CN114164236B - 一种同时制备ern-t和ilv-t的方法 - Google Patents

一种同时制备ern-t和ilv-t的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时制备ERN‑T和ILV‑T的方法。该方法首先用表达人源TRAIL蛋白的病毒转染传代至第2～4代的细胞，破碎、离心，分离上清液，通过蔗糖密度梯度离心至分层，自上往下第二层即为ERN‑T，第三层即为ILV‑T。本发明首次提供了一种可同时制备两种纳米TRAIL制剂(ERN‑T和ILV‑T)的方法，提高了TRAIL工程化细胞的利用率；且该方法操作简单，成本低，应用前景广阔。

Description

一种同时制备ERN-T和ILV-T的方法
技术领域
本发明属于抗癌生物纳米制剂制备技术领域。更具体地，涉及一种同时制备ERN-T和ILV-T的方法。
背景技术
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumour Necrosis Factor-RelatedApoptosis-Inducing Ligand，TRAIL)通过与多种癌细胞表面的死亡受体TRAILR1/DR4和TRAILR2/DR5结合，募集胞浆内接头蛋白FADD和半胱天冬酶原8(Procaspase-8)，形成一个死亡诱导信号复合体(DISC)，激活Procaspase-8，进而诱导Procaspase3的激活，启动细胞外源凋亡通路，引起细胞凋亡。此外，TRAIL还能激活线粒体介导的半胱天冬酶9(caspase-9)相关的细胞内源凋亡通路，即激活的caspase-8切割激活BID为tBID，后者结合到线粒体膜，降低线粒体的膜电势，促使线粒体释放细胞色素c和Smac/DIABLO，两者协同激活caspase-9，与caspase-8一起激活凋亡效应酶caspase-3，引起细胞凋亡。TRAIL通常只作用于肿瘤或癌细胞引发凋亡，对正常细胞没有影响，安全性好，因此具有良好的抗癌应用前景。
然而，目前重组可溶型TRAIL(rTRAIL)的临床试验效果很不理想，虽然安全性没有问题，但治疗几乎无效。主要原因可归纳为几点：1)rTRAIL的凋亡诱导活性不高；2)肿瘤细胞普遍存在对rTRAIL的耐药性；3)rTRAIL在体内不稳定，半衰期只有30min，生物利用度低；4)rTRAIL缺乏对癌症和肿瘤的靶向性。因此，研发新型高效的TRAIL制剂，以期实现这一促凋亡因子的临床应用成为了一个迫切的研究课题。近期(2021年6月)Hou Huan等公开了一种制备内质网源纳米TRAIL(ERN-T)的方法，但该方法只分离制备得到一种膜结合纳米TRAIL——ERN-T(Hou Huan et al.TRAIL-Armed ER Nanosomes Induce DrasticallyEnhanced Apoptosis in Resistant Tumor in Combination with the Antagonist ofIAPs(AZD5582)(Advanced Healthcare Materials,2021,10(11))。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种可同时制备两种纳米TRAIL制剂：ERN-T(内质网来源的纳米TRAIL)和ILV-T(表达TRAIL的多囊泡体腔内囊泡)的方法，提高了TRAIL工程化细胞的利用率。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种同时制备ERN-T和ILV-T的方法，包括如下步骤：
S1.用表达人源TRAIL蛋白的病毒转染传代至第2～4代的细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的细胞，破碎得到细胞匀浆液；
S2.将步骤S1所得细胞匀浆液离心、分离上清液，再通过蔗糖密度梯度离心至分层，自上往下第二层即为ERN-T，第三层即为ILV-T；
其中，所述细胞包括脐带间充质干细胞(MSC)、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、心肌细胞、人胚肾细胞、巨噬细胞、T细胞、肿瘤相关成纤维细胞中的一种或几种。
最优选地，所述细胞为脐带间充质干细胞。
优选地，步骤S1所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒中的一种或几种。
最优选地，所述病毒为慢病毒。
优选地，步骤S1所述病毒用于细胞转染的MOI为3～300。最优选为3。
优选地，步骤S1所述转染的方法为：
S1-1.将第2～4代的细胞在DMEM完全培养基中培养11～13h后，去除所述DMEM完全培养基；
S1-2.向步骤S1-1得到的产物中加入含表达人源TRAIL蛋白的病毒和聚凝胺(polybrene)的DMEM/F-12培养基，孵育6～24h后，去除所述DMEM/F-12培养基；
