CN104603616B - 使用纤蛋白‑3和/或肌聚糖γ作为指标评价脂肪团的方法和评价脂肪团有效药物的方法 - Google Patents

使用纤蛋白‑3和/或肌聚糖γ作为指标评价脂肪团的方法和评价脂肪团有效药物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104603616B
CN104603616B CN201280075648.4A CN201280075648A CN104603616B CN 104603616 B CN104603616 B CN 104603616B CN 201280075648 A CN201280075648 A CN 201280075648A CN 104603616 B CN104603616 B CN 104603616B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cellulite
sarcoglycan
expression
skin
fine protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201280075648.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104603616A (zh
Inventor
吉田雄三
加治屋健太郎
M·德特马
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Shiseido Co Ltd
Original Assignee
Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Shiseido Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ, Shiseido Co Ltd filed Critical Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Publication of CN104603616A publication Critical patent/CN104603616A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104603616B publication Critical patent/CN104603616B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6881—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from skin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及在收集的皮肤样品中使用纤蛋白‑3和/或肌聚糖γ的表达作为指标评价脂肪团的方法，和在培养的细胞中使用纤蛋白‑3和/或肌聚糖γ作为指标评价改善、预防或治疗脂肪团的药物的方法。

Description

使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ作为指标评价脂肪团的方法和 评价脂肪团有效药物的方法
[技术领域]
本发明涉及评价脂肪团的方法和使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ(sarcoglycangamma)作为指标评价脂肪团有效药物的方法。
[背景技术]
“脂肪团”(也称为女性脂肪代谢障碍)是主要在女人的腹部、大腿和臀部观察到的展示皮肤的波纹外观的组织，并且尤其是美容问题，因为其显著地损害了皮肤外观。脂肪团的发病机理在学术上或医学上还没有被完全阐明，并且其被简单地认为是皮下脂肪的堆积。根据使用Mirrashed,F.和Querleux,B等进行的MRT的非侵入性分析，在脂肪团皮肤中没有观察到脂肪细胞和脂肪组织的形态学变化，但是在脂肪团皮肤中，揭示一部分皮下脂肪组织深深地突出到表皮层内(非专利文献1和2)。
因为40％的成年女人具有脂肪团，并且脂肪团明显地损害了外形美观，所以高度需要减轻、预防和治疗脂肪团，并且国内外市场上早已存在针对脂肪团的产品和美容治疗。然而，因为还没有阐明定义脂肪团的组织学特征及其形成机理，所以此类产品一般针对缺少有效数据的产品或是简单地旨在减少脂肪量的减肥药。因此，目前存在非常少的对减少、预防和治疗脂肪团真正有效的产品，并且仍然不能通过商业途径获得特异地靶向脂肪团的产品。
尽管存在很少参考文献公开用于改善脂肪团外观的药物和/或治疗及其实验数据，但是烟酰胺、共轭亚油酸和sulfocarbiose被公开为通过应用于受影响的脂肪团位点上来减轻脂肪团的药物，并公开了实验数据(专利文献1和2，和非专利文献8)，此外，1-4MHz超声刺激被公开为减轻脂肪团的治疗(专利文献3)。尽管这些文献公开了表明减轻脂肪团的效果的数据，但它们并没有明确地证明其作用机制，并因此脂肪团的减少是通过脂肪量的减少引起的还是通过除脂肪减少外的机制引起的仍然未知。
主要通过非侵入性方法研究皮肤组织来进行脂肪团的研究。然而，除了由于非侵入性方法的性质导致的与少量测试样品相关的问题外，仅已经获得零散的信息。因此，很难说已经系统研究了脂肪团。[引用列表]
