CN104888221A - 一种治疗皮肤萎缩相关疾病的药物作用靶点 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用E-Cadherin抑制剂的应用来治疗皮肤萎缩相关疾病的方法,皮肤萎缩相关疾病包括但不局限于:生理情况下的皮肤萎缩,如衰老性皱纹;机械张力诱导的皮肤萎缩病,如妊娠纹、膨胀纹等;服用药物后导致的皮肤萎缩,以及其他皮肤萎缩相关疾病,如系统性硬化病、皮肌炎、埃-当综合征、皮肤异色病、Ccokayne氏综合征等。本发明优点在于:本发明系通过干预E-cadherin以调控表皮细胞去分化,使干细胞的数量增多,从而调节组织再生能力;一个实例是使用siRNA抑制剂沉默E-Cadherin,显著促进了皮肤再生,激活胶原新生,增加皮肤厚度,缓解皮肤萎缩症状。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地说,是一种治疗皮肤萎缩相关疾病的药物作用靶点。
背景技术
萎缩性皮肤病(Atrophic Skin Disease)是由多种因素导致的生理性或病理性的皮肤组织退行性变,基本病理改变表现为基底层干细胞数量减少,棘细胞层萎缩,表皮变薄,表皮突变平。真皮层胶原蛋白合成分泌能力下降、胶原纤维断裂老化,从而导致真皮萎缩、皮肤总厚度变薄等症状,并伴发皮肤功能障碍的一系列疾病。皮肤萎缩病覆盖人群广,产生原因复杂,是目前学界亟待解决的难题之一。然而,目前尚无统一对症治疗方案,故该问题的解决具有较高的学术和商业价值。
以发生诱因分类,萎缩性皮肤病所涉及的主要疾病包括生理情况下的皮肤萎缩,如衰老性皱纹;机械张力诱导的皮肤萎缩病,如妊娠纹、膨胀纹等;服用药物后导致的皮肤萎缩,以及其他皮肤萎缩相关疾病,如系统性硬化病(scleroderma)、皮肌炎(Dermatomyositis)、埃-当综合征(Ehlers-Danlossydrome)、皮肤异色病(Poikiloderma)、Ccokayne氏综合征等。在前期的研究中发现,以机械张力诱导的萎缩性皮肤病为例,萎缩性皮肤病表现在几个主要的方面:1、表皮基底层干细胞数量的减少,增殖细胞数量减少;2、真皮新生胶原减少,弹力纤维减少,排列紊乱,细胞间基质分泌减少;3、表皮基底层端粒酶活性下降,细胞分裂潜力下降。4、皮肤厚度变薄,皮肤密度下降。针对以上几个方面,几种现有的技术可针对萎缩性皮肤病进行对症治疗,如:1、为了增加皮肤组织干细胞的含量,提升皮肤再生能力,可进行干细胞移植治疗;2、为了增加皮肤厚度,提升细胞外基质含量,进行真皮填充物注射,如透明质酸、胶原蛋白等。3、肉毒毒素局部注射以麻痹局部神经,以减少衰老性皱纹的发生。
1.干细胞治疗存在的缺陷
以骨髓间充质干细胞治疗为例:
(1)有限性:因免疫排异问题,用于治疗的干细胞必须来源于自体,而成体干细胞的数量自出生即是恒定的,并且随着年龄增长其数量逐步减少。因此,自体干细胞是相当有限和宝贵的自体再生资源,不能维系治疗周期较长的疾病。
(2)过程繁琐:目前最多用于临床干细胞治疗的是骨髓间充质干细胞,事先需服用药物动员骨髓间充质干细胞,然后进行局麻下的骨髓穿刺,操作过程繁琐。
(3)体外污染:干细胞治疗环节涉及多道程序,干细胞在体外程序中易被病原体污染,造成安全问题。
(4)致瘤性:干细胞增殖分化过程中出现基因组不稳而导致自发突变,易出现染色体异常而形成肿瘤,形成安全隐患。
(5)有创性:干细胞治疗中,不论是提取骨髓间充质干细胞还是脂肪干细胞,都需要进行有创性操作提取干细胞,给患者带来身体上的痛苦。
2.透明质酸钠注射所存在的缺陷
(1)易吸收:仅作为真皮填充物增加细胞外基质的含量,而并不真正产生胶原蛋白,易被机体吸收,维持时间短,需反复注射以维持填充量。
(2)有创性:仅能通过注射的用药途径到达真皮,注射点易发生淤血,血肿等注射后并发症。
(3)血管堵塞风险:由于属于真皮注射物,如操作者经验不足,或操作不当则可发生严重并发症,如注射物阻塞局部血管,造成局部皮肤组织坏死,严重者甚至导致失明。
3.胶原蛋白注射所存在的缺陷
(1)免疫原性:现今的免疫学分析和研究结果表明,动物制品来源胶原蛋白注射能够诱导机体T细胞启动免疫反应,在治疗时对患者进行胶原注射,大约3%的患者有潜在的反应,反复多次注射后有1%-2%的患者会产生迟发型过敏反应的症状,典型症状包括局部水肿、红斑,又的伴有硬化和瘙痒,持续时间达4个月至一年。
(2)易吸收:胶原蛋白注射后一般三个月即被机体吸收,需重复注射以保持皮肤真皮厚度。
(3)有创性:仅能通过注射的用药途径到达真皮,注射点易发生淤血,血肿等注射后并发症。
4.肉毒毒素注射所存在的缺陷
