CN108841788A - 蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用，其中，蛋白交联纳米硅为采用Annexin V蛋白或Tim 4蛋白修饰羧酸化纳米硅球制得。通过本发明制备的蛋白交联纳米硅用作干细胞外泌体的分离纯化，能够快速且大规模分离样品中的干细胞外泌体，并保证分离后的干细胞外泌体具有较高的纯度，在干细胞外泌体的制备领域具有极其重要的意义。而通过本发明提供的外泌体分离纯化方法所制备的外泌体在制备与外泌体相关药物上的应用，如在制备神经损伤、心脏修复等药物上的应用，能够节省大量的时间和成本，保证了药物的质量，具有极大的应用价值。

Description

蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用。

背景技术

外泌体(Exosomes)是细胞经过"内吞-融合-外排"等一系列调控过程而形成的直径在30～150nm的圆形单层膜结构的细胞外小囊泡。外泌体由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中，可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和信息转导中起重要作用。外泌体的发现丰富了研究者们对细胞间通讯方式的认识，加深了对机体生理、病理过程的理解，2013年诺贝尔生物/医学奖授予了三位在细胞囊泡方面贡献突出的科学家，使外泌体的研究达到全新的高度。

间充质干细胞来源的外泌体是干细胞分泌产生的细胞外囊泡，可通过选择性的转运蛋白质、mRNA、microRNA来充当间充质干细胞与已分化细胞的信号分子。现有研究已证明间充质干细胞外泌体在减少心肌梗死面积，减轻肢体缺血，增进伤口愈合，改善移植物抗宿主病，减少肾损伤，促进肝再生，促进皮肤细胞再生、减轻视网膜损伤，以及最近改善软骨和骨再生等方面具有重要作用。

通常，为获取纯度高的外泌体，需要应用到外泌的分离技术。目前外泌体的分离技术有超速离心法、分子排阻法、免疫捕获法、PEG沉淀等方法。超速离心一般需要7小时以上，且耗时耗力；分子排阻法即免疫捕获法所收集的外泌体量少，且费用高昂；PEG沉淀法虽然可以大规模分离外泌体，但是在收集到大量外泌体的同时不可避免的引入脂蛋白，造成分离所得外泌体纯度低的问题。如何寻求一种能够高效分离外泌体并保证外泌体纯度的方式是本技术领域迫切需要解决问题。

发明内容

为解决上述背景技术中提到的问题，本发明提供一种蛋白交联纳米硅的制备方法，采用Annexin V蛋白或Tim 4蛋白修饰羧酸化纳米硅球制得蛋白交联纳米硅。

具体地，将羧酸化纳米硅球加入到DMF中，得到M1；所述DMF为N，N-二甲基甲酰胺；

向M1中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二异丙基乙胺，混合搅拌，得到M2；

对M2进行离心过滤，并将过滤后的沉淀采用盐酸水溶液洗涤，得到纳米硅活性酯；

将Annexin V蛋白或Tim 4蛋白加入到磷酸缓冲溶液中，再加入上述得到的纳米硅活性酯，搅拌后离心取沉淀并洗涤，即得蛋白交联纳米硅。

进一步地，所述羧酸化纳米硅球的直径为200nm-50μm。

本发明还提供一种采用如上任意所述的蛋白交联纳米硅制备方法所制得的蛋白交联纳米硅。

本发明还提供一种采用如上任意所述的蛋白交联纳米硅的外泌体分离纯化方法。

进一步地，所述外泌体包括间充质干细胞外泌体。

进一步地，所述间充质干细胞外泌体包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。

进一步地，包括以下步骤：

取外泌体粗提液，加入蛋白交联的纳米硅；再加入CaCl₂混合后，进行离心分离，得到沉淀P1；采用缓冲液洗涤后干燥，得到P2；加入洗脱液与P2混合，并静置一段时间后，收集上清液，即得到分离纯化后的干细胞外泌体，将得到的干细胞外泌体进行冷冻保存，以备用。