S1-3.向步骤S1-2得到的产物中加入含胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养2～3天后，进行传代培养，第3～4代即为所述表达人源TRAIL蛋白的细胞
进一步优选地，步骤S1-1所述培养为在35～39℃、4～6％CO2的细胞培养箱中培养。
最优选地，所述培养为在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
进一步优选地，步骤S1-2所述聚凝胺在所述DMEM/F-12培养基中的浓度为6～10μg/mL。最优选为8μg/mL。
进一步优选地，步骤S1-2所述孵育的时间为8h。
进一步优选地，步骤S1-3所述胎牛血清在DMEM/F12培养基中的浓度为8～12％(v/v)。最优选为10％(v/v)。
优选地，步骤S1所述破碎为在19～21kHz下超声破碎1～3min。
最优选地，所述破碎为在20kHz下超声破碎2min。
优选地，步骤S2所述离心为在11000～13000g、3～5℃下离心8～12min。离心是为了去除细胞核、线粒体和破碎的细胞。最优选地，所述离心为在12000g、4℃下离心10min。
优选地，步骤S2所述蔗糖密度梯度离心为：将所述上清液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层，在105000～115000g、3～5℃下离心14～18h。
最优选地，在110000g、4℃下离心16h。
进一步优选地，所述液柱中蔗糖溶液自下而上分别为2.4～2.6M蔗糖溶液A、1.8～2.2M蔗糖溶液B、0.3～0.35M蔗糖溶液C。
最优选地，所述液柱中蔗糖溶液自下而上分别为2.5M蔗糖溶液A、2M蔗糖溶液B、0.33M蔗糖溶液C
进一步优选地，所述上清液、蔗糖溶液A、蔗糖溶液B、蔗糖溶液C的体积比为1：0.3～0.35：0.61～0.67：1.5～1.7。
最优选地，所述上清液、蔗糖溶液A、蔗糖溶液B、蔗糖溶液C的体积比为1：0.32：0.64：1.6。
作为一种优选的可实施方案，该方法包括如下步骤：
S1.将第2～4代的细胞(脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、心肌细胞、人胚肾细胞、巨噬细胞、T细胞、肿瘤相关成纤维细胞中的一种或几种)在35～39℃、4～6％CO2的细胞培养箱中的DMEM完全培养基里培养11～13h后，去除所述DMEM完全培养基；再加入含表达人源TRAIL蛋白的病毒(慢病毒、逆转录病毒、腺病毒中的一种或几种，MOI为3～300)和聚凝胺(浓度为6～10μg/mL)的DMEM/F-12培养基，孵育6～24h后，去除所述DMEM/F-12培养基；然后加入含8～12％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养2～3天后，进行传代培养，第3～4代即为所述表达人源TRAIL蛋白的细胞，再在19～21KHZ下超声破碎1～3min，得到细胞匀浆液；
S2.将步骤S1所得细胞匀浆液在11000～13000g、3～5℃下离心8～12min、分离上清液，将所述上清液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层，在105000～115000g、3～5℃下离心14～18h分层，自上往下第二层即为ERN-T，第三层即为ILV-T；
其中，所述液柱中蔗糖溶液自下而上分别为2.4～2.6M蔗糖溶液A、1.8～2.2M蔗糖溶液B、0.3～0.35M蔗糖溶液C；所述上清液、蔗糖溶液A、蔗糖溶液B、蔗糖溶液C的体积比为1：0.3～0.35：0.61～0.67：1.5～1.7。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次提供了一种可同时制备两种生物纳米TRAIL制剂的方法，即ERN-T(内质网来源的纳米TRAIL，产率为21.12～21.52％)和ILV-T(表达TRAIL的多囊泡体腔内囊泡，产率为8.34～8.67％)的方法，提高了TRAIL工程化细胞的利用率；且该方法操作简单，成本低，应用前景广阔。
附图说明
图1a是TRAIL表达的流式分析图，图1b是TRAIL表达的共聚焦显微镜图。
图2a是液柱分布情况和离心后分层情况；图2b是蛋白免疫印迹结果；图2c是ERN-T形貌观察结果；图2d是ERN-T粒径分布结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种同时制备ERN-T和ILV-T的方法