[专利文献]
[PLT 1]WO99/47112
[PLT 2]WO01/17498
[PLT 3]WO2004/080147
[非专利文献]
[NPL 1]Mirrashed,P.,等.(2004).Skin Res Technol 10(3):161-8
[NPL 2]Querleux,B.,等.(2002).Skin Res Technol 8(2):118-242
[NPL 3]Mine,S.,等.(2008).PLoS One 3(12):e4066
[NPL 4]Ordway,G.A.,等.(2009).J.Neurosci Res 87(11):2430-8
[NPL 5]Erickson,H.S.,等(2009).Nat Protoc 4(6):902-22
[NPL 6]McLaughlin,P.J.,等.(2007).Hum Mol Genet 16(24):3059-70
[NPL 7]Rahn,D.D.,等(2009),Am J Pathol 174(1):206-15
[NPL 8]Hack,A.A.,等(1998).J Cell Biol 142(5):1279-87
[NPL 9]Vogelgesang,R.,等.Int J cosmet Sci 33(2):120-5
[NPL 10]Ana B R R等,JEADV(2000)14,251-262
[发明概述]
[技术问题]
在以上环境中，需要开发评价脂肪团的方法、旨在改善脂肪团的药物，和评价此类药物的方法。
[问题解决方案]
为了阐明脂肪团的组织学特征和形成机制的目的，更特别地，为了使用多种脂肪团组织和皮肤组织在组织水平上理解脂肪团特有的现象的目的，此外为了使用分子生物学方法阐明脂肪团特有现象的出现机制的目的，本发明人已经进行了研究。
更特别地，通过使用苏木精伊红(hematoxyline eosin)染色、天狼星红(SiriusRed)染色和Elastica van Gieson染色使来自展示脂肪团的女性臀部和大腿的25份皮肤活检组织样品(下文中称为脂肪团皮肤)和来自不展示脂肪团的女性臀部和大腿的19份皮肤活检组织样品(下文中称为女性对照皮肤)进行组织分析。
该组织分析揭示，乳突状结构在脂肪团皮肤中明显减少，脂肪团皮肤中真皮层上面部分中的乳突状真皮层相比于女性对照皮肤是薄的，尽管在脂肪团中含有胶原的胶原纤维的量没有注意到显著变化，但是弹性蛋白纤维趋向于减少并被扰乱，并且尽管在脂肪团皮肤本身的脂肪细胞和脂肪组织中没有发现形态学变化，但是观察到了脂肪突出形式的局部变化。
从上文提及的新的组织学发现推论，脂肪团的起因是双重的：由增加的脂肪量引起的皮肤内脂肪物突出的形成，和变化，如减少的弹性和真皮的变薄，其否则应该针对上述突出起垫子的作用，导致皮肤内波纹的向外表现。因此，发现脂肪团形成可能不仅与局部变化，如突出的脂肪有关，还与迄今为止没有引起注意的真皮层中的变化有关。因而，获得了新的发现，其表明旨在减轻体重或燃烧脂肪的减肥药不足以用于改善脂肪团，而对付真皮变化的有效药物或治疗可能为脂肪团改善所需。
为了澄清脂肪团皮肤和女性对照皮肤之间真皮纤维的变化原因，本发明人分析了真皮成纤维细胞的基因的表达水平，所述真皮成纤维细胞构成了真皮的最重要细胞并决定了其性质。更特别地，因为使用来自全层人组织的RNA的分析由于除构成大多数全层皮肤的成纤维细胞以外的细胞和/或器官的一种噪音而不能精确地鉴定成纤维细胞的性质，本发明人已经使用了激光捕获显微解剖方法(非专利文献4和5)来从皮肤组织切片中提取真皮成纤维细胞的mRNA，然后已经进行了基因微阵列。结果，本发明人已经成功鉴定了大量基因，其表达水平在脂肪团皮肤和女性对照皮肤之间不同。
由于通过使用定量PCR特异地检查脂肪团皮肤的成纤维细胞中该大量基因的表达，证实了脂肪团皮肤中纤蛋白-3和肌聚糖γ的显著减少的表达(图4和6)，此外通过免疫组织染色观察到了类似的趋势(图3和5)。
纤蛋白-3是参与弹性纤维形成的细胞外蛋白质之一，并且作为常见的功能，已知其涉及弹性蛋白纤维形成。(非专利文献6和7)。另一方面，尽管皮肤中肌聚糖γ(其为蛋白聚糖)的功能还未被证明，但是作为常见的功能，已知肌聚糖γ保护肌膜免于功能缺陷个体的表型。
因此，认为纤蛋白-3的减少表达通过弹性纤维，特别是弹性蛋白纤维的异常形成参与脂肪团形成，并且还认为肌聚糖γ的减少表达通过在成纤维细胞中保护细胞膜的功能减弱而参与脂肪团形成。然而，本发明不应受限于这些机制。
此外，当向培养细胞中加入已知改善脂肪团外观的烟酰胺和共轭亚油酸时，本发明人已经发现这些试剂以剂量依赖性方式增强了纤蛋白-3和肌聚糖的表达。因而，本发明人总结，这些试剂可以通过增强已经在脂肪团皮肤中减少的纤蛋白-3和肌聚糖γ的表达而将真皮纤维的变化恢复至正常，由此可以改善所述脂肪团的外观(图7和8)。此外，当向培养细胞应用已知改善脂肪团外观的1MHz超声刺激时，没有发现纤蛋白-3的表达变化，但是肌聚糖γ的表达增强。因而，本发明人已经总结，脂肪团的真皮纤维中的变化通过肌聚糖γ表达的增强而恢复至正常(图9)。
基于以上研究和本发明人证明的新发现，本发明人已经总结，纤蛋白-3和肌聚糖γ的减少的表达是脂肪团形成的原因，并且因此已经发明了使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ作为指标评价脂肪团的方法，和使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ作为指标评价药物减少、改善、预防或治疗脂肪团的方法。
