JP4382893B2 - カルボキシルプロテアーゼ、それを生産する微生物およびカルボキシルプロテアーゼの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なカルボキシルプロテアーゼ、それを生産する微生物および前記カルボキシルプロテアーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物を利用した好気的発酵処理による有機性廃棄物の堆肥化は、農業の現場において古くより行われてきた技術である。この原理を工学的に応用した、高速堆肥化施設やバイオ式生ゴミ処理装置は、現在広く普及している。特に、バイオ式生ゴミ処理装置は、従来の大規模な回収一括集中処理に代わり、有機性廃棄物をその発生場所において速やかに処理するといった個別分散処理を可能にした。この個別分散処理は、有機性廃棄物の回収までの保管場所の衛生改善、回収運搬コストの削減に大きく貢献している。また、微生物を利用した好気的発酵処理は、ランニングコストが低廉で、エネルギー消費量の少ない省資源的な方法であるばかりでなく、発酵処理物を堆肥として土壌に還元することができ、有機性廃棄物の再利用を可能にした。
しかし、微生物を利用した好気的発酵処理法は、有機物の分解反応の主体である微生物が活発に生育可能な環境条件下でのみ機能し得る。したがって、不適当な環境条件下においては、環境条件の調整が必要になる。発酵処理過程で関与する微生物の多くは、中性から弱アルカリ性に生育の至適pHを持ち、酸性環境下では、その増殖活性が低下し、pH４−５以下では、全く増殖を示さなくなるものが多い。このため発酵処理過程で、pHの低下が生じると分解反応速度が低下し、処理過程の大幅な遅延や停止を引き起こすことが知られている（衛生工学研究論文集、２０巻、１７５頁、１９８４年）。こうした発酵処理過程におけるpHの低下は、主に有機酸などの酸性物質の生成とその蓄積に起因する。この有機酸生成は、急速な分解反応時に、酸素の濃度が低下して嫌気的な状態になると起こりやすく、停電などの不慮の事故により攪拌や切り返し等の操作が停止し、酸素の供給が不足した場合にも同様の現象を起こす。
【０００３】
こうした酸性物質を中和するために、有機物処理装置に測定器を用いて発酵物質のｐＨを測定する機構や、ｐＨ値が適正範囲を外れた場合に消石灰などのアルカリ剤を投入する機構が既に提案されている（特開昭５５−１１３６８８号公報、特開平１−１４５３８８号公報）。しかし、処理装置にｐＨを測定する機構やアルカリ剤を投入する機構を搭載すると、装置が煩雑になりコストも高くなり、ことに装置が小規模であるバイオ式生ゴミ処理装置による個別分散処理に適用することは難しい。また固相反応系である発酵処理物の正確なｐＨ測定は困難であり、アルカリ剤の供給が不足すれば効果が得られないばかりか、過剰のアルカリ剤の供給によりｐＨが上昇し過ぎて逆に微生物の活性低下を引き起こすなどの問題があった。
また、有機物処理装置の発酵槽内に、水素イオン濃度を中性から弱アルカリ性に保つｐＨ調整剤および有機物を分解する微生物を固定した水分調整剤を充填することで、有機物を高速発酵させる方法が提案されている（特開平７−３０３８７１号公報）。しかしこの水分調節剤は作成に１週間以上の日数を要し、製造コストが高くなるという問題があった。
【０００４】
有機性廃棄物の発酵処理過程で、ｐＨを低下させる要因は、有機酸の蓄積であるが、逆にｐＨを高める要因はアンモニアの発生である。良好な発酵処理が進行すると、タンパク質の分解によって生じたアンモニアは、水に溶解し水酸化アンモニウムとなりｐＨを上昇させる。ある程度ｐＨが上昇すると、アンモニアがアンモニアガスとして揮散するため発酵に障害を与えるほどｐＨが上昇することはない。したがって、特別な装置を用いることなく、酸性環境下において効果的にタンパク質を分解し、ｐＨを改善することが可能となるシステムの実現、特にそれに適する酵素、さらに好ましくは微生物の提供が求められていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の目的は、低ｐＨ域でも高いタンパク質分解能をもち、直接的ではないにしろアンモニアを生じせしめて、コンポストの低ｐＨ環境を改善することができる酵素、並びにかかる酵素を菌体外に効率よく生産する微生物、及び当該微生物を用いたカルボキシルプロテアーゼの製造法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らはその研究途上、偶然にも発酵処理物のｐＨが４．５付近まで低下しているにもかかわらず活発な分解反応が継続するといった特異的現象を見いだした。そこで、この発酵処理物を分離源として耐酸性微生物を探索したところ、これらの中に、新規カルボキシルプロテアーゼを産生するタンパク質資化性微生物を見いだし、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち本発明は、χ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８(χ-Proteobacteria sp. MB8)と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６９４８として受託された微生物から生産され、配列表の配列番号１（Ｎ末端フラグメント）および配列番号２（中間部フラグメント ）で表されるアミノ酸配列を含む、次の酵素学的性質を有するカルボキシルプロテアーゼＭＢ８を提供するものである。
（１）基質特異性： カゼインおよびヘモグロビンをよく加水分解する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ： 少なくともｐＨ１．５〜５で作用し、最適ｐＨは約３〜４である。ｐＨ５において最大活性値の約５〜１５％、ｐＨ２において最大活性値の約２５〜３５％の活性を保持する。
（３）ｐＨ安定性： ４℃、１２時間の処理条件において少なくともｐＨ３．５〜５．５範囲で安定である。
（４）作用温度及び最適温度： 少なくとも１０〜７０℃で作用し、最適温度は５０〜６０℃である。４０℃で最適温度における活性の約５０〜６０％、３０℃で最適温度における活性の約２５〜３５％、７０℃で最適温度における活性の約１５〜２５％の活性を保持する。
（５）温度安定性： ｐＨ４．７、１０分間の処理条件で少なくとも約４０〜５０℃まで安定である。
（６）分子量： ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの推定分子量は、約６１，０００±１，０００である。
（７）阻害剤： ペプスタチンによっては阻害されない。