进一步地，所述CaCl₂加入后的浓度为15mmol/L；所述加入CaCl₂混合后，离心分离的温度为4℃。

进一步地，收集外泌体细胞培养液上清于离心管中，在4℃条件下500-1000g离心5-10min后，收集离心管上清液；

于4℃条件下，以10000g离心1h去除细胞碎片和蛋白聚合物及大细胞外囊泡后，将收集的上清液过滤后，即得到外泌体粗提液。

进一步地，去除细胞碎片和蛋白聚合物及大细胞外囊泡后，将采用收集的上清液过0.22μm滤膜后，即得到外泌体粗提液。

进一步地，所述蛋白交联的纳米硅为Annexin V蛋白交联的纳米硅，所述缓冲液为Ca-HEPES缓冲液。

进一步地，所述Ca-HEPES缓冲液包括了HEPES、MgCl₂、KCl、BSA、CaCl₂和NaCl。

进一步地，所述蛋白交联的纳米硅为Tim 4蛋白交联的纳米硅，所述缓冲液包括Tris-HCl、NaCl、Tween20和CaCl₂。

进一步地，所述洗脱液包括了Tris-HCl、NaCl和EDTA。

进一步地，所述冷冻保存的方法为：向分离纯化后的干细胞外泌体中加入5-50mMD(+)-海藻糖二水合物后进冻存。

进一步地，向分离纯化后的干细胞外泌体中加入5-50mM D(+)-海藻糖二水合物后，于-80℃下冻存12-24h，转移至真空冻干仓冻干，得到干细胞外泌体冻干粉，再于4℃条件下避光保存。

本发明还提供一种如上任意所述外泌体分离纯化方法所制备的外泌体在制备与外泌体相关药物上的应用。

本发明技术方案中，annexin V及Tim4蛋白均为Ca离子依赖性磷脂结合蛋白，在Ca离子的辅助下可与磷酯酰丝氨酸结合。在本发明中通过两步离心，获得的外泌体粗提液已去除了细胞、细胞碎片及大的细胞外囊泡，排除了其它含有磷酯酰丝氨酸的干扰物；而后利用两个蛋白与外泌体上的磷酯酰丝氨酸强结合力，捕获粗提液中的外泌体；最后通过添加EDTA鳌和反应体系中的Ca离子，消除两种蛋白的活性使蛋白与磷酯酰丝氨酸解离，从而释放出外泌体。

通过本发明制备的蛋白交联纳米硅用作干细胞外泌体的分离纯化，能够快速且大规模分离样品中的干细胞外泌体，并保证分离后的干细胞外泌体具有较高的纯度，在干细胞外泌体的制备领域具有极其重要的意义。而通过本发明提供的外泌体分离纯化方法所制备的外泌体在制备与外泌体相关药物上的应用，如在制备神经损伤、心脏修复等药物上的应用，能够节省大量的时间和成本，保证了药物的质量，具有极大的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的制备蛋白交联纳米硅反应过程示意图；

图2为通过NTA检测以不同式制得外泌体数量的测试结果图；

图3为采用NTA以不同式制得的外泌体粒径测试结果图；

图4为采用NTA检测浓度分析不同保存条件下的外泌体存储效率；

图5为采用NTA检测粒径分析不同保存条件下的外泌体存储效率；

图6为外泌体增值实验结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供以下具体实验实施例，包括以下步骤：

一、间充质干细胞培养：

采用的间充质干细胞包含脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等，本发明中以脐带间充质干细胞为实验对象。

步骤a、将P3代的脐带间充质干细胞冻存管从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴中解冻2分钟，待完全融化，用75％酒精擦拭冻存管壁置于生物安全柜中；

步骤b、将复苏后的脐带间充质干细胞悬液转移到T75培养瓶中，将已经温育好的30ml细胞培养基(DMEM/F12+10％FBS+2mM L-谷胱甘肽+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素：基础培养基可以用α-MEM或L-DMEM培养基)加入T75(干细胞浓度为4×10⁶/ml为宜)，在37℃，5％CO₂培养箱过夜培养；第二天观察细胞贴壁情况与细胞形态，后用温育的新培养基换液。

步骤c、待70％-85％融合时，即可开始传代培养，具体操作为：采用PBS缓冲液清洗贴壁生长的细胞两遍，用0.25％的胰酶消化至细胞脱壁，加入新鲜的培养基中和胰酶，按照1:3的比例进行细胞传代培养(接种后20％融合为宜)。

步骤d、3天左右换液，并观察细胞的融合情况；待70％-80％细胞融合，更换成外泌体收集培养基(DMEM/F12+10％无外泌体FBS+2mM L-谷胱甘肽+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素+7μm多能菌素：基础培养基可以用α-MEM或L-DMEM培养基)，再培养48-72小时，并观察细胞融合情况与形态。

步骤e、添加收集培养基再培养48-72小时，显微镜观察结果，当细胞融合达到90％以上时，获得的细胞培养物即可用于间充质干细胞外泌体分离。

二、Annexin V与Tim 4蛋白交联纳米硅的制备实施例

1、制备纳米硅的活性酯：取5mg直径为10μm(不限定于10μm，包含了200nm-50μm，此处以10μm为例)的羧酸化纳米硅球加入到含有0.5mL DMF(N、N-二甲基甲酰胺)圆底烧瓶中。然后向上述溶液中加入8mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、5mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，5uL的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)；反应液于室温下搅拌过夜，然后离心得沉淀并用1M盐酸水溶液洗涤最后得到纳米硅的活性酯；

