CN107603848A - 一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法 - Google Patents
一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,包括:将PEI/PVA纺丝液,静电纺丝,蒸汽交联,得到PEI/PVA纳米纤维膜;表面修饰两性离子MPC和靶向配体4‑FBA‑PEG‑RGD得到PEI/PVA‑PMPC‑RGD;与鱼骨形PDMS微流控通道盖片等离子键合,得到包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片,可用于循环肿瘤细胞分选。本发明主体材料制备工艺简单,原料廉价易得,样品处理过程操作简便、可快速实现血液中循环肿瘤细胞的高效捕获和无损释放,具有优异的抗蛋白和抗血细胞粘附性能,提高了捕获细胞的纯度,在CTC分选和检测分析方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微流控芯片和细胞分选技术领域,特别涉及一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法。
背景技术
据世界卫生组织在2014年的报告显示,癌症已成为威胁人类生命和健康的头号杀手。在癌症死亡病例中有超过90%的癌症患者死于肿瘤的转移和复发。肿瘤转移初期,肿瘤细胞从原发灶实体瘤上脱落,进入血液,成为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTC)。有研究表明,许多肿瘤在直径不足一毫米的情况下,已经在血液里查到CTC[PiergaJ-Y,et al.Clinical significance of immunocytochemical detection of tumorcells using digital microscopy in peripheral blood and bone marrow of breastcancer patients.Clinical Cancer Research.2004,10:1392-1400.],且癌症病人外周血中CTC的数量不仅与肿瘤的分期明显相关,还可以反映肿瘤治疗(手术或化疗)后的复发情况,以及个体对肿瘤治疗的敏感性[Maheswaran S,et al.Detection of mutations inEGFR in circulating lung-cancer cells.New England Journal of Medicine.2008,359:366-377.]。因此,CTC的检测对于肿瘤的早期诊断、疾病发展预测、疗效评估、预后判断和个体化治疗具有极其重要的意义。但是血液中CTC数目极少,每毫升血液中的血细胞超过109个,而CTC只有几个到几百个,因此采用常规手段难以实现CTC的捕获和分离。
近年来,基于微流控技术和纳米材料的检测平台受到了人们广泛的关注。微流控芯片是通过设计和制作出各种结构、尺寸在微米量级的管道进行实验的装置。微流控通道的特征尺度与细胞尺寸相匹配,通过对细胞周围流场的精细控制,或是芯片上加工的各种微型结构,可以对细胞进行各种操作。此外,微流控芯片具有装置体积小、样品需求量少以及对微量液体精准操作的优点,非常适用于血液中CTC的分选。例如,Nagrath等构建了有78000个微柱阵列的微流控芯片,通过在微柱表面固定EpCAM抗体,基于细胞尺寸和EpCAM与细胞表面抗原特异性结合高效捕获CTC,大大提高了敏感性和从全血中捕获稀少细胞的效率[Nagrath,S.,et al.,Isolation of rare circulating tumour cells in cancerpatients by microchip technology.Nature,2007,450(7173):1235-1239.]。
静电纺纳米纤维具有极大的比表面积,能提供大量的细胞接触位点,使单位体积内捕获细胞的数量增加,因而静电纺纳米纤维被越来越多地应用在CTC的捕获与检测领域。此外,静电纺纳米纤维还具有制备工艺简单、原料来源广泛、便于后续多功能化修饰等诸多优点。例如,聚乙烯亚胺/聚乙烯醇(PEI/PVA)静电纺纳米纤维是一种以水为溶剂的绿色纳米纤维,且PEI/PVA纳米纤维表面带有大量的氨基和羟基便于后续的功能化修饰,可将靶向配体修饰在纳米纤维表面用于癌细胞的特异性捕获。
一般来说,为了获得高效和灵敏的捕获效果,通常需要在通道内部或者纳米材料表面修饰靶向配体,利用靶向配体与肿瘤细胞表面标记物的特异性结合,实现CTC的快速、高效捕获。目前,CTC捕获大多以抗上皮细胞黏附分子(Epithelial Cell AdhesionMolecule)Anti-EpCAM抗体作为靶向材料,特异性地捕获上皮来源的癌细胞。但这类方法存在一定的局限性,以EpCAM抗原作为细胞标志物,仅能用于捕获上皮来源的癌细胞,且在肿瘤发生转移的过程中,肿瘤细胞会发生上皮间充质转化(EMT),从而导致细胞表面EpCAM表达量下调,而不能被EpCAM抗体特异性识别并结合。因此,需要发掘新的肿瘤细胞表面标志物,筛选出一种新型、灵敏的靶向分子取代EpCAM抗体。整合素αvβ3参与肿瘤血管的生成和肿瘤的转移过程,在多种肿瘤细胞表面有高表达,而RGD肽可以被整合素αvβ3受体识别,与整合素αvβ3过表达的癌细胞特异性结合。Luo等人在纳米材料表面修饰PEG化的RGD多肽后,可成功实现对αvβ3表达阳性的癌细胞(如U87MG)和肿瘤模型的特异性成像[Luo Y,et al.RGD-functionalized ultrasmall iron oxide nanoparticles for targeted T1-weightedMR imaging of gliomas.Nanoscale.2015,7:14538-14546.]。同时,通过查阅大量文献发现,RGD对SKOV-3、U87MG、A549、HepG2等多种癌细胞具有高效、灵敏的靶向能力,可用于癌细胞的捕获和分离。