(1)表情僵硬:由于肉毒毒素注射阻断的是神经递质,其除皱效果是通过麻痹局部运动神经而达到的,故除皱后局部表情僵硬,注射过量甚至形成所谓的“肉毒素脸”,为患者平日生活工作交流带来负担和痛苦。
(2)不良反应:肉毒素注射后不良反应有头痛、背痛等。
(3)有创性:仅能通过注射的用药途径达到效果,注射点易发生淤血,淤青等注射后并发症。
(4)仅有除皱作用:肉毒毒素作用的靶点为神经递质,通过麻痹神经达到除皱效果,而并不对真皮间质产生直接作用,不增加胶原和细胞间基质的含量,亦无法真正促进皮肤组织的再生。故肉毒毒素除了对衰老性皱纹有效外,对其他萎缩性皮肤病均无作用。
中国专利文献CN101616675A公开了一种涉及糖皮质激素和β-环糊精缀合的维生素A衍生物复合物的联合药物和含该联合药物的药用组合物,可用该发明联合药物和组合物减少或消除由糖皮质激素(GC)治疗引起的皮肤萎缩症,还包括减少或消除由GC治疗引起的皮肤萎缩症的方法。但是关于一种治疗皮肤萎缩相关疾病的药物作用靶点目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供以Cdh1基因/E‐Cadherin蛋白作为药物作用靶点的药物的应用。
本发明的第二个目的是,提供一种小核苷酸组合物或膏剂及其应用。
本发明的第三个目的是,提供以FoxO1基因/FoxO1蛋白作为药物作用靶点的药物的应用。
为实现上述第一个目的,本发明采取的技术方案是:以Cdh1基因作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤萎缩相关疾病药物中的应用。
以E‐Cadherin蛋白作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤萎缩相关疾病药物中的应用。
所述的皮肤萎缩相关疾病包括但不仅限于:皮肤生理性萎缩,如因衰老形成的皱纹;机械张力诱导的皮肤萎缩病,如妊娠纹、膨胀纹等;服用药物后导致的皮肤萎缩,以及其他皮肤萎缩相关疾病,如系统性硬化病、皮肌炎、埃‐当综合征、皮肤异色病、Ccokayne氏综合征等。
所述的以Cdh1基因或E‐Cadherin蛋白作为药物作用靶点的药物是干预Cdh1基因或E‐Cadherin蛋白的表达与功能的抑制剂,所述的干预Cdh1基因或E‐Cadherin蛋白的表达与功能的抑制剂包括但不仅限于:中和性抗体,小分子拮抗剂,小核苷酸,微小核糖核酸,反义分子或多肽抑制剂。
优选的,所述的小核苷酸选自表1中的小核苷酸分子。
所述的以Cdh1基因或E‐Cadherin蛋白作为药物作用靶点的药物可以激活哺乳动物细胞端粒酶的活性,并因此延长端粒的长度。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:一种组合物,所述的组合物包括药学上可接受的载体和表1所述的小核苷酸分子。
一种无需载体即能导入皮肤组织的小核苷酸的膏剂,所述的膏剂的制备方法为:对表1所述的小核苷酸分子进行2端OME修饰和胆固醇化学修饰,溶解于丙二醇,并混合于的愈合膏中。
优选的,所述的丙二醇为体积质量比v/w为20%-100%丙二醇。
所述的组合物或膏剂在制备经皮给药小核苷酸药物中的应用。
优选的,所述的经皮给药小核苷酸药物是治疗皮肤萎缩相关疾病的药物。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:以FoxO1基因作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤萎缩相关疾病的药物中的应用。
以FoxO1蛋白作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤萎缩相关疾病的药物中的应用。
所述的以FoxO1基因或FoxO1蛋白作为药物作用靶点的药物的干预方式是促进FoxO1进入细胞核或者使FoxO1表达量增多。所述的以FoxO1基因或FoxO1蛋白作为药物作用靶点的药物包括但不仅限于:FoxO1蛋白的入核激动剂,如小分子药物,多肽;或以慢病毒、腺病毒、质粒作为载体构建的FoxO1过表达体系。
本发明优点在于:
1、本发明系通过干预E-cadherin以调控表皮细胞去分化,使干细胞的数量增多,从而调节组织再生能力,并不动用机体有限宝贵的干细胞再生资源;
2、本发明涉及的药物相对于干细胞治疗而言,用药途径无创简便,无需事先服药动员干细胞,无需局麻手术提取干细胞,无需繁复的体外分离技术增加污染,细胞株突变致瘤的可能。规避了诸多干细胞治疗过程中的弊端;
3、两独立研究证实,E-cadherin条件性敲除小鼠不具有致瘤性,敲除小鼠的存活能力较野生型而言不具有明显的差异,佐证了以E-cadherin为靶点的药物的安全性;
