CN112195156B - 一种细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用 - Google Patents

一种细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然生物纳米材料和肿瘤治疗领域，具体涉及一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用。本发明将表达人源TRAIL蛋白的病毒转染人或动物细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞，然后大量培养，收集细胞，超声破碎细胞，通过蔗糖密度梯度离心方法对制得的破膜的细胞匀浆液进行超速离心，分层吸出内质网提取物溶液，得到基于细胞内质网来源的生物纳米粒子。本发明提供的多维多靶点复合纳米粒子，包含上述基于细胞内质网来源的生物纳米粒子和致敏癌细胞凋亡应答活性小分子药物，该复合纳米粒子制备工艺简单，成本低，治疗肿瘤高效安全，药物用量低且无毒副作用。

Description

一种细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米 粒子及制备与应用
技术领域
本发明属于天然生物纳米材料和肿瘤治疗领域，具体涉及一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用。
背景技术
肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumour necrosis factor(TNF)-relatedapoptosis-inducing ligand(TRAIL))，是一类具有凋亡诱导活性的细胞因子，其与靶细胞表面的死亡受体4或5(DR4/5)结合，募集胞浆内接头蛋白FADD(Fas associated deathdomain containing protein)和半胱天冬酶原8(procaspase 8)，导致caspase 8酶原被激活(CASP-8)；至此，CASP-8可直接激活终末凋亡效应酶 CASP-3、CASP-6、CASP-7；CASP-8也可通过切割激活细胞内BID为t-BID，激活CASP-9介导的内源性线粒体凋亡通路，最终激活终末凋亡效应酶CASP-3、 CASP-6、CASP-7，引起肿瘤细胞凋亡。TRAIL具有广谱抗癌潜能，它特异性地诱导肿瘤细胞和癌细胞凋亡，而通常情况下对正常细胞无影响，因此受到人们的热切关注。重组可溶型TRAIL(rTRAIL，rT)已被证明可有效诱导癌细胞凋亡，但临床I期试验证实其血液清除率很高，半衰期少于30分钟，其较低的稳定性和生物利用度极大地阻碍了临床应用。近年，有学者用表达TRAIL的慢病毒转染细胞，以细胞或细胞释放的细胞外囊泡(EV)递送膜结合TRAIL治疗癌症，发现其效应显著优于rT。这种膜结合TRAIL改变了TRAIL在血液或细胞外基质中被迅速清除的命运，且TRAIL以聚集体的形式与死亡受体结合，增强凋亡信号的触发，可部分克服抗性癌细胞对TRAIL的耐药性。我们前期研究显示，经转染后的MSC可以高表达TRAIL，并发现大量TRAIL富集在内质网(ER) 上。然而，目前尚无关于用内质网来源TRAIL治疗癌症的专利和报道。
内质网是蛋白表达的重要合成与加工场所，mRNA在粗面型内质网携带的核糖体上翻译，经由内质网合成多肽，修饰加工，产生具有一定结构和生物活性的蛋白质。许多研究表明，来源于抗原呈递细胞(APC)内质网的微粒体 (microsomes)，对病毒感染产生的免疫应答比相应APC的更强烈和持久，这说明内质网及其衍生微粒体上来源的蛋白可以具有显著的生物活性。
癌症难以治愈，重要的一个原因在于普遍存在的癌细胞对治疗药物的耐药性。而癌细胞耐药性的产生往往是由于其凋亡通路中关键调控因子的变异、缺失或过度表达。
多靶点多维度调控细胞内源性促存活因子或凋亡抑制剂的表达，是致敏癌细胞的TRAIL应答，解决其耐药性的一个重要策略。有研究表明，一种细胞内源性促凋亡因子Smac/Diablo的化学模拟小分子(AZD5582)，可特异性地与凋亡抑制剂(Inhibitors ofapoptosis proteins，IAPs)的BIR结构域结合，屏蔽掉抑制位点或使其泛素化降解，释放caspases，极大地促进凋亡信号的激活、传导及执行。AZD5582(AZD)可与XIAP、cIAP1和cIAP2的BIR3结合，特异性地诱导癌细胞凋亡，但其单独使用的治疗效果有限。
发明内容
