CN102732415B - 一种高效稀有细胞捕获集成芯片及其制作方法和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效稀有细胞捕获集成芯片及其制作方法和应用方法，适用于血液中内皮前驱细胞以及循环肿瘤细胞的捕获及与之相关的体外早期诊断、化疗药物评估、肿瘤复发监测及药物开发等。芯片包括基体和基片；基体上设置有样品通道和进出口、缓冲液通道和出入口；缓冲液通道中部有与样品通道汇合的、具有细胞捕获组件和流体控制组件的通道交汇腔。制作方法包括基体及基片制作和键合程序。应用方法包括高温灭菌、表面及特异修饰和细胞捕获、固定及染色；本发明优点是：解决了在细胞捕获过程中细胞堵塞问题，同时能在短的通道中实现迅速、高效、可靠地细胞捕获和检测，而且芯片集成化程度高、结构灵巧、操作简便和制作工艺简单，应用方便、可靠、且效率高。

Description

一种高效稀有细胞捕获集成芯片及其制作方法和应用方法

技术领域：

本发明涉及一种高效稀有细胞捕获集成芯片及其制作方法和应用方法,适用于血液中内皮前驱细胞以及循环肿瘤细胞的捕获、体外早期诊断、化疗药物评估、个体化治疗、肿瘤复发监测及肿瘤药物的开发等,属于生物技术以及疾病检测和诊断领域。

背景技术：

进入21世纪，癌症及心血管疾病已经成为影响人类健康的头号大敌，因为，它是目前最常见的致死因素。通常，这些疾病在早期时，大多无明显症状，难以发现，而等到身体已经出现明显不适再进行检查，往往癌症已经发展到了中晚期，这时已经错过了最佳治疗时机，基本上已经不可能完全治愈。研究表明,人体外周血液中癌症细胞和内皮前驱细胞的数量、种类和特性可以作为癌症及心血管疾病的重要标志物, 如果能够快速捕获血液中癌症细胞和内皮前驱细胞意味着有希望在早期发现癌症及心血管疾病并改变护理治疗。目前,常见癌症检测的方法是X光、B超和CT等，还有就是直接手术或是做病变组织的穿刺活检，但很难进行早期诊断，且对人体有较大伤害。心血管疾病常规方法是检测，主要依赖流式细胞仪（FACS），它需要复杂的预处理，及长时间的检测分析和昂贵的设备。

随着微流控芯片细胞筛选技术和细胞定位、操纵和高灵敏度检测方法的建立，有望将疾病诊断推进到细胞，甚至是单细胞水平。运用微流控芯片免疫细胞筛选进行全血细胞的检测和分析将成为一种趋势。微流控产品在微型化、集成化和低消耗等方面的优势也有益于医疗诊断产品的推广和医疗成本的降低，并实现医疗条件的改善。目前,用微流控芯片实现癌症细胞和内皮前驱细胞的捕获有以下几类主要思路：(1)利用布置在微流通道中修饰特异抗体的密集细胞捕获组件捕获相对应的稀有细胞,一个普遍的问题在于，在试验的过程中,容易发生细胞堵塞的情况 (Nagrath et al, Nature 450, 1235-1239, 2007)；(2)在微流通道的顶部布置鱼翅状流体控制组件,使流体走向发生改变,从而将细胞推入平坦或有密集纳米柱的微流通道底部,细胞经与其表面特异抗体的作用而被捕获；由于作用效率低，通常需要很长距离的通道,使检测分析时间过长 (Wang et al, AngewChemie50, 3084–3088,)；(3)在微流通道中布置特异抗体修饰过的磁珠，与稀有细胞作用将其捕获，这一方法的捕捉效率和准确度也较低，均有待提高(Saliba et al, PNAS 107, 14524 –14529, 2010)。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种高效稀有细胞捕获集成芯片及其制作方法和应用方法，不仅解决在细胞捕获过程中的细胞堵塞问题，同时，通过更有效的流体控制，增加细胞与流体控制组件的相互作用，在较短的通道中实现迅速、高效、可靠地细胞捕获和检测。而且芯片集成化程度高、结构灵巧、操作简便和制作工艺简单，应用方便、可靠、且效率高。