また本発明は、χ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８(χ-Proteobacteria sp.MB8)と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６９４８として受託された前記のカルボキシルプロテアーゼＭＢ８を生産する微生物を提供するものである。
さらに本発明は、前記の微生物を培地に培養し、その培養物から前記のカルボキシルプロテアーゼＭＢ８を採取することを特徴とする、カルボキシルプロテアーゼＭＢ8の製造法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ8は、例えばχ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８(χ-Proteobacteria sp. MB8)を培養し、その培養物から採取することにより製造される。
【０００９】
χ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８(χ-Proteobacteria sp. MB8)の分類学的性質を以下に示す。
（ａ）顕微鏡的観察結果
０．5〜０．８μm ×１．５〜３．５μm の桿菌であり、運動性がある。黄色の色素を産生する。胞子の形成は認められない。
（ｂ）グラム染色性：−
（ｃ）3% KOHによる溶菌：＋
（ｄ）アミノペプチダーゼ活性：＋
（ｅ）胞子形成能：−
（ｆ）運動性：＋
（ｇ）カタラーゼ活性：＋
（ｈ）オキシダーゼ活性：＋
（ｉ）β−ガラクトシダーゼ活性：−
（ｊ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性：−
（ｋ）硝酸からの亜硝酸の生成：＋
（ｌ）ウレアーゼ活性：−
（ｍ）ゼラチンの加水分解：−
（ｎ）Tween 80の加水分解：＋
（ｍ）esculinの加水分解：−
（ｏ）利用性：
グルコース：＋
phenlyacetat：−
アラビノース：−
citrat：−
malat：−
adipat：−
マルトース：＋
mannit：−
マンノース：＋
N-acetylglucosamin：＋
Cellobiose：＋＋
β-hydroxybutyrat：−
L-histidin：−
【００１０】
１６ＳｒＤＮＡの部分配列は、Stenotrophomonas maltophilia と８９．５％の相同性、他のχ-Proteobacteria とは約８０−８８％の相同性を示した。しかし細胞の脂肪酸組成は明らかに、Stenotrophomonas属のものとは異なっていた。以上の菌学的性質に基づき、ドイツＤＳＭＺにより、本菌株は、χ−プロテオバクテリア(χ-Proteobacteria )に属するStenotrophomonas属に近縁の新属新種であると同定された。そこで、本菌株をχ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８（χ-Proteobacteria sp. MB8 )と命名し、ＦＥＲＭ Ｐ−１６９４８として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。受託証を添付する。
【００１１】
上記の菌株を用いて、本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ8を得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養することでこれを得ることができる。
培養に用いる培地中には、資化しうる炭素源及びタンパク質を適当量含有せしめておくことが望ましいが、タンパク質以外の窒素源を与えると、微生物は生育できるが本発明の酵素の生産は低下する。
この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、その例としては、炭素源として例えばグルコースや資化し得る有機酸があげられるが各種のスターチが最も好適である。またタンパク質源としては、カゼイン、大豆粉、肉エキス等の有機窒素源が有効であるが、低分子のペプチドやアミノ酸が豊富に存在する窒素源を供給すると、本発明の酵素の生産は著しく低下する。また、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量成分を培地中に適宜添加することができる。
このような培地として、例えば、ACS培地は特に好適に用いることができる。
［ACS培地］（Soil Biol. Biochem. ７巻、３４５頁、１９７５年をもとに改変）
スターチ：１％、カゼイン：０．３％、ＮａＣｌ：０．２％、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ：０．００５％、ＣａＣＯ３：０．００２％、ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ：０．００１％、ＫＨ２ＰＯ４：０．３％、ｐＨ：４．５。
培養温度は、３０℃前後が好ましく、培養初発ｐＨ４．５付近が好ましい。この条件下において通常３−５日間で培養は完了する。
【００１２】
かくして得られた培養液の中から目的の酵素であるカルボキシルプロテアーゼＭＢ８を採取するには、一般の酵素採取の手段に準じて行えばこれを得ることができる。即ち、培養後、遠心分離、濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過、沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。この粗酵素液を、更に、酵素精製の一般的手段、例えば適当なイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の組合わせによって精製することもできる。なお、好適な酵素の精製方法は以下の通りである。即ち、ｐＨ5.8に調節した粗酵素液をＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィに付し、さらにゲル濾過を必要に応じ繰り返すことができる。
【００１３】
本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ８の酵素学的諸性質について以下に説明する。
（酵素活性測定法）
ヘモグロビン１．３３％を含むMcllvaine緩衝液（ｐＨ３．０）（J. Biol. Chem. ４９巻、１８３頁、１９２１年）（酸成分：０．１Ｍクエン酸、塩基成分：０．２ＭＫＨ２ＰＯ４ ）０．７００ｍlに、０．２５０ｍlの酵素液を加え37℃、10分間反応させた（以降「反応液」と記す）。反応停止液（０．４４Ｍトリクロロ酢酸）１．０mlを加え、３０℃、２０分間静置した。次に遠心分離（1000Ｇ×５分間）し、上清の０．５mlについて、さらに０．４４M炭酸ナトリウム２．５mlを加え、1N Folin-Ciocalteu試薬（シグマ社製）０．５mlを加え、37℃で20分間静置後、６６０nmの吸光度を測定する。上記反応条件下において、１分間に１μｇのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を(反応液中に)生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
