JPH037357B2

JPH037357B2 -

Info

Publication number: JPH037357B2
Application number: JP13062885A
Authority: JP
Inventors: Koji Wada; Toshiichi Nishio; Shigeo Yasugi
Original assignee: Nitta Gelatin Inc
Current assignee: Nitta Gelatin Inc
Priority date: 1985-06-14
Filing date: 1985-06-14
Publication date: 1991-02-01
Also published as: JPS61289885A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は新規のコラゲナーゼおよびその製造方
法に関する。〔従来の技術〕コラゲナーセはコラーゲンのみに作用し、卵ア
ルブミン、カゼイン、フイブリン等には作用しな
い性質を有しており、古くには火傷や褥瘡の創面
浄化、今日では動物組織からの細胞の分散等、生
化学試薬等として広く利用されている。これまで、コラゲナーゼを得るには嫌気性のク
ロストリジウム属〔例えば、クロストリジウムヒ
ストリチクム（Clostridium histolyticum）を嫌
気的条件下で培養し、採取する方法がとられてい
る。嫌気的条件を満たすためには、培地の重層や
空気排除または窒素ガスもしくは二酸化炭素置換
などの手段が考えられるが、いずれにすても煩雑
な過程を必要とする。また、得ようとするコラゲ
ナーゼの収率を上げるためには、天然栄養分を添
加することが端的であるが、夾雑物の多様化によ
り抽出分離工程が複雑になり、経済的にみても好
ましくない等の問題点がある。これらの問題点を解消するためにストレプトマ
イセスＣ−51株を培養してコラゲナーゼを採取す
る方法を開示している〔農芸化学59要旨集204頁
（1984）、農芸化学第２巻233頁（1985）〕。しかして、上記公知のコラゲナーゼは、それぞ
れ分子量約７万、等電点p14.8付近ならびに分子
量約10万および９〜11万、等電点p15.2である。〔発明が解決しようとする問題点〕本発明者らは、好気的条件下で培養して新規な
コラゲナーゼを産生しうる菌株を得るために、多
数の土壌微生物を分離し、それが産生するコラゲ
ナーゼについて検討したところ、好気性菌である
ストレプトマイセス属の菌株が新規コラゲナーゼ
産生を有することを見い出した。従つて、本発明の目的は新規コラゲナーゼを提
供することである。また、本発明の他の目的は上記新規コラゲナー
ゼの製造方法を提供することである。〔問題点を解決するための手段〕本発明は、ストレプトマイセス属に属する菌株
が産生し得、以下の理化学的性質を有するコラゲ
ナーゼに関する。基質特異生： (i) コラーゲン（分子量300000）１モル相当の
コラゲナーゼ消化物のＮ末端アミノ酸残基数
は93でグリシンのみである。 (ii) コラーゲン（分子量300000）１モル相当の
コラゲナーゼ消化物のＣ末端アミノ酸残基は