4、本发明涉及的药物相对于透明质酸注射、胶原注射等真皮填充的方式而言,具有无创性,简便性等优势;
5、本发明涉及的药物帮助诱导自体胶原新生,不存在类似胶原蛋白注射的免疫原性、抗原性等问题;
6、本发明涉及的药物相对于目前现行药物具有成本上的显著优势,合成成本较低。
附图说明
图1.E-cadherin的结构模式图。能够帮助上皮细胞组成粘附连接,促进上皮细胞分化和屏障功能的建立。
图2.体外药物靶向干预后,有效序列能够显著敲低人类和大鼠的Cdh1和FoxO1a基因的表达(左)和蛋白水平的表达(右)。
图3.对角质形成细胞进行Cdh1敲低之后进行PCR检测,发现干预显著提升干细胞标记物基因的表达,显著减低细胞分化标记物基因的表达(左),在蛋白层面上,通过western blot检测发现Cdh1敲低之后与PCR实验结果一致(右)。
图4:通过免疫荧光检测,发现Cdh1敲低之后干细胞的标记物,例如krt5,krt15,krt19相对对照组而言显著升高(左),Cdh1敲低后可显著增加细胞增殖能力,提升细胞抗失巢凋亡能力,增加细胞存活几率。
图5.对角质形成细胞进行Cdh1敲低之后,转录因子β-catenin核转移能力显著增加,基因层面的表达也显著升高,其下游基因端粒酶的表达随β-catenin的表达提升后也有了相对应的升高。
图6.对角质形成细胞进行Cdh1敲低之后,能够显著增加端粒的长度,使细胞“返老还童”,增加细胞寿命。右图展示了转录因子β-catenin结合端粒酶基因启动子部位机制图。
图7.成纤维细胞与角质形成细胞共培养之后增殖能力增加。A.成纤维细胞与干预CDH1表达的角质形成细胞共培养后,干预组成纤维增殖能力显著加快;B.干预组成纤维细胞胞体肥大,呈现纤维母细胞形态。核分裂相相对于对照组显著增多;C.蛋白芯片筛查发现干预CDH1表达的角质形成细胞分泌spp1和fgf-2的能力显著升高,两者均为刺激成纤维细胞生长、促进胶原分泌的外分泌蛋白。
图8.对角质形成细胞进行Cdh1敲低之后,转录因子FoxO1核转移能力显著增加,基因层面的表达也显著升高。
图9.对角质形成细胞进行FoxO1和Cdh1的双重干预后,发现FoxO1为分化细胞转变为干细胞的始动因子,Cdh1敲低后导致的干性升高可被FoxO1的干扰所阻断。
图10.经过药物涂抹干预后,实验组表达更多表皮干细胞标记物keratin5;B.实验组经过干预后表达更多毛囊干细胞标记物keratin 15,以及端粒酶活性显著升高。
图11.干预CDH1能够使胶原分泌增加,皮肤厚度增加。A.干预组HE染色示表皮基底层下新生胶原;B.对照组HE染色未见显著新生胶原;C.干预组MASSON染色示表皮基底层下新生胶原;D.对照组HE染色未见显著新生胶原;E.干预组皮肤厚度相比对照组增厚两倍。
图12.人体试验中观察到实验组涂抹siEcad药膏的手背皮肤显著增厚,皮肤质地柔韧,具有更好的弹性、延展性。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明主要通过靶向干预一上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)的表达或功能,实现将上皮细胞基底干细胞含量增多,促进真皮胶原新生,增加皮肤厚度(图1)。E-cadherin蛋白是一种广泛表达在上皮细胞的钙黏蛋白,能够帮助上皮细胞组成粘附连接,促进上皮细胞的分化和屏障功能的建立。干预E-cadherin蛋白的表达与功能的方式较多,如中和性抗体、小分子药物、小核苷酸,微小核糖核酸,多肽等。
这些方式与现有治疗方式相比,具有诸多优势,比如:
(1)本发明系通过局部涂抹药膏,实现无创性干预E-cadherin的表达以调控表皮细胞的去分化功能,使表皮干细胞的数量增多,从而调节皮肤组织再生能力。
(2)本发明涉及的药物能够通过局部涂抹药物,促进成纤维细胞增殖加速皮肤胶原新生。无需通过注射等有创性途径增加真皮基质含量,增加真皮厚度。
(3)本发明涉及的药物能够提高基底层表皮干细胞端粒酶的转录活性,延长干细胞寿命,延缓皮肤衰老。
(4)两独立研究证实,E-cadherin基因皮肤条件性敲除小鼠不具有致瘤性,敲除小鼠的存活能力较野生型而言不具有明显的差异。佐证了以E-cadherin为靶点的药物的安全性:
Tinkle CL,Lechler T,Pasolli HA et al.Conditional targeting of E-cadherin inskin:insights into hyperproliferative and degenerative responses.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 2004;101:552-557.