（タンパク量測定法）
クロマトグラフィー操作においては、吸光度（２８０nm）の測定値を用いた。また各精製ステップにおいて、分取した活性画分においては、Bradford法（Anal. Biochem.、７２巻、２４８頁）により牛血清アルブミン（ナカライテスク社製）を標準タンパク質として測定した。
（酵素学的性質）
（１）作用および基質特異性
McIlvaine緩衝液（ｐＨ３．５）中に最終濃度１．０％となるようにヘモグロビン（シグマ社製、Bovine）又は、カゼイン（和光純薬工業社製、ハマルステン氏法）を加え、３７℃で１０分間酵素反応を行い、活性を測定した。その結果、本酵素は、ヘモグロビンおよびカゼインをよく分解することが分かった。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ
Clark-Lubs緩衝液（ｐＨ1−2）（J. Bact.、２巻、１９１頁、１９１７年）（酸成分：０．２Ｍ ＨＣｌ、塩基成分：０．２Ｍ ＫＣｌ）およびMcIlvaine緩衝液（ｐＨ２−８）中に最終濃度１．０％となるようにヘモグロビン（シグマ社製、Bovine）を加え、３７℃で１０分間酵素反応を行い、活性を測定した。図１に示したように、少なくともｐＨ１．５〜５で作用し、最適ｐＨは約３〜４である（Clark-Lubs緩衝液は黒丸で、McIlvaine緩衝液は白丸で表した）。ｐＨ５において最大活性値の約５〜１５％、ＰＨ２において最大活性値の約２５〜３５％の活性を保持する。
（３）ｐＨ安定性
Clark-Lubs緩衝液（ｐＨ1−2）およびMcIlvaine緩衝液（ｐＨ２−８）中に本酵素を加え、４℃で１２時間放置した。ヘモグロビンを基質として、ｐＨ３．５、３７℃の条件下で１０分間酵素反応を行い、残存活性を測定した。図２に示したように、４℃、１２時間の処理条件において少なくともｐＨ３．５〜５．５の範囲で安定である（Clark-Lubs緩衝液は黒丸で、McIlvaine緩衝液は白丸で表した）。
（４）作用温度及び最適温度
McIlvaine緩衝液（ｐＨ３．５）中に最終濃度１．０％となるようにヘモグロビンを加え、各温度で１０分間酵素反応を行い、活性を測定した。図３に示したように、少なくとも１０〜７０℃で作用し、最適温度は５０〜６０℃である。４０℃ で最適温度における活性の約５０〜６０％、３０℃で最適温度における活性の約２５〜３５％、７０℃ で最適温度における活性の約１５〜２５％の活性を保持する。
（５）温度安定性
本酵素を、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中で、各温度により１０分間放置した後氷冷した。ヘモグロビンを基質として、ｐＨ３．５、３７℃の条件下で１０分間酵素反応を行い、残存活性を測定した。図４に示したように、本酵素はｐＨ４．７、１０分間の処理条件で少なくとも約４０〜５０℃まで安定である。
（６）分子量
Molecular Weight Standards (Low Range) (バイオ ラッド社製、ホスホリラーゼｂ（９７．４ｋＤ）、血清アルブミン（６６．２ｋＤ）、卵白アルブミン（４５．０ｋＤ）、炭酸脱水素酵素（３１．０ｋＤ）、トリプシンインヒビター（２１．５ｋＤ）、リソチーム（１４．４ｋＤ）を含む）を分子量マーカーとして、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した推定分子量は、約６１,０００±１,０００である（図５。白丸が本タンパク質）。
（７）阻害剤
ブタペプシン（シグマ社製）を対照区として、カルボキシルプロテアーゼの特異的阻害剤であるペプスタチンに対する感受性を検討した。McIlvaine緩衝液（ｐＨ４．０）に本酵素を最終濃度１０（μg/ml）となるように添加し、各濃度のペプスタチンを３７℃で１０分間作用させた。作用後、ヘモグロビンを基質として、ｐＨ３．５、３７℃の条件下で１０分間酵素反応を行い残存活性を測定した。図６に示したように、本酵素はペプスタチンによっては阻害されないことが分かる（白丸が本酵素。黒丸は、従来のカルボキシルプロテアーゼ）。
【００１４】
このように、本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ8は、過去に報告のない新規酵素である。中温性バクテリアの産生するカルボキシルプロテアーゼに関しては、Pseudomonas sp.101（Biochimica et Biophysica Acta、９２３巻、４６３頁、１９８７年。J. Biol. Chem.、２６９巻、２６５１８頁、１９９４年）、およびXanthomonas sp.（Agric. Biol. Chem.、５１巻、３０７３頁、１９８７年。 J. Biochem.、１２０巻、５６４頁、１９９６年)等に報告が見られる。本酵素は、これらPseudomonas sp.101およびXanthomonas sp.が産生する酵素と共にペプスタチン非感受性カルボキシルプロテアーゼの一種と考えられるものの、その起源とする微生物および酵素の分子量に差異を認めることができ、その他の性質を比較しても明らかに本発明の酵素とは異なっている。
【００１５】
本発明の微生物は、タンパク質の一連の資化過程をへて、最終的に脱アミノ化反応により、アンモニアを生じることにより、これが結果として生育環境のｐＨを上昇させる。
【００１６】
本発明のカルボキシプロテアーゼＭＢ８は、有機性廃棄物の醗酵処理工程の他に、酸性洗浄剤への配合によりタンパク質汚れの除去、あるいは酸性食料品の製造ライン洗浄剤としても有効に利用することができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
本発明者らは、研究途上、偶然にも発酵処理物のｐＨが４．５付近まで低下しているにもかかわらず活発な分解反応が継続するといった特異的現象を見いだした。そこで、この発酵処理物から本発明の菌株の分離を試みた。
先ず、一次スクリーニングとして、酸性培地（ＳＰＹＮ培地）による選択培養により耐酸性微生物の分離を行った。
［ＳＰＹＮ培地］ （J. Gen. Appl. Microbiol. 41巻、175頁、１９９５年）
Soluble Starch : 1%、Pepton : 0.1%、Yeast extract : 0.01%、Nutrient broth : 0.05%、KNO3 : 0.2%、NaCl : 0.2%、MgSO4 7H20 : 0.005%、CaCl2 2H2O : 0.002%、FeSO4 7H2O : 0.001%、(pH: 4.5)