为了克服现有技术中促凋亡蛋白(比如TRAIL)治疗癌症存在的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种细胞内质网来源的生物纳米粒子(ERN-T)的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的细胞内质网来源的生物纳米粒子，该生物纳米粒子为纳米级别，携带膜结合的促肿瘤凋亡蛋白 (TRAIL)。
本发明的再一目的在于提供上述细胞内质网来源的生物纳米粒子的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种多维多靶点复合纳米粒子，该多维多靶点复合纳米粒子包含上述细胞内质网来源的生物纳米粒子，可共载送促凋亡蛋白和化疗小分子药物(例如：可致敏癌细胞凋亡应答活性小分子)，其中，低剂量的促凋亡蛋白和化疗小分子药物具有协同治疗癌症的作用，可显著增强抗癌效果，并且对正常组织细胞无明显毒性。
本发明的第五个目的在于提供上述多维多靶点复合纳米粒子的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子的制备方法，包含如下步骤：
(1)传代培养：将人或动物细胞进行传代培养，获得第二代(P2)至第四代(P4)的人或动物细胞；
(2)将表达人源TRAIL蛋白的病毒转染人或动物细胞，得到表达人源 TRAIL蛋白的人或动物细胞；
(3)步骤(2)制得的表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞大量培养，收集细胞，然后超声破碎细胞，得到破膜的细胞匀浆液；
(4)通过蔗糖密度梯度离心方法对步骤(3)制得的破膜的细胞匀浆液进行超速离心，分层吸出内质网提取物溶液，得到基于细胞内质网来源的生物纳米粒子；
步骤(1)中所述的人或动物细胞包括但不限于：脐带间充质干细胞 (UC-MSC)、骨髓间充质干细胞(BM-MSC)、脂肪间充质干细胞(AD-MSC)、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞、心肌细胞、人胚肾细胞(293T)、巨噬细胞、T细胞和肿瘤相关成纤维细胞中的至少一种；
在具体实施例中，步骤(1)中所述的人或动物细胞为脐带间充质干细胞 (UC-MSC)；
步骤(2)中所述的病毒不限于慢病毒、逆转录病毒以及腺病毒；
在具体实施例中，步骤(2)中所述的病毒为慢病毒；
在具体实施例中，步骤(2)中所述的转染的具体操作为：
将状态良好的P2～P4代脐带间充质干细胞，以1×106个/孔接种于六孔板， 37℃，5％CO2细胞培养箱过夜；离心去除培养基，然后加入含有表达人源TRAIL 蛋白的慢病毒和polybrene的DMEM/F-12培养基，孵育6～24h；孵育后离心去除培养基，加入含有10％FBS(胎牛血清)的DMEM/F12新鲜培养基继续培养 2～3天；待细胞长满后，进行增殖传代培养，得到表达TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞；
所述的表达人TRAIL蛋白的慢病毒的MOI优选为2，用量选为10～30μL/mL (培养基)；
所述的表达人TRAIL蛋白的慢病毒的用量优选为30μL/mL(培养基)；
所述的polybrene在DMEM/F-12培养基中的浓度选为5～20μg/mL；
所述的polybrene在DMEM/F-12培养基中的浓度优选为8μg/mL；
所述的孵育的时间进一步优选为10h；
步骤(3)中所述的超声的条件优选为20KHZ超声2min；
步骤(4)中所述的蔗糖密度梯度离心方法的具体操作优选为：
将破膜的细胞匀浆液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层，在4℃条件下，以 100000g超高速离心3h；然后将液柱中的液体由上至下等体积取出，收集第6～8 次取出的液体，即为含有表达TRAIL的细胞内质网来源的生物纳米粒子 (ERN-T)溶液；
所述的蔗糖密度梯度的液柱通过如下方法建立：
从下到上依次缓慢加入2M蔗糖0.2mL，1.5M蔗糖0.8mL，1.2M蔗糖0.7mL， 0.8M蔗糖0.4mL；
所述的等体积优选为0.2mL/次；
一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子，通过上述制备方法制备得到；
所述的基于细胞内质网来源的生物纳米粒子在制备癌症防治产品中的应用；
一种多维多靶点复合纳米粒子，包含上述基于细胞内质网来源的生物纳米粒子；
所述的多维多靶点复合纳米粒子还包含致敏癌细胞凋亡应答活性小分子药物；
所述的致敏癌细胞凋亡应答活性小分子药物为化疗药物、免疫治疗药物、天然活性产物分子和核酸类药物(例如siRNA和miRNA)中的至少一种；
所述的多维多靶点复合纳米粒子优选为内质网膜来源纳米颗粒(ERN)表面携带促肿瘤凋亡蛋白，同时膜上或内部囊腔内搭载致敏癌细胞凋亡应答活性小分子药物；