S1.将状态良好的第2～4代的脐带间充质干细胞以5×105个/孔接种于六孔板，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中的DMEM完全培养基里培养12h后，用无菌移液管移去所述DMEM完全培养基；再加入含30μL表达人源TRAIL蛋白的慢病毒(此时感染复数MOI为3)和浓度为8μg/mL的polybrene的DMEM/F-12培养基，孵育8h后，用无菌移液管移去所述DMEM/F-12培养基；然后加入含10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养3天后，进行传代培养，第3～4代即为所述表达人源TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞，收集状态良好的表达人源TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞，用PBS将其浓度调到4.0×107/mL，置于1.5mL EP管中，再加入0.5mL匀浆液(0.25M蔗糖+10mM Tris-HCl(pH 7.4)+1mM乙酸镁+10μL 100×蛋白酶抑制剂)，冰浴并在20KHZ下超声破碎2min，得到细胞匀浆液；
S2.将步骤S1所得细胞匀浆液在12000g、4℃下离心10min、分离收集1mL上清液，将上清液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层，在110000g、4℃下离心16h分层，自上往下第二层即为ERN-T，第三层即为ILV-T，分装，-80℃下保存；
其中，所述液柱中蔗糖溶液自下而上分别为2.5M蔗糖溶液A、2M蔗糖溶液B、0.33M蔗糖溶液C，所述上清液、蔗糖溶液A、蔗糖溶液B、蔗糖溶液C的体积比为1：0.32：0.64：1.6。
实施例2一种同时制备ERN-T和ILV-T的方法
S1.将状态良好的第2～4代的心肌细胞以5×105个/孔接种于六孔板，在39℃、4％CO2的细胞培养箱中的DMEM完全培养基里培养11h后，用无菌移液管移去所述DMEM完全培养基；再加入含30μL表达人源TRAIL蛋白的慢病毒(此时感染复数MOI为3)和浓度为10μg/mL的polybrene的DMEM/F-12培养基，孵育6h后，用无菌移液管移去所述DMEM/F-12培养基；然后加入含12％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养3天后，进行传代培养，第3～4代即为所述表达人源TRAIL蛋白的心肌细胞，收集状态良好的表达人源TRAIL蛋白的心肌细胞，用PBS将其浓度调到4.0×107/mL，置于1.5mL EP管中，再加入0.5mL匀浆液(0.25M蔗糖+10mMTris-HCl(pH 7.4)+1mM乙酸镁+10μL 100×蛋白酶抑制剂)，冰浴并在19KHZ下超声破碎3min，得到细胞匀浆液；
S2.将步骤S1所得细胞匀浆液在11000g、5℃下离心8min、分离收集1mL上清液，将上清液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层，在115000g、3℃下离心18h分层，自上往下第二层即为ERN-T，第三层即为ILV-T，分装，-80℃下保存；
其中，所述液柱中蔗糖溶液自下而上分别为2.4M蔗糖溶液A、1.8M蔗糖溶液B、0.35M蔗糖溶液C，所述上清液、蔗糖溶液A、蔗糖溶液B、蔗糖溶液C的体积比为1：0.3：0.61：1.5。
实施例3一种同时制备ERN-T和ILV-T的方法
S1.将状态良好的第2～4代的肿瘤相关成纤维细胞以5×105个/孔接种于六孔板，在35℃、6％CO2的细胞培养箱中的DMEM完全培养基里培养13h后，用无菌移液管移去所述DMEM完全培养基；再加入含30μL表达人源TRAIL蛋白的慢病毒(此时感染复数MOI为3)和浓度为6μg/mL的polybrene的DMEM/F-12培养基，孵育24h后，用无菌移液管移去所述DMEM/F-12培养基；然后加入含8％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养3天后，进行传代培养，第3～4代即为所述表达人源TRAIL蛋白的肿瘤相关成纤维细胞，收集状态良好的表达人源TRAIL蛋白的肿瘤相关成纤维细胞，用PBS将其浓度调到4.0×107/mL，置于1.5mL EP管中，再加入0.5mL匀浆液(0.25M蔗糖+10mM Tris-HCl(pH 7.4)+1mM乙酸镁+10μL 100×蛋白酶抑制剂)，冰浴并在21KHZ下破碎超声1min，得到细胞匀浆液；
S2.将步骤S1所得细胞匀浆液在13000g、3℃下离心12min、分离收集1mL上清液，将所述上清液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层，在105000g、5℃下离心14h分层，自上往下第二层即为ERN-T，第三层即为ILV-T，分装，-80℃下保存；
其中，所述液柱中蔗糖溶液自下而上分别为2.6M蔗糖溶液A、2.1M蔗糖溶液B、0.3M蔗糖溶液C，所述上清液、蔗糖溶液A、蔗糖溶液B、蔗糖溶液C的体积比为1：0.35：0.67：1.7。