上記の発酵処理物をＳＰＹＮ液体培地に添加し、３０℃で好気的培養を行い、培養１−７日後に適時ＳＰＹＮ寒天培地を用いて発生した菌株を分離した。得られた菌株は、ＳＰＹＮ寒天培地により画線培養を繰り返し純化した。
次に、プロテアーゼ活性の有無による二次スクリーニングを行った。プロテアーゼ活性を有する菌株をＡＣＳ寒天培地上で培養すると、コロニーの周辺に透明帯（ハロ）が形成される。この性質を指標とし、タンパク質資化性微生物の分離を行った。得られた分離株について、カルボキシルプロテアーゼ活性を定量したところ、該酵素活性を有していた。このようにして、χ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８（χ-Proteobacteria sp. MB8 )株を選抜した。
【００１８】
（実施例２）
次に実施例１で得られたχ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８株のカルボキシルプロテアーゼの産生、およびタンパク質の分解にともなうpHを改善する効果について検証した。ＡＣＳ培地により本菌株を３０℃で５日間培養し、菌体の生育、培地のｐＨ、およびプロテアーゼ活性を測定した。
［菌体の生育測定法］
菌体の生育は、ＡＴＰ濃度を測定しその指標とした。ＡＴＰ濃度の測定は、ＡＴＰ測定用試薬キット ルシフェールＬＵ（キッコーマン社製）を使用した。
菌体の生育、培地中に分泌されたプロテアーゼ活性、および培地のｐＨ値の経時変化を図７−９に示した。本菌株は、その生長にともない盛んにプロテアーゼを産生していることが分かる。また菌体の生育によってプロテアーゼが産生されるとともに培地のｐＨ値が中性付近にまで増加している。図１０に示したように、本発明の微生物の増殖に伴う培地中のプロテアーゼ活性とｐＨ値の関係をプロットしてみると、プロテアーゼが産生されタンパク質の分解が進行すると、結果として明らかにｐＨ値が中性側にシフトしており、本発明の目的に合致していることが示された。
【００１９】
（実施例３）
次に本発明により得られる酵素の精製法について説明する。実施例１で得られたχ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８株をＡＣＳ液体培地（ｐＨ４．５）に接種し、３０℃で４日間培養した。培養後、遠心により菌体を除去した上清に２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を添加し、ｐＨを５．８に調整した。本粗酵素液を、予め２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したDEAE-Sepharose CL-6B(ファルマシア社製、カラム径１．８４ｃｍ×長さ１５．０ｃｍ）に添加し、０−０．４Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた（図１１）。プロテアーゼ活性の高い画分を分取し、コロジオンバック(ザルトリウス社製)によって濃縮した。濃縮液を、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したBio-Gel P-100(バイオ ラッド社製、カラム径１．７ｃｍ×長さ８１ｃｍ）に添加し、同一の緩衝液により溶出し活性画分を分取した（図１２）。以上の操作により、電気泳動的に単一のバンドを示す酵素標品を得た。この結果、本酵素は約１３倍まで精製された。精製の各段階を下記の表１の精製表にまとめた。この中で注目されるのは、ＡＣＳ培地を培養基として得られた粗酵素液の比活性は、６４９（Ｕ／ｍｇ）と極めて高い値を示し、この培地が本酵素の生産および精製に適した培地であるという点である。このため本培地の使用は、本酵素の精製を容易にすることを可能にした。
【００２０】
【表１】
【００２１】
プロテインシークエンサー（Applied Biosystem社製 477A）により本酵素のアミノ酸配列を決定したした結果、本酵素は次のＮ末端フラグメントおよび中間部フラグメントを含むタンパク質であることが分かった。
【００２２】
【００２３】
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、低ｐＨ域でも高性能のタンパク質分解能をもち、直接的でないにしろアンモニアを生じせしめて、コンポストの低ｐＨ環境を改善することができる、酵素並びにかかる酵素を菌体外に効率よく生産する微生物及び当該微生物を用いたカルボキシルプロテアーゼの製造法が提供される。
【００２５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明プロテアーゼＭＢ８のｐＨ特性を示す図である。
【図２】本発明プロテアーゼＭＢ８のｐＨ安定性を示す図である。
【図３】本発明プロテアーゼＭＢ８の温度特性を示す図である。
【図４】本発明プロテアーゼＭＢ８の温度安定性を示す図である。
【図５】本発明プロテアーゼＭＢ８のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量を示す図である。
【図６】本発明プロテアーゼＭＢ８のペプスタチン感受性を示す図である。
【図７】本発明の微生物の生育曲線を示す図である。
【図８】本発明の微生物のプロテアーゼ産生を示す図である。
【図９】本発明の微生物の増殖にともなう培地ｐＨの変化を示す図である。
【図１０】本発明の微生物の増殖にともなう培地ｐＨ値とプロテアーゼ産生との関係を示す図である。
【図１１】本発明の酵素の精製過程における、イオン交換クロマトグラム（DEAE-Sepharose CL-6B）を示す図である。
【図１２】本発明の酵素の精製過程における、ゲル濾過クロマトグラム（Bio-Gel P100）を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なカルボキシルプロテアーゼ、それを生産する微生物および前記カルボキシルプロテアーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物を利用した好気的発酵処理による有機性廃棄物の堆肥化は、農業の現場において古くより行われてきた技術である。この原理を工学的に応用した、高速堆肥化施設やバイオ式生ゴミ処理装置は、現在広く普及している。特に、バイオ式生ゴミ処理装置は、従来の大規模な回収一括集中処理に代わり、有機性廃棄物をその発生場所において速やかに処理するといった個別分散処理を可能にした。この個別分散処理は、有機性廃棄物の回収までの保管場所の衛生改善、回収運搬コストの削減に大きく貢献している。また、微生物を利用した好気的発酵処理は、ランニングコストが低廉で、エネルギー消費量の少ない省資源的な方法であるばかりでなく、発酵処理物を堆肥として土壌に還元することができ、有機性廃棄物の再利用を可能にした。