本发明的一种高效稀有细胞捕获集成芯片技术方案是： 

一种高效稀有细胞捕获集成芯片，包括一个基体和一个与基体平面吻合并密封固定连接的基片；所述基体一端上设置的样品入口通过样品通道与另一端的样品出口联通；样品通道两侧各有一条缓冲液通道；该缓冲液通道一端有缓冲液入口，另一端有缓冲液出口；所述的两条缓冲液通道中部与样品通道汇合，形成一个通道交汇腔；该通道交汇腔中沿流体流动方向阵列设置两排细胞捕获组件；该两排细胞捕获组件之间的间隔空间与样品通道直通，成为样品通道的一部分；细胞捕获组件与缓冲液通道之间的间隔空间与缓冲液通道直通，成为缓冲液通道的一部分；在通道交汇腔中，缓冲液通道与样品通道通过细胞捕获组件的空隙联通；细胞捕获组件固定在基片或基体上，或细胞捕获组件与基片或基体为一整体；通道交汇腔内的样品通道中有用于控制流体走向的流体控制组件。

进一步的技术方案是： 

所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，其细胞捕获组件为垂直于基片或基体的若干个修饰了抗体的微柱组成；细胞捕获组件上的空隙是构成细胞捕获组件的每个构件之间的间隔空间所形成的通道。

所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，其流体控制组件为固定在通道交汇腔中的样品通道顶部和/或下部的与样品流向成夹角斜置的控制棒，或是与样品通道顶部和/或下部成为一体且与样品流向成夹角斜置的控制棒。 

所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，其缓冲液入口与缓冲液出口连成循环通道,用于使部分未被捕获并进入缓冲液通道的细胞再次被细胞捕获组件捕获。 

所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，在通道交汇腔中的样品通道顶部与下部的流体控制组件布置成鱼翅状或上下交叉形。 

所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，流体控制组件与样品流向夹角大于等于45度,小于等于90度,控制棒的宽度大于等于20微米,小于等于100微米,控制棒之间的间距大于等于30微米,小于等于400微米。 

所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，通道交汇腔的长为大于等于0.5毫米，小于等于100毫米，宽为大于等于50微米，小于等于2毫米，高为大于等于10微米，小于等于0.5毫米； 样品通道的长度大于10毫米,小于100毫米；组成细胞捕获组件的每个微柱直径为大于等于50微米, 小于等于500微米；高度为小于等于100微米,微柱之间的间距为小于等于15微米；细胞捕获组件一排的长度小于等于100毫米。 

所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，细胞捕获组件材料为生物兼容高分子材料, 选自于聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS），或光刻胶（SU8），或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）。 

所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，基体其材料为透明的生物兼容高分子材料，选自于聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS），或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）。 

所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，构成芯片基片材料为透明的生物兼容高分子材料，选自于热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）；或为二氧化硅材料，选用玻璃片；基体和基片2上有用于基体与基片对位的定位标记。 

所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，在细胞捕获组件的表面通过表面修饰方法修饰的抗体是CD31，或CD34，或VEGF，或CD146，或CD133，是针对内皮前驱细胞ENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS或 EPC的特异性标志物。 

     所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，在细胞捕获组件的表面通过表面修饰方法修饰的抗体是CD33，或CD44，或CD133，或乙醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase,ALDH），或上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM) ，或表皮特异性抗原(epithelial specific antigen,ESA) ，或人去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR），是针对循环肿瘤细胞的特异性标志物。 

本发明的一种制作上述权利要求所述高效稀有细胞捕获集成芯片的方法技术方案是： 

包括如下步骤：

A、制作基体1：

1) 制作阳模：

先绘图并制作光学模板，包括样品通道和缓冲液通道及流体控制组件,并用不同颜色区分；然后用光学曝光方法制作包括样品主通道和缓冲液通道及流体控制组件的阳模；

2)模制成型基体：

通过软光刻和热压印的方法复制阳模，制成含样品通道和缓冲液通道6及流体控制组件的聚二甲基硅氧烷（PDMS），或聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）基体；