Young P,Boussadia O,Halfter H et al.E-cadherin controls adherens junctions inthe epidermis and the renewal of hair follicles.The EMBO journal 2003;22:5723-5733.。
以下实例将阐述本发明的特定方面,且不应解释为其范围的限制。
实施例1
1.实验材料
干预E-cadherin蛋白的表达与功能的方式较多,如中和性抗体、小分子药物、小核苷酸,微小核糖核酸,多肽等,现以小核苷酸药物及中和性抗体为例,以皮肤表皮角质细胞为靶细胞,证实对E-cadherin蛋白进行干预能够促使表皮细胞去分化为表皮干细胞,并促进真皮胶原新生,增加皮肤厚度。佐证Cdh1基因或其产物E-Cadherin是诱导皮肤再生的关键靶点。
1.1小核苷酸序列
小核苷酸(Small interfering RNA,siRNA):是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默。RNA干涉(RNA interference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解,从而导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失的现象。
表1.实验中针对不同种属Cdh1和FoxO1a基因小核苷酸的序列
1.2小核苷酸涂抹药膏配置方法
体内实验小核苷酸药膏的配置:使用29mg品牌的修复乳霜作为药膏的油性成分,DEPC水配置20%的丙二醇(购自赛默飞公司)溶液(v/w),用于溶解300pmol经过特殊修饰的siRNA(购自锐博生物科技有限公司)将siRNA充分溶解于20%的丙二醇溶液后,将混合液搅拌入的愈合膏,直至充分混合,常温下静置30分钟待用。
1.3小核苷酸针剂配置方法
体内试验小核苷酸针剂的配置,配置:溶液①7.5μg siRNA溶解于75μlDEPC配置的5%葡萄糖注射液中,震荡混匀;溶液②3μl HKP(10μg/μl)溶解于75μl DEPC配置的5%葡萄糖注射液中,震荡混匀;将溶液①和溶液②混合,震荡混匀,静置30分钟后待用。
2.实验方法
2.1细胞培养
2.1.1人类角质形成细胞培养与传代
外科手术切下的包皮经常规处理后剪成条状(3-10mm),浸入0.25%Dispase液中4℃过夜(16h)。分离表、真皮,表皮置于0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA液中,37℃继续消化10min,小心吸去上层消化液,加适量含10%胎牛血清的DMEM(Gibco公司购置)终止消化,并反复吹打成细胞悬液,滤去残渣,离心,沉淀用KSFM液吹打成单细胞悬液,调整细胞数为5×l05/ml,接种于培养瓶。37℃5%CO2培养箱中培养,每3天更换1次培养液。原代细胞长至70%融合时,弃去培养液,加0.02%EDTA+0.25%胰蛋白酶(1:1)室温消化至细胞间出现间隙,弃消化液,用D-hanks液洗1~2次,加入0.25%胰蛋白酶继续消化至细胞间隙增加,细胞收缩变圆,立即加入与胰蛋白酶等量的含10%胎牛血清的DMEM终止消化。用弯头吸管反复吹打成单细胞悬液,低速离心,沉淀重悬于KSFM液中,转于新的培养瓶中。
2.1.2人类成纤维细胞培养与传代
在手术室无菌条件下,切取正常皮肤,修除表皮和皮下组织,盐水反复冲洗后在实验室超净工作台上反复剪切制成0.5mm3~1mm3的组织块,接种于培养瓶壁上,组织块间距0.3mm~0.5mm,密闭后在普通恒温电热箱内培养3小时30分钟后加入含20%小牛血清(FCS,GIBCO)青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml的DMEM培养液(DMEM,GIBCO)5ml继续培养,每周换液二次。待原代培养细胞生长基本融合成片时,吸除培养液,Hank’s液漂洗二次后加入0.5%的胰蛋白酶消化约1分钟,镜下见胞质回缩、细胞间隙增大时,加入DMEM培养液终止消化,吸管轻轻吹打瓶壁细胞使呈细胞悬液,按1:3比例分装传代。
2.2角质形成细胞慢病毒转染
2.2.1慢病毒构建
人类靶向基因慢病毒载体构建由吉凯公司完成,共设计三对针对人类Cdh1的RNAi序列,三对针对人类FoxO1的siRNA序列。大鼠靶向基因慢病毒载体构建由吉凯公司完成,共设计三对针对大鼠Cdh1的RNAi序列,三对针对大鼠FoxO1的siRNA序列,具体序列见表1。
2.2.2角质形成细胞慢病毒转染
选择生长状态良好的角质细胞,按3×104个/cm2接种于24孔板。待细胞达60%-80%融合度时,用DPBS漂洗2次,加入siCdh1-EGFP慢病毒上清液500μl于37℃、体积分数5%CO2,条件下培养。48h后更换为KSFM培养液继续培养。转染后24h至第3天,在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况。
2.3免疫荧光
2.3.1细胞免疫荧光
干预细胞用DPBS冲洗两次后,4%多聚甲醛室温固定30min,PBS洗三次。用与二抗来源相同的5%血清固定细胞1小时后,吸走固定液,目标抗体用抗体稀释缓冲液以1:100-1:250浓度配置,4℃孵育过夜,PBS洗三次后,加入与一抗对应的荧光标记二抗,室温孵育2小时后,PBS洗涤三次,每次五分钟,1:1000浓度孵育DAPI核染料,10s以后PBS冲洗,抗淬灭荧光封片剂封片,荧光显微镜下镜检。
2.3.2组织免疫荧光
皮肤组织常规4%多聚甲醛固定过夜后脱水石蜡包埋,切片后常规脱蜡至水。用与二抗来源相同的5%血清固定细胞1小时后,吸走固定液,目标抗体用抗体稀释缓冲液以1:100-1:250浓度配置,4℃孵育过夜,PBS洗三次后,加入与一抗对应的荧光标记二抗,室温孵育2小时后,PBS洗涤三次,每次五分钟,1:1000浓度孵育DAPI核染料,10s以后PBS冲洗,抗淬灭荧光封片剂封片。
2.4流式细胞术:失巢凋亡检测
角质形成细胞分为Cdh1敲低组与对照组,在低吸附培养皿中,37℃5%CO2低氧培养箱中培养1-2天。使用annexin V-FITC/PI试剂盒检(购自Gibco公司)测失巢凋亡。悬浮细胞:300g,4℃离心5min收集细胞。用预冷的PBS洗涤细胞2次,每次均需300g,4℃离心5min。收集1~5×105细胞。加入100μl1×Binding Buffer重悬细胞。加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI StainingSolution,轻轻混匀。避光、室温反应10min。加入400μl 1×Binding Buffer,混匀,样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。流式细胞仪分析:FITC最大激发波长为488nm,最大发射波长525nm,FITC的绿色荧光在FL1通道检测;PI-DNA复合物的最大激发波长为535nm,最大发射波长为615nm,PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。用CellQuest等软件进行分析,绘制双色散点图(two-color dot plot),FITC为横坐标,PI为纵坐标。