しかし、微生物を利用した好気的発酵処理法は、有機物の分解反応の主体である微生物が活発に生育可能な環境条件下でのみ機能し得る。したがって、不適当な環境条件下においては、環境条件の調整が必要になる。発酵処理過程で関与する微生物の多くは、中性から弱アルカリ性に生育の至適pHを持ち、酸性環境下では、その増殖活性が低下し、pH４−５以下では、全く増殖を示さなくなるものが多い。このため発酵処理過程で、pHの低下が生じると分解反応速度が低下し、処理過程の大幅な遅延や停止を引き起こすことが知られている（衛生工学研究論文集、２０巻、１７５頁、１９８４年）。こうした発酵処理過程におけるpHの低下は、主に有機酸などの酸性物質の生成とその蓄積に起因する。この有機酸生成は、急速な分解反応時に、酸素の濃度が低下して嫌気的な状態になると起こりやすく、停電などの不慮の事故により攪拌や切り返し等の操作が停止し、酸素の供給が不足した場合にも同様の現象を起こす。
【０００３】
こうした酸性物質を中和するために、有機物処理装置に測定器を用いて発酵物質のｐＨを測定する機構や、ｐＨ値が適正範囲を外れた場合に消石灰などのアルカリ剤を投入する機構が既に提案されている（特開昭５５−１１３６８８号公報、特開平１−１４５３８８号公報）。しかし、処理装置にｐＨを測定する機構やアルカリ剤を投入する機構を搭載すると、装置が煩雑になりコストも高くなり、ことに装置が小規模であるバイオ式生ゴミ処理装置による個別分散処理に適用することは難しい。また固相反応系である発酵処理物の正確なｐＨ測定は困難であり、アルカリ剤の供給が不足すれば効果が得られないばかりか、過剰のアルカリ剤の供給によりｐＨが上昇し過ぎて逆に微生物の活性低下を引き起こすなどの問題があった。
また、有機物処理装置の発酵槽内に、水素イオン濃度を中性から弱アルカリ性に保つｐＨ調整剤および有機物を分解する微生物を固定した水分調整剤を充填することで、有機物を高速発酵させる方法が提案されている（特開平７−３０３８７１号公報）。しかしこの水分調節剤は作成に１週間以上の日数を要し、製造コストが高くなるという問題があった。
【０００４】
有機性廃棄物の発酵処理過程で、ｐＨを低下させる要因は、有機酸の蓄積であるが、逆にｐＨを高める要因はアンモニアの発生である。良好な発酵処理が進行すると、タンパク質の分解によって生じたアンモニアは、水に溶解し水酸化アンモニウムとなりｐＨを上昇させる。ある程度ｐＨが上昇すると、アンモニアがアンモニアガスとして揮散するため発酵に障害を与えるほどｐＨが上昇することはない。したがって、特別な装置を用いることなく、酸性環境下において効果的にタンパク質を分解し、ｐＨを改善することが可能となるシステムの実現、特にそれに適する酵素、さらに好ましくは微生物の提供が求められていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の目的は、低ｐＨ域でも高いタンパク質分解能をもち、直接的ではないにしろアンモニアを生じせしめて、コンポストの低ｐＨ環境を改善することができる酵素、並びにかかる酵素を菌体外に効率よく生産する微生物、及び当該微生物を用いたカルボキシルプロテアーゼの製造法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らはその研究途上、偶然にも発酵処理物のｐＨが４．５付近まで低下しているにもかかわらず活発な分解反応が継続するといった特異的現象を見いだした。そこで、この発酵処理物を分離源として耐酸性微生物を探索したところ、これらの中に、新規カルボキシルプロテアーゼを産生するタンパク質資化性微生物を見いだし、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち本発明は、χ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８(χ-Proteobacteria sp. MB8)と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６９４８として受託された微生物から生産され、配列表の配列番号１（Ｎ末端フラグメント）および配列番号２（中間部フラグメント ）で表されるアミノ酸配列を含む、次の酵素学的性質を有するカルボキシルプロテアーゼＭＢ８を提供するものである。
（１）基質特異性： カゼインおよびヘモグロビンをよく加水分解する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ： 少なくともｐＨ１．５〜５で作用し、最適ｐＨは約３〜４である。ｐＨ５において最大活性値の約５〜１５％、ｐＨ２において最大活性値の約２５〜３５％の活性を保持する。
（３）ｐＨ安定性： ４℃、１２時間の処理条件において少なくともｐＨ３．５〜５．５範囲で安定である。
（４）作用温度及び最適温度： 少なくとも１０〜７０℃で作用し、最適温度は５０〜６０℃である。４０℃で最適温度における活性の約５０〜６０％、３０℃で最適温度における活性の約２５〜３５％、７０℃で最適温度における活性の約１５〜２５％の活性を保持する。
（５）温度安定性： ｐＨ４．７、１０分間の処理条件で少なくとも約４０〜５０℃まで安定である。
（６）分子量： ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの推定分子量は、約６１，０００±１，０００である。
（７）阻害剤： ペプスタチンによっては阻害されない。
また本発明は、χ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８(χ-Proteobacteria sp.MB8)と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６９４８として受託された前記のカルボキシルプロテアーゼＭＢ８を生産する微生物を提供するものである。
さらに本発明は、前記の微生物を培地に培養し、その培養物から前記のカルボキシルプロテアーゼＭＢ８を採取することを特徴とする、カルボキシルプロテアーゼＭＢ8の製造法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ8は、例えばχ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８(χ-Proteobacteria sp. MB8)を培養し、その培養物から採取することにより製造される。
【０００９】
χ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８(χ-Proteobacteria sp. MB8)の分類学的性質を以下に示す。
（ａ）顕微鏡的観察結果
０．5〜０．８μm ×１．５〜３．５μm の桿菌であり、運動性がある。黄色の色素を産生する。胞子の形成は認められない。