3)加工流体进出口：

通过微细加工机床定位打通基体上样品入口、缓冲液入口，和样品出口及缓冲液出口；

B、在基片上制作流体控制组件和细胞捕获组件：

1) 制作阳模：

先绘图并制作光学模板，包括流体控制组件和细胞捕获组件,并用不同颜色区分；然后用光学曝光方法制作包括流体控制组件和细胞捕获组件阳模；

2)模制成型基片：

在基片上通过软光刻、热压印或刻蚀的方法复制阳模，流体控制组件和细胞捕获组件；

C、键合基片和基体：

将基体与基片按照定位标记对位并键合。

本发明的一种高效稀有细胞捕获集成芯片在用于捕获内皮前驱细胞EPC的应用方法，芯片包括一个基体和一个与基体平面吻合并密封固定连接的基片，方法包括下述步骤： 

a1、高温灭菌：将制作好的细胞捕获集成芯片用紫外线光进行灭菌；

b1、表面修饰：在常温下将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液注入芯片中,修饰1小时后,用去离子水冲洗3次；

c1、特异抗体修饰：在常温下将100微克/毫升抗体CD34溶液注入芯片中,修饰30分钟后,用去离子水冲洗3次；

d1、细胞捕获：将含有内皮前驱细胞的溶液以0.5微升/分钟通入样品通道,同时以1～2微升/分钟将PBS缓冲液通入位于样品通道两侧的缓冲液通道中；

e1、细胞固定：待进样5分钟后,停止进样,用一定浓度的多聚甲醛溶液注入芯片中将捕获在细胞捕获组件上的细胞固定；

f1、细胞染色：在上述d步骤完成后，对细胞进行染色；所述染色为免疫荧光染色；

g1、检测与分析：用荧光显微镜表征细胞捕获组件上捕获的内皮前驱细胞并分析捕获的内皮前驱细胞的数目以及对应的捕获效率。

本发明高效稀有细胞捕获集成芯片在用于捕获胶质瘤U87细胞的应用方法，芯片包括一个基体和一个与基体1平面吻合并密封固定连接的基片2，方法包括下述步骤： 

a2、高温灭菌：将制作好的细胞捕获集成芯片用紫外线光进行灭菌；

b2、表面修饰：在常温下将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液注入芯片中,修饰1小时后,用去离子水冲洗3次；

c2、特异抗体修饰：在常温下将10微克/毫升抗体EpCAM溶液注入芯片中,修饰30分钟后,用去离子水冲洗3次；

d2、细胞捕获：将含有胶质瘤U87细胞的溶液以0.5微升/分钟通入样品通道,同时以1～2微升/分钟将PBS缓冲液通入位于样品通道两侧的缓冲液通道中；

e2、细胞固定：待进样5分钟后,停止进样,用一定浓度的多聚甲醛溶液注入芯片中将捕获在细胞捕获组件上的细胞固定；

f2、细胞染色：在上述d步骤完成后，对细胞进行染色；所述染色为免疫荧光染色；

g2、检测与分析：用荧光显微镜表征细胞捕获组件上捕获胶质瘤U87细胞并分析捕获细胞的数目以及对应的捕获效率。

结合本发明结构、原理对本发明效果说明如下：1、通过在芯片中添加流体控制组件有效的调节样品通道中流体形态,使得样品中的细胞在通过主通道的过程中尽可能的集中；并提升细胞与修饰上特定抗体的细胞捕获组件的相互作用，提高捕获率；2、通过改变传统的细胞捕获组件在通道中的布置解决在细胞捕获过程中的细胞堵塞问题；3、芯片集成化程度高、结构灵巧；4、芯片操作简便、；5、制作工艺简单，造价低廉；6、为体外早期诊断、化疗药物评估、个体化治疗、肿瘤复发监测及肿瘤药物的开发等提供了一种可靠的手段；7、应用方便、可靠、且效率高。  