其中，所述羧酸化纳米硅球可通过市售得到，例如QDSphere公司的CSI1010羧基二氧化硅微球；当然，也可以采用其它能达到相同技术效果的羧酸化纳米硅球。

2.1、Annexin V蛋白交联纳米硅的制备：取Annexin蛋白1mg加入到含有500uL的磷酸缓冲溶液中(pH为8)，然后向里面各加入1mg上述所得的纳米硅活性酯，混合液于4℃条件下下搅拌2小时然后离心取沉淀并洗涤即得到被Annexin V蛋白交联得纳米硅，PBS(pH为7.4)重悬，标定浓度为10¹²particles/ml，于4℃条件下避光存放。

2.2、Tim 4蛋白交联纳米硅的制备：取Tim 4蛋白1mg加入到含有500uL的磷酸缓冲溶液中(pH为8)，然后向里面各加入1mg上述所得的纳米硅活性酯，混合液于4℃条件下下搅拌2小时然后离心取沉淀并洗涤即得到被Tim 4蛋白交联得纳米硅，PBS(pH为7.4)重悬，标定浓度为10¹²particles/ml，于4℃条件下避光存放。

具体地，制备Annexin V/Tim 4蛋白交联纳米硅的反应过程示意图如图1所示，图中“1”表示羧基化的纳米硅球，经一步化学反应修饰得到纳米硅球的活性酯“2”,“3”代表Annexin V蛋白或者Tim 4蛋白，纳米硅活性酯“2”与蛋白中氨基酸上的氨基发生反应最终得到蛋白交联的纳米硅球。

将上述制备的Annexin V和Tim 4蛋白交联纳米硅进行以下实验：

取新鲜制备的纯化外泌体(10¹⁰particles/ml)500ul,加入500ul10¹²particles/ml的Annexin V(或Tim 4)蛋白交联的10μm纳米硅，并添加终浓度为15mM(Tim 4体系2mM)CaCl₂，在4℃条件下低速混匀12h；

在4℃下，以500g离心10min，弃去上清，用洗涤缓冲液2ml重悬离心3遍(Annexin V体系用Ca-HEPES buffer(包含10 mM HEPES,pH 7.5；1mM MgCl₂；5mM KCl；2％BSA；15mMCaCl₂；and 150mM NaCl)，Tim 4体系用20mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,0.0005％Tween20,2mM CaCl₂)。收集到的沉淀，自然风干后，用500ul洗脱液(包含20mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl,2mM EDTA)与沉淀混匀静置10min，4℃条件500g离心10min，收集上清，NTA检测分离纯化得到的外泌体粒径和浓度，测试结果如下表所示：

表1

体系	起始浓度	起始粒径	纯化后浓度	纯化后粒径
					Annexin V	1.0±0.09×1012/ml	94±3nm	9.8±0.17×1011/ml	95±4nm
Tim 4	1.0±0.09×1012/ml	94±3nm	9.5±0.27×1011/ml	92±4nm

通过表1结果可以证明，合成的Annexin V和Tim 4蛋白交联得纳米硅的外泌体回收率分别达到了98％、95％，且外泌体的粒径无明显的变化，可以用于外泌体的分离纯化。

三、外泌体收集与纯化

1、制备外泌体粗提液：收集细胞培养液上清于离心管中，4℃条件下500-1000g离心5-10min后收集离心管上清液。再经4℃条件下10000g离心1h去除细胞碎片和蛋白聚合物及大的细胞外囊泡后再次收集上清过0.22μm滤膜获即得去除细胞、细胞碎片等的外泌体粗提液。

2、本发明以Annexin V蛋白交联纳米硅分离纯化外泌体作为实施例a、以Tim 4蛋白交联纳米硅分离纯化外泌体作为实施例b，以传统分离方法作为对比例1，具体地：

对比例1：取40ml外泌体粗提液，4℃条件100000g离心2h，用500ul PBS缓冲溶液重悬沉淀，超速离心(UC)制得外泌体，外泌体置于-80℃冰箱内保存备用。