所述的搭载的方法为超声法、膜穿孔法(辅助剂可以为两性霉素B，皂苷和抗溶血性链球菌(SLO)等中的至少一种)、电穿孔法和共孵育法中至少一种；
在具体实施例中，致敏癌细胞凋亡应答活性小分子药物为AZD，搭载的方法为超声法；
所述的多维多靶点复合纳米粒子的制备方法，优选包含如下具体步骤：
(1)将AZD溶液与上述基于细胞内质网来源的生物纳米粒子溶液混匀，然后20KHZ超声30秒，间隔30秒，再次重复超声操作，如此重复6次；
(2)超声处理后，立即放入细胞培养箱中孵育1小时，以促进ERN-T膜修复；
(3)孵育结束后，将混合液以100000g(RCF)超速离心3h，倒掉上清液，再用PBS洗涤，同条件离心，沉淀物即为同时负载TRAIL和AZD的多维多靶点复合纳米粒子(AZD@ERN-T)；
所述的多维多靶点复合纳米粒子在癌症防治领域中的应用；
所述的癌症包括但不局限于神经胶质瘤、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、肠癌、宫颈癌以及皮肤癌；
本发明的原理：
本发明用超声处理间充质干细胞，可以获得平均粒径约为70.6nm的内质网(ER)衍生颗粒，由于其大小是属于纳米级别，我们将其命名为内质网膜来源纳米颗粒(ERnanosomes，ERN)。且进一步发现由TRAIL基因工程化修饰MSC 衍生的ERN携带了膜结合的TRAIL，我们将其命名为ERN-T。我们推测，ERN-T 也具有诱导癌细胞凋亡的活性，是可以用于癌症治疗的新型的生物纳米药物。实验结果表明ERN-T确实具有抗癌活性，且其无论是在细胞实验还是在动物肿瘤模型中都表现出远优于rTRAIL的抗癌效应。这表明，本研究发明提供的细胞内质网来源的生物纳米粒子(ERN-T)，是一种既不同于重组可溶性TRAIL，也不同于细胞或细胞外囊泡表达呈递TRAIL的新的TRAIL药物载体，为今后开展基于TRAIL抗癌研究或临床应用提供了另一种载体选择。
本发明进一步将化疗小分子药物AZD与ERN-T联用，实验结果发现可致敏癌细胞对TRAIL的应答，增强了ERN-T的凋亡诱导活性，可提高其用于癌症治疗的潜力。实验的结果表明，用AZD和ERN-T共处理癌细胞，或将AZD载入 ERN-T，制备的多维多靶点复合纳米粒子AZD@ERN-T，可获得极显著优化增强癌症治疗效应。
综上，本发明制备了基于间充质干细胞内质网来源的生物纳米粒子(ERN-T) 和多维多靶点复合纳米粒子，后者实现了共载递促肿瘤凋亡蛋白TRAIL和致敏癌细胞凋亡应答活性小分子，提供了一种可优化增强TRAIL治疗效应的复合生物纳米药物制备策略，可以成为对rTRAIL(rT)或TRAIL基因工程化MSC细胞治疗产品的一种优选的替代。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一种细胞内质网来源的生物纳米粒子，该生物纳米粒子为纳米级别，携带膜结合的促肿瘤凋亡蛋白(TRAIL)，具有诱导癌细胞凋亡的活性，可以用于制备癌症治疗的新型的生物纳米药物或载体。
(2)本发明提供的AZD@ERN-T是一种新的膜结合型TRAIL制剂，同时递送促凋亡蛋白TRAIL和小分子药物AZD，一方面延长了TRAIL和AZD在体内的半衰期，提高了生物利用度，加大了治疗窗口，可极大程度地降低治疗可能产生的毒副作用；另外，AZD与ERN-T协同诱导凋亡，显著增强了TRAIL 介导的体内/体外对肿瘤细胞的杀伤效果，且肿瘤动物模型结果表明， AZD@ERN-T治疗能够显著抑制肿瘤生长，同时对机体正常组织和器官没有明显的毒副作用。本发明公开了上述AZD@ERN-T的制备方法及抗肿瘤治疗应用，制备工艺简单、高效、成本低；其用于抗肿瘤治疗效果显著，药物用量低且无毒副作用，为临床基于TRAIL的癌症治疗提供了新的生物纳米药物来源及增效策略。为以后基于ERN-T的癌症治疗提供了新型纳米药物的制备方法，前期研究数据及一定的理论依据。
附图说明
图1是表达人源TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞(MSCflT)的鉴定结果图，其中，A：免疫荧光染色结合流式细胞仪分析TRAIL阳性转染率；B：共聚焦荧光显微镜检测TRAIL在细胞的表达及分布。
图2是表达人源TRAIL蛋白的基于细胞内质网来源的生物纳米粒子 (ERN-T)的表征结果图，其中，A：以ELISA试剂盒定量检测ERN-T溶液中人源TRAIL蛋白的表达情况；B：以免疫印记法(WB)检测ERN-T溶液中ER 标记分子BIP以及人源TRAIL蛋白的表达；C：ERN-T溶液中纳米粒子粒径分布。
图3是DiI标记ERN-T的M231细胞摄入实验(6h)结果图，其中，A：M231 细胞与游离DiI(PBS/DiI)或DiI标记的ERN-T(ERN-T/DiI)共培养6h后，以共聚焦荧光显微镜观察细胞对DiI的摄入情况分析；B：流式分析定量DiI阳性细胞比例分析。