 附图说明

图1为本发明高效稀有细胞捕获集成芯片组装后整体结构主视图，该主视图为具有局部剖视的示意图；

图2为图1中的基体1主视图；

图3为图2中的基体1仰视图，本实施例的基体1上加工有样品入口3、缓冲液入口4、样品通道5、缓冲液通道6、以及样品出口9和缓冲液出口10；流体控制组件8.1为独立构件，与基体1样品通道与缓冲液通道交汇腔M处的样品通道顶部固定连接；由于基体1由透明材料制成，定位标记11也显示在本仰视图上；

图4为图1中的基片2主视图；

图5为图4的俯视图，本实施例的流体控制组件8.2为独立构件，并与基片2与基体1对应的通道交汇腔M处的样品通道底部固定连接；细胞捕获组件7为独立构件，固定在基片2通道交汇腔M处样品通道的底部；

图6为图3的A-O-A剖视图；

图7为图5的B-B剖视图；

图8为图1中的通道交汇腔M的C-C剖视放大图；

图9为为图1芯片整体的立体投影图；

图10为图5基片上的细胞捕获组件7投影图；

图11为在通道交汇腔M处样品通道5顶部呈鱼翅状布置的流体控制组件8示意图；

图12为在通道交汇腔M处样品通道5顶部和底部呈倾斜状布置的流体控制组件8示意图；

图13为在细胞捕获组件7中捕获的内皮前驱细胞EPC12荧光图；

图14为图13不同浓度的内皮前驱细胞EPC12在芯片中的捕获效率图；

图15为在细胞捕获组件7中捕获的胶质瘤细胞U8713显微图；

图16为基体1在下、基片2在上、细胞捕获组件7在基体1上、流体控制组件8与基体及基片为一体的实施例主视图； 

图17为图16中的基片2主视图；

图18为图17的仰视图；

图19为图16中的基体1的主视图；

图20为图19的俯视图。

图中各附图标记的名称为： 

1－基体；2－基片； 3-样品入口；4－缓冲液入口；5-样品通道；6－缓冲液通道；M－样品通道与缓冲液通道交汇腔；7-细胞捕获组件；8－流体控制组件；8.1-通道交汇腔M内样品通道顶部的流体控制组件；8.2-通道交汇腔M内样品通道底部的流体控制组件；9-样品出口；10-缓冲液出口；11－用于基体与基片对位的定位标记；12－内皮前驱细胞EPC；13－癌细胞U87。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 

实施例1：

如图1-12所示是本发明一种高效稀有细胞捕获集成芯片的基本实施例。包括一个基体1和一个与基体1平面吻合并密封固定连接的基片2；所述基体1一端上设置的样品入口3通过样品通道5与另一端的样品出口9联通；样品通道5两侧各有一条缓冲液通道6；该缓冲液通道6一端有缓冲液入口4，另一端有缓冲液出口10；所述的两条缓冲液通道6中部与样品通道5汇合，形成一个通道交汇腔M；该通道交汇腔M中沿流体流动方向阵列设置两排细胞捕获组件7；该两排细胞捕获组件7之间的间隔空间与样品通道5直通，成为样品通道5的一部分；细胞捕获组件7与缓冲液通道6之间的间隔空间与缓冲液通道6直通，成为缓冲液通道6的一部分；在通道交汇腔M中，缓冲液通道6与样品通道5通过细胞捕获组件7的空隙联通；如图1-12所示，细胞捕获组件7固定在基片2上；通道交汇腔M内的样品通道5中有用于控制流体走向的流体控制组件8，与基体1固定或为一体的是流体控制组件8.1，与基片2固定或为一体的是流体控制组件8.2。所述的细胞捕获组件7为垂直于基片2或基体1的若干个修饰了抗体的微柱组成；细胞捕获组件7上的空隙是构成细胞捕获组件7的每个构件之间的间隔空间所形成的通道空隙。所述的流体控制组件8为固定在通道交汇腔M中的样品通道5顶部和下部的与样品流向成夹角斜置的控制棒。所述的缓冲液入口4与缓冲液出口10连成循环通道,用于使部分未被捕获并进入缓冲液通道6的细胞再次被细胞捕获组件7捕获。在通道交汇腔M中的样品通道5顶部与下部的流体控制组件8布置成如图12所示上下交叉形，用于控制流体走向,提高样品中的细胞在通过主通道的过程中与细胞捕获组件的相互作用从而提高细胞捕获机率。所述的流体控制组件8与样品流向夹角大于等于45度,小于等于90度,控制棒的宽度大于等于20微米,小于等于100微米,控制棒之间的间距大于等于30微米,小于等于400微米。通道交汇腔M的长为大于等于0.5毫米，小于等于100毫米，宽为大于等于50毫米，小于等于2毫米，高为大于等于10毫米，小于等于0.5毫米； 样品通道5的长度大于10毫米,小于100毫米；组成细胞捕获组件7的每个微柱直径为大于等于50微米, 小于等于500微米；高度为小于等于100微米,微柱之间的间距为小于等于15微米；细胞捕获组件7一排的长度小于等于100毫米。