研究表明,使用微纳米基质或含特定结构设计的微流控芯片可获得理想的分离效率,但CTC目前的分离纯度普遍较低[Sheng W A,et al.Multivalent DNA nanospheresfor enhanced capture of cancer cells in microfluidic devices.ACS Nano,2013,7(8):7067.]。因此通过发明新材料或发展新方法,保证CTC高效捕获的同时,采取有效手段提高CTC的分离纯度是当前的一个重要研究方向。Wang等人利用两性离子半胱氨酸修饰的纳米粒子用于肿瘤的磁共振成像,发现两性离子具有良好的抗污性能,采用两性离子修饰可赋予纳米材料优异的抗蛋白黏附性能,同时两性离子修饰还可减少巨噬细胞的吞噬,延长纳米材料在血液中的循环时间[Wang P,et al.Antifouling Manganese OxideNanoparticles:Synthesis,Characterization,and Applications for Enhanced MRImaging of Tumors.Acs Applied Materials&Interfaces.2017,9:47-53.]。同时,查阅文献发现,修饰两性离子的纳米材料可获得血液惰性表面,减小血细胞黏附[Chang Y,etal.Blood-Inert Surfaces via Ion-Pair Anchoring of Zwitterionic CopolymerBrushes in Human Whole Blood.Adv Funct Mater.2013,23:1100-1110.]。因此,可以通过在材料表面修饰两性离子,使其获得血液惰性表面,从而减少血液中蛋白质和血细胞的非特异性黏附,提高最终捕获到的CTC的纯度。
目前,常见的CTC分选技术大多是对血液中的CTC进行捕获或者富集,捕获后的肿瘤细胞继续保留于基质上,不利于后续的检测分析,如细胞培养、PCR分析等。Yu等人于2014年发表在《Science》上的研究成果表明,若能将CTC从捕获基质有效解离并对其进行体外培养,结合基因测序与体外药敏实验,将有助于建立基于CTC的肿瘤个性化诊断技术[Yu M,etal.Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualizedtesting of drug susceptibility.Science,2014,345(6193):216-220.]。因此,发展有效的技术手段,满足CTC高效捕获的同时实现CTC无损伤释放,获取具有高生物活力的CTC,是当前CTC研究的另一热点。当前,已有部分CTC可逆释放体系取得了可喜进展,但释放过程中存在细胞损伤及释放效率较低等问题。因此必须建立温和的CTC释放体系,获取纯度高、活力好的CTC,方便对其进行后续培养及再分析。苯亚胺基团是一种酸敏感性的化学基团,在弱酸性(pH=6.8)条件下可快速断裂[Gu J,et al.pH-Triggered Reversible“Stealth”Polycationic Micelles.Biomacromolecules,2008,9,255-262]。有研究者通过苯亚胺基团将PEG或mPEG连接在纳米载体的表面,利用肿瘤组织微环境的弱酸性使得苯亚胺键断裂,实现纳米材料的去PEG化保护[Liu J,et al.Hollow mesoporous silica nanoparticlesfacilitated drug delivery via cascade pH stimuli in tumor microenvironmentfor tumor therapy.Biomaterials,2016,83,51-65]。虽然目前尚未见应用此原理进行较大粒子、细胞,特别是CTC的释放,但根据前人的研究基础可知,可在体外利用弱酸性磷酸盐缓冲液处理含有苯亚胺基团的靶向配体来实现CTC的快速、无损释放。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,具有主体材料制备工艺简单,原料廉价易得,样品处理过程操作简便、可快速实现癌细胞的高纯度捕获和无损释放等优点,在CTC分选和检测分析方面具有良好的应用前景。
本发明的一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,包括:
(1)将聚乙烯亚胺PEI和聚乙烯醇PVA加入去离子水中,磁力搅拌,得到质量分数为8~12wt%的PEI/PVA纺丝液,静电纺丝,得到PEI/PVA纳米纤维膜,蒸汽交联,得到交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜;其中PEI和PVA的质量比为0.5:1~2;