2.5蛋白芯片
角质形成细胞培养液上清蛋白样品(实验组和对照组)在生物素标记前需要利用透析管进行透析(Item A)。分别取样品各200μL加入透析管中,然后在4000ml的1×PBS(pH=8)中4℃边搅拌边透析。间隔3小时更换透析液一次。在整个生物素标记样品的过程,避免任何试剂受到胺类物质或叠氮钠(例如Tris,甘氨酸)的污染。使用标记试剂前,将标记试剂小管快速离心后,管中加入100μL 1×PBS溶解粉末,上下吹打将标记试剂混匀,制备成1×标记试剂溶液。向装有样本的离心管中加入适当量的标记试剂。快速混匀,摇床上室温孵育30min。每5min轻弹离心管,混合反应试剂。
Name | ug/ml | sample | labeling |
Si-ecad | 393.392 | 180 | 2.5 |
Sicontrol | 349.362 | 180 | 2.3 |
在上步反应液中加入3μl终止液;
分别取样品各200μL加入透析管中,然后在4000mL的1×PBS(pH=8)中4℃边搅拌边透析。间隔3小时更换透析液一次。透析三次以后收集样品。将玻片芯片从盒子中取出来,在室温平衡20-30min后,将包装袋打开,揭开密封条,然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。每个芯片孔中加入400μL的1×封闭液,室温摇床上孵育1h,避免产生气泡;抽去封闭液,每个孔中添加200μL样品,一个阵列一个样品,4℃振荡过夜孵育。
用封闭液4倍稀释生物素标记的样本,抽去样品,每个孔中加入约1ml的1×洗液I(20×洗液用去离子水稀释)室温振荡,洗玻片4次,每次5min;抽去1×洗液I,加入1×洗液II室温振荡,洗玻片3次,每次5min抽去1×洗液II,每孔加入400μL稀释的荧光剂-链霉亲和素(快速离心后加入1ml的封闭液到荧光剂-链霉亲和素的小管,另取1.5ml的离心管加入800μL的封闭液,再向离心管中加入200μL的荧光剂-链霉亲和素),用密封条贴住玻片,然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育2个小时。
采用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号,采用Cy3或者绿色通道(激发频率=532nm)
1)扫描仪器:GenePix 4000B Microarray Scanner
2)产地:Molecular Devices,LLC;1311Orleans Drive Sunnyvale,CA94089-1136United States
3)扫描参数:Wavelengh:532nm;resolution:10um
采用仪器自带分析软件提取数据,采用AAR-BLG-1的数据分析软件来进行数据预分析。
2.6CCK-8
制备细胞悬液:细胞计数。将细胞接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时。加入10ul CCK8,测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。连续测7天。记录每天吸光度数值。
2.7HE染色和masson染色
皮肤组织常规4%多聚甲醛固定过夜后脱水石蜡包埋,切片后常规脱蜡至水。苏木精染色后盐酸以纯1-3s,水洗后0.5%伊红1-3分钟,蒸馏水稍洗,梯度乙醇脱水后过二甲苯,中性树胶封片。石蜡切片脱蜡至水。铬化处理或去汞盐沉淀(甲醛固定的组织此步可略)。依次自来水和蒸馏水洗。用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min。充分水洗,如过染可盐酸酒精分化。蒸馏水洗。用Masson丽春红酸性复红液5-10min。以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。1%磷钼酸水溶液分化3-5min。不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min。以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。
2.8体内试验用药配方
2.8.1膏剂配方
小核苷酸药膏的配置:使用29mg品牌的修复乳霜作为药膏的油性成分,DEPC水配置20%的丙二醇(购自赛默飞公司)溶液(v/w),用于溶解300pmol经过特殊修饰的siRNA(参见第1.2部分),经2’ome修饰以及胆固醇修饰,增加其进入细胞的能力(购自锐博生物科技有限公司)。将siRNA充分溶解于20%的丙二醇溶液后,将混合液搅拌入的愈合膏,直至充分混合,常温下静置30分钟待用。
皮肤体内试验中,小核苷酸药膏的涂抹方式为:每天一次,每cm2涂抹200μg药膏,盖上敷贴保持湿润,抑制水分过快蒸发,大约保持40分钟‐1小时左右,可洗去药膏或使其自然吸收。
2.9Q-PCR检测
细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净,加入1ml Trizol(Invitrogen)溶液,吹打混匀,并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解,室温静置5min。组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol(Invitrogen)溶液,混匀,室温放置5min使其充分裂解;加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3-5min;4℃下,14,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNase free EP管;沉淀RNA:加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)。4℃下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀,去上清;用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)。超净台风干;沉淀不能过干或过湿,过干则不易溶解,过湿则乙醇残留。视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。
使用RNase-free的DNase I(Promega),按以下体系配置反应液,37℃消化30min,65℃灭活10min。
RNA | 30 | μl |
DNase I | 20 | μl |
10x buffer | 10 | μl |
H2O(RNase free) | 39.5 | μl |
