CN112852725B - 利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法及应用 - Google Patents

利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体的方法及应用，所述方法包括：将预处理后的干细胞培养液加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球，再加入亲和液，反应1h‑5h后离心分离，得到沉淀物，将所述沉淀物洗涤后，最后加入洗脱液洗脱，离心得到含干细胞外泌体的上清液。本发明的蛋白交联纳米亲和微球对各种干细胞来源的外泌体提取纯化，该方法操作方便，耗时短，提取效率高，获得的外泌体纯度高，产量多，还能保证其生物学活性及完整性。该方法制备的干细胞外泌体用于外泌体相关的技术开发及转化应用，包括外泌体载药、外泌体靶向治疗(包括急性呼吸窘迫症，呼吸道感染，哮喘及阿默茨海默症等)，及创面修复及医学美容类应用等。

Description

利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法 及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用蛋白交联纳米亲和微球纯化干细胞外泌体制备方法及应用。
背景技术
外泌体是由活细胞分泌的磷脂双分子层结构的小囊泡，直径在30-150 nm，可存在于各种体液中，如血清、血浆、唾液、尿液、腹水、脊髓液、乳汁等。外泌体中含有多种生物分子，如mRNA、miRNA、蛋白质、脂质等，可以传递给受体细胞，从而改变受体细胞的生理功能或病理功能。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用开发潜力。
目前，针对外泌体的提取纯化没有一个统一的标准，常用的方法有超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫捕获法等。超速离心法虽然是公认的外泌体提取的“金标准”方法，但是操作费时费力、高度依赖人工、回收率低，外泌体形态大小不一，高速离心会损害外泌体而影响下游实验。密度梯度离心法虽然可以获得很纯的外泌体，但该方法操作繁琐、重复性差、耗时很长、回收率低，不适合大批量提取外泌体。超滤法可以方便快速的提取外泌体，但该方法提取的外泌体中含有大颗粒杂质污染，严重影响下游应用。聚合物沉淀法提取的外泌体中杂蛋白污染多，颗粒形态不均一，影响下游分析。免疫捕获法虽然可以特异性地捕获外泌体，获得的外泌体纯度高，但该方法成本高且产量低，不能提取样本中所有的外泌体，只能提取某种表面抗原阳性的外泌体。
综上所述，亟需一种操作方便，提取效率高，获得的外泌体纯度高，可以适合各种样本来源的外泌体提取方法。
发明内容
为此，本发明提供一种蛋白交联纳米亲和微球及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明实施例提供一种利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，所述方法包括：
将预处理后的干细胞培养液加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球，再加入亲和液，反应1h-5h后离心分离，得到沉淀物，将所述沉淀物用洗涤液洗涤，最后加入洗脱液洗脱，离心得到含干细胞外泌体的上清液。
优选的，所述的干细胞外泌体为不同来源的干细胞及其诱导分化细胞，包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞，羊膜间充质干细胞、牙髓干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞及其诱导分化细胞的外泌体。
优选的，所述亲和液包括以下组分：15mM-25mM HEPES、20mM-30mM CaCl2、1mM-5mMNaCl、1mM-5mM、MgCl2，pH（7.2-7.5）。
优选的，所述洗涤液包括以下组分：20mM-30mM Tris-HCl、5mM-15mM NaCl、1mM-5mM CaCl2、1mM-5mM MgCl2、pH7.2-7.5。
优选的，所述洗脱液包括以下组分：20mM-30mM Tris-HCl、1mM-5mM NaCl、5mM-10mMEDTA、pH7.2-7.5。