图4是AZD溶液经紫外分光光度计定量标准曲线图。
图5是细胞增殖及活性(CCK8实验)结果分析图，A：肺癌NCI-H727，B：乳腺癌细胞M231，C：宫颈癌细胞Hela，D：神经胶质瘤细胞SH-SY5YE，E：人的正常角质细胞(HaCaT)，所试验的药物为重组可溶型TRAIL(rT)，联用 AZD5582(20nM)和rT(AZD20nM+rT)，ERN-T，载入了AZD5582的ERN- T(AZD20nM@ERN-T)。
图6是AZD@ERN-T极其显著地抑制小鼠M231皮下移植肿瘤的生长结果图，其中，A：肿瘤生长曲线(肿瘤体积测量)分析，B：治疗终止时各治疗组肿瘤大小比较分析，C：各治疗组动物体重变化分析，D：治疗终止时各治疗组肿瘤重量测量比较分析。
图7是免疫印迹法检测药物处理癌细胞后蛋白表达水平的结果分析图，其中，M231细胞在对照(Ctrl)、AZD5582(AZD)和ERN-T(ERN-T)单独使用或联合(AZD@ERN-T)处理12h后，提取蛋白进行了免疫印迹(WB)分析，检测了凋亡抑制蛋白Mcl-1、Survivin、半胱天冬酶3以及内参GAPDH的表达。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 TRAIL基因工程化MSC干细胞的制备与表征
(1)以jetPEI为DNA转染试剂，将表达人源TRAIL蛋白的重组载体 PCCL-CMV-flT和包装载体pMD2.G共转染293T细胞，离心，收集上清液，即为表达人源TRAIL蛋白的慢病毒(Yuan Z Q,Kolluri K K,Sage E K,et al. Mesenchymal stromal cell delivery offull-length tumor necrosis factor–related apoptosis-inducing ligand issuperior to soluble type for cancer therapy[J]. Cytotherapy,2015,17(7):885-896.)；其中，人源TRAIL基因CDS全长序列如下：
ATGGCTATGATGGAGGTCCAGGGGGGACCCAGCCTGGGACAGACCTG CGTGCTGATCGTGATCTTCACAGTGCTCCTGCAGTCTCTCTGTGTGGCTGT AACTTACGTGTACTTTACCAACGAGCTGAAGCAGATGCAGGACAAGTACT CCAAAAGTGGCATTGCTTGTTTCTTAAAAGAAGATGACAGTTATTGGGACC CCAATGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTGGCAAGTCAAGTGGCAA CTCCGTCAGCTCGTTAGAAAGATGATTTTGAGAACCTCTGAGGAAACCATT TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAAAATATTTCTCCCCTAGTGAGAGAAAG AGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGC AACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAA AATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTT GCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACAT CTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACACAAA GAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCCTGA CCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCA GAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAA ATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACC ATGAAGCCAGTTTTTTTGGGGCCTTTTTAGTTGGCTAA
(2)传代培养：将P0代脐带间充质干细胞(MSC)(市购)进行传代培养，获得P2～P4代脐带来源间充质干细胞；