(2)将步骤(1)得到的交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜浸没在无水二氯甲烷溶液中,加入三乙胺,再逐滴加入2-溴异丁酰溴BBIB,冰浴反应,然后室温反应,经超声清洗得到表面溴化的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-Br;其中无水二氯甲烷、三乙胺和2-溴异丁酰溴的用量比为10mL:500μL:410~415μL;
(3)在氮气氛围下将步骤(2)得到的PEI/PVA-Br加入到甲醇和去离子水的混合溶液中,继续加入溴化亚铜CuBr、联吡啶、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC单体,聚合反应,然后经超声清洗,真空干燥得到两性离子MPC功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-Br;其中混合溶液、CuBr、联吡啶、MPC单体的用量比为10mL:105~110mg:230~240mg:1.75~1.80g;
(4)将末端为氨基和马来酰亚胺基的PEG化试剂NH2-PEG-Mal溶解于溶剂中,加入RGD肽,室温磁力搅拌,然后透析,真空冷冻干燥得到NH2-PEG-RGD,溶解于溶剂中,加入对醛基苯甲酸4-FBA,再次室温磁力搅拌,然后透析,真空冷冻干燥得到4-FBA-PEG-RGD;其中溶剂、NH2-PEG-Mal、RGD肽、4-FBA的用量比为5mL:28~32mg:10.35~10.40mg:2.2~2.3mg;
(5)将步骤(4)得到的4-FBA-PEG-RGD溶解于溶剂中,磁力搅拌充分溶解,先后加入催化剂和步骤(3)得到的PEI/PVA-PMPC-Br,回流反应,然后超声清洗,真空干燥后得到两性离子MPC和靶向配体4-FBA-PEG-RGD功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-RGD;其中溶剂和催化剂的用量比为20mL:25~35μL;
(6)将负载步骤(5)得到的PEI/PVA-PMPC-RGD的载玻片作为基底,与鱼骨形聚二甲基硅氧烷PDMS微流控通道盖片,通过等离子键合,得到包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片。
所述步骤(1)中磁力搅拌的工艺参数为:搅拌温度为80~100℃,搅拌时间为3~5h。
所述步骤(1)中静电纺丝的工艺参数为:选用16号针头,纺丝电压为28.5kV,流速0.6mL/h,接收距离20cm,环境温度20~25℃,湿度30~40%,接收装置为平放在铝箔纸上的直径为14mm的圆形盖玻片或长方形载玻片。
所述步骤(1)中蒸汽交联的工艺参数为:在底部放有质量分数为20~30%的戊二醛溶液的真空干燥器中抽真空至真空度达到0.08~0.09Mpa,交联处理11~13h。
所述步骤(2)中冰浴反应时间为3~5h。
所述步骤(2)中室温反应时间为7~9h。
所述步骤(2)中超声清洗的工艺参数为:以二氯甲烷和去离子水依次超声清洗3~8min。
所述步骤(3)中混合溶液中甲醇和去离子水的体积比为1:1。
所述步骤(3)中聚合反应时间为2~3h。
所述步骤(3)中超声清洗的工艺参数为:以甲醇和去离子水依次超声清洗3~8min。
所述步骤(3)中真空干燥的工艺参数为:真空度为0.09~0.1MPa,干燥温度为40~50℃,干燥时间为22~26h。
所述步骤(4)中溶剂为二甲基亚砜。
所述步骤(4)中磁力搅拌的时间为23~25h。
所述步骤(4)中再次磁力搅拌的时间为4~8h。
所述步骤(4)中透析的工艺参数为:以截留分子量为1000的透析袋,透析3天。
所述步骤(4)中真空冷冻干燥的工艺参数为:真空度为0.085~0.1mBar,冷冻干燥温度为-40~-50℃,冷冻干燥时间为48~72h。
所述步骤(5)中溶剂为苯。
所述步骤(5)中催化剂为二氮杂二环DBU。
所述步骤(5)中磁力搅拌时间为0.5~1h。
所述步骤(5)中回流反应的工艺参数为:回流反应温度为60~70℃,时间为35~37h。
所述步骤(5)中超声清洗的工艺参数为:以丙酮和去离子水超声清洗5~10min。
所述步骤(5)中真空干燥的工艺参数为:真空度为0.09~0.1MPa,干燥温度为35~45℃,干燥时间为46~50h。
所述步骤(6)中的鱼骨形PDMS微流控通道盖片是通过设计出包含一个入口、一个出口、四条平行的鱼骨形通道的鱼骨形微流控通道结构,然后打印出掩膜版,再在硅片上光刻制备出模具,然后倒模得到。
所述鱼骨形微流控通道结构的微流控通道高度为40μm,鱼骨高度为30μm,通道入口到出口的总长度为65mm,鱼骨形通道长度为45.5mm,通道总宽度为20mm,单条鱼骨形通道宽度为4mm。
所述步骤(6)中的等离子键合的工艺参数为:真空度为20~26Pa,空气中键合处理40~50s。
所述步骤(6)得到的包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片用于循环肿瘤细胞CTC分选,包括癌细胞的捕获和释放。
所述癌细胞的捕获和释放的工艺参数为:先向所述包埋取向纳米纤维的微流控芯片中通入的磷酸盐缓冲液PBS,保证通道和纳米纤维膜充分浸润,将含有癌细胞的细胞悬液(或癌症患者血液)通入微流控芯片中,随后再通入1mL的PBS缓冲液清洗微流控通道,完成捕获过程;以8mL/h的流速向微流控芯片中持续通入事先配置好的pH=6.8的PBS缓冲液,并收集回收液,完成捕获癌细胞的释放。