次の通りである。ヒドロキシプロリン 19.24 アスパラギン酸 0.45 トレオニン 2.04 セリン 4.87 グルタミン酸 0.48 プロリン 1.44 グリシン 4.95 アラニン 15.08 バリン 2.24 イソロイシン 0.71 ロイシン 2.71 ヒドロキシリジン 2.86 リジン 3.94 至適温度： 30℃（0.002％水溶液）至適PH： PH7.0〜8.0 安定PH範囲： PH5.5〜9.5 鉄イオンの存在により酵素活性が促進され、
水銀イオン、カドミウムイオン、EDTAの存
在により酵素活性が阻害される。分子量： TSK G3000 SW ゲルを用いる高速液体ク
ロマトグラフイーによつて測定した分子量は約
52000。等電点：約pI5.4 さらに、本発明はストレプトマイセス属に属す
る菌株を培養し、培養物から前記の性質を有する
コラゲナーゼを採取することによる前記コラゲナ
ーゼの製造方法である。本発明で使用されるコラゲナーゼ生産菌は、ス
トレプトマイセス属に属し、本発明コラゲナーゼ
を生産する能力を有するものであれば如何なる微
生物でもよい。たとえば、大阪府八尾市二俣、新
田ゼラチン社内の土壌から分離したストレプトマ
イセスパルブルスＮ−１株（以後、「Ｎ−１
株」と略称する）、ストレプトマイセスアルボ
グリセオルス（Streptomyces albogriceolus）、
ストレプトマイセスフミダス（Streptomyces
humidus）等が挙げられる。好ましくはＮ−１株
が使用され、このＮ−１株の細菌学的性質は次の
通りである。 (1) 形態イースト・麦芽寒天培地に生育した細胞は以
下の形態を示す。 (a) 胞子形成菌糸は単純分枝しており、螺旋状
で10以上の胞子を有する。胞子の表面構造は
鞭毛、胞子のう共に存在しない。また、胞子
柄は気菌糸上に着生し、菌核は形成しない。 (b) 各種培地における生育状態シユクロース・硝酸塩寒天培地 27℃、14日間培養の集落では生育は弱
い。気菌糸の生育は認められず、基生菌糸
の色はナチユラル（Natural）。水溶性色
素はなし。グルコース・アスパラギン寒天培地 27℃、14日間培養の集落では生育は良好。
気菌糸の色はシエルピンク（Shell Pink）。
基生菌糸の色カナリア色（Canary
Yellow）水溶性色素はなし。グリセリン・アスパラギン寒天培地 27℃、14日間培養の集落では生育は良
好。気菌糸の色は白色。基生菌糸の色はバ
ンブー（Bamboo）。水溶性色素はなし。スターチ寒天培地 27℃、14日間培養の集落では生育は良
好。気菌糸、基生菌糸の色は共に白色。水
溶性色素はなし。チロシン寒天培地 27℃、14日間培養の集落では生育は良
好。気菌糸の色はパテイー（Putty）。基
生菌糸の色はハナーゴールド（Honey
Gold）。水溶性色素はなし。栄養寒天培地 27℃、14日間培養の集落では生育は良
好。気菌糸の色は白色。基生菌糸の色はダ
ステイーイエロー（Dusty Yellow）。水
溶性色素はなし。イースト・麦芽寒天培地 27℃、14日間培養の集落では生育は良
好。気菌糸の色は暗灰色。基生菌糸の色は
メロンイエロー（Melon Yellow）。水溶
性色素はサンライトイエロー（Sun Light
Yellow）。オートミール寒天培地 27℃、14日間培養の集落では生育は良
好。気菌糸の色は白色。基生菌糸の色はア
イボリーテイント（Ivory Tint）。水溶性
色素はリトルホイート（Lt wheat）。なお、色の記載についてはカラー・ハーモ
ニーマニユアル（Color Harmony
Manual）に従つた。 (c) 生理学的性質