细胞捕获组件7材料为生物兼容高分子材料, 选自于聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS），或光刻胶（SU8），或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯（PMM）A，或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）。基体1其材料为透明的生物兼容高分子材料，选自于聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS），或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）。构成芯片基片2材料为透明的生物兼容高分子材料，选自于热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）；或为二氧化硅材料，选用玻璃片；基体1和基片2上有用于基体与基片对位的定位标记11。在细胞捕获组件7的表面通过表面修饰方法修饰的抗体是CD31，或CD34，或VEGF，或CD146，或CD133，是针对内皮前驱细胞ENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS或 EPC的特异性标志物。在细胞捕获组件7的表面通过表面修饰方法修饰的抗体是CD33，或CD44，或CD133，或乙醛脱氢酶Aldehyde dehydrogenase,ALDH，或上皮细胞粘附分子epithelial cell adhesion molecule,EpCAM ，或表皮特异性抗原epithelial specific antigen,ESA ，或人去唾液酸糖蛋白受体asialoglycoprotein receptor，ASGPR，是针对循环肿瘤细胞的特异性标志物。 

在芯片中所捕获的稀有细胞可用显微成像及显微荧光成像的方法加以分析。 

实施例2：

如图11所示，是本发明的高效稀有细胞捕获集成芯片一个较优的实施例。在实施例1基础上本实施例优选为：布置在样品通道5顶部鱼翅状流体控制组件8的交叉角度为45度,线条的宽度为35微米,小于等于100微米,线条之间的间距为110微米。样品通道的长度为25毫米。每个细胞捕获组件7的大小为50微米,高度为100微米,微柱之间的间距为15微米。所述的基片1为玻璃片。本实施例用于细胞捕获组件7的材料为SU8光胶。本实例中基体1其材料为聚合物聚二甲基硅氧烷PDMS。

实施例3：

如图12所示，是本发明的高效稀有细胞捕获集成芯片又一个较优的实施例。在实施例1基础上本实施例选为：布置在样品通道顶部和底部的交叉线条形流体控制组件8的交叉角度为45度,线条的宽度为35微米,线条之间的间距为110微米。主通道的长度为25毫米。每个细胞捕获组件的大小为50微米,高度为100微米,微柱之间的间距为15微米。所述的基片2为玻璃片。本实例中细胞捕获组件7和用于控制流体的交叉线条微结构材料为SU8光胶。本实例中基体1其材料为聚合物聚二甲基硅氧烷PDMS。

实施例4：

如图16-20所示，与实施例1不同的是，基片2在上方，基体1在下方，细胞捕获组件7在基体1上面且与基体1为一整体；所述的流体控制组件8为固定在通道交汇腔M中的样品通道5顶部和下部与样品通道5顶部和下部成为一体且与样品流向成夹角斜置的控制棒。

