CN113008652A - 一种利用tim-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用TIM‑4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法，该方法包含如下步骤：收集待测液，向待测液中加入含Ca2+溶液，将含Ca2+待测液泵入TIM‑4功能化微流控芯片，待测液中的外泌体被微流通道内的TIM‑4蛋白捕获，然后通过EDTA洗脱液洗脱，收集得到纯化的外泌体。本方法外泌体的捕获效率约90％，纯度为71.12％，优于超速离心获取的外泌体纯度。此外，本方法还具有相对简洁的步骤，捕获和释放时间少于20分钟，且成本较低，仅需较小的样品量(20μL)，即可检测到肿瘤患者和健康人的PS+外泌体含量的差异，可为外泌体用于肿瘤的后续检测和诊断提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测领域，具体涉及一种利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法。
背景技术
恶性肿瘤发病率和死亡率高，其防治是世界各国所面临的一大难题。目前临床对肿瘤的诊断主要依赖组织活检、血清学筛查和影像学检查，但这些方法灵敏度与特异性较差、结果滞后，大多数肿瘤患者确诊时已有转移或处于晚期。目前迫切需要寻找到更好的诊断靶标和建立更优的检测方法来实现肿瘤的早期与伴随诊断。近年来研究发现外泌体不但在细胞间信息交流和信号转导中起着重要作用，肿瘤来源的外泌体还参与调控肿瘤的生长发展和侵袭转移等过程。研究显示，外泌体是一种直径为30-150nm的细胞外囊泡，由免疫细胞、组织细胞、肿瘤细胞等各类型的细胞通过内溶酶体途径释放至细胞外，参与一系列生理和病理过程的发生发展。外泌体内携带的生物信息分子主要为DNAs、RNAs、蛋白质等，能够来源细胞的生物特异性以及肿瘤微环境的状态。同时外泌体在体液中的含量丰富，在血液中的浓度(约＞109particles/ml)显著大于循环肿瘤细胞。有研究肿瘤患者血液中的外泌体含量普遍高于正常人血液中外泌体的含量，与肿瘤的大小，淋巴结转移数量，以及肿瘤细胞类型密切相关。因此，外泌体具有成为肿瘤诊断标记物的潜力。
然而，外泌体作为诊断标记物尚未实现临床转化，主要是由于外泌体尺寸较小。现有的技术难以从复杂的体液环境中将外泌体分离出来。目前用于外泌体的分离和富集方式主要依赖于超高速离心法，但是这种方法步骤繁琐，耗时长(＞10h)，仪器昂贵，不能将外泌体和其它囊泡或大分子蛋白区分开来。此外市场上常见的外泌体分离试剂盒利用聚合物分离外泌体，但沉淀外泌体的同时会沉淀出大量的杂蛋白，给后续检测结果带来假阳性的结果。微流控芯片的技术进展为外泌体的分离提供了可能性，然而传统的芯片通道多为平滑的S形通道，或者需要使用抗体进行捕获，不但成本高，也不利于流体中的细胞、蛋白和外泌体与通道中的抗体结合。因此，急需一种快速，低成本，高效分离外泌体的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片从肿瘤患者体液中分离纯化分泌体的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法，包含如下步骤：收集待测样本，向待测样本中加入含Ca2+溶液，将含Ca2+的待测样本泵入TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片，使待测样本中的外泌体被微流通道内的TIM-4蛋白捕获，然后使用Ca2+螯合剂洗脱，收集得到纯化的外泌体。
优选的，所述待测液为肿瘤患者的体液。
优选的，所述体液为血清、细胞培养物或尿液。
优选的，所述Ca2+溶液的加入后Ca2+终浓度为2.5mM。
优选的，所述Ca2+螯合剂为EDTA。
优选的，所述EDTA的浓度为20mM。
优选的，待测样本泵入TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片后还包括用2.5mMCaCl2以20μL/min的流速冲洗芯片通道10min，再通入空气，将芯片中的液体出去后。
优选的，所述含Ca2+的待测样本泵入TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片的流速为16.67μL/min。
优选的，所述鱼骨状微流控芯片包含入样口、分支通道、微流通道和出样口；入样口通过集管与分支通道的入口连通，分支通道的出口通过集管与出样口连通，出样口与收集装置连接，所述微流通道以鱼骨状微通道构成的阵列单元，每个单元的鱼骨状凹槽呈周期性地交错排列，待测样本从入样口进入后分流到分支通道，分别流入鱼骨状微流通道。
优选的，所述芯片的最终尺寸为：通道的总高度h为50μm，凹槽的高度与通道的高度α的比率设定为0.9，鱼骨状的边和通道轴的夹角θ为45°，主波矢量q＝2π/100μm，长边和通道轴的垂直距离为200μm，短边和通道轴的垂直距离为100μm。