RNasin | 0.5 | μl |
总体积 | 100 | μl |
然后按以下步骤操作:
1)加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀,室温放置5min,后14,000rpm,离心15min,取上清。
2)加入等体积的氯仿,上下颠倒混匀,静置分层后14,000rpm,离心15min,取上清。
3)加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次),-20℃静置15min;
4)4℃下,14,000g离心15min,收集RNA沉淀,去上清;5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min),超净台风干;6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。
纯度检测:取1μl RNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定OD值,OD260/OD280的比值应大于1.8。
总RNA完整性检测:取RNA样品1μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min,EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照,总RNA的5s rRNA,18s rRNA和28s rRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
计算好实验中需用多少份体系,则按具体量配置。总的体系配好后,在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀,然后15ul每管分装至8连管中。
cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度,一般为1:20稀释,如遇到基因表达低的样品,则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后,即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕。把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒,随后上机检测。
本发明中所涉及的引物序列由表2给出。
表2本发明中所涉及的引物序列
2.10Western blot检测
蛋白抽提:细胞培养至所需要的密度时,细胞经预冷的PBS漂洗3次,加入450μl裂解液,细胞刮刀收集,用移液器转移至离心管中,反复吹打。所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理,超声时为5S,间歇时间为10S,功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止,处理过程在水浴中进行,后4℃25000g离心,上清液样品置100℃水浴箱里水浴加热3-5分钟,10000g离心10分钟,取出清液,将其移入另一洁净试管中。
蛋白定量:
①Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4℃至少6个月保持稳定。
②标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20μg-150μg/100μl之间绘制标准曲线。
③将待测样本溶于100μl缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS)。
④按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去。
⑤每个样品加5ml稀释的染料结合溶液,作用5-30分钟,染料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟。
⑥根据标准曲线计算待测样品的浓度。
制做分离胶、浓缩胶:
①按比例配制分离胶,轻缓地摇动溶液(8-10下),使激活剂混合均匀,将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中,再在液面上小心注入一层水或正丁醇,以阻止氧气进入凝胶溶液中,然后静置90min。
②同前按比例配制浓缩胶,但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分,以连续平稳的液流注入凝胶溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡,静制90min以上以保证完全聚合。
加样:预电泳后依次加入标准品和待分析样品,注意加样时间要尽量短,以免样品扩散,为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
电泳:加样完毕,盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳,通常在连续系统中,上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压,使样品更好的进入凝胶,电泳时,应采用恒压的模式,这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶80V,分离胶120V,电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳。
转膜:
①Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后,取出凝胶,在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法:用刀片将两玻璃板分开,将多余的凝胶划去,上部以浓缩胶为准全部弃去,下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去,取一10ml注射器注满转印缓冲液,插入玻璃板与凝胶之间注水,使水的压力将两者自然分开,边推边进,反复多次注水,直至凝胶从玻璃板上滑落下来。
②将NC膜和滤纸切出与凝胶一样大小,置转移缓冲液中湿润5-10min.
③按照以下顺序放置滤纸,凝胶和NC膜到半干槽中。
④每层之间的气泡要全部去除。可以用10ml吸管轻轻在上一层滚动去除气泡,然后用一绝缘的塑料片中间挖空与凝胶一样大小或略小一点,以防电流直接从没有凝胶处通过造成短路,盖好加上阳极电极板。
膜的封闭:
1)洗转印膜:室温漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜上的SDS,防止影响后面的抗体结合。
2)取漂洗的转印膜,放入5%No-fat milk的封闭液内,摇床震动,室温封闭2h,也可在4度过夜。
3)用1xTBS-T,PH7.6洗液,室温漂洗3次x10min.