优选的，所述蛋白交联纳米亲和微球的制备方法为：
将生物素标记的ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球中，反应30 min-3 h后，离心得沉淀，所述沉淀即为蛋白交联纳米亲和微球。
优选的，所述生物素标记的ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白的制备方法为：
将ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白加入活性生物素，4℃孵育1h-24h，再用脱盐柱去除游离的生物素，用 PBS缓冲液洗脱，得到生物素标记的ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白。
优选的，所述预处理的方法为：取干细胞培养上清至于离心管中，5000-12000g，离心5-50min，取上清液，过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。
优选的，所述干细胞置于干细胞培养基中培养条件，含5％CO2、温度为37℃，待细胞贴壁铺满85%-95%时，收集上清液。
本发明实施例还体用所述的方法纯化的外泌体在以下应用，（1）外泌体药物装载与应用；（2）外泌体靶向治疗与应用，包括急性呼吸窘迫症，呼吸道感染，哮喘及阿默茨海默症；（3）创面修复及医学美容类应用。
本发明具有如下优点：
本发明制备的蛋白交联亲和微球可对各种干细胞来源的外泌体提取纯化，而且该方法操作方便，耗时短，提取效率高，获得的外泌体纯度高，产量多，还能保证其生物学活性及完整性，本发明的方法非常适合外泌体相关的技术开发及转化应用，可用于外泌体药物装载与应用，外泌体靶向治疗与应用，包括急性呼吸窘迫症，呼吸道感染，哮喘及阿默茨海默症，创面修复及医学美容类应用。因此，本发明提供的技术方案可助力外泌体的产业化应用，具有极大的商业价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的蛋白交联亲和微球制备流程示意图，其中，A：纳米羧基硅胶微球；B：链霉亲和素；C：链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球；D：ReprotideTM511或Tim4；E：活化的生物素；F：生物素标记的ReprotideTM511或Tim4；G：蛋白交联纳米亲和微球；
图2为本发明实施例提供的干细胞培养鉴定及其外泌体提取纯化流程图；
图3为本发明实施例提供的脐带间充质干细胞显微镜观察图；
图4为本发明实施例提供的脐带间充质干细胞特异蛋白CD34的流式检测结果图；
图5为本发明实施例提供的脐带间充质干细胞特异蛋白CD45的流式检测结果图；
图6为本发明实施例提供的脐带间充质干细胞特异蛋白CD73的流式检测结果图；
图7为本发明实施例提供的脐带间充质干细胞特异蛋白CD90的流式检测结果图；
图8为本发明实施例提供的脐带间充质干细胞特异蛋白CD105的流式检测结果图；
图9为本发明实施例提供的超速离心法提取的外泌体电镜检测结果图；
图10为本发明实施例提供的ReprotideTM511蛋白交联亲和微球提取的外泌体电镜检测结果图；
图11为本发明实施例提供的Tim4蛋白交联亲和微球提取的外泌体电镜检测结果图；
图12为本发明实施例采用BSA蛋白定量检测不同提取方法制得外泌体蛋白浓度检测结果图；
图13为本发明实施例通过NTA检测不同提取方法制得外泌体数量的检测结果图；
图14为本发明实施例提供的不同提取方法的外泌体相对纯度检测结果图；
图15为本发明实施例采用Western Blot检测不同提取方法制得外泌体的CD9，CD63，ALIX标志蛋白检测结果图，（1）为ReprotideTM511蛋白，（2）为Tim4蛋白，（3）为超速离心法；
图16为本发明实施例提供的细胞增殖实验检测结果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、蛋白交联纳米亲和微球的制备
本实施例提供一种蛋白交联纳米亲和微球，蛋白交联纳米亲和微球为蛋白与纳米微球偶联物的结合体；其中，蛋白为生物素标记的ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白，纳米微球偶联物为链霉亲和素偶联纳米羧基硅胶微球。
如图1和2所示，该链霉亲和素偶联纳米羧基硅胶微球的制备方法包括以下步骤：