因此，本发明涉及以下：
[1]在所收集的皮肤样品中使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达作为指标评价脂肪团的方法。
[2]项目[1]的评价方法，其中所述皮肤样品是真皮。
[3]项目[1]或[2]的评价方法，其中所述皮肤样品是真皮成纤维细胞。
[4]在培养的细胞中使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ作为指标评价改善、预防或治疗脂肪团的药物的方法。
[5]项目[4]的评价方法，其包括以下步骤：
向培养细胞中加入候选药物；
确定纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达；和
比较对照中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达与加入候选药物后纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达。
[6]项目[4]或[5]的评价方法，其中所述培养细胞是真皮成纤维细胞。
[7]项目[4]-[6]任一项的评价方法，其中当在上文比较步骤中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ表达的量增强时，判断候选药物具有抑制脂肪团的活性。
[8]评价美容方法减轻脂肪团的方法，其使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ表达的量作为指标。
[9]项目[8]的评价方法，其包括以下步骤：
在应用美容方法之前确定皮肤的真皮中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ表达的量；
应用所述美容方法；
在应用美容方法之后确定皮肤的真皮中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达；和
比较应用美容方法之前和之后皮肤的真皮中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达。
[10]项目[9]的评价方法，其中当在上文比较步骤中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达增强时，判断美容方法具有抑制脂肪团的活性。
[11]项目[10]的评价方法，其中通过定量PCR在上述皮肤的真皮中为通过激光显微解剖收集的样品进行纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达的确定。
[发明的有益效果]
本发明通过使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达作为指标使得能够适当地评价活体中的脂肪团。同样，通过使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达作为指标，评价药物抑制或减少脂肪团的活性成为可能，并且筛选药物治疗、预防或减轻脂肪团是可能的。
[附图简述]
[图1]图1显示了女性对照皮肤和脂肪团皮肤的外观照片，和通过利用Elasticavan Gieson染色来染色皮肤切片获得的照片。在女性对照皮肤中，显示弹性蛋白纤维在真皮中紧密排列存在，然而显示脂肪团皮肤弹性蛋白纤维聚集并且稀疏地存在。
[图2]图2显示了弹性蛋白纤维排列程度的图像。得分1表示照片中的弹性蛋白纤维被扰乱，并且其量是低的。随着得分增加，弹性蛋白纤维整齐排列，并且其量是高的。
[图3]图3是显示真皮中纤蛋白-3的免疫染色的图画。其显示，没有患有脂肪团的女性对照皮肤中纤蛋白-3的表达高，然而，脂肪团皮肤中纤蛋白-3的表达低。
[图4]
图4是显示通过定量PCR测定真皮中纤蛋白-3的mRNA的量的结果的图画。其显示，在没有患有脂肪团的女性对照皮肤中纤蛋白-3的表达高，然而，脂肪团皮肤中纤蛋白-3的表达低。
[图5]
图5是显示真皮中肌聚糖γ的免疫染色的图画。其显示，没有患有脂肪团的女性对照皮肤中肌聚糖γ的表达高，然而，脂肪团皮肤中肌聚糖γ的表达低。
[图6]
图6是显示通过定量PCR测定真皮中肌聚糖γ的mRNA的量的结果的图画。其显示，在没有患有脂肪团的女性对照皮肤中，肌聚糖γ的表达高，然而在脂肪团皮肤中肌聚糖γ的表达低。
[图7]
图7是显示当向培养的成纤维细胞中加入共轭亚油酸时，肌聚糖γ和纤蛋白-3的表达变化的图画。
[图8]
图8是显示当向培养的成纤维细胞中加入烟酰胺时，肌聚糖γ和纤蛋白-3的表达变化的图画。
[图9]
图9是显示当向培养的成纤维细胞应用1MHz超声刺激时，肌聚糖γ和纤蛋白-3的表达变化的图画。
[实施方案的描述]
本发明涉及在所收集的皮肤样品中使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达作为指标评价脂肪团的方法。更特别地，所述收集的样品特别是真皮组织，更优选真皮成纤维细胞。可以通过任何方法收集皮肤样品，但是在仅收集目的细胞方面，优选通过激光显微解剖进行收集。