【表】 (d) 炭素源の同化性

〔作用・効果〕

本発明の新規コラゲナーゼは、好気生菌である
ストレプトマイセス属菌が産生しうるものであ
り、培養装置として、嫌気培養装置を必要とせ
ず、通常の振盪培養装置にて培養して産生され
る。また、培地として高価な天然培地を使用せず
ともよく、安価なゼラチンを含む合成培地にて培
養、産生される。また本発明の製造方法によれば、夾雑物が少な
いので、分離、精製が容易である。本発明のコラゲナーゼは、動物組織からの細胞
の分散、コラーゲンゲル内培養におけるゲル消
化、創面浄化等に有用であり、その使用方法は従
来既知のコラゲナーゼと同様である。〔実施例〕次に、実施例にて本発明のコラゲナーゼの採取
方法とコラゲナーゼの性質について述べる。実施例１Ｎ−１株を次の成分を含有する培地：デンプン 10ｇゼラチン 10ｇリン酸水素カリウム１ｇ硫酸マグネシウム・７水和物１ｇ塩化ナトリウム１ｇ硫酸アンモニウム２ｇ炭酸カルシウム２ｇ硫酸第一鉄・７水和物１mg 塩化マンガン・４水和物１mg 硫酸亜鉛・７水和物１mg 以上を水１に溶解したもの（作成した培地はPH7.0〜7.4である。）で、30℃で５日間振盪培養した。培養液に硫酸ア
ンモニウム55％飽和分画を行い、10000rpmで10
分間遠心分離をした。その上澄液を0.025モルイ
ミダゾール・塩酸溶液（PH7.0）に透析した。得
られた透析液をデアエートヨパール（DEAE−
TOYOPEARL）を充填したカラムに吸着させ、
0.1〜0.25の塩化ナトリウム溶液で溶出した。溶
出液をセフアデツクスＧ−100を用い、0.1モルリ
ン酸緩衡液（PH7.0）でゲル濾過を行なつて目的
とするコラゲナーゼを得た。かくして、得られた
コラゲナーゼの特性は以下のとおりである。分子量実施例で得たコラゲナーゼをさらに、クロマ
トフオーカシングによつて精製し、それを0.1
モルの硫酸ナトリウムを含有する50ミリモルの
リン酸ナトリウム緩衡液（PH6.8）を用い、
TSK G3000SWでゲル濾過をし、分子量を求
めた。その結果を第１図に示す。その結果、○
印で示す分子量52000付近に目的物質であるコ
ラゲナーゼを得た。第１図中、１はアルドラー
ゼ（分子量158000）、２及び３はアルブミン
（分子量はそれぞれ68000、45000）、４はキモト
リプシノーゲンＡ（分子量28000）および５はチ
トクロームＣ（分子量12500）を示す。基質特異性：豚腱由来のペプシン可溶化コラーゲン溶液
（３mg／ml）24mlに精製コラゲナーゼ液（0.01
％）３mlを加え、更に1.4モル塩化ナトリウム
を含む0.1モルリン酸緩衡液（PH7.4）を３ml加
えて37℃ゲル化後、30℃で24時間反応させた。
反応後ゲルの溶解液を凍結乾燥し、コラゲナー
ゼ分解物を得た。 (i) コラーゲン（分子量300000）１モル相当の
コラゲナーゼ消化物のＮ末端アミノ酸残基数
は、93でグリシンのみであつた。（直接エド
マン分解によるフエニルチオヒダントイン化
法による薄層クロマトグラフイーによつて同
定） (ii) コラーゲン（分子量300000）１モル相当の
コラゲナーゼ消化物のＣ末端アミノ酸残基数
は、次の通りである（無水ヒドラジンによる
無触媒ヒドラジン分解を行ないアミノ酸分析
計によつて定量同定）：ヒドロキシプロリン 19.24 アスパラギン酸 0.45 トレオニン 2.04 セリン 4.87 グルタミン酸 0.48 プロリン 1.44 グリシン 4.95 アラニン 15.08 バリン 2.24 イソロイシン 0.71 ロイシン 2.71 ヒドロキシリジン 2.86 リジン 3.94 酵素活性測定法（合成基質による測定法）基質（Cbz−Gly−Pro−Leu−Gly−Pro：
Cbzはカルボベンゾキシを意味する）を50ミリ
モルトリス−塩酸緩衡液（PH7.4）で２ミリモ
ル溶液としてその0.5mlと酵素液0.5mlを混合
し、30℃で30分間反応後ニンヒドリン溶液１ml
を加え、15分間沸騰水中に保つ。その後ただち
に水冷し50％エタノール５mlを加え、激しく振
盪し、570nｍにおける吸光度を測定した。上
記条件でGly−Proを1μｍ生成するとき1unitと
した。ここで用いるニンヒドリン溶液はメチルセロ
リルブと4M酢酸緩衡を３：１に混合し、窒素
置換したものにニンヒドリンを２％濃度に加え
溶解後ヒドリンダンチンを0.125％濃度に加え
たものである。至適温度コラゲナーゼの0.002％水溶液を作成し、そ
の温度に対する酵素活性を調べた。その結果を
第２図に示す。至適温度は30℃付近で、55℃以
上ではコラゲナーゼは失活した。熱安定性 0.1モルリン酸ナトリウム緩衡液（PH7.0）に
コラゲナーゼが0.002％になるように溶解し、
所定の温度で１時間加熱した。その結果を第３
図に示す。30℃付近ではほとんど活性は失われ
ず、45℃以上でほぼ不活性となつた。 PHに対する酵素活性および安定性緩衡液に、PH３〜６付近では酢酸緩衝液、PH
５〜８付近ではリン酸緩衝液、PH８〜10付近で
はホウ酸緩衝液、PH９〜11付近では炭酸水素ナ
トリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を用い、コ
ラゲナーゼを0.002％溶液となるように加え、
酵素活性を調べた。また、それぞれのコラゲナ
ーゼ溶液を24時間処理した。その結果第４図及
び第５図に示した。なお第４図はPHと活性の関
係、第５図はPH安定性を示すものである。その
結果、至適PHは7.0〜8.0であり、PH5.5〜9.5で
は安定であつた。 (i) 金属イオン系に対する影響最終金属イオン濃度が10^-3モルとなるよう
にコラゲナーゼ0.002％溶液を作成した。金
属イオンを含まないコラゲナーゼ溶液の酵素
活性を100％としたとき、各種金属イオンを
含むコラゲナーゼ溶液の酵素活性を調べ、以
下の表１に示した。