1、链霉亲和素偶联纳米羧基硅胶微球的制备：
取1 ml直径1 μm纳米微球至离心管中，该纳米微球的直径范围为200 nm-2000nm，本实施例中，以1 μm微球为例，先将上述纳米微球10000 g离心10 min，弃上清，得到沉淀物，向沉淀物加入5 ml MES缓冲液混匀，以10000 g离心10 min，弃上清，然后将微球沉淀物重悬在4.5 ml的DMF（N、N-二甲基甲酰胺）溶液中，确保微球被均匀分散，得到微球混合液。其中，MES缓冲液为pH6.0 0.01M-0.5M MES溶液。
取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2 mg，N-羟基琥珀酰亚胺9 mg，加入微球混合液中，室温混匀1 h后10000 g离心10 min，弃上清，用无菌水洗涤2遍，得到第一沉淀物。取链霉亲和素2 mg加入1 ml MES溶液中，充分混匀，再将链霉亲和素溶液加至第一沉淀物中活化微球中，室温混匀2h，10000 g离心10 min，弃上清，得到第二沉淀物，加入2ml 40 mM的乙醇胺封闭液混合反应1h，最后10000 g离心10 min，弃上清，PBS缓冲液洗涤2遍，即得链霉亲和素偶联纳米羧基硅胶微球。
2、生物素标记的ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白的制备
取生物素标记物NHS-PEG2-Biotin 1 mg加入106 μl的DMSO中，配置成10 mM的生物素标记物NHS-PEG2-Biotin的母液。向体积0.1 ml浓度1 mg/ml的ReprotideTM511蛋白溶液中加入0.25 μl生物素标记物NHS-PEG2-Biotin的母液，或向体积0.1 ml浓度1 mg/ml的Tim4蛋白溶液加入0.29 μl生物素标记物NHS-PEG2-Biotin的母液，分别混匀，4℃反应1h。
采用脱盐柱去除游离的生物素，分别将生物素标记的ReprotideTM511蛋白和Tim4蛋白加入脱盐柱中，脱盐柱采用PD MiniTrapTMG25 Desalting Column，用0.4 ml PBS洗涤一次，最后加入0.4 ml PBS洗脱生物素标记化蛋白并收集液体。
3、蛋白交联纳米亲和微球的制备：
各取生物素标记的ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白1ml，分别加入100 mg的链霉亲和素偶联纳米羧基硅胶微球中，反应30min，离心得沉淀，即为蛋白交联纳米亲和微球。
实施例2、脐带间充质干细胞外泌体的制备及培养
1、脐带间充质干细胞的制备
从手术室采集新生儿脐带，用PBS缓冲液将脐带冲洗干净，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将组织充分剪碎至1 mm3大小的组织块。将组织块均匀铺于培养皿中，至于培养箱中培养1h，培养条件：5% CO2，温度37℃。待组织块贴壁比较牢固时，加入适量的干细胞培养基，置于培养箱培养，培养条件：5% CO2，温度37℃。
待细胞贴壁情况良好后，轻轻吸去培养基，并用干细胞培养基轻轻漂洗一次，再加入10 ml新鲜的干细胞培养基置于培养箱中培养，培养条件：5% CO2，温度37℃。待培养皿中贴壁细胞铺满70%-85%时，用消化液消化，待细胞开始脱落飘起时，加入终止液终止消化，用移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000 rpm离心10 min后弃上清，最后用10 ml新鲜干细胞培养基重悬，所得细胞为原代脐带间充质干细胞（P0）。
图3所示，原代脐带间充质干细胞显微镜观察图。
2、脐带间充质干细胞的鉴定
将步骤1中获得原代脐带间充质细胞后，加PBS缓冲液调整细胞浓度至1×106/mL，取200 μl细胞悬液分别加入5 μl荧光标记的单抗（CD73、CD90、CD105、CD34、CD45）混匀，室温下避光孵育20min，于流式细胞仪中检测，图4-8所示，脐带间充质干细胞流式检测结果图。
3、脐带间充质干细胞的培养
将脐带间充质干细胞置于干细胞培养基中培养，培养条件：含5％CO2、温度为37℃，待细胞贴壁铺满90%时，离心收集细胞培养上清液。
4、外泌体的提取纯化
（1）蛋白交联纳米亲和微球提取外泌体
样本预处理，取30 ml的脐带间充质干细胞培养上清至于离心管中，4℃条件下10000 g离心30 min，收集离心管的上清液，再通过0.22 μm膜过滤后备用，得到预处理后的细胞培养上清。
将蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）加入预处理后的细胞培养上清中，加入量为每毫升样本加1mg（即加入300ul微球）蛋白交联纳米亲和微球，加入15ml的亲和液，室温混匀4h，10000g离心10min得沉淀，用洗涤缓冲液对沉淀洗涤2遍，最后加入1ml的洗脱液进行洗脱，离心得含脐带间充质干细胞外泌体的上清液，即得到的蛋白交联纳米亲和微球提取纯化的外泌体。
（2）超速离心法提取外泌体
将30ml预处理后细胞培养上清加至超速离心管中，4℃条件下100000 g离心2 h，得到沉淀物，再用1ml的洗脱液进行重悬沉淀物，即得到超速离心分离纯化的外泌体。
本实施例的蛋白交联亲和微球提取外泌体方法相较于超速离心法的强大的离心力破坏了外泌体部分膜结构而言，该方法更温和，这样更好的保证了外泌体的生物学活性。
实施例3、血浆来源的外泌体提取纯化
1. 血浆样本的预处理及外泌体提取纯化
（1）血浆样本的预处理
来自辽宁省血液中心的健康人血液，加人一定比例的抗凝剂（抗凝剂：血液 = 1：9）,再颠倒混匀，经3000g离心10min后，所得的上清液即为血浆样本。
将血浆样本至于离心管中，4℃条件下10000 g离心30 min，收集离心管的上清液，再通过0.22 μm膜过滤后备用，得到预处理后的血浆样本。
（2）蛋白交联纳米亲和微球提取外泌体
将蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）加入4ml经预处理的血浆样本，加入量为每毫升血浆样本加5mg（即加入200ul微球）蛋白交联纳米亲和微球，再加入2ml的亲和液，室温混匀4h，10000g离心10min得沉淀，用洗涤缓冲液对沉淀洗涤2遍，最后加入0.5ml的洗脱液进行洗脱，离心得含血浆外泌体的上清液，即得到的蛋白交联纳米亲和微球提取的血浆外泌体。
（3）超速离心法提取外泌体
取4ml预处理后的血浆样本加至超速离心管，4℃条件下100000 g离心2 h，得到沉淀物，再用0.5ml的洗脱液进行重悬沉淀物，即得到超速离心提取的外泌体。
2. 评估不同提取方法对外泌体纯度的影响
（1）外泌体蛋白定量对比
采用BSA法检测外泌体的蛋白浓度，将收集的外泌体溶液中加入等体积的裂解液，充分混匀，4℃静置30min，裂解处理后的外泌体蛋白溶液按照 BSA检测试剂盒说明书的操作要求进行外泌体蛋白浓度测定。实验结果如表所示，超速离心法提取的外泌体蛋白浓度明显高于蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）。
（2）颗粒浓度定量对比
采用纳米粒径示踪分析仪对外泌体溶液中颗粒浓度进行检测。如图表所示，蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）略低于超速离心法，由于血浆样本中还有大量非外泌体颗粒物质，所以超速离心法提取的外泌体中可能含有大量该物质污染。
根据外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的比值，可以简单比较外泌体的相对纯度（颗粒浓度与蛋白浓度的比值越大，其外泌体的纯度越高）。如表1所示，蛋白交联纳米亲和微球得到的外泌体，其浓度蛋白的比值比超速离心法高出3倍左右，说明外泌体亲和微球得到的外泌体纯度更高。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例4、HEK-293细胞来源的外泌体提取纯化
1. HEK-293细胞培养上清的预处理及外泌体提取纯化
（1）HEK-293细胞培养上清的预处理
将HEK-293细胞培养上清至于离心管中，4℃条件下10000 g离心30 min，收集离心管的上清液，再通过0.22μm膜过滤后备用，得到预处理后的HEK-293细胞培养上清。
（2）蛋白交联纳米亲和微球提取外泌体
将蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）加入30ml经预处理的HEK-293细胞培养上清，加入量为每毫升细胞培养上清加1mg（即加入300ul微球）蛋白交联纳米亲和微球，再加入15ml的亲和液，室温混匀4h，10000g离心10min得沉淀，用洗涤缓冲液对沉淀洗涤2遍，最后加入0.5ml的洗脱液进行洗脱，离心得上清液，即得到的蛋白交联纳米亲和微球提取的HEK-293细胞来源的外泌体。
