１モルの硫酸ナトリ
ウムを含有する５０ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６，８）を用い、ＴＳＫ Ｇ３０００Ｓ−でゲル
濾過をし、分子量を求めた。その結果を第１図に示す。
シングによって精製し、それを０．１モルの硫酸ナトリ
ウムを含有する５０ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６，８）を用い、ＴＳＫ Ｇ３０００Ｓ−でゲル
濾過をし、分子量を求めた。その結果を第１図に示す。
その結果、○印で示す分子量５２０００付近に目的物質
であるコラゲナーゼを得た。第１図中、１はアルドラー
ゼ（分子量１５８０００）、２及び３はアルブミン（分
子量はそれぞれ６１３０００．４５０００）、４はキモ
トリプシノーゲンＡ（分子量２８０００）および５はチ
トクロームＣ（分子量１２５００）を示す。
であるコラゲナーゼを得た。第１図中、１はアルドラー
ゼ（分子量１５８０００）、２及び３はアルブミン（分
子量はそれぞれ６１３０００．４５０００）、４はキモ
トリプシノーゲンＡ（分子量２８０００）および５はチ
トクロームＣ（分子量１２５００）を示す。
■基質特異性：
豚股由来のペプシン可溶化コラーゲン溶液（３ｍｇ／ｍ
／） ２４−に精製コラゲナーゼ液（０，０１％）３ｍ
ｌを加え、更に１．４モル塩化ナトリウムを含む０．１
モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を３１１Ｉ！加えて３
７℃ゲル化後、３０℃で２４時間反応させた。反応後ゲ
ルの溶解液を凍結乾燥し、コラゲナーゼ分解物を得た。
／） ２４−に精製コラゲナーゼ液（０，０１％）３ｍ
ｌを加え、更に１．４モル塩化ナトリウムを含む０．１
モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を３１１Ｉ！加えて３
７℃ゲル化後、３０℃で２４時間反応させた。反応後ゲ
ルの溶解液を凍結乾燥し、コラゲナーゼ分解物を得た。
（＋）コラーゲン（分子量３０００００） １モル相当
のコラゲナーゼ消化物のＮ末端アミノ酸残基数は、９３
でグリシンのみであった。（直接エドマン分解によるフ
ェニルチオヒダントイン化法による薄層クロマトグラフ
ィーによって同定） （ｉｉ）コラーゲン（分子量３０００００） １モル相
当のコラゲナーゼ消化物のＣ末端アミノ酸残基数は、次
の通りである（無水ヒドラジンによる無触媒ヒドラジン
分解を行ないアミノ酸分析計によって定量同定）： ヒドロキシプロリン １９．２４ アスパラギン酸 ０．４５ トレオニン ２．０４ セリン ４．８７ グルタミン酸 ０．４８ プロリン １．４４ グリシン ４．９５ アラニン １５．０８ バリン ２．２４ イソロイシン ０．７１ ロイシン ２．７１ ヒドロキシリジン ２．８６ リジン ３．９４ ■酵素活性測定法（合成基質による測定法）基質（Ｃｂ
ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ： Ｃｂ
ｚはカルボベンゾキシを意味する）を５０ミリモルトリ
スー塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）で２ミリモル溶液として
そのＱ、 ５ ｍｌと酵素液Ｑ、 ５ ｍｌを混合し、
３０°Ｃで３０分間反応後ニンヒドリン溶液ｉ ｍｌを
加え、１５分間沸騰水中に保つ。その後ただちに水冷し
５０％エタノール５ｍｌを加え、激しく振盪し、５７０
ｎｍにおける吸光度を測定した。上記条件でＧｌｙ−Ｐ
ｒ。
のコラゲナーゼ消化物のＮ末端アミノ酸残基数は、９３
でグリシンのみであった。（直接エドマン分解によるフ
ェニルチオヒダントイン化法による薄層クロマトグラフ
ィーによって同定） （ｉｉ）コラーゲン（分子量３０００００） １モル相
当のコラゲナーゼ消化物のＣ末端アミノ酸残基数は、次
の通りである（無水ヒドラジンによる無触媒ヒドラジン
分解を行ないアミノ酸分析計によって定量同定）： ヒドロキシプロリン １９．２４ アスパラギン酸 ０．４５ トレオニン ２．０４ セリン ４．８７ グルタミン酸 ０．４８ プロリン １．４４ グリシン ４．９５ アラニン １５．０８ バリン ２．２４ イソロイシン ０．７１ ロイシン ２．７１ ヒドロキシリジン ２．８６ リジン ３．９４ ■酵素活性測定法（合成基質による測定法）基質（Ｃｂ
ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ： Ｃｂ
ｚはカルボベンゾキシを意味する）を５０ミリモルトリ
スー塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）で２ミリモル溶液として
そのＱ、 ５ ｍｌと酵素液Ｑ、 ５ ｍｌを混合し、
３０°Ｃで３０分間反応後ニンヒドリン溶液ｉ ｍｌを
加え、１５分間沸騰水中に保つ。その後ただちに水冷し
５０％エタノール５ｍｌを加え、激しく振盪し、５７０
ｎｍにおける吸光度を測定した。上記条件でＧｌｙ−Ｐ
ｒ。
を１１生成するとき１ｕｎｉｔとした。
ここで用いるニンヒドリン溶ｆ（ｌはメチルセロリルブ
と４Ｍ酢酸緩衝液を３：１に混合し、窒素置換したもの
にニンヒドリンを２％濃度に加え溶解後ヒドリンダンチ
ンを０．１２５％濃度に加えたものである。
と４Ｍ酢酸緩衝液を３：１に混合し、窒素置換したもの
にニンヒドリンを２％濃度に加え溶解後ヒドリンダンチ
ンを０．１２５％濃度に加えたものである。
■至適温度
コラゲナーゼの０．００２％水溶液を作成し、その温度
に対する酵素活性を調べた。その結果を第２図に示す。
に対する酵素活性を調べた。その結果を第２図に示す。
至適温度は３０℃付近で、５５°Ｃ以上ではコラゲナー
ゼは失活した。
ゼは失活した。
■熱安定性
０．１モルリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋７．０）に
コラゲナーゼが０．００２％になるように熔解し、所定
の温度で１時間加熱した。その結果を第３図に示す。３
０℃付近ではほとんど活性は失われず、４５℃以上でほ
ぼ不活性となった。
コラゲナーゼが０．００２％になるように熔解し、所定
の温度で１時間加熱した。その結果を第３図に示す。３
０℃付近ではほとんど活性は失われず、４５℃以上でほ
ぼ不活性となった。
■ｐＨに対する酵素活性および安定性
緩衝液に１、ｐＨ３〜６付近では酢酸緩衝液、ｐｌ（５
〜８付近ではリン酸緩衝液、ｐＨ８〜１０付近ではホウ
酸緩衝液、ｐＨ９〜１１付近では炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液を用い、コラゲナーゼを０．０
０２％溶液となるように加え、酵素活性を調べた。また
、それぞれのコラゲナーゼ溶液を２４時間処理した。そ
の結果を第４図及び第５図に示した。なお第４図はｐＨ
と活性の関係、第５図はｐＨ安定性を示すものである。
〜８付近ではリン酸緩衝液、ｐＨ８〜１０付近ではホウ
酸緩衝液、ｐＨ９〜１１付近では炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液を用い、コラゲナーゼを０．０
０２％溶液となるように加え、酵素活性を調べた。また
、それぞれのコラゲナーゼ溶液を２４時間処理した。そ
の結果を第４図及び第５図に示した。なお第４図はｐＨ
と活性の関係、第５図はｐＨ安定性を示すものである。
その結果、至適ｐ）１は７．０〜８゜０であり、ｐＨ５
，５〜９．５では安定であった。
，５〜９．５では安定であった。
■（＋）金属イオン系に対する影響
最終金属イオン濃度が１０４モルとなるようにコラゲナ
ーゼ０．００２％溶液を作成した。金属イオンを含まな
いコラゲナーゼ溶液の酵素活性を１００％としたとき、
各種金属イオンを含むコラゲナーゼ溶液の酵素活性を調
べ、以下の表１に示した。
ーゼ０．００２％溶液を作成した。金属イオンを含まな
いコラゲナーゼ溶液の酵素活性を１００％としたとき、
各種金属イオンを含むコラゲナーゼ溶液の酵素活性を調
べ、以下の表１に示した。
表１
（ｉｔ）阻害剤系に対する影響
最終阻害剤濃度が２ｘｌＯ−”モルとなるようにコラゲ
ナーゼ０．００２％溶液を作成した。阻害剤を含まない
コラゲナーゼ溶液の酵素活性を１００％としたとき、各
種阻害剤を含むコラゲナーゼ溶液の酵素活性を調べ、以
下の表２に示した。
ナーゼ０．００２％溶液を作成した。阻害剤を含まない
コラゲナーゼ溶液の酵素活性を１００％としたとき、各
種阻害剤を含むコラゲナーゼ溶液の酵素活性を調べ、以
下の表２に示した。
表２
（トリプシン阻害剤は１．６６ｍｇ／ｍ＋添加）その結
果、鉄イオンの存在により酵素活性は促進され、水銀イ
オンおよびカドミウムイオンの存在により酵素活性は阻