抗体孵育:
1)封闭后的杂交膜放入杂交袋中,加入抗体稀释液稀释的Ab1浓度为1ug/ml,封口,4℃孵育过夜或室温(22-25℃)摇动孵育2h;
2)液洗膜3次x10min;
3)标记的Ab2(羊抗兔-HRP)室温1h,洗膜3x10min。
检测:
①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀。
②显色:将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带。
③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应。
3.实验结果
3.1siRNA干扰靶基因结果
体外实验中,本发明筛选出了有效的siRNA序列,相对于对照组,能够显著敲低大鼠和人类Cdh1和FoxO1的基因表达,和蛋白水平的表达(图2)。
3.2E-Cadherin敲低后可逆转分化细胞成为干细胞
体外实验中,我们发现皮肤角质形成细胞敲低E-cadherin的表达后,通过免疫荧光检测,比较干预前后干细胞标记物的变化。PCR实验发现,诸多干细胞标记物相对于对照组显著上升。例如:基底层干细胞和毛囊干细胞都表达的ITGB1、ITGA6、Krt15、Krt5,Krt14,毛囊干细胞特有标记物:CD34,SOX9,Krt19(图3左)(毛囊干细胞是相对于基底层干细胞更原始的干细胞标记物)。Western blot实验进一步证实,基底层干细胞标记物Keratin 5,ITGA6表达量相对于对照组显著升高,除此以外,毛囊干细胞标记物Keratin 19,Keratin 15重新开始表达,而分化标记物,如Krt1,Krt10,Involucrine,Filaggrin,Loricrin则显著降低(图3右)。在免疫荧光检测中,研究发现诸多干细胞标记物表达高于对照组,与western blot实验结果相符(图4左)。
3.3E-Cadherin敲低后可促进角质形成细胞增殖、抗凋亡能力。
在进一步实验中发现,皮肤角质形成细胞敲低E-cadherin的表达后,可显著增加细胞的增殖能力,增殖指数显著高于对照组。在失巢凋亡的流式检测中,敲低E-cadherin的表达后,可显著增加细胞的早期抗凋亡能力,增加细胞的生存活力(图4右)。
3.4E-Cadherin敲低后激活Wnt/β-catenin信号通路
本发明发现,当干扰E-Cadherin表达后,可促进转录因子β-catenin的基因CTNNB1的表达及β-catenin蛋白核转移能力增加(图5),并从而激活Wnt/β-catenin信号通路。在进入细胞核后,转录因子β-catenin能够结合端粒酶的启动子部位,并启动对端粒酶基因Tert的转录,增加端粒酶蛋白的表达量(图5)。端粒酶是一种能够在细胞中负责延长端粒的蛋白酶,一般仅在干细胞中具有表达活性。进一步实验发现,干扰E-Cadherin的表达,能够显著激活端粒酶,增加细胞端粒长度,并显著延长细胞的寿命,使细胞“返老还童”,增加其增殖能力及多向分化能力(图6)。关于E-Cadheirn干扰后激活Wnt/β-catenin信号通路并激活端粒酶涉及的信号通路如图6所示。
3.5表皮E-Cadherin敲低后促进成纤维细胞增殖
为了明确角质形成细胞中CDH1的沉默效应对成纤维细胞有何影响,我们将这两种皮肤的主要细胞作了共培养。CCK-8细胞增殖实验结果显示与CDH1沉默的角质形成细胞共培养的成纤维细胞具有更活跃的增殖能力,形态学上细胞胞体肥大,呈现纤维母细胞形态(一种功能活跃的成纤维细胞)。纤维母细胞核分裂相相对于对照组显著增多(图7A-B)。为进一步理解角质形成细胞敲低CDH1表达后为何能够促进成纤维细胞增殖能力的增强,我们将经过干预过程的角质形成细胞的上清液进行了蛋白芯片的检测,发现在对CDH1进行敲低以后,相比对照组表皮细胞分泌b-FGF,SPP1等与成纤维增殖、胶原新生的相关蛋白的升高了两倍以上(图7C)。
3.6FoxO1为E-cadheirn敲低后诱导干性的主要转录因子
为了进一步了解E-Cadherin敲低后诱导分化细胞成为干细胞的机制,本发明发现,在E-Cadherin敲低后,一种名为FoxO1的转录因子的表达量升高的同时,核转移能力显著升高(图8)。通过同时对E-Cadherin敲低后的干细胞进行FoxO1转录因子的siRNA干扰,发现E-Cadherin所诱导的干细胞的干性基本消失,证明FoxO1转录因子是E-Cadherin激活后的主要诱导细胞干性的启动因子,起到了促进细胞去分化的关键性作用(图9)。
3.7体内实验结果
在后续的体内实验中,本研究发现,通过使用小核苷酸药物对正常的大鼠皮肤组织进行局部涂抹(300pmol siRNA),或进行中和性抗体针剂注射。涂抹三天后,通过组织免疫荧光检测,发现该药物能够使皮肤基底层干细胞数量显著增多,基底层干细胞标记物keratin 5的表达量明显增加(图10);除此以外,毛囊干细胞的标记物keratin 15在干预后也相对于对照组显著增加(图10),通过对E-cadherin的干预,其下游b-catenin转录端粒酶Tert,显著提升了基底层干细胞端粒酶Telomerase的活性(图10),延长了端粒的长度,提升了干细胞分裂增殖的能力。