本发明通过静电纺丝技术制备PEI/PVA纳米纤维膜,利用原子转移自由基聚合反应在PEI/PVA纳米纤维膜表面修饰两性离子MPC,赋予纳米纤维膜抗蛋白吸附和抗血细胞粘附的能力,从而提高捕获到的癌细胞的纯度;随后将含有苯亚胺基团的靶向配体4-FBA-PEG-RGD通过酯化反应接枝到修饰到纳米纤维膜表面,使得纳米纤维膜能够特异性地结合αvβ3整合素过表达的癌细胞,实现肿瘤细胞的特异性捕获;以pH敏感断裂的苯亚胺键作为靶向配体与纳米纤维的中间连接体,实现了循环肿瘤细胞的无损释放;利用鱼骨形通道产生的紊流,增加癌细胞与纳米纤维膜基底的碰撞接触几率,提高了捕获的效率。本发明制备的包埋功能化纳米纤维的微流控芯片实现了CTC的高效捕获和快速无损释放,为用于循环肿瘤细胞分选的微流控芯片的开发提供了一种新方法。
本发明结合静电纺纳米纤维和微流控技术,以负载功能化纳米纤维膜的载玻片为基底,通过键合鱼骨形微流控通道盖片构建包埋功能化纳米纤维的微流控芯片,实现对全血中癌细胞的高效捕获和无损释放。
有益效果
(1)本发明中主体材料为纳米纤维膜和微流控盖片,材料加工工艺简单,成本低廉,具有产业化实施的前景;
(2)本发明通过两性离子对纳米纤维膜的功能化修饰,赋予纳米纤维膜抗蛋白吸附和抗血细胞粘附的能力,从而提高捕获到的癌细胞的纯度;
(3)本发明以pH敏感断裂的苯亚胺键作为靶向配体与纳米纤维基底的中间连接体,实现了循环肿瘤细胞的无损释放,便于后续对CTC的检测分析;
(4)本发明将功能化纳米纤维和微流控技术相结合,制备的包埋功能化纳米纤维的微流控芯片可实现CTC的高效、高纯度捕获和快速无损释放,为用于循环肿瘤细胞分选的微流控芯片的开发提供了一种新方法,在循环肿瘤细胞的分离和检测分析方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明中PEI/PVA纳米纤维膜的扫描电镜照片及尺寸分布图;
图2为本发明中功能化纳米纤维PEI/PVA-PMPC-RGD的合成示意图;
图3为本发明中NH2-PEG-RGD和4-FBA-PEG-RGD的核磁共振氢图谱;
图4为本发明中纳米纤维膜修饰前后的红外光谱图和热重分析图,其中(a)为红外光谱图,(b)为热重分析图;
图5为本发明中纳米纤维膜修饰前后的溶血试验结果和动态凝血试验结果,其中(a)为溶血试验结果,(b)为动态凝血试验结果;
图6为本发明中纳米纤维膜修饰前后对蛋白质的抗吸附试验结果和对血细胞的抗黏附试验结果,其中(a)为对蛋白质的抗吸附试验结果,(b)为对血细胞的抗黏附试验结果;
图7为本发明中鱼骨形微流控通道结构示意图;
图8为本发明中包埋两性离子功能化纳米纤维的微流控芯片对癌细胞的捕获效果,其中(a)为不同流速条件下微流控芯片对癌细胞A549的捕获效率,(b)为微流控芯片对不同数量癌细胞的捕获效率,(c)为微流控芯片对不同类型癌细胞的捕获效率,(d)为微流控芯片对不同类型癌细胞的捕获纯度;
图9为本发明中包埋两性离子功能化纳米纤维的微流控芯片对捕获到的癌细胞的释放效果,(a)为不同处理时间后癌细胞的释放效率,(b)为不同处理时间后释放癌细胞的活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将0.5g聚乙烯亚胺PEI和1.5g聚乙烯醇PVA加入18g去离子水中,90℃下磁力搅拌4h,得到质量分数为10wt%的PEI/PVA纺丝液,以10mL的注射器吸取PEI/PVA纺丝液,注射器连接16号针头,设置注射泵流速为0.6mL/h,以平放在铝箔纸上的圆形盖玻片或者长方形载玻片上为接收装置,调节接收距离为20cm,设置纺丝电压为28.5kV,在环境温度25℃,湿度40%条件下进行静电纺丝处理,得到PEI/PVA纳米纤维膜,放入真空干燥器中进行蒸汽交联,真空干燥器底部放有质量分数为25%的戊二醛溶液,然后抽真空至真空度达到0.085Mpa,交联处理12h,得到交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜。
(2)将步骤(1)得到的交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜浸没在10mL的无水二氯甲烷溶液中,加入500μL的三乙胺,再逐滴加入412μL的2-溴异丁酰溴BBIB,冰浴反应4h,然后室温反应8h,反应完成后以二氯甲烷和水依次超声清洗5min,得到表面溴化的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-Br。
(3)将步骤(2)得到的PEI/PVA-Br加入圆底烧瓶中,充氮赶氧5次,然后在氮气氛围下加入10mL甲醇和去离子水的混合溶液(v/v=1:1),继续加入107mg溴化亚铜CuBr、234mg联吡啶、1.77g的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC单体,聚合反应2h,随后取出纳米纤维膜,以甲醇和去离子水依次超声清洗5min,真空度为0.095MPa,45℃条件下真空干燥24h,得到两性离子MPC功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-Br。
(4)将30mg末端为氨基和马来酰亚胺基的PEG化试剂NH2-PEG-Mal溶解于5mL的二甲基亚砜溶剂中,加入10.38mg的RGD肽,室温磁力搅拌24h,然后以截留分子量为1000的透析袋,透析3天,在真空度为0.09mBar,-45℃低温条件下冷冻干燥48h得到NH2-PEG-RGD,溶解于5mL的二甲基亚砜溶剂中,加入2.25mg对醛基苯甲酸4-FBA,再次室温磁力搅拌8h,然后以截留分子量为1000的透析袋,透析3天,在真空度为0.09mBar,-45℃低温条件下冷冻干燥72h得到4-FBA-PEG-RGD。