实施例5：

是本发明高效稀有细胞捕获集成芯片的制作方法的基本实施例，步骤包括：

本发明的一种制作上述权利要求所述高效稀有细胞捕获集成芯片的方法技术方案，包括如下步骤：

A、制作基体1：

1) 制作阳模：

先绘图并制作光学模板，包括样品通道5和缓冲液通道6及流体控制组件8,并用不同颜色区分；然后用光学曝光方法制作包括样品主通道5和缓冲液通道6及流体控制组件8的阳模；

2)模制成型基体：

通过软光刻和热压印的方法复制阳模，制成含样品通道5和缓冲液通道6及流体控制组件8的聚二甲基硅氧烷（PDMS），或聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）基体1；

3)加工流体进出口：

通过微细加工机床定位打通基体1上样品入口3、缓冲液入口4，和样品出口出9口及缓冲液出口10；

B、在基片2上制流体控制组件8和细胞捕获组件7：

1) 制作阳模：

先绘图并制作光学模板，包括流体控制组件8和细胞捕获组件7,并用不同颜色区分；然后用光学曝光方法制作包括流体控制组件8和细胞捕获组件7阳模；

2)模制成型基片：

在基片上通过软光刻、热压印或刻蚀的方法复制阳模，流体控制组件8和细胞捕获组件7；

C、键合基片2和基体1：

将基体1与基片2按照定位标记11对位并键合。

实施例6：

为本发明的一种高效稀有细胞捕获集成芯片在用于捕获内皮前驱细胞EPC的应用方法实施例。芯片包括一个基体1和一个与基体1平面吻合并密封固定连接的基片2，方法包括下述步骤：

a1、高温灭菌：将制作好的细胞捕获集成芯片用紫外线光进行灭菌；

b1、表面修饰：在常温下将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液注入芯片中,修饰1小时后,用去离子水冲洗3次；

c1、特异抗体修饰：在常温下将100微克/毫升抗体CD34溶液注入芯片中,修饰30分钟后,用去离子水冲洗3次；

d1、细胞捕获：将含有内皮前驱细胞的溶液以0.5微升/分钟通入样品通道5,同时以1～2微升/分钟将PBS缓冲液通入位于样品通道5两侧的缓冲液通道6中；

e1、细胞固定：待进样5分钟后,停止进样,用一定浓度的多聚甲醛溶液注入芯片中将捕获在细胞捕获组件7上的细胞固定；

f1、细胞染色：在上述d步骤完成后，对细胞进行染色；所述染色为免疫荧光染色；

g1、检测与分析：用荧光显微镜表征细胞捕获组件7上捕获的内皮前驱细胞并分析捕获的内皮前驱细胞的数目以及对应的捕获效率。

实施例7：

为本发明的高效稀有细胞捕获集成芯片在用于捕获胶质瘤U87细胞的应用方法实施例。芯片包括一个基体1和一个与基体1平面吻合并密封固定连接的基片2，方法包括下述步骤：

a2、高温灭菌：将制作好的细胞捕获集成芯片用紫外线光进行灭菌；

b2、表面修饰：在常温下将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液注入芯片中,修饰1小时后,用去离子水冲洗3次；

c2、特异抗体修饰：在常温下将10微克/毫升抗体EpCAM溶液注入芯片中,修饰30分钟后,用去离子水冲洗3次；

d2、细胞捕获：将含有胶质瘤U87细胞的溶液以0.5微升/分钟通入样品通道5,同时以1～2微升/分钟将PBS缓冲液通入位于样品通道5两侧的缓冲液通道6中；

e2、细胞固定：待进样5分钟后,停止进样,用一定浓度的多聚甲醛溶液注入芯片中将捕获在细胞捕获组件7上的细胞固定；

f2、细胞染色：在上述d步骤完成后，对细胞进行染色；所述染色为免疫荧光染色；

g2、检测与分析：用荧光显微镜表征细胞捕获组件7上捕获胶质瘤U87细胞并分析捕获细胞的数目以及对应的捕获效率。

本发明权利要求保护范围不限于上述实施例。 

Claims (11)