Masson染色显示真皮增厚至对照组的两倍,皮下胶原分泌显著增加(图11E)。通过进一步对HE染色和Masson染色进行皮肤细微结构鉴定,发现治疗组表皮基底膜下新生了大量幼稚胶原纤维与成纤维细胞,呈现弱伊红染色与弱苯胺蓝染色(成熟胶原则显示嗜伊红染色和嗜苯胺蓝染色),治疗组真皮深层呈现较深的伊红染色和苯胺蓝染色,提示胶原分泌增多,丽春红染色显示弹力纤维在干预组分泌增多(图11A-D)。在人体临床实验当中,涂抹siEcad的组相对于涂抹对照组药膏而言,皮肤增厚近1/3,皮肤弹性、延展性变好,和动物实验大体所观察到的现象一致(图12)。
4.结论
本发明的创新之处在于:
发现可诱导表皮细胞去分化的关键蛋白:可通过药物干预途径促使组织器官干细胞含量增多;替代干细胞治疗;
发现促进真皮胶原新生的关键蛋白:可通过药物干预促进真皮胶原新生,一定程度上替代真皮填充物;
发现维持皮肤端粒酶活性的关键蛋白:可通过药物干预促进端粒酶活性,进而保证皮肤基底层干细胞端粒长度,维持细胞分裂增殖的能力。
本发明的优点在于:
(1)本发明系通过干预E-cadherin以调控上皮细胞的去分化功能,使干细胞的数量增多,从而调节组织再生能力,并不动用机体有限宝贵的干细胞再生资源。
(2)本发明涉及的药物相对于干细胞治疗而言,用药途径无创简便,无需事先服药动员干细胞,无需局麻手术提取干细胞,无需繁复的体外分离技术增加污染,细胞株突变致瘤的可能。规避了诸多干细胞治疗过程中的弊端。
(3)两独立研究证实,E-cadherin条件性敲除小鼠不具有致瘤性,敲除小鼠的存活能力较野生型而言不具有明显的差异。佐证了以E-cadherin为靶点的药物的安全性。
(4)本发明涉及的药物相对于透明质酸注射、胶原注射等真皮填充的方式而言,具有无创性,简便性等优势。
(5)本发明涉及的药物帮助诱导自体胶原新生,不存在类似胶原蛋白注射的免疫原性、抗原性等问题。
(6)小核苷酸药物相对于目前现行药物具有成本上的显著优势,合成成本较低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (17)
1.以Cdh1基因作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤萎缩相关疾病药物中的应用。
2.以E-Cadherin蛋白作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤萎缩相关疾病药物中的应用。
3.根据权利要求1或2任一所述的应用,其特征在于,所述的皮肤萎缩相关疾病包括:皮肤生理性萎缩,机械张力诱导的皮肤萎缩病,服用药物后导致的皮肤萎缩和其他皮肤萎缩相关疾病。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的皮肤生理性萎缩包括因衰老形成的皱纹,所述的机械张力诱导的皮肤萎缩病包括妊娠纹、膨胀纹,所述的服用药物后导致的皮肤萎缩和其他皮肤萎缩相关疾病包括系统性硬化病、皮肌炎、埃-当综合征、皮肤异色病、Ccokayne氏综合征。
5.根据权利要求1或2任一所述的应用,其特征在于,所述的以Cdh1基因或E-Cadherin蛋白作为药物作用靶点的药物是干预Cdh1基因或E-Cadherin蛋白的表达与功能的抑制剂。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的干预Cdh1基因或E-Cadherin蛋白的表达与功能的抑制剂包括:中和性抗体,小分子拮抗剂,小核苷酸,微小核糖核酸,反义分子或多肽抑制剂。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的小核苷酸选自下表中的小核苷酸分子:
8.跟据权利要求1或2任一所述的应用,其特征在于,所述的以Cdh1基因或E-Cadherin蛋白作为药物作用靶点的药物可以激活哺乳动物细胞端粒酶的活性,并因此延长端粒的长度。
9.一种组合物,其特征在于,所述的组合物包括药学上可接受的载体和权利要求7所述的小核苷酸分子。
10.一种无需载体即能导入皮肤组织的小核苷酸的膏剂,其特征在于,所述的膏剂的制备方法为:对权利要求7所述的小核苷酸分子进行2端OME修饰和胆固醇化学修饰,溶解于丙二醇,并混合于的愈合膏中。
11.根据权利要求10所述的膏剂,其特征在于,所述的丙二醇为体积质量比v/w为20%-100%丙二醇。
12.根据权利要求9-11任一所述的组合物或膏剂在制备经皮给药小核苷酸药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用,其特征在于,所述的经皮给药小核苷酸药物是治疗皮肤萎缩相关疾病的药物。
14.以FoxO1基因作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤萎缩相关疾病的药物中的应用。
15.以FoxO1蛋白作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤萎缩相关疾病的药物中的应用。
16.根据权利要求14或15任一所述的应用,其特征在于,所述的以FoxO1基因或FoxO1蛋白作为药物作用靶点的药物的干预方式是促进FoxO1进入细胞核或者使FoxO1表达量增多。
17.根据权利要求16所述的应用,其特征在于,所述的以FoxO1基因或FoxO1蛋白作为药物作用靶点的药物包括FoxO1蛋白的入核激动剂,或以慢病毒、腺病毒、质粒作为载体构建的FoxO1过表达体系,其中所述的FoxO1蛋白的入核激动剂为小分子药物或多肽。
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