(5)将步骤(4)得到的4-FBA-PEG-RGD溶解于20mL苯溶剂中,磁力搅拌1h充分溶解,先后加入30μL的二氮杂二环DBU催化剂和步骤(3)得到的PEI/PVA-PMPC-Br,随后升温至60℃,保持温度回流反应36h,然后以丙酮和去离子水超声清洗8min,在真空度为0.095MPa,40℃条件下真空干燥48h后得到两性离子MPC和靶向配体4-FBA-PEG-RGD功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-RGD。
(6)利用Auto CAD软件设计微流控通道结构,微流控通道设计采用鱼骨形通道,包括:一个入口,一个出口,四条平行的鱼骨形通道,通道高度40μm,鱼骨高度30μm,通道入口到出口的总长度为65mm,鱼骨形通道长度45.5mm,通道总宽度为20mm,单条鱼骨形通道宽度为4mm(如图7所示);然后把设计好的芯片利用高分辨率的打印机打印出掩膜版,再利用光刻技术在硅片上制备出微流控芯片模具,最后利用制备好的芯片模具倒模出相应的聚二甲基硅氧烷PDMS微流控通道盖片。
(7)通过等离子键合技术,设置真空度为21Pa,空气氛围下处理50s,将负载步骤(5)得到的PEI/PVA-PMPC-RGD的载玻片作为基底,与步骤(6)得到的PDMS微流控通道盖片键合,得到包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片。
实施例2
本发明以扫描电子显微镜(SEM)、衰减全反射-傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)、核磁共振氢谱(1H NMR)、热重(TG)以及溶血-凝血试验、抗蛋白和血细胞黏附试验、癌细胞的捕获和释放试验表征本发明中制备的功能化纳米纤维膜的各项性能及其结合微流控芯片在循环肿瘤细胞分选中的应用潜能。
扫描电子显微镜测试:
采用SEM表征实施例1步骤(1)得到的PEI/PVA纳米纤维膜的形貌和直径大小,SEM结果如图1所示,通过静电纺丝技术制备出的PEI/PVA纳米纤维膜表面光滑、尺寸均一,平均直径为365nm。
核磁共振氢谱测试:
采用1H NMR图谱表征实施例1步骤(4)得到的含有苯亚胺基团的靶向配体4-FBA-PEG-RGD的合成,结果如图3所示:左图为NH2-PEG-RGD的1H NMR图谱,在化学位移3.4~3.6ppm处为PEG中亚甲基的特征峰,在化学位移7.0~7.3ppm处对应靶向配体RGD的特征峰;右图中,在化学位移7.6ppm和7.9ppm出现了对醛基苯甲酸4-FBA中苯环的特征吸收峰,在8.4ppm处为4-FBA-PEG-RGD中亚氨基的特征峰,表明4-FBA成功与NH2-PEG-RGD连接,形成了含有苯亚胺基团的4-FBA-PEG-RGD。
衰减全反射-傅里叶变换红外光谱测试:
采用ATR-FTIR表征实施例1步骤(5)得到的PEI/PVA-PMPC-RGD中两性离子MPC和靶向配体4-FBA-PEG-RGD是否成功修饰在其表面,结果如图4(a)所示:图中(1)曲线为PEI/PVA纳米纤维膜的红外曲线,(2)曲线在1275cm-1处出现了属于两性离子MPC的磷氧双键的特征吸收峰,说明两性离子MPC已成功修饰在纳米纤维表面;此外,相比(1),(2)曲线,曲线(3)在1112cm-1处出现了PEG的C-O-C红外吸收峰,1570、1450cm-1处的吸收峰为RGD中的苯环的红外特征吸收峰,说明靶向配体RGD已成功修饰在纳米纤维表面。
热重测试:
通过TG来检测实施例1步骤(5)得到的功能化纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-RGD中的两性离子MPC和靶向配体4-FBA-PEG-RGD的质量百分比。TG测试结果如图4(b)所示:对比图4(b)中PEI/PVA和PEI/PVA-PMPC的热重曲线可知,修饰在纳米纤维(PEI/PVA-PMPC)表面的两性离子所占含量为23.81%;通过分析PEI/PVA-PMPC和PEI/PVA-PMPC-RGD的热重曲线并计算可知,功能化纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-RGD中,4-FBA-PEG-RGD所占含量约为25.17%。从而得出功能化纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-RGD中,两性离子MPC和靶向配体4-FBA-PEG-RGD的质量百分比分别为17.81%和25.17%。
实施例3
溶血试验测试:
通过溶血试验研究修饰前后纳米纤维膜的血液相容性。取新鲜的健康成年人全血1mL,2000r/min离心处理5min然后以磷酸盐缓冲液PBS洗涤3次,得到红细胞HRBCs。将HRBCs用PBS溶液稀释30倍,取出0.2mL HRBCs稀释液转移至含有0.8mL PBS的1.5mL离心管中,作为阴性对照。取0.2mL HRBCs稀释液转移至含有0.8mL蒸馏水的1.5mL离心管中,作为阳性对照。随后,将所配置的HRBCs稀释液用PBS再稀释5倍,取实施例1步骤(1)的交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜、步骤(3)的PEI/PVA-PMPC纳米纤维膜、步骤(5)的PEI/PVA-PMPC-RGD纳米纤维膜各4mg浸入到1mL稀释5倍后的HRBCs悬液中,每个样品设置5个平行样,在37℃环境下孵育2h。最后,取出纤维膜,将对照组及浸泡过纤维膜的HRBCs悬液以10000r/min的转速离心1min,离心后拍照,并取上清液用紫外分光光度计测试上清液在540nm处的吸光值,并利用公式计算溶血率。