（ｂ）グラム染色性：−
（ｃ）3% KOHによる溶菌：＋
（ｄ）アミノペプチダーゼ活性：＋
（ｅ）胞子形成能：−
（ｆ）運動性：＋
（ｇ）カタラーゼ活性：＋
（ｈ）オキシダーゼ活性：＋
（ｉ）β−ガラクトシダーゼ活性：−
（ｊ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性：−
（ｋ）硝酸からの亜硝酸の生成：＋
（ｌ）ウレアーゼ活性：−
（ｍ）ゼラチンの加水分解：−
（ｎ）Tween 80の加水分解：＋
（ｍ）esculinの加水分解：−
（ｏ）利用性：
グルコース：＋
phenlyacetat：−
アラビノース：−
citrat：−
malat：−
adipat：−
マルトース：＋
mannit：−
マンノース：＋
N-acetylglucosamin：＋
Cellobiose：＋＋
β-hydroxybutyrat：−
L-histidin：−
【００１０】
１６ＳｒＤＮＡの部分配列は、Stenotrophomonas maltophilia と８９．５％の相同性、他のχ-Proteobacteria とは約８０−８８％の相同性を示した。しかし細胞の脂肪酸組成は明らかに、Stenotrophomonas属のものとは異なっていた。以上の菌学的性質に基づき、ドイツＤＳＭＺにより、本菌株は、χ−プロテオバクテリア(χ-Proteobacteria )に属するStenotrophomonas属に近縁の新属新種であると同定された。そこで、本菌株をχ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８（χ-Proteobacteria sp. MB8 )と命名し、ＦＥＲＭ Ｐ−１６９４８として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。受託証を添付する。
【００１１】
上記の菌株を用いて、本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ8を得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養することでこれを得ることができる。
培養に用いる培地中には、資化しうる炭素源及びタンパク質を適当量含有せしめておくことが望ましいが、タンパク質以外の窒素源を与えると、微生物は生育できるが本発明の酵素の生産は低下する。
この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、その例としては、炭素源として例えばグルコースや資化し得る有機酸があげられるが各種のスターチが最も好適である。またタンパク質源としては、カゼイン、大豆粉、肉エキス等の有機窒素源が有効であるが、低分子のペプチドやアミノ酸が豊富に存在する窒素源を供給すると、本発明の酵素の生産は著しく低下する。また、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量成分を培地中に適宜添加することができる。
このような培地として、例えば、ACS培地は特に好適に用いることができる。
［ACS培地］（Soil Biol. Biochem. ７巻、３４５頁、１９７５年をもとに改変）
スターチ：１％、カゼイン：０．３％、ＮａＣｌ：０．２％、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ：０．００５％、ＣａＣＯ３：０．００２％、ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ：０．００１％、ＫＨ２ＰＯ４：０．３％、ｐＨ：４．５。
培養温度は、３０℃前後が好ましく、培養初発ｐＨ４．５付近が好ましい。この条件下において通常３−５日間で培養は完了する。
【００１２】
かくして得られた培養液の中から目的の酵素であるカルボキシルプロテアーゼＭＢ８を採取するには、一般の酵素採取の手段に準じて行えばこれを得ることができる。即ち、培養後、遠心分離、濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過、沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。この粗酵素液を、更に、酵素精製の一般的手段、例えば適当なイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の組合わせによって精製することもできる。なお、好適な酵素の精製方法は以下の通りである。即ち、ｐＨ5.8に調節した粗酵素液をＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィに付し、さらにゲル濾過を必要に応じ繰り返すことができる。
【００１３】
本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ８の酵素学的諸性質について以下に説明する。
（酵素活性測定法）
ヘモグロビン１．３３％を含むMcllvaine緩衝液（ｐＨ３．０）（J. Biol. Chem. ４９巻、１８３頁、１９２１年）（酸成分：０．１Ｍクエン酸、塩基成分：０．２ＭＫＨ２ＰＯ４ ）０．７００ｍlに、０．２５０ｍlの酵素液を加え37℃、10分間反応させた（以降「反応液」と記す）。反応停止液（０．４４Ｍトリクロロ酢酸）１．０mlを加え、３０℃、２０分間静置した。次に遠心分離（1000Ｇ×５分間）し、上清の０．５mlについて、さらに０．４４M炭酸ナトリウム２．５mlを加え、1N Folin-Ciocalteu試薬（シグマ社製）０．５mlを加え、37℃で20分間静置後、６６０nmの吸光度を測定する。上記反応条件下において、１分間に１μｇのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を(反応液中に)生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
（タンパク量測定法）
クロマトグラフィー操作においては、吸光度（２８０nm）の測定値を用いた。また各精製ステップにおいて、分取した活性画分においては、Bradford法（Anal. Biochem.、７２巻、２４８頁）により牛血清アルブミン（ナカライテスク社製）を標準タンパク質として測定した。
（酵素学的性質）
（１）作用および基質特異性
McIlvaine緩衝液（ｐＨ３．５）中に最終濃度１．０％となるようにヘモグロビン（シグマ社製、Bovine）又は、カゼイン（和光純薬工業社製、ハマルステン氏法）を加え、３７℃で１０分間酵素反応を行い、活性を測定した。その結果、本酵素は、ヘモグロビンおよびカゼインをよく分解することが分かった。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ
Clark-Lubs緩衝液（ｐＨ1−2）（J. Bact.、２巻、１９１頁、１９１７年）（酸成分：０．２Ｍ ＨＣｌ、塩基成分：０．２Ｍ ＫＣｌ）およびMcIlvaine緩衝液（ｐＨ２−８）中に最終濃度１．０％となるようにヘモグロビン（シグマ社製、Bovine）を加え、３７℃で１０分間酵素反応を行い、活性を測定した。図１に示したように、少なくともｐＨ１．５〜５で作用し、最適ｐＨは約３〜４である（Clark-Lubs緩衝液は黒丸で、McIlvaine緩衝液は白丸で表した）。ｐＨ５において最大活性値の約５〜１５％、ＰＨ２において最大活性値の約２５〜３５％の活性を保持する。
（３）ｐＨ安定性
Clark-Lubs緩衝液（ｐＨ1−2）およびMcIlvaine緩衝液（ｐＨ２−８）中に本酵素を加え、４℃で１２時間放置した。ヘモグロビンを基質として、ｐＨ３．５、３７℃の条件下で１０分間酵素反応を行い、残存活性を測定した。図２に示したように、４℃、１２時間の処理条件において少なくともｐＨ３．５〜５．５の範囲で安定である（Clark-Lubs緩衝液は黒丸で、McIlvaine緩衝液は白丸で表した）。
（４）作用温度及び最適温度
McIlvaine緩衝液（ｐＨ３．５）中に最終濃度１．０％となるようにヘモグロビンを加え、各温度で１０分間酵素反応を行い、活性を測定した。図３に示したように、少なくとも１０〜７０℃で作用し、最適温度は５０〜６０℃である。４０℃ で最適温度における活性の約５０〜６０％、３０℃で最適温度における活性の約２５〜３５％、７０℃ で最適温度における活性の約１５〜２５％の活性を保持する。
（５）温度安定性
本酵素を、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中で、各温度により１０分間放置した後氷冷した。ヘモグロビンを基質として、ｐＨ３．５、３７℃の条件下で１０分間酵素反応を行い、残存活性を測定した。図４に示したように、本酵素はｐＨ４．７、１０分間の処理条件で少なくとも約４０〜５０℃まで安定である。
（６）分子量
Molecular Weight Standards (Low Range) (バイオ ラッド社製、ホスホリラーゼｂ（９７．４ｋＤ）、血清アルブミン（６６．２ｋＤ）、卵白アルブミン（４５．０ｋＤ）、炭酸脱水素酵素（３１．０ｋＤ）、トリプシンインヒビター（２１．５ｋＤ）、リソチーム（１４．４ｋＤ）を含む）を分子量マーカーとして、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した推定分子量は、約６１,０００±１,０００である（図５。白丸が本タンパク質）。
（７）阻害剤
ブタペプシン（シグマ社製）を対照区として、カルボキシルプロテアーゼの特異的阻害剤であるペプスタチンに対する感受性を検討した。McIlvaine緩衝液（ｐＨ４．０）に本酵素を最終濃度１０（μg/ml）となるように添加し、各濃度のペプスタチンを３７℃で１０分間作用させた。作用後、ヘモグロビンを基質として、ｐＨ３．５、３７℃の条件下で１０分間酵素反応を行い残存活性を測定した。図６に示したように、本酵素はペプスタチンによっては阻害されないことが分かる（白丸が本酵素。黒丸は、従来のカルボキシルプロテアーゼ）。
【００１４】
このように、本発明のカルボキシルプロテアーゼＭＢ8は、過去に報告のない新規酵素である。中温性バクテリアの産生するカルボキシルプロテアーゼに関しては、Pseudomonas sp.101（Biochimica et Biophysica Acta、９２３巻、４６３頁、１９８７年。J. Biol. Chem.、２６９巻、２６５１８頁、１９９４年）、およびXanthomonas sp.（Agric. Biol. Chem.、５１巻、３０７３頁、１９８７年。 J. Biochem.、１２０巻、５６４頁、１９９６年)等に報告が見られる。本酵素は、これらPseudomonas sp.101およびXanthomonas sp.が産生する酵素と共にペプスタチン非感受性カルボキシルプロテアーゼの一種と考えられるものの、その起源とする微生物および酵素の分子量に差異を認めることができ、その他の性質を比較しても明らかに本発明の酵素とは異なっている。
【００１５】
本発明の微生物は、タンパク質の一連の資化過程をへて、最終的に脱アミノ化反応により、アンモニアを生じることにより、これが結果として生育環境のｐＨを上昇させる。
【００１６】
本発明のカルボキシプロテアーゼＭＢ８は、有機性廃棄物の醗酵処理工程の他に、酸性洗浄剤への配合によりタンパク質汚れの除去、あるいは酸性食料品の製造ライン洗浄剤としても有効に利用することができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
本発明者らは、研究途上、偶然にも発酵処理物のｐＨが４．５付近まで低下しているにもかかわらず活発な分解反応が継続するといった特異的現象を見いだした。そこで、この発酵処理物から本発明の菌株の分離を試みた。
先ず、一次スクリーニングとして、酸性培地（ＳＰＹＮ培地）による選択培養により耐酸性微生物の分離を行った。
［ＳＰＹＮ培地］ （J. Gen. Appl. Microbiol. 41巻、175頁、１９９５年）
Soluble Starch : 1%、Pepton : 0.1%、Yeast extract : 0.01%、Nutrient broth : 0.05%、KNO3 : 0.2%、NaCl : 0.2%、MgSO4 7H20 : 0.005%、CaCl2 2H2O : 0.002%、FeSO4 7H2O : 0.001%、(pH: 4.5)
上記の発酵処理物をＳＰＹＮ液体培地に添加し、３０℃で好気的培養を行い、培養１−７日後に適時ＳＰＹＮ寒天培地を用いて発生した菌株を分離した。得られた菌株は、ＳＰＹＮ寒天培地により画線培養を繰り返し純化した。
次に、プロテアーゼ活性の有無による二次スクリーニングを行った。プロテアーゼ活性を有する菌株をＡＣＳ寒天培地上で培養すると、コロニーの周辺に透明帯（ハロ）が形成される。この性質を指標とし、タンパク質資化性微生物の分離を行った。得られた分離株について、カルボキシルプロテアーゼ活性を定量したところ、該酵素活性を有していた。このようにして、χ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８（χ-Proteobacteria sp. MB8 )株を選抜した。
【００１８】
（実施例２）
次に実施例１で得られたχ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８株のカルボキシルプロテアーゼの産生、およびタンパク質の分解にともなうpHを改善する効果について検証した。ＡＣＳ培地により本菌株を３０℃で５日間培養し、菌体の生育、培地のｐＨ、およびプロテアーゼ活性を測定した。
［菌体の生育測定法］