（3）超速离心法提取外泌体
取30ml预处理后的HEK-293细胞培养上清液加至超速离心管，4℃条件下100000 g离心2 h，得到沉淀物，再用0.5ml的洗脱液进行重悬沉淀物，即得到超速离心提取的外泌体。
2. 评估不同提取方法对外泌体纯度的影响
（1）外泌体蛋白定量对比
采用BSA法检测外泌体的蛋白浓度，将收集的外泌体溶液中加入等体积的裂解液，充分混匀，4℃静置30min，裂解处理后的外泌体蛋白溶液按照 BSA检测试剂盒说明书的操作要求进行外泌体蛋白浓度测定。实验结果如图6所示，图12所示，超速离心法提取的外泌体蛋白浓度明显高于蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）。
（2）颗粒浓度定量对比
如表2所示，采用纳米粒径示踪分析仪对外泌体溶液中颗粒浓度进行检测。如图13所示，蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）是超速离心法的4倍左右。
根据外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的比值，可以简单比较外泌体的相对纯度（颗粒浓度与蛋白浓度的比值越大，其外泌体的纯度越高）。如图8所示，蛋白交联纳米亲和微球得到的外泌体，其浓度蛋白的比值比超速离心法高出10倍左右，说明外泌体亲和微球得到的外泌体纯度更高，超速离心法提取的外泌体中可能含有污染蛋白。
表2
Figure 316601DEST_PATH_IMAGE002
实施例5、牛奶来源的外泌体提取纯化
牛奶样本的预处理及外泌体提取纯化
（1）牛奶样本的预处理
将来自辽宁辉山乳业集团的新鲜牛奶样本至于离心管中，4℃条件下10000 g离心30 min，收集离心管的上清液，再通过0.22μm膜过滤后备用，得到预处理后的牛奶样本。
（2）蛋白交联纳米亲和微球提取外泌体
将蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）加入4ml经预处理的牛奶样本，加入量为每毫升牛奶样本加5mg（即加入200ul微球）蛋白交联纳米亲和微球，再加入2ml的亲和液，室温混匀4h，10000g离心10min得沉淀，用洗涤缓冲液对沉淀洗涤2遍，最后加入0.5ml的洗脱液进行洗脱，离心得含牛奶外泌体的上清液，即得到的蛋白交联纳米亲和微球提取的牛奶外泌体。
（3）超速离心法提取外泌体
取4ml预处理后的牛奶样本加至超速离心管，4℃条件下100000 g离心2 h，得到沉淀物，再用0.5ml的洗脱液进行重悬沉淀物，即得到超速离心提取的外泌体。
3. 评估不同提取方法对外泌体纯度的影响
（1）外泌体蛋白定量对比
采用BSA法检测外泌体的蛋白浓度，将收集的外泌体溶液中加入等体积的裂解液，充分混匀，4℃静置30min，裂解处理后的外泌体蛋白溶液按照 BSA检测试剂盒说明书的操作要求进行外泌体蛋白浓度测定。实验结果如表所示，超速离心法提取的外泌体蛋白浓度明显高于蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）。
（2）颗粒浓度及纯度对比
采用纳米粒径示踪分析仪对外泌体溶液中颗粒浓度进行检测。如表所示，蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）略低于超速离心法，，超速离心法提取的牛奶来源的外泌体中可能含有大量的大颗粒物质，如酪蛋白聚团、脂蛋白颗粒等污染物。
根据外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的比值，可以简单比较外泌体的相对纯度（颗粒浓度与蛋白浓度的比值越大，其外泌体的纯度越高）。如表3所示，蛋白交联纳米亲和微球得到的外泌体，其浓度蛋白的比值比超速离心法高出3倍左右，说明外泌体亲和微球得到的外泌体纯度更高。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
亲和液的组成为：HEPES（15mM-25mM）、CaCl2（20mM-30mM）、NaCl（1mM-5mM）、MgCl2（1mM-5mM）、pH（7.2-7.5）。
洗涤液的组成为：Tris-HCl（20mM-30mM）、NaCl（5mM-15mM）、CaCl2（1mM-5mM）、MgCl2（1mM-5mM）、pH（7.2-7.5）。