溶血试验的测试结果如图5(a)所示:溶血试验结果可知PBS阴性对照组和3种纳米纤维膜均未出现明显的溶血现象,且3种纳米纤维膜的溶血率均小于5%,说明纳米纤维膜具有良好的血液相容性。
动态凝血试验测试:
采用动态凝血试验对纳米纤维膜的抗凝血性能进行评价。首先将直径为14mm的圆形盖玻片负载的3种纳米纤维膜,放入12孔培养板中,每个样品取4个平行样,直径为14mm的盖玻片作为对照。然后,向每孔中纤维毡以及对照组盖玻片上滴加20μL肝素锂稳定的健康成年人全血,同时加入10μL浓度为0.2mol/L的氯化钙CaCl2溶液,置于37℃环境下孵育5、10、20、30、40、60min。在每个培养时间结束后,向每孔加5mL蒸馏水并37℃孵育5分钟,然后用UV-Vis测试上清夜中在540nm处的吸光值。
动态凝血试验的测试结果如图5(b)所示:动态凝血试验结果可知修饰前的PEI/PVA纳米纤维膜在一定程度上会促进血液凝固,对比PEI/PVA纳米纤维膜和对照组(Coverslip)可知,经过两性离子和靶向配体的修饰,功能化纳米纤维膜获得了一定的抗凝血性能。
实施例4
抗粘附性能测试:
选用纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)表征实施例1修饰前后纳米纤维膜对蛋白质的抗粘附性能。首先配置梯度浓度纤维蛋白原的PBS溶液,利用UV-Vis分光光度计测试不同浓度Fg溶液的在280nm处的吸光值,得到Fg溶液的浓度-吸光度标准曲线。将负载有3种纳米纤维膜的圆形盖玻片放入24孔板中,每孔加入500μL的PBS溶液室温下平衡4h,随后吸出PBS溶液,再向每孔中加入1mL浓度为1mg/mL的Fg溶液,每个样品设置5个平行,将孔板放入37℃恒温摇床中孵育1h,测试纳米纤维膜吸附前后上清液中蛋白的吸光度,进而计算出蛋白质的吸附量。
抗蛋白黏附试验结果如图6(a)所示:与修饰前的PEI/PVA纳米纤维膜相比,PEI/PVA-PMPC和PEI/PVA-PMPC-RGD对蛋白的吸附率明显减小,呈现出显著性差异,说明经过两性离子功能化修饰以后,纳米纤维膜获得了优异的抗蛋白粘附性能。
取5mL新鲜的健康人血液,利用红细胞裂解液除去血液中的红细胞,1500r/min离心处理5min,得到白细胞沉淀,用钙黄绿素(Calcein-AM)染料对白细胞染色15min,再用PBS清洗3次,然后向预染色的白细胞沉淀中加入5mL细胞培养液,吹打均匀得到白细胞悬液。取出10μL白细胞悬液,用培养液稀释至1mL,用细胞计数枪计数,随后向白细胞悬液中加入一定量的新鲜培养基,得到白细胞浓度为106/mL的白细胞悬液。将负载有3种纳米纤维膜的圆形盖玻片放入24孔板中,每孔加入500μL的PBS溶液室温下平衡4h。吸出PBS溶液,每孔加入500μL的浓度为106/mL的白细胞悬液,置于37℃恒温培养箱中共培养2h。吸出白细胞悬液,用500μL的PBS溶液的清洗纤维膜3次,然后利用荧光显微镜观察黏附在纳米纤维膜上的白细胞并计数。
抗血细胞黏附试验结果如图6(b)所示:修饰前的PEI/PVA纳米纤维膜上单位面积的血细胞粘附数目接近300个/mm2,经过两性离子修饰后的纳米纤维膜血细胞粘附数仅为3~8个/mm2,这充分说明经两性离子修饰后的纳米纤维膜表面黏附的白细胞数明显减少,几乎没有白细胞黏附,具有优异的抗血细胞粘附性能。
实施例5
癌细胞捕获试验测试:
采用实施例1得到的包埋功能化纳米纤维的微流控芯片研究微流控芯片对癌细胞的捕获效果。首先,研究不同流速条件下微流控芯片对癌细胞的捕获效率。取新鲜的健康人血液,裂解红细胞后得到白细胞沉淀,用钙黄绿素橙对白细胞进行染色,然后用细胞培养液重悬浮并用细胞计数仪进行计数,随后将一定数量的人非小细胞肺癌A549细胞掺入到白细胞悬液中,得到白细胞浓度为106/mL、癌细胞浓度为200/mL的混合细胞悬液,掺入前对A549细胞用钙黄绿素红进行荧光染色,以便于后续观察计数。先向微流控芯片通入磷酸盐缓冲液PBS,保证通道和纳米纤维膜充分浸润,随后分别取1mL混合细胞悬液以不同的流速(1mL/h,2mL/h,4mL/h,6mL/h,8mL/h,10mL/h)通入到微流控芯片中,捕获完成以后再次通入磷酸盐缓冲液PBS清洗微流控通道,然后利用荧光显微镜观察统计纳米纤维膜上的癌细胞(红色)和白细胞(绿色)数目,计算癌细胞的捕获效率。
不同流速条件下微流控芯片对癌细胞的捕获效率测试结果如图8(a)所示:随着入场流速的增大,微流控芯片对A549的捕获效率逐渐降低,在流速为6mL/h时,捕获效率仍能达到90%以上,说明实施例1得到的微流控芯片在高流速条件下,仍能保持较高的捕获效率,可在短时间内可完成癌细胞的高效捕获。研究微流控芯片对不同数量癌细胞的捕获效率和捕获纯度,测定微流控芯片的检测限。
采用上述方法得到钙黄绿素橙染色的白细胞悬液,随后向白细胞悬液中分别加入不同数量预染色的A549细胞,得到白细胞浓度为106/mL、癌细胞浓度依次为10/mL,20/mL,50/mL,100/mL,200/mL,1000/mL的混合细胞悬液。先向微流控芯片通入磷酸盐缓冲液PBS,随后分别将1mL掺入不同数量癌细胞的混合细胞悬液以4mL/h的流速通入微流控芯片,完成捕获后再次通入磷酸盐缓冲液PBS清洗微流控通道,然后利用荧光显微镜观察统计纳米纤维膜上的癌细胞(红色)和白细胞(绿色)数目,计算癌细胞的捕获效率。