害された。また、阻害剤としてＥＤＴＡ、８−ヒドロキ
シキノリン、シアン化カリウムで強く阻害された。
果、鉄イオンの存在により酵素活性は促進され、水銀イ
オンおよびカドミウムイオンの存在により酵素活性は阻
害された。また、阻害剤としてＥＤＴＡ、８−ヒドロキ
シキノリン、シアン化カリウムで強く阻害された。
第１図はゲル濾過による溶出量と溶出物の分子量との関
係を示すグラフである。○印は本発明のコラゲナーゼを
示す。 第２図および第３図は温度と酵素活性との関係を示した
グラフである。 第４図および第５図はｐＨと酵素活性との関係を示した
グラフである。 特許出願人 新田ゼラヂン株式会社 ｔで）２図 至道巳監既（°Ｃ） 第３図 熱系ｔヨ定・ト性Ｌ（’（：） 第４図 主光ｉｐＨ 第５図 ｐｉ−１＋二１トする９宣乙・を生 手 続 （甫 正 書（自発） 昭和６０年１０月３日
係を示すグラフである。○印は本発明のコラゲナーゼを
示す。 第２図および第３図は温度と酵素活性との関係を示した
グラフである。 第４図および第５図はｐＨと酵素活性との関係を示した
グラフである。 特許出願人 新田ゼラヂン株式会社 ｔで）２図 至道巳監既（°Ｃ） 第３図 熱系ｔヨ定・ト性Ｌ（’（：） 第４図 主光ｉｐＨ 第５図 ｐｉ−１＋二１トする９宣乙・を生 手 続 （甫 正 書（自発） 昭和６０年１０月３日
Claims (6)
- （１）ストレプトマイセス属に属する菌株が産生し得、
ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷゲルを用る高速液体クロマト
グラフィーによって測定した分子量が約５２０００であ
るコラゲナーゼ。 - （２）以下の理化学的性質を有する特許請求の範囲第（
１）項記載のコラゲナーゼ。 ［１］外観：淡黄色粉末（凍結乾燥） ［２］基質特異性： （ｉ）コラーゲン（分子量３０００００）１モル相当の
コラゲナーゼ消化物のＮ末端アミノ酸残基数は９３でグ
リシンのみである。 （ｉｉ）コラーゲン（分子量３０００００）１モル相当
のコラゲナーゼ消化物のＣ末端アミノ酸残基数は次の通
りである： ヒドロキシプロリン １９．２４ アスパラギン酸 ０．４５ トレオニン ２．０４ セリン ４．８７ グルタミン酸 ０．４８ プロリン １．４４ グリシン ４．９５ アラニン １５．０８ バリン ２．２４ イソロイシン ０．７１ ロイシン ２．７１ ヒドロキシリジン ２．８６ リジン ３．９４ ［３］至適温度：３０℃（０．００２％水溶液）、５５
℃以上では不活性となる。 ［４］至適ｐＨ：ｐＨ７．０〜８．０（但し、ｐＨ４以
下、ｐＨ１１以上では不活性となる） ［５］鉄イオンの存在により酵素活性が促進され、水銀
イオン、カドミウムイオン、ＥＤＴＡの存在により酵素
活性が阻害される。 ［６］分子量：ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ ゲルを用い
る高速液体クロマトグラフィーによって測定した分子量
は約５２０００ ［７］等電点：約ｐＩ５．４ - （３）ストレプトマイセス属に属する菌株を培養し、培
養物から以下の性質を有するコラゲナーゼを採取するこ
とを特徴とするコラゲナーゼの製造方法。 ［１］外観：淡黄色粉末（凍結乾燥） ２基質特異性： （ｉ）コラーゲン（分子量３０００００）１モル相当の
コラゲナーゼ消化物のＮ末端アミノ酸残基数は９３でグ
リシンのみである。 （ｉｉ）コラーゲン（分子量３０００００）１モル相当
のコラゲナーゼ消化物のＣ末端アミノ酸残基数は次の通
りである： ヒドロキシプロリン １９．２４ アスパラギン酸 ０．４５ トレオニン ２．０４ セリン ４．８７ グルタミン酸 ０．４８ プロリン １．４４ グリシン ４．９５ アラニン １５．０８ バリン ２．２４ イソロイシン ０．７１ ロイシン ２．７１ ヒドロキシリジン ２．８６ リジン ３．９４ ［３］至適温度：３０℃（０．００２％水溶液）、５５
℃以上では不活性となる。 ［４］至適ｐＨ：ｐＨ７．０〜８．０（但し、ｐＨ４以
下、ｐＨ１１以上では不活性となる） ［５］鉄イオンの存在により酵素活性が促進され、水銀
イオン、カドミウムイオン、ＥＤＴＡの存在により酵素
活性が阻害される。 ［６］分子量：ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ ゲルを用い