(3)将步骤(2)获得的状态良好的P2～P4代脐带间充质干细胞，以1×106个/孔接种于含DMEM/F-12新鲜培养基的六孔板中，37℃，5％CO2细胞培养箱过夜；去除原培养基，然后加入含有步骤(1)制得的表达人源TRAIL蛋白的慢病毒和polybrene的DMEM/F-12新鲜培养基1mL，孵育6～24h，其中，每1 mL DMEM/F-12新鲜培养基包含10～30μL表达人源TRAIL蛋白的慢病毒 (MOI＝2)和5～20μg polybrene；孵育后，去除原培养基，加入含有10％FBS (胎牛血清)的DMEM/F12新鲜培养基继续培养2～3天，然后通过流式细胞仪检测TRAIL表达阳性细胞率和免疫荧光染色法检测TRAIL在细胞内分布状况；待细胞长满后，将细胞转移到培养瓶进行增殖传代培养，得到表达人源TRAIL 蛋白的脐带间充质干细胞(MSCflT)。其中，具体检测方法如下：
①将六孔板转染后得到的MSCflT细胞消化，离心沉淀，经PE标记的小鼠抗人TRAIL单克隆抗体(市购)避光染色1h，2000g，5min离心，再用PBS洗两次，最后加入0.5mL PBS，使用流式细胞仪检测TRAIL表达阳性细胞率。
②免疫荧光染色法检测TRAIL在MSCflT细胞内分布状况：将MSCflT接种于载玻片培养2天后，用4％(体积百分比)多聚甲醛固定，再用0.1％(体积百分比)tween-20缓冲液在细胞膜上制造穿孔，最后用含有10％(体积百分比) FBS和0.1％(体积百分比)tween-20的PBS封闭；然后用PE标记的小鼠抗人 TRAIL单克隆抗体染色，用鬼笔环肽-FITC标记细胞骨架，再用DAPI对细胞核标记染色；最后加入一点PBS保证细胞湿润状态，然后用共聚焦显微镜观察和成像。
经过预实验，步骤(3)孵育过程中，每1mL DMEM/F-12新鲜培养基最佳包含30μL表达人源TRAIL蛋白的慢病毒(MOI＝2)和8μg polybrene，孵育时间最佳为10h；
图1A中检测结果显示经TRAIL慢病毒转染后的脐带间充质干细胞的 TRAIL阳性率97.8％(MSCflT)，说明本发明成功制得高表达TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞(MSCflT)；图1B中结果显示TRAIL大量分布在细胞核周围的内置网膜上表达，这就意味分离MSCflT内质网即可获得内质网来源的 TRAIL。这种内质网膜来源的TRAIL还未见相关专利和文献报道，具有潜在研究价值。
实施例2以蔗糖密度梯度超速离心制备表达TRAIL的内质网来源纳米颗粒(ERN-T)
(1)制备：
①将实施例1制得的表达人源TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞大量培养，收集状态良好的细胞并用PBS将其浓度调到1.0×108/mL，得到细胞液；
②然后取一支1.5mL EP管加入0.5mL步骤①制得的细胞液和0.5mL匀浆液(匀浆液配方：0.25M蔗糖，10mM Tris-HCl(pH 7.4，1mM乙酸镁，及5μL 100×蛋白酶抑制剂)，冰浴中20KHZ超声处理2分钟，得到细胞匀浆液；
③将步骤②制得的细胞匀浆液加入到建立好的蔗糖密度梯度的液柱上层 (蔗糖密度梯度建立：从下到上，贴着管壁依次缓慢加入2M蔗糖0.2mL，1.5M 蔗糖0.8mL，1.2M蔗糖0.7mL，0.8M蔗糖0.4mL)，然后在4℃条件下，以100000g 超速离心3h，然后将离心管中的液体由上至下等体积(0.2mL/次)取出，收集第6～8次取出的液体，即为含有人源TRAIL蛋白的基于脐带间充质干细胞内质网来源的生物纳米粒子(ERN-T)溶液；同时以脐带间充质干细胞为对照，制备得到细胞内质网来源的生物纳米粒子(ERN)溶液，分装，-80℃保存。
(2)TRAIL定量及定性：
①将表达TRAIL蛋白的脐带来源间充质干细胞(MSCflT)按照常规方法经 RIPA裂解液裂解后离心，取上清，得到MSCflT细胞总蛋白溶液；将脐带间充质干细胞按照常规方法经RIPA裂解液裂解后离心，后取上清，得到MSC细胞总蛋白溶液；
②分别取MSCflT细胞总蛋白溶液(蛋白含量10μg、1μg)，MSC细胞总蛋白溶液(蛋白含量10μg)，步骤(1)中制得的ERN-T溶液(蛋白含量10μg、1μg) 和ERN溶液(蛋白含量10μg)，用商品化TRAIL特异性ELISA试剂盒检测TRAIL 的含量；
③分别取步骤(1)中制得的ERN溶液及ERN-T溶液(蛋白含量各20μg)，用免疫蛋白印记法检测ER标志物BIP及TRAIL蛋白的表达；
④取适量ERN-T溶液稀释与适量PBS溶液中，用马尔文粒度仪检测其粒径分布。
图2A中检测结果显示ERN-T溶液中的TRAIL浓度高于MSCflT裂解后 TRAIL含量，总蛋白含量1μg的ERN-T溶液中含有64.6±2.2pg TRAIL；图2B 中免疫蛋白印记法(WB)检测结果显示ERN溶液和ERN-T溶液均含有内质网标记分子BIP，但ERN-T溶液含有人源TRAIL蛋白，而ERN溶液不含人源TRAIL 蛋白；图2C显示ERN-T溶液中纳米粒子粒径比较均一，99.2％的颗粒集中在平均粒径为70.6nm的峰。上述ERN-T的优良特性，说明ERN-T具有良好的TRAIL相关的研究前景。