本发明评价脂肪团的方法使得能够在患有多种严重程度的脂肪团的受试者中通过确定从所述受试者获得的皮肤样品中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达并预先澄清表达和严重程度之间的关系来评价脂肪团。随着脂肪团严重程度的增加，方法从脂肪团的外观将脂肪团划分为0到4级(NLP 1)。在下表中列出了脂肪团严重程度划分的标准：
[表1]
然而，严重性的划分不应该受限于上文的划分方法，可以使用任何划分。例如，本领域还知道用于划分脂肪团的方法，其不基于皮肤的外观，而是基于组织病理学和临床观察(NLP10)。根据该划分方法，可以如下表中所述划分脂肪团的严重性：
[表2]
通过将这些划分方法的各等级等预先与纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达水平相关联来在受试者中评价脂肪团成为可能。
通过使用本发明的纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达作为指标，可以诊断在皮肤表面不可见的早期阶段的脂肪团，由此其特异地用于脂肪团的早期发现和预防。如果脂肪团的早期发现是可能的，那么其使得能够在皮肤表面出现脂肪团之前，即皮肤外观受不良影响之前采取任何预防措施，因此其为最优选的。
在本发明的另一实施方案中，本发明涉及通过在培养细胞中使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ作为指标评价改善、预防或治疗脂肪团的药物的方法。更特别地，评价改善、预防或治疗脂肪团的药物的所述方法可以包括以下步骤：
向培养的细胞中加入候选药物；
确定纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达；和
比较对照中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达与加入候选药物后纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达。此外，当纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达增强时，在比较步骤中或之后可以包括确定候选药物具有抑制脂肪团活性的步骤。
本发明评价改善、预防或治疗脂肪团的药物的方法可以用于筛选方法，其允许通过使用含有多种候选药物的候选药物库，如化合物库和提取物库来选择具有降低脂肪团活性的候选药物。因此，本发明评价改善、预防或治疗脂肪团的药物的方法也涉及药物的筛选方法。
在本发明的再一实施方案中，本发明还涉及使用纤蛋白-3和/或肌聚糖γ作为指标来评价美容方法减轻和/或改善脂肪团的方法。更特别地，评价美容方法的方法包括以下步骤：
在应用美容方法之前确定皮肤的真皮中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达；
应用美容方法；
在应用美容方法之后确定皮肤的真皮中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达；和
在应用美容方法之前和之后比较皮肤的真皮中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达。所述美容方法包括，但不限于美容、锻炼、按摩和超声治疗。当在比较中应用该美容方法后，皮肤真皮，特别是皮肤真皮的成纤维细胞中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达增强时，其被确定为对于减轻和/或改善脂肪团有效。评价美容方法的这种方法不仅可以由个人提供，还可以由美容销售人员或除医师以外的审美学家提供。
根据本发明，可以通过任何方法确定待用作指标的纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达，只要其可以用于基因表达的研究，例如通过定量PCR确定mRNA的量，通过Northern印迹确定mRNA的量，并通过Western印迹确定蛋白质的量，可以使用ELISA或免疫沉淀。从测定观点出发，使用通过激光显微解剖收集的小量样品，可以优选通过定量PCR测定mRNA。
在本发明的方法中，待用作指标的纤蛋白-3和肌聚糖γ各自的表达可以单独使用或纤蛋白-3和肌聚糖γ两者均可以用作指标。
根据本发明，纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的增强表达表示，相对于对照中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达，加入候选药物后纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达增加，优选增加20％或更高，更优选35％或更高，并最优选50％或更高。表达的增加优选是统计学上显著的。
真皮是位于表皮下面的结构，并且表皮和真皮被基膜隔开。成纤维细胞存在于真皮中，并且在解剖学上，真皮由两层乳头层和网状层构成。
培养的细胞可以是任何细胞，只要它们来源于皮肤细胞。在与脂肪团相关的细胞方面，特别优选真皮细胞，更优选来自真皮的成纤维细胞的培养细胞。
[实施例]