る高速液体クロマトグラフィーによって測定した分子量
は約５２０００ ［７］等電点：約ｐＩ５．４ - （４）培養が好気的条件下で行われる特許請求の範囲第
（３）項記載の方法。 - （５）培養される菌がストレプトマイセス パルブルス
Ｎ−１株である特許請求の範囲第（３）項記載の方法
。 - （６）培養される菌が微工研菌寄第８２２４号である特
許請求の範囲第（３）項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13062885A JPS61289885A (ja) | 1985-06-14 | 1985-06-14 | コラゲナ−ゼおよびコラゲナ−ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13062885A JPS61289885A (ja) | 1985-06-14 | 1985-06-14 | コラゲナ−ゼおよびコラゲナ−ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61289885A true JPS61289885A (ja) | 1986-12-19 |
| JPH037357B2 JPH037357B2 (ja) | 1991-02-01 |
Family
ID=15038787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13062885A Granted JPS61289885A (ja) | 1985-06-14 | 1985-06-14 | コラゲナ−ゼおよびコラゲナ−ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61289885A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009525283A (ja) * | 2006-01-30 | 2009-07-09 | オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド | コラーゲン媒介疾患を処置するための組成物および方法 |
| US11879141B2 (en) | 2012-01-12 | 2024-01-23 | Endo Global Ventures | Nucleic acid molecules encoding clostridium histolyticum collagenase II and methods of producing the same |
-
1985
- 1985-06-14 JP JP13062885A patent/JPS61289885A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009525283A (ja) * | 2006-01-30 | 2009-07-09 | オーキシリウム インターナショナル ホールディングス，インコーポレイテッド | コラーゲン媒介疾患を処置するための組成物および方法 |
| US11879141B2 (en) | 2012-01-12 | 2024-01-23 | Endo Global Ventures | Nucleic acid molecules encoding clostridium histolyticum collagenase II and methods of producing the same |
| US11975054B2 (en) | 2012-01-12 | 2024-05-07 | Endo Global Ventures | Nucleic acid molecules encoding clostridium histolyticum collagenase I and methods of producing the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH037357B2 (ja) | 1991-02-01 |
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Legal Events
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