实施例3观察细胞对DiI标记ERN-T(ERN-T/DiI)的摄入情况
为了考察所制备的细胞内质网来源的生物纳米粒子(ERN-T)载送药物进入细胞的情况，可以进行荧光染料标记纳米粒子的细胞摄入实验。具体方法如下：
(1)分别向200μL PBS和200μL实施例2制得的ERN-T溶液(TRAIL浓度为40ng/mL)中各加入200μL 10μM DiI溶液，常温避光，孵育20min；
(2)孵育后，100KD超滤管10000g离心15min，去除下清液，再各加入 1mL PBS缓冲液涤两次，即得到游离DiI(PBS/DiI)或DiI标记的ERN-T (ERN-T/DiI)；
(3)将M231细胞(市购)接种于载玻片培养孔，培养24h，待细胞贴壁后，加入步骤(2)制得的PBS/DiI或ERN-T/DiI 200μL，共培养6h，弃去培养基，以PBS洗涤3次后，以共聚焦荧光显微镜观察细胞对DiI的摄入情况，或者将细胞酶解脱壁后回收，以流式细胞仪检测含有DiI的细胞比例。
结果见图3，从图中可以看出：M231细胞与PBS/DiI或ERN-T/DiI经过6 小时共孵育后，PBS/DiI与M231细胞共孵育组没有到DiI荧光信号；而ERN-T/DiI 与M231细胞共孵育组检测到明显的DiI荧光信号。实验结果表明M231细胞对 ERN-T摄取良好。
实施例4测试AZD@ERN-T对癌细胞的生长抑制活性(细胞毒性)
(1)向1mL TRAIL蛋白浓度为40ng/mL的ERN-T溶液中加入50μL 20mM AZD溶液，混匀后；20kHZ超声处理30s后，停30s，再次超声30s，停30s，如此循环6次；超声处理结束后，将含有ERN-T和AZD混合液37℃，5％CO2培养箱中修复外泌体膜1h；孵育结束后，100000g，4℃，超速离心3h去除上清液，再用PBS轻轻摇晃洗两次，最后加入100μL PBS溶液重悬，得到AZD@ERN-T溶液，-80℃备用；
(2)AZD标准曲线及制备的AZD@ERN-T溶液中AZD浓度测定：准确配制0.0625mM、0.125mM、0.25mM、0.5mM、1.0mM AZD标准液，以紫外分光光度计在272nm处检测对应AZD浓度吸光值，AZD标准曲线如图4所示；取步骤(1)制得的AZD@ERN-T溶液稀释10倍后，紫外分光光度计检测其吸光值，根据AZD标准曲线算得AZD@ERN-T溶液中AZD浓度为0.8mM；
(3)将H727细胞、M231细胞、Hela细胞、SH-SY5Y细胞和Hacat细胞 (上述细胞均市购)按1×104个/孔接种于96板中，培养24小时；
(4)去除原培养基，加入含有0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、 4.0ng/mLTRAIL浓度的ERN-T或重组TRAIL(rT市购)或AZD 20nM+rT(该体系中，rT的浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL， AZD浓度为20nM)、含有20nM AZD的AZD@ERN-T(AZD 20nM@ERN-T) (其中，该复合粒子中TRAIL浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、 4.0ng/mL，AZD浓度为20nM)作用24h后，使用商品化细胞活性及繁殖试剂 CCK-8，根据试剂供应商使用说明测试细胞的增殖和活力。通过酶标仪 (PerkinElmer 2300，MA，USA)，测定每个孔在450nM波长的吸光度值。每个试验组设置三个重复，每个实验重复3次。细胞增殖及活性计算公式为：viability of cells(％)＝(Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank))×100.Ablank、Acontrol、和Asample分别是培养基、对照和药物作用组在450nM测量波长处的吸光度值。
实验结果如图5所示，在TRAIL单独作用下，ERN-T比同等TRAIL剂量下rT杀伤效果更好；在TRAIL与AZD联合作用下，AZD 20nM+rT杀伤作用并不明显，而AZD 20nM@ERN-T杀伤效果得到了极大提升，并且对正常细胞Hacat没有毒副作用。结果表明ERN-T可以部分克服癌细胞TRAIL抗性，并在 AZD 20nM@ERN-T联合作用下极显著杀伤癌细胞，这体现ERN-T及AZD 20nM @ERN-T安全高效的抗癌活性，也预示ERN-T及AZD 20nM@ERN-T在癌症治疗研究中的光明前景。