实施例1：组织切片的制备
使用来自展示脂肪团外观的臀部和/或大腿的25份皮肤活检组织样品(下文中称为脂肪团皮肤)和来自不展示脂肪团外观的臀部和大腿的19份皮肤活检组织样品(下文中称为对照皮肤)进行组织分析。所有活检皮肤组织均获自女人。将活检皮肤组织包埋在用于冰冻组织的包埋剂OCT化合物(Sakura Finetek)中，并且使用冰冻切片制备仪器Cryostat(Leica)制备冰冻切片载玻片。
实施例2：组织化学染色
将实施例1中获得的组织切片空气干燥后，根据说明书中描述的方法，使用Elastica van Gieson染色试剂(Merck)对各组织切片进行Elastica van Gieson染色。从Elastica van Gieson染色的结果看，弹性蛋白纤维在脂肪团皮肤的真皮中的排列被扰乱，并且弹性蛋白纤维与对照皮肤相比是聚集的并且减少的(图1)。为了明显地表明该点，随机选择14份脂肪团组织切片样品和9份对照组织切片样品，然后在盲法试验中通过两个观察者对它们评分。预先将得分确定为由5个等级组成，并且当得分是5(其为最高等级)时，弹性蛋白纤维被确定为在真皮中丰富且排列整齐，然而当得分是1(其为最低等级)时，弹性蛋白纤维被确定为减少且杂乱的。将两个观察者确定的得分的平均值分成脂肪团组和对照组，并且分别作图以确定得分趋势。结果，其显示，脂肪团组中弹性蛋白纤维的排列被扰乱，并且脂肪团组中的弹性蛋白纤维是聚集且减少的(图2)。从这些结果看，本发明人已经总结出，真皮弹性蛋白纤维(其应该作为针对由真皮中脂肪突出形成的波纹的垫子起作用)是聚集且减少的，由此由真皮中脂肪突出形成的波纹出现在皮肤表面上以形成脂肪团。
将实施例1中获得的组织切片空气干燥后，如下进行纤蛋白-3和肌聚糖γ的免疫组织染色。将组织切片在4％PFA中固定15分钟后，利用PBS洗涤所述组织切片，并使用CSAIIBiotin-free Tyramide Signal Amplification system(DAKO)，根据DAKO的方案使其进行免疫染色。所使用的抗体是抗人纤蛋白-3抗体(Santa Cruz)和抗人肌聚糖γ抗体(Abcam)。DAB染色后，利用封固剂和盖玻片封固切片，在显微镜，如荧光显微镜(Olympus)下检查并拍照(图3和5)。
实施例3:提取来源于皮肤组织切片的成纤维细胞的痕量RNA、cDNA合成和扩增
通过使用PEN膜玻璃载玻片(Molecular Device)从利用冰冻切片制备仪器Cryostat(Leica)制备的组织切片制备组织切片载玻片，然后使用冰冻切片染色试剂盒(Arcturus)进行染色。随后，将组织切片载玻片浸入利用无RNA酶的蒸馏水(下文中称为蒸馏水)制备的75％乙醇中30秒，在蒸馏水中浸泡30秒，然后在100μl Histogene染色溶液(Arcturus)中染色20秒。在蒸馏水中洗涤30秒后，将载玻片分别在75％、95％和100％乙醇系列和二甲苯中浸泡并脱水30分钟。将脱色并脱水的组织切片载玻片放置在激光显微解剖仪器Veritas(Arcturus)中，并显微解剖含有成纤维细胞(其为定位在真皮中的单个细胞)的区域，同时注意不要污染血管或其他附属器官。随后，通过使用Rneasy Plus Micro试剂盒(Qiagen)进行痕量RNA的提取和纯化。将含有显微解剖的成纤维细胞的切片区域置于含有350μl含有1％巯基乙醇的RLT加缓冲液的500μl管中，以提取RNA。然后，根据Qiagen的方案，纯化和分离痕量RNA。冰上冷却后，将其转移到cDNA合成过程中。根据所提供的方案使用WTOvation Pico System(NuGEN)，基于提取的RNA作为模板合成单链cDNA，然后进行扩增。通过使用Bioanalyzer 2100(Agilent)证实cDNA合成和扩增。通过使用核酸定量仪器Nanodrop(Thermo Scientific)测定浓度。
实施例4：纤蛋白-3和肌聚糖γ的定量PCR
通过使用合成的cDNA作为模板，进一步通过使用反应试剂LightCycler(注册商标)FastStart DNA MasterPlus SYBR Green(Roche)，和反应仪器LightCycler(Roche)或AB 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)进行定量RT-PCR。用于组合物的条件如在Roche的方案中所述。将引物的退火温度设置在60℃，并通过使用ΔΔCt方法进行定量。
用于定量PCR的引物对的序列信息如下：
G3PDH正向:5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'
反向:5'-TGGGATTTCCATTGATGACA-3'
18S rRNA正向:5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3'
反向:5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3'
纤蛋白-3正向:5'-GCTTCCGTTGTTATCCACGAAATCC-3'
反向:5'-CTGTATCTGGAAGATGTCTGATGGC-3'
肌聚糖γ正向:5'-GAGGCCAGAGAATCAGTATGTCTAC-3'
反向:5'-CCATCTTTTGTTACACACAAGTGGCC-3'