实施例a：40ml外泌体粗提液中分别加入10⁶，10⁷，10⁸,10⁹，10¹⁰particles数量的Annexin V交联10μm纳米硅(设置为Annexin V a、Annexin V b、Annexin V c、Annexin Vd，Annexin V e系列)，添加CaCl₂至15mM(毫摩尔每升)，定容至50ml，4℃条件下侧向摇床低速混匀1h-12h；在4℃条件下以2000g离心10min，弃上清并收集沉淀；用1ml Ca-HEPESbuffer(包含10mM HEPES,pH 7.5；1mM MgCl₂；5mM KCl；2％BSA；15mM CaCl₂；and 150mMNaCl)离心洗涤3遍后并自然风干；而后加入500ul洗脱液(包含20mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,2mM EDTA)与沉淀混匀静置10min，4℃条件500g离心10min，收集上清，即为纯化后的浓缩外泌体；制备得到的外泌体置于-80℃冰箱内保存备用。

实施例b：40m外泌体粗提液中加入10⁶，10⁷，10⁸,10⁹，10¹⁰particles数量的Tim 4交联10μm纳米硅(设置为Tim 4a、Tim 4b、Tim 4c、Tim 4d，Tim 4e系列)，添加Cacl₂至2mM，定容至50ml，4℃条件下侧向摇床低速混匀1-12h。而后4℃条件下2000g离心10min，弃上清并收集沉淀；用洗脱液(包含20mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,0.0005％Tween20,2mMCaCl₂)离心洗涤3遍后并自然风干，用500ul(20mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,2mMEDTA)；再加入500ul洗脱液(20mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,2mM EDTA)与沉淀混匀静置10min，4℃条件500g离心10min，收集上清，即为纯化后的外泌体；制备得到的外泌体置于-80℃冰箱内保存备用。

通过NTA检测以上方式制得的外泌体数量，并分析外泌体得率，测试结果如图2所示，通过图2可以看出：

在实施例a和实施例b中，Annexin V c和Tim 4d(分别添加10⁸particles的Annexin V交联10μm纳米硅及10⁹Tim 4交联10μm纳米硅)既达到很好的外泌体分离结果，较传统的超速离心法分离得到的外泌体总量分别提升到5.3倍和4.6倍。

此外，将超速离心及两种不同蛋白交联硅球的浓度梯度分离外泌体，采用NTA进行外泌体粒径测试，测试结果如图3所示，由图3可知，通过两种方式，获取的外泌体粒径与通过超速离心获得的外泌体一致。结合外泌体分离效率的实验结果(图2)，10⁸Annexin V交联10μm纳米硅效费比最优，即优选的使用浓度为10⁶particles/ml；同样10⁹Tim 4交联10μm纳米硅效费比最优，即优选的使用浓度为10⁷particles/ml。

本发明还提供以下外泌体的冷冻干燥存储实施例：

取新鲜制备的外泌体加D(+)-海藻糖二水合物，PBS配平外泌体浓度均为10¹⁰particles/ml，且D(+)-海藻糖终浓度分别为0mM,5mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，分为7组分别于-80℃下冻存；5mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM D(+)-海藻糖组冻存12h后将样品转移至真空冻干仓冻干，冻干的真空度保持在10Pa，温度在-45℃以下冷冻12h-48h得到间充质干细胞外泌体冻干粉，而后4℃条件下避光保存。

2个月后，0mM D(+)-海藻糖组解冻，5mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mMD(+)-海藻糖组用500ul的PBS缓冲溶液复溶；采用NTA检测浓度与粒径，分析不同保存条件下的外泌体存储效率；测试结果如图4和图5所示，由图4和图5可知，30mM D(+)-海藻糖组冷冻干燥后4℃条件下避光保存，复溶后外泌体浓度较原先无太大变化，同时粒径与冻存前比较保存完好。

采用CCK-8法检测外泌体的增殖效能，取第12代的人脐带间充质干细胞(此代细胞的增殖能力减弱，活性降低)，以每孔5×10³个细胞接种于96孔板中，分别加入7组不同的外泌体各10ul，取第1d、3d、5d、7d的细胞作检测，添加10μl染色剂，培养2h。用酶标仪在450nm处检测OD值，以不添加外泌体的培养基培养作对照组，每组6个重复，取平均值。结果如表2以及图6所示：

表2

	1d	3d	5d	7d
					对照组	0.29	0.35	0.51	0.59
0mM D(+)-海藻糖组	0.28	0.39	0.73	0.89
					5mM D(+)-海藻糖组	0.29	0.37	0.60	0.65
10mM D(+)-海藻糖组	0.30	0.38	0.68	0.75
					20mM D(+)-海藻糖组	0.29	0.40	0.73	0.89
30mM D(+)-海藻糖组	0.30	0.41	0.77	0.90
					40mM D(+)-海藻糖组	0.29	0.40	0.79	0.89
50mM D(+)-海藻糖组	0.30	0.37	0.77	0.88