【表】

【表】 (ii) 阻害剤系に対する影響最終阻害剤濃度が２×10^-3モルとなるよう
にコラゲナーゼ0.002％溶液を作成した。阻
害剤を含まないコラゲナーゼ溶液の酵素活性
を100％としたとき、各種阻害剤を含むコラ
ゲナーゼ溶液の酵素活性を調べ、以下の表２
に示した。

【表】

【表】その結果、鉄イオンの存在により酵素活性は促
進され、水銀イオンおよびカドミウムイオンの存
在により酵素活性は阻害された。また、阻害剤と
してEDTA、８−ヒドロキシキノリン、シアン
化カリウムで強く阻害された。

【図面の簡単な説明】

第１図はゲル濾過による溶出量と溶出物の分子
量との関係を示すグラフである。○印は本発明の
コラゲナーゼを示す。第２図および第３図は温度
と酵素活性との関係を示したグラフである。第４
図および第５図はPHと酵素活性との関係を示した
グラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１ストレプトマイセス属に属する菌株が産生し
得、以下の理化学的性質を有するコラゲナーゼ。基質特異生： (i) コラーゲン（分子量300000）１モル相当の
コラゲナーゼ消化物のＮ末端アミノ酸残基数
は93でグリシンのみである。 (ii) コラーゲン（分子量300000）１モル相当の
コラゲナーゼ消化物のＣ末端アミノ酸残基数
は次の通りである。ヒドロキシプロリン 19.24 アスパラギン酸 0.45 トレオニン 2.04 セリン 4.87 グルタミン酸 0.48 プロリン 1.44 グリシン 4.95 アラニン 15.08 バリン 2.24 イソロイシン 0.71 ロイシン 2.71 ヒドロキシリジン 2.86 リジン 3.94 至適温度： 30℃（0.002％水溶液）至適PH： PH7.0〜8.0 安定PH範囲： PH5.5〜9.5 鉄イオンの存在により酵素活性が促進され、
水銀イオン、カドミウムイオン、EDTAの存
在により酵素活性が阻害される。分子量： TSK G3000 SW ゲルを用いる高速液体ク
ロマトグラフイーによつて測定した分子量は約
52000。等電点：約pI5.4 ２ストレプトマイセス属に属する菌株を培養
し、培養物から以下の性質を有するコラゲナーゼ
を採取することを特徴とする下記コラゲナーゼの
製造方法。基質特異生： (i) コラーゲン（分子量300000）１モル相当の
コラゲナーゼ消化物のＮ末端アミノ酸残基数
は93でグリシンのみである。 (ii) コラーゲン（分子量300000）１モル相当の
コラゲナーゼ消化物のＣ末端アミノ酸残基数
は次の通りである。ヒドロキシプロリン 19.24 アスパラギン酸 0.45 トレオニン 2.04 セリン 4.87 グルタミン酸 0.48 プロリン 1.44 グリシン 4.95 アラニン 15.08 バリン 2.24 イソロイシン 0.71 ロイシン 2.71 ヒドロキシリジン 2.86 リジン 3.94 至適温度： 30℃（0.002％水溶液）至適PH： PH7.0〜8.0 安定PH範囲： PH5.5〜9.5 鉄イオンの存在により酵素活性が促進され、
水銀イオン、カドミウムイオン、EDTAの存
在により酵素活性が阻害される。分子量： TSK G3000 SW ゲルを用いる高速液体ク
ロマトグラフイーによつて測定した分子量は約
52000。等電点：約pI5.4 ３培養が好気的条件下で行われる特許請求の範
囲第２項記載の方法。４培養される菌がストレプトマイセスパルブ
ルスＮ−１株である特許請求の範囲第２項記載
の方法。５培養される菌が微工研菌寄第8224号である特
許請求の範囲第２項記載の方法。