校正对照组中cDNA的量，并分别在女性对照皮肤和脂肪团皮肤之间比较纤蛋白-3和肌聚糖γ的表达。在图4和6中显示了结果。
实施例5：加入已知改善脂肪团的药物的实验
将来源于人皮肤组织的成纤维细胞平板接种在24孔I型胶原包被的皿(IWAKI)中，并在10％胎牛血清补充的DMEM(Gibco/Invitrogen)中，在37℃和5％CO2的条件下培养至70-80％汇合。利用无血清培养基替换半天后，进一步利用具有多种浓度的共轭亚油酸(Sigma)(0.001％v/v,0.01％v/v)或烟酰胺(Sigma)(0.0005％v/v,0.005％v/v)的无血清培养基替换。24小时后，通过使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)，根据Qiagen的方案回收RNA。作为对照，使用通过完整的无血清培养基替换培养基并在24小时后回收RNA而制备和回收的RNA。使用核酸定量仪器Nanodrop(Thermo Scientific)确定所回收的RNA的浓度。在相同浓度下调整可比较对照组的RNA浓度后，使用cDNA合成试剂盒高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)，根据Applied Biosystems的方案从RNA合成cDNA。使用实施例4中描述的方法，在图7和图8中显示了当使用各自已知的改善脂肪团的药物时纤蛋白-3的表达和肌聚糖γ的表达的变化。
实施例6：培养细胞的超声处理
将来源于人皮肤组织的成纤维细胞平板接种在35mm孔皿(Becton Dickinson)中，并在10％胎牛血清补充的DMEM(Gibco/Invitrogen)中，在37℃和5％CO2的条件下培养至70-80％汇合。利用无血清培养基替换半天后，进一步利用新鲜的无血清培养基进行替换，并使用超声美容机器(Matsushita Denko)距离0.5mm进行1MHz超声刺激。考虑到细胞直接被刺激，将刺激时间设置为短的20秒。刺激24小时后，根据Qiagen的方案回收RNA。使用核酸定量仪器Nanodrop(Thermo Scientific)确定所回收的RNA的浓度。在相同浓度下调整可比较对照组的RNA浓度后，使用cDNA合成试剂盒高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems)，根据Applied Biosystems的方案从RNA合成cDNA。使用工作实施例4中描述的方法，在图9中显示了当进行超声处理时纤蛋白-3的表达和肌聚糖γ的表达的变化。

Claims (4)

1.评价脂肪团的形成的方法，其使用在收集的真皮成纤维细胞中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的减少的表达量作为指标。
2.评价脂肪团的改善、预防或其治疗药剂的方法，其使用在培养的真皮成纤维细胞中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的增加的表达作为指示剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其包括以下步骤：
向培养的真皮成纤维细胞中加入候选药物；
测定纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达；和
比较对照中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达与加入候选药物后纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达量。
4.根据权利要求3所述的方法，其中当在上述比较步骤中纤蛋白-3和/或肌聚糖γ的表达增强时，判断所述候选药物具有抑制脂肪团的活性。
CN201280075648.4A 2012-09-07 2012-09-07 使用纤蛋白‑3和/或肌聚糖γ作为指标评价脂肪团的方法和评价脂肪团有效药物的方法 Active CN104603616B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2012/073561 WO2014038097A1 (en) 2012-09-07 2012-09-07 Method of evaluating cellulite and method of evaluating cellulite-effective drug using fibulin-3 and/or sarcoglycan gamma as an indicator

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104603616A CN104603616A (zh) 2015-05-06
CN104603616B true CN104603616B (zh) 2017-03-08

Family

ID=46970373

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280075648.4A Active CN104603616B (zh) 2012-09-07 2012-09-07 使用纤蛋白‑3和/或肌聚糖γ作为指标评价脂肪团的方法和评价脂肪团有效药物的方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US9933436B2 (zh)