通过表2和图6可以看出，30mM D(+)-海藻糖的添加浓度，用于外泌体冷冻干燥，可以取得最佳的外泌体冷冻干燥保存效果，经PBS复溶后，外泌体活性强于-80℃冻存的外泌体。

本发明还提供一种经以上外泌体分离纯化方法所制备的外泌体在制备与外泌体相关药物上的应用，尤其涉及制备神经损伤、心脏修复等药物上的应用，当然，也还包括其它与外泌体相关药物方面的制备。采用本发明提供的外泌体分离纯化方法所制备的外泌体进行药物制备，能够节省了大量的时间和成本，保证了药物的质量，具有极大的应用价值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；实施例中涉及到试剂浓度以及其它参数为在本发明构思下的一种可行方式，并不限制于本实施例中所限定的相关实验参数；在本发明构思下，能够解决相关技术问题，达到本发明技术效果的相关实验参数均在本发明保护的范围内；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (18)

1.一种蛋白交联纳米硅的制备方法，其特征在于：

采用Annexin V蛋白或Tim 4蛋白修饰羧酸化纳米硅球制得蛋白交联纳米硅。

2.根据权利要求1所述的蛋白交联纳米硅的制备方法，其特征在于：

将羧酸化纳米硅球加入到DMF中，得到M1；

向M1中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二异丙基乙胺，混合搅拌，得到M2；

对M2进行离心过滤，并将过滤后的沉淀采用盐酸水溶液洗涤，得到纳米硅活性酯；

将Annexin V蛋白或Tim 4蛋白加入到磷酸缓冲溶液中，再加入上述得到的纳米硅活性酯，搅拌后离心取沉淀并洗涤，即得蛋白交联纳米硅。

3.根据权利要求1所述的蛋白交联纳米硅的制备方法，其特征在于：所述羧酸化纳米硅球的直径为200nm-50μm。

4.一种采用如权利要求1-3任一项所述的制备方法所制得的蛋白交联纳米硅。

5.一种采用如权利要求1-3任一项所述的蛋白交联纳米硅的外泌体分离纯化方法。

6.根据权利要求5所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述外泌体包括间充质干细胞外泌体。

7.根据权利要求6所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述间充质干细胞外泌体包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。

8.根据权利要求5所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

取外泌体粗提液，加入蛋白交联的纳米硅；再加入CaCl₂混合后，进行离心分离，得到沉淀P1；采用缓冲液洗涤后干燥，得到P2；加入洗脱液与P2混合，并静置一段时间后，收集上清液，即得到分离纯化后的干细胞外泌体，将得到的干细胞外泌体进行冷冻保存，以备用。

9.根据权利要求8所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述CaCl₂加入后的浓度为15mmol/L；所述加入CaCl₂混合后，离心分离的温度为4℃。

10.根据权利要求8所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于，所述外泌体粗提液的制备方法包括：收集外泌体细胞培养液上清于离心管中，在4℃条件下500-1000g离心5-10min后，收集离心管上清液；

于4℃条件下，以10000g离心1h去除细胞碎片和蛋白聚合物及大细胞外囊泡后，将收集的上清液过滤后，即得到外泌体粗提液。

11.根据权利要求10所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：去除细胞碎片和蛋白聚合物及大细胞外囊泡后，将采用收集的上清液过0.22μm滤膜后，即得到外泌体粗提液。

12.根据权利要求8所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述蛋白交联的纳米硅为Annexin V蛋白交联的纳米硅，所述缓冲液为Ca-HEPES缓冲液。

13.根据权利要求12所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述Ca-HEPES缓冲液包括了HEPES、MgCl₂、KCl、BSA、CaCl₂和NaCl。

14.根据权利要求8所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述蛋白交联的纳米硅为Tim4蛋白交联的纳米硅，所述缓冲液包括Tris-HCl、NaCl、Tween20和CaCl₂。

15.根据权利要求8所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述洗脱液包括了Tris-HCl、NaCl和EDTA。

16.根据权利要求8所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于，所述冷冻保存的方法为：向分离纯化后的干细胞外泌体中加入5-50mM D(+)-海藻糖二水合物后进冻存。

17.根据权利要求16所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：向分离纯化后的干细胞外泌体中加入5-50mM D(+)-海藻糖二水合物后，于-80℃下冻存12-24h，转移至真空冻干仓冻干，得到干细胞外泌体冻干粉，再于4℃条件下避光保存。

18.根据权利要求5-17任一项所述外泌体分离纯化方法所制备的外泌体在制备与外泌体相关药物上的应用。