对比例1
同实施例1的方法，区别在于，所述液柱中蔗糖溶液自下而上分别为3.0M蔗糖溶液A、2.8M蔗糖溶液B、0.5M蔗糖溶液C。
对比例2
同实施例1的方法，区别在于，所述液柱中蔗糖溶液自下而上分别为2M蔗糖溶液A、1.2M蔗糖溶液B、0.1M蔗糖溶液C。
对比例3
同实施例1的方法，区别在于，所述上清液、蔗糖溶液A、蔗糖溶液B、蔗糖溶液C的体积比为1：0.5：0.8：1.9。
对比例4
同实施例1的方法，区别在于，所述上清液、蔗糖溶液A、蔗糖溶液B、蔗糖溶液C的体积比为1：0.1：0.3：1.2。
对比例5
同实施例1的方法，区别在于，所述液柱中蔗糖溶液自下而上分别为0.8M蔗糖溶液A、1.2M蔗糖溶液B、1.5M蔗糖溶液C、2.0M蔗糖溶液D，所述上清液、蔗糖溶液A、蔗糖溶液B、蔗糖溶液C、蔗糖溶液D的体积比分别为1：0.3：0.7：0.8：0.2，所述上清液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层后，离心2h。
对比例6
同实施例1的方法，区别在于，步骤S2所述上清液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层后，离心10h。
测试例
一、实施例1中表达人源TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞的表征
(1)将未经处理的脐带间充质干细胞(MSC组)、实施例1中表达人源TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞(MSCflt组)分别用PBS洗涤2次后，胰酶消化洗脱细胞，1000rpm/min离心收集细胞，PBS重悬后，加入PE偶联鼠来源的抗TRAIL抗体，避光染色30min，1000r/min离心，弃上清，PBS洗涤，离心，PBS重悬后以流式细胞仪检测TRAIL表达水平。
(2)将未经处理的脐带间充质干细胞(MSC组)、实施例1中表达人源TRAIL蛋白的1×105脐带间充质干细胞(MSCflt组)分别接种于共聚焦培养皿中，待其贴壁生长12h后，PBS洗涤2次，4％多聚甲醛固定15min后，用含0.1％tween-20PBS溶液破膜10min，以PE偶联鼠来源的抗TRAIL抗体避光染色30min，经PBS洗涤细胞3次，每次5min，清洗掉没有结合到细胞膜上的游离的抗体。再以异硫氰酸酯偶联的鬼笔环肽染色细胞骨架10min，PBS洗涤细胞3次，共聚焦显微镜下观察TRAIL表达。
图1a是TRAIL表达的流式分析图，图1b是TRAIL表达的共聚焦显微镜图。由图1a可知，MSCflt组的TRAIL阳性率高达93.6％，而MSC组的TRAIL阳性率仅3.5％，可见MSCflt组的TRAIL阳性率显著高于MSC组；由图1b可知，MSCflt组呈现出大片的红色，而MSC组无明显红色，可见MSCflt组的TRAIL表达显著高于MSC组。图1a～1b均说明本发明方法可成功将表达人源TRAIL蛋白成功转染至脐带间充质干细胞中，且转染率较高。
二、实施例1中ERN-T和ILV-T的表征
(1)ERN-T和ILV-T的蛋白免疫印迹：
将实施例1步骤S1蔗糖密度梯度离心分层得到的液体等分为7份，标记为F1～F7，其中F5为自下而上第二层，F6～F7为自下而上第三层，具体如图2a所示，左侧为蔗糖密度梯度的液柱分布情况，右侧为蔗糖密度梯度离心后的分层情况。
再将F1～F7分别进行蛋白免疫印迹，首先将待测组分收集，在4℃用RIPA裂解液裂解30min，并用BCA试剂盒测出蛋白浓度。取蛋白加入上样缓冲液，100℃条件下煮10min；选用12％SDS-PAGE凝胶，蛋白上样量为10μg；恒压80V，浓缩胶电泳30min，待样品压成一条线时，恒压120V电泳分离胶60min，跑出所有maker条带，以确保样品条带更好分离；在新配置的转膜液中转膜，转膜电流为恒流200mA，转膜时间为55～57min，待maker全部转到PVDF膜为止；4℃摇床(70rpm)孵育BIP抗体和TRAIL抗体过夜，TBST洗净后，室温摇床孵育二抗2h；用TBST洗去PVDF膜上残余二抗后，避光浸泡化学发光液，上机曝光。用BioImage Lab(Bio-Rad)对条带拍照，并用ImageJ software软件(National Institutes of Health)分析条带。
结果如图2b所示，其中，F5显示表达了TRAIL、内质网(ER)的生物标志物BIP和CD63，说明F5(自上往下第二层)为内质网衍生的纳米体膜TRAIL(ERN-T)，而CD63的存在表明了F5的粗糙内质网特征，使得TRAIL和CD63被翻译；F6～F7显示表达了TRAIL和外泌体的生物标志物CD63，说明F6～F7(自上往下第三层)为表达TRAIL的腔内囊泡(ILV-T)；而F1～F4未见TRAIL、BIP和CD63的同时表达，说明F1～F4不含有ERN-T和ILV-T。以上均表明本发明方法同时制备得到了ERN-T和ILV-T。