微流控芯片对不同数量癌细胞的捕获效率和捕获纯度的测试结果如图8(b)所示:实施例1得到的微流控芯片对不同数量(10~1000/mL)的A549细胞均具有理想的捕获效率,捕获效率大致呈先增大后减小的趋势,说明实施例1得到的微流控芯片可用于不同浓度癌细胞(10~1000/mL)的捕获分离。
研究微流控芯片对不同种类癌细胞的捕获效率和捕获纯度。参照上述实验步骤,向白细胞悬液中分别加入不同类型(恶性胶质瘤细胞U87MG、宫颈癌细胞HeLa、人非小细胞肺癌A549、人乳腺癌细胞MDA-MB-231)预染色的癌细胞,得到白细胞浓度为106/mL、不同类型癌细胞浓度均为200/mL的混合细胞悬液。先向微流控芯片通入磷酸盐缓冲液PBS,随后分别将1mL掺入不同类型癌细胞的混合细胞悬液以4mL/h的流速通入微流控芯片,完成捕获后再次通入磷酸盐缓冲液PBS清洗微流控通道,然后利用荧光显微镜观察统计纳米纤维膜上的癌细胞(红色)和白细胞(绿色)数目,计算癌细胞的捕获效率和捕获纯度。
微流控芯片对不同类型癌细胞的捕获效率的测试结果如图8(c)所示:实施例1得到的微流控芯片对4种不同类型的癌细胞都具有理想的捕获效率,可用于多种类型癌细胞的捕获分离。
微流控芯片对不同类型癌细胞的捕获纯度的测试结果如图8(d)所示:实施例1得到的微流控芯片对不同类型癌细胞的捕获纯度测试结果表明不同类型癌细胞的捕获纯度都大于60%,远高于常规捕获方法中的癌细胞捕获纯度,说明实施例1得到的微流控芯片可以实现癌细胞的高纯度捕获。
实施例6
癌细胞释放试验测试:
采用实施例1得到的包埋功能化纳米纤维的微流控芯片研究微流控芯片研究对捕获到的癌细胞的释放效果。首选把A549细胞用胰酶消化,用无血清的培养基重悬浮细胞,然后加入钙黄绿素(Calcein-AM)染料对A549细胞染色15min,然后离心并以PBS溶液清洗两次除去多余染料,最后再用无血清培养基悬浮细胞,计数后利用无血清培养基调节A549细胞浓度为104/mL。先向微流控芯片通入磷酸盐缓冲液PBS,随后取1mL浓度为104/mL的A549细胞悬浮以4mL/h的流速通入微流控芯片,完成捕获后再次通入磷酸盐缓冲液PBS清洗微流控通道,用荧光显微镜观察并计数。然后以8mL/h的流速向微流控芯片中通入事先配置好的pH=6.8的磷酸盐缓冲液,通入不同时间后,利用荧光显微镜观察纳米纤维膜表面存留的癌细胞并计数,从而计算出处理不同时间后癌细胞的释放效率。
不同处理时间后癌细胞的释放效率测试结果如图9(a)所示:随着处理时间的延长,癌细胞的释放效率逐渐增大,当处理时间为30min时,癌细胞的释放效率可达到92.6%,说明通入pH=6.8的磷酸盐缓冲液处理可以实现捕获癌细胞的快速释放。
把A549细胞用胰酶消化,用新鲜培养基重悬浮细胞,计数后利用培养基调节A549细胞浓度为104/mL。先向微流控芯片通入磷酸盐缓冲液PBS,随后取1mL浓度为104/mL的A549细胞悬浮以4mL/h的流速通入微流控芯片,完成捕获后再次通入磷酸盐缓冲液PBS清洗微流控通道。然后以8mL/h的流速向微流控芯片中通入事先配置好的pH=6.8的磷酸盐缓冲液,收集回收液,并对通入不同时间后回收液中的癌细胞进行活死细胞染色,向回收液中加入5μL浓度为8μM的碘化丙啶PI溶液和5μL浓度为2μM的钙黄绿素AM溶液,室温下染色20min,离心处理去除染色液,随后用荧光显微镜观察并统计活(绿色)死(红色)细胞的数目,进而计算出不同处理时间后释放癌细胞的活性。
不同处理时间后释放癌细胞的活性测试结果如图9(b)所示:经过pH=6.8的磷酸盐缓冲液处理60min后,释放癌细胞的活性仍可达到90%,说明pH=6.8的磷酸盐缓冲液处理对捕获的癌细胞几乎不产生损伤,本发明中的微流控芯片可以实现捕获癌细胞的无损释放。
Claims (10)
1.一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,包括:
(1)将聚乙烯亚胺PEI和聚乙烯醇PVA加入去离子水中,磁力搅拌,得到质量分数为8~12wt%的PEI/PVA纺丝液,静电纺丝,得到PEI/PVA纳米纤维膜,蒸汽交联,得到交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜;其中PEI和PVA的质量比为0.5:1~2;
(2)将步骤(1)得到的交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜浸没在无水二氯甲烷溶液中,加入三乙胺,再逐滴加入2-溴异丁酰溴BBIB,冰浴反应,然后室温反应,经超声清洗得到表面溴化的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-Br;其中无水二氯甲烷、三乙胺和2-溴异丁酰溴的用量比为10mL:500μL:410~415μL;
(3)在氮气氛围下将步骤(2)得到的PEI/PVA-Br加入到甲醇和去离子水的混合溶液中,继续加入溴化亚铜CuBr、联吡啶、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC单体,聚合反应,然后经超声清洗,真空干燥得到两性离子MPC功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-Br;其中混合溶液、CuBr、联吡啶、MPC单体的用量比为10mL:105~110mg:230~240mg:1.75~1.80g;