1.一种高效稀有细胞捕获集成芯片，其特征在于，它包括一个基体（1）和一个与基体（1）平面吻合并密封固定连接的基片（2）；所述基体（1）一端上设置的样品入口（3）通过样品通道（5）与另一端的样品出口（9）联通；样品通道（5）两侧各有一条缓冲液通道（6）；该缓冲液通道（6）一端有缓冲液入口（4），另一端有缓冲液出口（10）；所述的两条缓冲液通道（6）中部与样品通道（5）汇合，形成一个通道交汇腔（M）；该通道交汇腔（M）中沿流体流动方向阵列设置两排细胞捕获组件（7）；该两排细胞捕获组件（7）之间的间隔空间与样品通道（5）直通，成为样品通道（5）的一部分；细胞捕获组件（7）与缓冲液通道（6）之间的间隔空间与缓冲液通道（6）直通，成为缓冲液通道（6）的一部分；在通道交汇腔（M）中，缓冲液通道（6）与样品通道（5）通过细胞捕获组件（7）的空隙联通；细胞捕获组件（7）固定在基片（2）或基体（1）上，或细胞捕获组件（7）与基片（2）或基体（1）为一整体；通道交汇腔（M）内的样品通道（5）中有用于控制流体走向的流体控制组件（8）；流体控制组件（8）为固定在通道交汇腔（M）中的样品通道（5）顶部和/或下部的与样品流向成夹角斜置的控制棒，或是与样品通道（5）顶部和/或下部成为一体且与样品流向成夹角斜置的控制棒；在通道交汇腔（M）中的样品通道（5）顶部与下部的流体控制组件（8）布置成鱼翅状或上下交叉形；所述缓冲液入口（4）与缓冲液出口（10）连成循环通道,用于使部分未被捕获并进入缓冲液通道（6）的细胞再次被细胞捕获组件（7）捕获。

2.如权利要求1所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，其特征在于，细胞捕获组件（7）为垂直于基片（2）或基体（1）的若干个修饰了抗体的微柱组成；细胞捕获组件（7）上的空隙是构成细胞捕获组件（7）的每个构件之间的间隔空间所形成的通道。

3.如权利要求1所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，其特征在于，流体控制组件（8）与样品流向夹角大于等于45度,小于等于90度,控制棒的宽度大于等于20微米,小于等于100微米,控制棒之间的间距大于等于30微米,小于等于400微米。

4.如权利要求2所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，其特征在于，通道交汇腔（M）的长为大于等于0.5毫米，小于等于100毫米，宽为大于等于50微米，小于等于2毫米，高为大于等于10微米，小于等于0.5毫米；样品通道（5）的长度大于10毫米,小于100毫米；组成细胞捕获组件（7）的每个微柱直径为大于等于50微米, 小于等于500微米；高度为小于等于100微米,微柱之间的间距为小于等于15微米；细胞捕获组件（7）一排的长度小于等于100毫米。

5.如权利要求1所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，其特征在于，细胞捕获组件（7）材料为生物兼容高分子材料, 选自于聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS），或光刻胶（SU8），或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）。

6.如权利要求1所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，其特征在于，基体（1）其材料为透明的生物兼容高分子材料，选自于聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS），或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）。

7.如权利要求1所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，其特征在于，构成芯片基片（2）材料为透明的生物兼容高分子材料，选自于热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）；或为二氧化硅材料，选用玻璃片；基体（1）和基片（2）上有用于基体与基片对位的定位标记（11）。

8.如权利要求1所述的高效稀有细胞捕获集成芯片，其特征在于，在细胞捕获组件（7）的表面通过表面修饰方法修饰的是针对CD33，或CD44，或CD133细胞特异标志物的抗体，或针对乙醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase,ALDH），或上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)，或表皮特异性抗原(epithelial specific antigen,ESA) ，或人去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）循环肿瘤细胞特异性标志物的抗体。

9.一种制作上述权利要求1所述高效稀有细胞捕获集成芯片的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、制作基体（1）：