洗脱液的组成为：Tris-HCl（20mM-30mM）、NaCl（1mM-5mM）、EDTA（5mM-10mM）、pH（7.2-7.5）。
试验例1、蛋白交联纳米亲和微球提取外泌体回收率测定
将3瓶外泌体粉末标准品（ReproExoTM101，1010 particals/瓶）分别溶于1ml的无菌蒸馏水，配制成外泌体标准品溶液（1010 particals/ml），分别用三种方式对外泌体进行提取（实施例1方法制备的ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球、实施例1方法制备的Tim4蛋白交联纳米亲和微球及超速离心方法）。
分别向外泌体标准品加入15mg的蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白），室温混匀4 h，10000 g离心10 min得沉淀，用洗涤缓冲液对沉淀洗涤2遍，最后加入0.5ml洗脱液洗脱，离心得回收外泌体。
将1ml外泌体标准品溶液加至超速离心管，4℃条件下100000 g离心2 h，用0.5 ml洗脱液进行重悬得回收外泌体。得到的回收外泌体经NTA检测外泌体浓度及平均粒径，测试结果如下表4所示：
表4
Figure 905845DEST_PATH_IMAGE004
通过表可以说明，ReprotideTM511蛋白和Tim4蛋白的蛋白交联纳米亲和微球对外泌体得回收率分别达到了86%和83%，而超速离心对外泌体的回收率只有17%，平均粒径无明显变化。
试验例2、蛋白交联纳米亲和微球提取脐带间充质干细胞外泌体纯度评估
（1）外泌体电镜对比
取5 µl外泌体溶液置载样铜网上，加50 µl 1%戊二醛液固定外泌体，反应5 min后，用ddH2O洗涤铜网，去除戊二醛，再将铜网放在50 µl草酸双氧铀液滴上，反应5 min后，用滤纸上吸去多余液体，待铜网干燥后，将其放在样品盒里，80 kV下拍摄电镜照片。如图10、图11所示，蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）和如图9所示的超速离心法提取的外泌体，电镜下都可见茶托状的双层囊泡结构，粒径大小在30-150 nm范围内，且结构清晰，无明显差别。
（2）外泌体蛋白定量对比
采用BSA法检测外泌体的蛋白浓度，将收集的外泌体溶液中加入等体积的裂解液，充分混匀，4℃静置30min，裂解处理后的外泌体蛋白溶液按照 BSA检测试剂盒说明书的操作要求进行外泌体蛋白浓度测定。实验结果如图6所示，图12所示，超速离心法提取的外泌体蛋白浓度明显高于蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白），超速离心法提取的外泌体蛋白浓度约是蛋白交联纳米亲和微球的4倍。
（3）外泌体浓度定量对比
用ddH2O稀释外泌体样本，使外泌体颗粒浓度大约在1×107/mL和1×109/mL范围内。采用纳米粒径示踪分析仪对外泌体浓度进行检测。如图7所示，蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）获得的外泌体浓度约是超速离心法的4倍，说明蛋白交联纳米亲和微球能够捕获更多的外泌体。
根据外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的比值，可以简单比较外泌体的相对纯度（颗粒浓度与蛋白浓度的比值越大，其外泌体的纯度越高）。如图8所示，蛋白交联纳米亲和微球得到的外泌体，其浓度蛋白的比值比超速离心法高出10倍，说明外泌体亲和微球得到的外泌体纯度更高，超速离心法提取的外泌体中可能含有大量的污染蛋白。
（4）外泌体Western Blot实验
将收集的外泌体加入适量的loading buffer，沸水浴加热10min，使蛋白充分变性。配置SDS-PAGE凝胶，取外泌体蛋白变性样品加样至SDS-PAGE胶的加样孔，电泳分离蛋白样本并进行转膜。转膜完毕后，把转膜液洗涤干净。再把蛋白膜放置5%封闭液中，室温封闭2h。封闭完成后，按照适当比例配制一抗（CD9、CD63、ALIX），并加入封闭好的蛋白膜中，4℃孵育过夜。再按照适当比例用配置酶标二抗，将膜放在酶标二抗的稀释液中，室温孵育1h。最后将蛋白膜放置在1ml混合好的ECL发光液中，反应2min后，放入化学发光成像系统进行显色成像。外泌体CD9、CD63、ALIX蛋白Western Blot实验结果如图15所示，蛋白交联纳米亲和微球（ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白）提取纯化的外泌体条带清晰明亮，而超速离心法提取的外泌体条带的清晰度较低，说明超速离心法提取外泌体的纯度低于蛋白交联纳米亲和微球。