(2)ERN-T的粒径分布和形貌：
将实施例1制得的10μL ERN-T用PBS稀释后，滴加到镍网吸附10min，未吸附到镍网上的ERN-T用PBS清洗，再加入4％多聚甲醛固定10min，0.3％醋酸铀负染后自然晾干，用透射电子显微镜观察ERN-T形貌。
另取实施例1制得的10μL ERN-T用PBS稀释，以福流生物公司纳米流式仪nanoFCM对其粒径分布进行检测。
形貌观察结果如图2c所示，可见ERN-T为单层磷脂膜结构；粒径分布结果如图2d所示，可见ERN-T的平均粒径为78.82nm，为纳米级别的粒子。
三、ERN-T和ILV-T的产率
实施例1～3和对比例1～6所得ERN-T和ILV-T的产率如表1所示。其中，ERN-T和ILV-T产率的计算方法为：产率＝蔗糖密度离心相应组分的蛋白量/细胞匀浆液的总蛋白量*100％。
表1ERN-T和ILV-T的产率
产率 ERN-T/％ ILV-T/％
实施例1 21.52 8.52
实施例2 21.41 8.67
实施例3 21.12 8.34
对比例1 18.54 6.82
对比例2 21.47 0
对比例3 16.23 6.34
对比例4 17.43 5.21
对比例5 19.88 0
对比例6 18.6 7.25
从表1可知，实施例1～3中ERN-T的产率为21.12～21.52％，显著高于对比例1、3、4、6(16.23～18.6％)；而虽然对比例2和5的ERN-T产率分别达到了21.47％和19.88％，但其ILV-T产率为0，显著低于实施例1～3(8.34～8.67％)。总体而言，实施例1～3中ERN-T和ILV-T的产率显著高于对比例1～6。
综上，本发明首次提供了一种可同时制备两种生物纳米TRAIL制剂的方法，即ERN-T(内质网来源的纳米TRAIL，产率为21.12～21.52％)和ILV-T(表达TRAIL的多囊泡体腔内囊泡，产率为8.34～8.67％)的方法，提高了TRAIL工程化细胞的利用率；且该方法操作简单，成本低，应用前景广阔。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种同时制备内质网来源的纳米TRAIL（ERN-T）和表达TRAIL的多囊泡体腔内囊泡（ILV-T）的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 用表达人源TRAIL蛋白的病毒转染传代至第2～4代的细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的细胞，破碎得到细胞匀浆液；
S2. 将步骤S1所得细胞匀浆液在11000～13000g、3～5℃下离心8～12min后，分离上清液，再通过蔗糖密度梯度离心至分层，自上往下第二层即为ERN-T，第三层即为ILV-T；
其中，所述细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、心肌细胞、肿瘤相关成纤维细胞中的一种或几种；
步骤S2所述蔗糖密度梯度离心为：将所述上清液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层，在105000～115000g、3～5℃下离心14～18h；所述液柱中蔗糖溶液自下而上分别为2.4～2.6M蔗糖溶液A、1.8～2.2M蔗糖溶液B、0.3～0.35M蔗糖溶液C；所述上清液、蔗糖溶液A、蔗糖溶液B、蔗糖溶液C的体积比为1：0.3～0.35：0.61～0.67：1.5～1.7。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1所述病毒用于细胞转染的MOI为3～300。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1所述转染的方法为：
S1-1. 将第2～4代的细胞在DMEM完全培养基中培养11～13h后，去除所述DMEM完全培养基；
S1-2. 向步骤S1-1得到的产物中加入含表达人源TRAIL蛋白的病毒和聚凝胺的DMEM/F-12培养基，孵育6～24h后，去除所述DMEM/F-12培养基；
S1-3. 向步骤S1-2得到的产物中加入含胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养2～3天后，进行传代培养，第3～4代即为所述表达人源TRAIL蛋白的细胞。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S1-2所述聚凝胺在所述DMEM/F-12培养基中的浓度为6～10μg/mL。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1所述破碎为在19～21kHz下超声破碎1～3min。
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