1) 制作阳模：

先绘图并制作光学模板，包括样品通道（5）和缓冲液通道（6）及流体控制组件（8）,并用不同颜色区分；然后用光学曝光方法制作包括样品主通道（5）和缓冲液通道（6）及流体控制组件（8）的阳模；

2)模制成型基体：

通过软光刻和热压印的方法复制阳模，制成含样品通道（5）和缓冲液通道（6）及流体控制组件（8）的聚二甲基硅氧烷（PDMS），或聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），或聚碳酸酯（PC），或聚苯乙烯（PS）基体（1）；

3)加工流体进出口：

通过微细加工机床定位打通基体（1）上样品入口（3）、缓冲液入口（4），和样品出口（9）及缓冲液出口（10）；

B、在基片（2）上制作流体控制组件（8）和细胞捕获组件（7）：

1) 制作阳模：

先绘图并制作光学模板，包括流体控制组件（8）和细胞捕获组件（7）,并用不同颜色区分；然后用光学曝光方法制作包括流体控制组件（8）和细胞捕获组件（7）阳模；

2)模制成型基片：

在基片上通过软光刻、热压印或刻蚀的方法复制阳模，流体控制组件（8）和细胞捕获组件（7）；

C、键合基片（2）和基体（1）：

将基体（1）与基片（2）按照定位标记（11）对位并键合。

10.一种权利要求1所述的高效稀有细胞捕获集成芯片在用于捕获内皮前驱细胞EPC的应用方法，其特征在于，芯片包括一个基体（1）和一个与基体（1）平面吻合并密封固定连接的基片（2），方法包括下述步骤：

a1、高温灭菌：将制作好的细胞捕获集成芯片用紫外线光进行灭菌；

b1、表面修饰：在常温下将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液注入芯片中,修饰1小时后,用去离子水冲洗3次；

c1、特异抗体修饰：在常温下将100微克/毫升抗体CD34溶液注入芯片中,修饰30分钟后,用去离子水冲洗3次；

d1、细胞捕获：将含有内皮前驱细胞的溶液以0.5微升/分钟通入样品通道（5）,同时以1～2微升/分钟将PBS缓冲液通入位于样品通道（5）两侧的缓冲液通道（6）中；

e1、细胞固定：待进样5分钟后,停止进样,用一定浓度的多聚甲醛溶液注入芯片中将捕获在细胞捕获组件（7）上的细胞固定；

f1、细胞染色：在上述d1步骤完成后，对细胞进行染色；所述染色为免疫荧光染色；

g1、检测与分析：用荧光显微镜表征细胞捕获组件（7）上捕获的内皮前驱细胞并分析捕获的内皮前驱细胞的数目以及对应的捕获效率。

11.一种如权利要求1所述的高效稀有细胞捕获集成芯片在用于捕获胶质瘤U87细胞的应用方法，其特征在于，芯片包括一个基体（1）和一个与基体（1）平面吻合并密封固定连接的基片（2），方法包括下述步骤：

a2、高温灭菌：将制作好的细胞捕获集成芯片用紫外线光进行灭菌；

b2、表面修饰：在常温下将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液注入芯片中,修饰1小时后,用去离子水冲洗3次；

c2、特异抗体修饰：在常温下将10微克/毫升抗体EpCAM溶液注入芯片中,修饰30分钟后,用去离子水冲洗3次；

d2、细胞捕获：将含有胶质瘤U87细胞的溶液以0.5微升/分钟通入样品通道（5）,同时以1～2微升/分钟将PBS缓冲液通入位于样品通道（5）两侧的缓冲液通道（6）中；

e2、细胞固定：待进样5分钟后,停止进样,用一定浓度的多聚甲醛溶液注入芯片中将捕获在细胞捕获组件（7）上的细胞固定；

f2、细胞染色：在上述d2步骤完成后，对细胞进行染色；所述染色为免疫荧光染色；

g2、检测与分析：用荧光显微镜表征细胞捕获组件（7）上捕获胶质瘤U87细胞并分析捕获细胞的数目以及对应的捕获效率。