试验例3、外泌体对细胞增殖能力的评估
采用MTT法检测外泌体的增殖效能，取脐带间充质干细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔板中，将三种方法提取外泌体稀释到相同的浓度（超速离心、ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球、Tim4蛋白交联纳米亲和微球），各取10 μl分别加入培养的细胞中，用10μl不添加外泌体的培养基培养作对照组，培养3d后，每孔加MTT溶液（5 mg/ml）20 μl，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μl DMSO，振荡10 min。用酶标仪在450 nm处检测OD值，每组6个重复，取平均值。结果如图16所示，脐带间充质干细胞外泌体对细胞增殖起到了明显的促进作用，而ReprotideTM511或Tim4蛋白制备的蛋白交联纳米亲和微球提取的外泌体，对细胞增殖的效果明显高于超速离心法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将预处理后的干细胞培养液加入蛋白交联纳米亲和微球，再加入亲和液，反应1h-5h后离心分离，得到沉淀物，将所述沉淀物用洗涤液洗涤，最后加入洗脱液洗脱，离心得到含干细胞外泌体的上清液；
所述亲和液为以下组分：15mM-25mM HEPES、20mM-30mM CaCl2、1mM-5mM NaCl、1mM-5mM、MgCl2，pH7.2-7.5；
所述洗涤液为以下组分：20mM-30mM Tris-HCl、5mM-15mM NaCl、1mM-5mM CaCl2、1mM-5mM MgCl2、pH7.2-7.5；
所述洗脱液为以下组分：20mM-30mM Tris-HCl、1mM-5mM NaCl、5mM-10m MEDTA、pH7.2-7.5；
所述蛋白交联纳米亲和微球的制备方法为：
将生物素标记的ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球中，反应30 min-3 h后，离心得沉淀，所述沉淀即为蛋白交联纳米亲和微球。
2.如权利要求1所述的利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，其特征在于，
所述的干细胞外泌体为不同来源的干细胞及其诱导分化细胞，包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞，羊膜间充质干细胞、牙髓干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞及其诱导分化细胞的外泌体。
3.如权利要求1所述的利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，其特征在于，
所述生物素标记的ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白的制备方法为：
将ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白加入活性生物素，4℃孵育1h-24h，再用脱盐柱去除游离的生物素，用 PBS缓冲液洗脱，得到生物素标记的ReprotideTM511蛋白或Tim4蛋白。
4.如权利要求1所述的利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，其特征在于，
所述预处理的方法为：取干细胞培养上清至于离心管中，5000-12000g，离心5-50min，取上清液，过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。
5.如权利要求1所述的利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，其特征在于，
所述干细胞置于干细胞培养基中培养条件，含5％CO2、温度为37℃，待细胞贴壁铺满85%-95%时，收集上清液。
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