EP (1) EP2893345B1 (zh)
JP (1) JP6049862B2 (zh)
CN (1) CN104603616B (zh)
ES (1) ES2647895T3 (zh)
HK (1) HK1210264A1 (zh)
WO (1) WO2014038097A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013106510A2 (en) 2012-01-12 2013-07-18 Auxilium Pharmaceuticals, Inc. Clostridium histolyticum enzymes and methods for the use thereof
CN115969318A (zh) * 2017-03-01 2023-04-18 恩多风投有限公司 用于评估和治疗橘皮组织的装置和方法
KR102642381B1 (ko) 2017-03-28 2024-02-28 엔도 벤쳐즈 리미티드 개선된 콜라게나제 생성 방법
WO2024004675A1 (ja) * 2022-07-01 2024-01-04 国立大学法人大阪大学 肝臓癌の発症可能性を検査する方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3122177B2 (ja) * 1991-08-09 2001-01-09 旭硝子株式会社 薄膜トランジスタとその製造方法
JP3179887B2 (ja) * 1992-09-02 2001-06-25 ポーラ化成工業株式会社 皮膚メラニンの評価法
AU3000499A (en) * 1998-03-16 1999-10-11 Procter & Gamble Company, The Method of reducing cellulite in mammalian skin
ITMI991894A1 (it) 1999-09-09 2001-03-09 Carlo Ghisalberti Acido linoleico coniugato e trigliceride nuovi metodi di sintesi e d'uso
HUE035374T2 (hu) 2003-03-13 2018-05-02 Real Aesthetics Ltd Ultrahangos cellulitis kezelés
WO2006052735A2 (en) * 2004-11-04 2006-05-18 National Jewish Medical And Research Center Fibulin-3 and uses thereof
EP1738747B1 (en) * 2005-06-30 2008-01-02 Evonik Goldschmidt GmbH Use of salicyloyl-sphingoidbase for the treatment or prevention of cellulite
US20070031482A1 (en) * 2005-08-02 2007-02-08 Ceramoptec Industries, Ind. PDT treatment method for cellulites and cosmetic use
WO2007027509A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Biogen Idec Ma Inc. Evaluating and treating scleroderma
WO2007100590A2 (en) * 2006-02-22 2007-09-07 Auxilium Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cellulite
WO2008073201A2 (en) * 2006-11-10 2008-06-19 Health Research Inc. Compositions and methods for identifying agents that alter expression of survivin
FR2930154B1 (fr) * 2008-04-21 2012-04-20 Oreal Utilisation d'un extrait de baie, et plus particulierement de wolfberry, pour maintenir et/ou restaurer la tonicite et/ou la fermete de la peau
WO2010046861A1 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 Novodermix International Limited Composition for treatment of epithelial tissue