(4)将末端为氨基和马来酰亚胺基的PEG化试剂NH2-PEG-Mal溶解于溶剂中,加入RGD肽,室温磁力搅拌,然后透析,真空冷冻干燥得到NH2-PEG-RGD,溶解于溶剂中,加入对醛基苯甲酸4-FBA,再次室温磁力搅拌,然后透析,真空冷冻干燥得到4-FBA-PEG-RGD;其中溶剂、NH2-PEG-Mal、RGD肽、4-FBA的用量比为5mL:28~32mg:10.35~10.40mg:2.2~2.3mg;
(5)将步骤(4)得到的4-FBA-PEG-RGD溶解于溶剂中,磁力搅拌充分溶解,先后加入催化剂和步骤(3)得到的PEI/PVA-PMPC-Br,回流反应,然后超声清洗,真空干燥后得到两性离子MPC和靶向配体4-FBA-PEG-RGD功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-RGD;其中溶剂和催化剂的用量比为20mL:25~35μL;
(6)将负载步骤(5)得到的PEI/PVA-PMPC-RGD的载玻片作为基底,与鱼骨形聚二甲基硅氧烷PDMS微流控通道盖片,通过等离子键合,得到包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中磁力搅拌的工艺参数为:搅拌温度为80~100℃,搅拌时间为3~5h;静电纺丝的工艺参数为:选用16号针头,纺丝电压为28.5kV,流速0.6mL/h,接收距离20cm,环境温度20~25℃,湿度30~40%,接收装置为平放在铝箔纸上的直径为14mm的圆形盖玻片或长方形载玻片;蒸汽交联的工艺参数为:在底部放有质量分数为20~30%的戊二醛溶液的真空干燥器中抽真空至真空度达到0.08~0.09Mpa,交联处理11~13h。
3.根据权利要求1所述的一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中冰浴反应时间为3~5h;室温反应时间为7~9h;超声清洗的工艺参数为:以二氯甲烷和去离子水依次超声清洗3~8min。
4.根据权利要求1所述的一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中混合溶液中甲醇和去离子水的体积比为1:1;聚合反应时间为2~3h;超声清洗的工艺参数为:以甲醇和去离子水依次超声清洗3~8min;真空干燥的工艺参数为:真空度为0.09~0.1MPa,干燥温度为40~50℃,干燥时间为22~26h。
5.根据权利要求1所述的一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)中溶剂为二甲基亚砜;磁力搅拌的时间为23~25h;再次磁力搅拌的时间为4~8h;透析的工艺参数为:以截留分子量为1000的透析袋,透析3天;真空冷冻干燥的工艺参数为:真空度为0.085~0.1mBar,冷冻干燥温度为-40~-50℃,冷冻干燥时间为48~72h。
6.根据权利要求1所述的一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,其特征在于:所述步骤(5)中溶剂为苯;催化剂为二氮杂二环DBU;磁力搅拌时间为0.5~1h;回流反应的工艺参数为:回流反应温度为60~70℃,时间为35~37h;超声清洗的工艺参数为:以丙酮和去离子水超声清洗5~10min;真空干燥的工艺参数为:真空度为0.09~0.1MPa,干燥温度为35~45℃,干燥时间为46~50h。
7.根据权利要求1所述的一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,其特征在于:所述步骤(6)中的鱼骨形PDMS微流控通道盖片是通过设计出包含一个入口、一个出口、四条平行的鱼骨形通道的鱼骨形微流控通道结构,然后打印出掩膜版,再在硅片上光刻制备出模具,然后倒模得到;其中鱼骨形微流控通道结构的微流控通道高度为40μm,鱼骨高度为30μm,通道入口到出口的总长度为65mm,鱼骨形通道长度为45.5mm,通道总宽度为20mm,单条鱼骨形通道宽度为4mm。
8.根据权利要求1所述的一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,其特征在于:所述步骤(6)中的等离子键合的工艺参数为:真空度为20~26Pa,空气中键合处理40~50s。
9.根据权利要求1所述的一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,其特征在于:所述步骤(6)得到的包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片用于循环肿瘤细胞CTC分选,包括癌细胞的捕获和释放。
10.根据权利要求9所述的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法,其特征在于:所述癌细胞的捕获和释放的工艺参数为:先向所述包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片中通入磷酸盐缓冲液PBS,然后通入含有癌细胞的细胞悬液或癌症患者血液,再通入PBS缓冲液完成捕获过程;向所述包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片中持续通入pH=6.8的PBS缓冲液,并收集回收液,完成捕获癌细胞的释放。
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