本发明的有益效果在于：利用TIM-4功能化的鱼骨状微流控芯片靶向外泌体膜表面的生物标记物PS，可以直接从肿瘤患者血清中分离出肿瘤细胞来源的外泌体。与标准的外泌体分离方法(超速离心法)相比，本方法外泌体的捕获效率约90％，纯度为71.12％(超速离心获取的外泌体纯度为67.48％)。此外，微流控平台捕获外泌体具有相对简洁的步骤(捕获和释放＜20分钟)，且成本较低，仅需较小的样品量(20μL)即可检测到肿瘤患者和健康人的PS+外泌体含量的差异。因此，利用鱼骨状微流控芯片捕获的PS+外泌体有作为肿瘤诊断的标志物的潜力，并且分离出的外泌体亚群和肿瘤的发生发展高度相关，可为外泌体用于肿瘤的后续检测和诊断提供基础。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为鱼骨状微流控芯片平面设计图；
图2为鱼骨状微流控芯片立体设计图；
图3为芯片实物图；
图4为通道剖面图；
图5为电镜下的通道结构；
图6为鱼骨状微流控芯片工作流程图；
图7为鱼骨状微流控芯片进样图；
图8为通道内各向异性流示意图；
图9为TIM-4功能化的鱼骨状微流控芯片用于捕获分离外泌体的原理图；
图10外泌体分离效果(A：TIM-4和anti-CD63功能化微流控芯片的比较；B：超速离心和微流控芯片的比较；C：平滑通道和鱼骨状通道的比较；D：TIM-4功能化的芯片捕获不同细胞来源的外泌体)。
图11为TIM-4功能化的鱼骨状微流控芯片分离得到的外泌体电镜图；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、TIM-4功能化的鱼骨状微流控芯片
传统的芯片通道多为平滑的S形通道，不利于流体在通道里的混合，也不利于流体中的细胞、蛋白和外泌体与通道中的抗体结合。本发明设计并制造鱼骨状微流控芯片，具体结构如图1和图2所示。芯片包括以鱼骨状微通道构成的阵列单元，每个单元的鱼骨状凹槽呈周期性地交错排列，八个不对称鱼骨状连续区域组成。优选的，阵列单元为八个单独的鱼骨状微通道，八个鱼骨状微通道通过集管与入口连接。流体从入样口进入后分流，分别流入八个单独的鱼骨状微通道，以保证整个芯片的机械完整性和均匀的流量分布。通过鱼骨状微混合器结合于微流控芯片的通道上，解决了平滑通道混合不均致反应不完全的弊端。鱼骨状微流控芯片的设计在几何上是基于低Re数下诱导混沌混合，通过改变凹槽高度与通道高度的比值来分离血浆中外泌体。
芯片的尺寸优选为：通道的总高度(h)50μm，凹槽的高度与通道的高度(α)的比率设定为0.9，使用标准光刻法在硅晶片上刻蚀通道结构；鱼骨状的边和通道轴的夹角(θ)为45°，长边和通道轴的垂直距离为200μm，短边和通道轴的垂直距离为100μm，主波矢量q＝2π/100μm。构建的芯片实物如图3所示，通道剖面图如图4所示，电镜下的通道结构如图5所示。
将鱼骨状微流控芯片入样口与待测液体标本相连，出口与检测装置连接，形成结构如图6和7所示。当待测液体标本通过时形成各向异性流，最后形成微涡流，使外泌体与捕获体充分结合，克服常规微流控芯片平滑通道因混合不均致反应不完全的弊端(图8)。
鱼骨状微流控芯片TIM-4功能化的方法如下：首先向通道内充入体积浓度为4％的硅烷化试剂MPS的无水乙醇溶液，室温孵育20min，重复三次。然后用无水乙醇充分洗脱10min后注入2mg/mL GMBS溶液，室温孵育15min，重复两次。两次结束后，先用无水乙醇充分洗脱10min后，再用PSB充分洗脱10min。用压力泵将芯片里残留的液体全部泵出。然后注入10μg/mL Streptavidin溶液于芯片中，将芯片置于湿盒中，4℃冰箱孵育过夜，储存1-10天。取芯片，用PBS充分洗脱10min，用压力泵充分压出芯片中残留的液体。之后加入125ng/mLbio-TIM-4溶液充满芯片，置于湿盒中，4℃冰箱孵育过夜。取芯片用PBS充分洗脱10min后，压出残余的液体后，加入5％的BSA封闭30min，用PBS充分洗脱10min。以上功能化液体均以20μl/min流速注入芯片。
实施利2、利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体
利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体，原理如图9所示。具体步骤如下：制备完善的微流控芯片用于PS+外泌体的捕获分离。将肿瘤患者血清标本从-80℃冰箱中拿出，置冰上缓慢解冻，取其中200μL体积血清加入0.5μL1M CaCl2混合均匀后以16.67μL/min的流速流过鱼骨状微流控芯片。然后用2.5mM的CaCl2以20μL/min的流速冲洗芯片内通道10min。以压力泵通入空气，将芯片中的液体出去后。加入100μL浓度为20mM的EDTA溶液，室温孵育30min后，再通入100μL浓度为20mM的EDTA溶液洗脱通道内的外泌体。最后，利用压力泵往通道内通入空气，以确保通道内残留的液体全部流出。在芯片的另外一端1.5mL离心管收集捕获的PS+外泌体。获取的外泌体溶液送NTA检测粒径浓度，或储存在-80℃中备用。
将TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体与anti-CD63功能化微流控芯片比较，结果如图10中A所示。结果显示，TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的捕获效率和纯度均优于anti-CD63功能化微流控芯片。
按照上述相同的方法，将超速离心和微流控芯片的分离分泌体进行比较，结果如图10中B所示，结果显示，利用微流控芯片分离的外泌体的纯度为71.12％(MFD)，超速离心获取的外泌体纯度为67.48％(UC)，利用微流控芯片分离的外泌体的纯度高于超速离心。
按照上述相同的方法，将平滑通道和鱼骨状微流控通道进行比较，结果如图10中C所示。结果显示，鱼骨状微流控通道(Herringbone)较平滑通道(FLAT)外泌体的捕获率更高。
按照上述相同的方法，将TIM-4功能化的鱼骨状微流控芯片分离不同细胞株来源的PS+外泌体，结果如图10中D所示，MRC-5为正常人胚肺成纤维细胞株，PANC-1为人胰腺癌细胞株，A549为人非小细胞肺癌细胞株。结果显示，分离捕获的肿瘤细胞株来源的PS+外泌体数量约为正常细胞株来源的外泌体数量的三倍。因此，PS+外泌体数量在肿瘤和正常细胞株上存在显著差异。IM-4功能化的鱼骨状微流控芯片分离得到的外泌体电镜图，如图11所示。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：收集待测样本，向待测样本中加入含Ca2+溶液，将含Ca2+的待测样本泵入TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片，使待测样本中的外泌体被微流通道内的TIM-4蛋白捕获，然后使用Ca2+螯合剂洗脱，收集得到纯化的外泌体。
2.根据权利要求1所述的利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法，其特征在于：所述待测样本为肿瘤患者的体液。
3.根据权利要求1所述的利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法，其特征在于：所述体液为血清、细胞培养物或尿液。
4.根据权利要求1所述的利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法，其特征在于：所述Ca2+溶液的加入后Ca2+终浓度为2.5mM。
5.根据权利要求1所述的利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法，其特征在于：所述Ca2+螯合剂为EDTA。
6.根据权利要求5所述的利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法，其特征在于：所述EDTA的浓度为20mM。
7.根据权利要求1所述的利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法，其特征在于：待测样本泵入TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片后还包括用2.5mM的CaCl2以20μL/min的流速冲洗芯片通道10min，再通入空气，将芯片中的液体出去后。
8.根据权利要求1所述的利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片分离外泌体的方法，其特征在于：所述含Ca2+的待测样本泵入TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片的流速为16.67μL/min。
9.根据权利要求1所述的利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片捕获外泌体的方法，其特征在于；所述鱼骨状微流控芯片包含入样口、分支通道、微流通道和出样口；入样口通过集管与分支通道的入口连通，分支通道的出口通过集管与出样口连通，出样口与收集装置连接，所述微流通道以鱼骨状微通道构成的阵列单元，每个单元的鱼骨状凹槽呈周期性地交错排列，待测样本从入样口进入后分流到分支通道，分别流入鱼骨状微流通道。
10.根据权利要求9所述的利用TIM-4功能化鱼骨状微流控芯片捕获外泌体的方法，其特征在于，所述芯片的最终尺寸为：通道的总高度h为50μm，凹槽的高度与通道的高度α的比率设定为0.9，鱼骨状的边和通道轴的夹角θ为45°，主波矢量q＝2π/100μm，长边和通道轴的垂直距离为200μm，短边和通道轴的垂直距离为100μm。
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