菌体の生育は、ＡＴＰ濃度を測定しその指標とした。ＡＴＰ濃度の測定は、ＡＴＰ測定用試薬キット ルシフェールＬＵ（キッコーマン社製）を使用した。
菌体の生育、培地中に分泌されたプロテアーゼ活性、および培地のｐＨ値の経時変化を図７−９に示した。本菌株は、その生長にともない盛んにプロテアーゼを産生していることが分かる。また菌体の生育によってプロテアーゼが産生されるとともに培地のｐＨ値が中性付近にまで増加している。図１０に示したように、本発明の微生物の増殖に伴う培地中のプロテアーゼ活性とｐＨ値の関係をプロットしてみると、プロテアーゼが産生されタンパク質の分解が進行すると、結果として明らかにｐＨ値が中性側にシフトしており、本発明の目的に合致していることが示された。
【００１９】
（実施例３）
次に本発明により得られる酵素の精製法について説明する。実施例１で得られたχ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８株をＡＣＳ液体培地（ｐＨ４．５）に接種し、３０℃で４日間培養した。培養後、遠心により菌体を除去した上清に２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を添加し、ｐＨを５．８に調整した。本粗酵素液を、予め２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したDEAE-Sepharose CL-6B(ファルマシア社製、カラム径１．８４ｃｍ×長さ１５．０ｃｍ）に添加し、０−０．４Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた（図１１）。プロテアーゼ活性の高い画分を分取し、コロジオンバック(ザルトリウス社製)によって濃縮した。濃縮液を、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したBio-Gel P-100(バイオ ラッド社製、カラム径１．７ｃｍ×長さ８１ｃｍ）に添加し、同一の緩衝液により溶出し活性画分を分取した（図１２）。以上の操作により、電気泳動的に単一のバンドを示す酵素標品を得た。この結果、本酵素は約１３倍まで精製された。精製の各段階を下記の表１の精製表にまとめた。この中で注目されるのは、ＡＣＳ培地を培養基として得られた粗酵素液の比活性は、６４９（Ｕ／ｍｇ）と極めて高い値を示し、この培地が本酵素の生産および精製に適した培地であるという点である。このため本培地の使用は、本酵素の精製を容易にすることを可能にした。
【００２０】
【表１】
プロテインシークエンサー（Applied Biosystem社製 477A）により本酵素のアミノ酸配列を決定したした結果、本酵素は次のＮ末端フラグメントおよび中間部フラグメントを含むタンパク質であることが分かった。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、低ｐＨ域でも高性能のタンパク質分解能をもち、直接的でないにしろアンモニアを生じせしめて、コンポストの低ｐＨ環境を改善することができる、酵素並びにかかる酵素を菌体外に効率よく生産する微生物及び当該微生物を用いたカルボキシルプロテアーゼの製造法が提供される。
【００２５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明プロテアーゼＭＢ８のｐＨ特性を示す図である。
【図２】本発明プロテアーゼＭＢ８のｐＨ安定性を示す図である。
【図３】本発明プロテアーゼＭＢ８の温度特性を示す図である。
【図４】本発明プロテアーゼＭＢ８の温度安定性を示す図である。
【図５】本発明プロテアーゼＭＢ８のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量を示す図である。
【図６】本発明プロテアーゼＭＢ８のペプスタチン感受性を示す図である。
【図７】本発明の微生物の生育曲線を示す図である。
【図８】本発明の微生物のプロテアーゼ産生を示す図である。
【図９】本発明の微生物の増殖にともなう培地ｐＨの変化を示す図である。
【図１０】本発明の微生物の増殖にともなう培地ｐＨ値とプロテアーゼ産生との関係を示す図である。
【図１１】本発明の酵素の精製過程における、イオン交換クロマトグラム（DEAE-Sepharose CL-6B）を示す図である。
【図１２】本発明の酵素の精製過程における、ゲル濾過クロマトグラム（Bio-Gel P100）を示す図である。
Claims (3)
- χ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８(χ-Proteobacteria sp. MB8)と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６９４８として受託された微生物から生産され、配列表の配列番号１（Ｎ末端フラグメント）および配列番号２（中間部フラグメント ）で表されるアミノ酸配列を含む、次の酵素学的性質を有するカルボキシルプロテアーゼＭＢ８。
（１）基質特異性： カゼインおよびヘモグロビンをよく加水分解する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ： 少なくともｐＨ１．５〜５で作用し、最適ｐＨは約３〜４である。ｐＨ５において最大活性値の約５〜１５％、ｐＨ２において最大活性値の約２５〜３５％の活性を保持する。
（３）ｐＨ安定性： ４℃、１２時間の処理条件において少なくともｐＨ３．５〜５．５の範囲で安定である。
（４）作用温度及び最適温度： 少なくとも１０〜７０℃で作用し、最適温度は５０〜６０℃である。４０℃ で最適温度における活性の約５０〜６０％、３０℃で最適温度における活性の約２５〜３５％、７０℃ で最適温度における活性の約１５〜２５％の活性を保持する。
（５）温度安定性： ｐＨ４．７、１０分間の処理条件で少なくとも約４０〜５０℃まで安定である。
（６）分子量： ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの推定分子量は、約６１，０００±１，０００である。
（７）阻害剤： ペプスタチンによっては阻害されない。 - χ−プロテオバクテリア sp. ＭＢ８(χ-Proteobacteria sp. MB8)と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６９４８として受託された請求項１に記載のカルボキシルプロテアーゼＭＢ８を生産する微生物。
- 請求項２記載の微生物を培地に培養し、その培養物から請求項１に記載のカルボキシルプロテアーゼＭＢ８を採取することを特徴とする、カルボキシルプロテアーゼＭＢ８の製造法。
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