实施例5 AZD@ERN-T在M231肿瘤模型中的抗癌活性
本实施例采用2μg AZD和2.0ng ERN-T共混、超声、孵育(具体步骤同实施例4)，未经后续洗涤，制备得到AZD@ERN-T：
M231皮下移植瘤模型：从北京斯贝福生物科技有限公司买4～5周龄的 Balb/c雌性裸鼠，在SPF级饲养环境下饲养1周，称其体重约20g左右(5～6 周龄)；选取健康小鼠用于肿瘤移植；选取同一批生长状态及正常形态的M231 细胞(市购)传代培养，按照500万细胞/只，注射于右侧前肢皮下；待接种癌细胞14天后，肿瘤体积长到200～300mm3(体积计算公式：肿瘤长×肿瘤宽2/2) 时，准备药物注射肿瘤；随机将25只小鼠分为5组：control、AZD、ERN-T、 AZD+rT和AZD@ERN-T分别按下述剂量：0.5M蔗糖/只、2μg AZD/只、2.0ng/ 只、2μgAZD+2.0ng rT/只、2μg AZD+2.0ng ERN-T/只进行瘤内注射。共治疗3 次，每次治疗之间间隔4天。每4天测一次肿瘤体积及小鼠体重。第43天处死实验动物，收集小鼠肿瘤及器官组织进行终末瘤重测量或进一步的病理分析。
图6结果显示ERN-T单独低剂量给药对肿瘤有抑制生长作用(maximal TVI15.5％)，随着时间推移效果并不太明显；然而，AZD、AZD+rT和AZD@ERN-T (AZD+ERN-T)抑瘤作用明显TVI分别为47％、44％和76％。经过三次注射后， AZD和AZD+rT组肿瘤又出现缓慢增长；而AZD@ERN-T组肿瘤慢慢皱缩消亡, 直至肿瘤体积维持在289～333mm3状态。如图6C所示，当注射药物时，小鼠体重有轻微的波动；随着注射时间的推移，小鼠体重逐渐恢复正常。在向小鼠移植肿瘤43天后，处死老鼠并取出肿瘤，照片数据显示AZD@ERN-T组联合治疗的肿瘤体积明显小于其他各作用组；将肿瘤称重，Ctrl组肿瘤重量将近 AZD@ERN-T组的12倍。结果显示，AZD@ERN-T在体内实验中可显著的抑制 M231肿瘤生长。
实施例6以免疫印迹法检测药物处理癌细胞后其蛋白表达水平的变化
本实施例中的AZD@ERN-T为实施例4超声法制得的AZD@ERN-T溶液，其中，TRAIL浓度为2ng/mL，AZD浓度为20nM：
(1)以50万细胞/孔密度将M231细胞种植于六孔板中，孵育24小时后，去除原培养基，分别加入新鲜培养基、含有20nM AZD的新鲜培养基、含有 2ng/mL TRAIL的ERN-T的新鲜培养基、含有AZD@ERN-T(ERN-T的TRAIL 为2ng/mL，AZD浓度为20nM)的新鲜培养基作为Ctrl组、AZD组、ERN-T 组、AZD@ERN-T组；经药物作用24小时后，将细胞消化裂解，用商品化BCA试剂盒按照说明指南检测细胞裂解液总蛋白浓度；
(2)总蛋白上样量为20μg，上样体积为10μL条件下，对步骤(1)中Ctrl、 AZD、ERN-T、AZD@ERN-T等组的M231细胞裂解液进行免疫蛋白印记实验检测Mcl-1，Surivivin，capase3及内参GAPDH等蛋白表达量变化情况；
结果(见图7)表明，AZD@ERN-T处理M231细胞，下调了Mcl-1和Survivin 的表达，相应地在与ERN-T联用时上调了凋亡蛋白酶Caspase3的激活水平，因而促进了ERN-T对癌细胞的凋亡诱导效应。
本发明提供了一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子和多维多靶点复合纳米粒子(AZD@ERN-T)，该复合纳米粒子同时递送促凋亡蛋白(比如TRAIL) 和化疗小分子药物，低剂量ERN-T和AZD协同作用，显著增强抗癌效果，并且对正常组织细胞无明显毒性，为以后基于ERN-T的癌症治疗提供了新型纳米药物的制备方法，前期研究数据及一定的理论依据。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东工业大学
<120> 一种细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应
用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 846
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人源TRAIL基因CDS全长序列
<400> 1
atggctatga tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 60
atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac 120
gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa 180
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cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg 540
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acaaatgagc acttgataga catggaccat gaagccagtt tttttggggc ctttttagtt 840
ggctaa 846

Claims (7)

1.一种多维多靶点复合纳米粒子，其特征在于包含基于细胞内质网来源的生物纳米粒子和致敏癌细胞凋亡应答活性小分子药物AZD5582；
所述的多维多靶点复合纳米粒子的制备方法，包含如下步骤：
（1）传代培养：将人或动物细胞进行传代培养，获得第二代至第四代的人或动物细胞；
（2）将表达人源TRAIL蛋白的病毒转染人或动物细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞；
（3）步骤（2）制得的表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞大量培养，收集细胞，然后超声破碎细胞，得到破膜的细胞匀浆液；
（4）通过蔗糖密度梯度离心方法对步骤（3）制得的破膜的细胞匀浆液进行超速离心，分层吸出内质网提取物溶液，得到基于细胞内质网来源的生物纳米粒子溶液；
（5）将AZD5582溶液与步骤（4）制得的基于细胞内质网来源的生物纳米粒子溶液混匀，然后20KHZ超声30秒，间隔30秒，再次重复超声操作，如此重复6次；
（6）超声处理后，立即放入细胞培养箱中孵育1小时，以促进基于细胞内质网来源的生物纳米粒子膜修复；
（7）孵育结束后，将混合液以100000g超速离心3小时，倒掉上清液，再用PBS洗涤，同条件离心，沉淀物即为同时负载TRAIL和AZD5582的多维多靶点复合纳米粒子；
步骤（1）中所述的人或动物细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞或羊膜间充质干细胞中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的多维多靶点复合纳米粒子，其特征在于：
步骤（2）中所述的病毒为慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。
3.根据权利要求1所述的多维多靶点复合纳米粒子，其特征在于：
步骤（2）中所述的转染的具体操作为：
将状态良好的P2~P4代脐带间充质干细胞，以1×106个/孔接种于六孔板，37℃，5%CO2细胞培养箱过夜；离心去除培养基，然后加入含有表达人源TRAIL蛋白的慢病毒和polybrene的DMEM/F-12培养基，孵育6~24小时；孵育后离心去除培养基，加入含有10% FBS的DMEM/F12新鲜培养基继续培养2~3天；待细胞长满后，进行增殖传代培养，得到表达TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的多维多靶点复合纳米粒子，其特征在于：
所述的表达人源TRAIL蛋白的慢病毒的MOI为2，用量为10~30 μL/mL；
所述的polybrene在DMEM/F-12培养基中的浓度为5~20 μg/mL。
5.根据权利要求1所述的多维多靶点复合纳米粒子，其特征在于：
步骤（4）中所述的蔗糖密度梯度离心方法的具体操作为：
将破膜的细胞匀浆液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层，在4℃条件下，以100000g超高速离心3小时；然后将液柱中的液体由上至下等体积取出，收集第6~8次取出的液体，即为含有表达TRAIL的基于细胞内质网来源的生物纳米粒子溶液。
6.权利要求1~5任一项所述的多维多靶点复合纳米粒子的制备方法，其特征在于包含如下具体步骤：
（1）将AZD5582溶液与基于细胞内质网来源的生物纳米粒子溶液混匀，然后20KHZ超声30秒，间隔30秒，再次重复超声操作，如此重复6次；
（2）超声处理后，立即放入细胞培养箱中孵育1小时，以促进基于细胞内质网来源的生物纳米粒子膜修复；
（3）孵育结束后，将混合液以100000g超速离心3小时，倒掉上清液，再用PBS洗涤，同条件离心，沉淀物即为同时负载TRAIL和AZD5582的多维多靶点复合纳米粒子。
7.权利要求1~5任一项所述的多维多靶点复合纳米粒子在制备癌症防治药物中的应用。
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