EP3272329B1 (en) * 2010-06-30 2020-09-16 Avon Products, Inc. Compositions and methods for stimulation magp-1 to improve the appearance of skin

Also Published As

Publication number Publication date
US20180196064A1 (en) 2018-07-12
CN104603616A (zh) 2015-05-06
WO2014038097A1 (en) 2014-03-13
EP2893345A1 (en) 2015-07-15
US20150301064A1 (en) 2015-10-22
US10718782B2 (en) 2020-07-21
EP2893345B1 (en) 2017-11-08
US9933436B2 (en) 2018-04-03
JP6049862B2 (ja) 2016-12-21
ES2647895T3 (es) 2017-12-27
HK1210264A1 (zh) 2016-04-15
JP2015530071A (ja) 2015-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104840371B (zh) 间质干细胞萃取物及其用途
US10718782B2 (en) Method of evaluating cellulite and method of evaluating cellulite-effective drug using fibulin-3 and/or sarcoglycan gamma as an indicator
JP6836950B2 (ja) 細胞外マトリックスに関連した皮膚色素斑の分子シグネチャー
US20220031759A1 (en) Composition for skin regeneration and wound healing, comprising induced exosomes
JP2020531027A (ja) 老化の徴候を示す皮膚の診断方法
CN103619317B (zh) 和细胞外基质结构相关的皮肤色斑分子标签
Wang et al. Effect of advanced glycosylation end products on apoptosis in human adipose tissue-derived stem cells in vitro
JP2019122265A (ja) 育毛作用の予測方法
Xu et al. FSTL1 promotes nitric oxide-induced chondrocyte apoptosis via activating the SAPK/JNK/caspase3 signaling pathway
CN107847424A (zh) 包含脂肪干细胞诱引剂的、由真皮空洞化引起的皮肤的松弛或老化改善剂
JP5693821B2 (ja) 皮膚のエストロゲン応答性を測定する方法、及び、シワ・タルミの形成、又はキメが粗くなるという皮膚老化の進行状態を予測する皮膚検査方法
CN107012235A (zh) 检测fgl2基因或fgl2蛋白表达水平的物质在诊断和预示肾癌产品中的应用
EP3302716B1 (en) Methods for identifying circadian rhythm-dependent cosmetic agents for skin care compositions
JP7272808B2 (ja) 抗皮膚老化剤のスクリーニング方法
JP7219087B2 (ja) 抗皮膚老化剤のスクリーニング方法
RU2392866C1 (ru) Способ оценки адаптационного потенциала у больных раком молочной железы
Trevor Overcoming wound healing complications following radiotherapy in human breast dermal fibroblasts, through the influence of preadipocytes from the stromal vascular fraction
KR20220101913A (ko) 피부 섬유아세포에서 발현하는 노화 관련 후각 수용체 유전자 및 이들의 용도
KR20210009981A (ko) 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성의 평가방법
JP2012039970A (ja) 皮膚損傷の程度を検査する方法
CN104888221A (zh) 一种治疗皮肤萎缩相关疾病的药物作用靶点
CN105219877A (zh) Ccdc59的激动剂在制备骨性关节炎药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1210264

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1210264

Country of ref document: HK