CN103447101B - 一种微流芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微流芯片的制备方法，包括如下操作：掩膜制备操作：设计两种掩膜，掩膜包括感光区和非感光区，其中，第一掩膜的感光区包括第一封闭图形及与第一封闭图形间隔一定距离的带状图形，第二掩膜的感光区包括在第一封闭图形的基础上平行扩大至与带状图形相连形成的第二封闭图形以及带状图形；另外还包括第一刻蚀操作和第二刻蚀操作以及键合操作。根据本发明方法得到的芯片能够有效分选肿瘤细胞，并且在捕获肿瘤细胞后对其进行直接分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种微流芯片的制备方法，尤其涉及一种用于捕获肿瘤细胞的微流芯片的制备方法。
背景技术
循环肿瘤细胞通常是指来自于原发肿瘤组织，经脱落和浸染而进入人体外周血的细胞，在循环细胞转移过程中能够在不同的组织上寄居，并且可以在许多转移后的固相肿瘤上发现，因而循环肿瘤细胞可以作为早期肿瘤诊断的重要标志。另外循环肿瘤细胞在肿瘤的转移和复发中也起到重要作用。因此，对于循环肿瘤细胞生理机制的研究具有非常重要的意义。然而循环肿瘤细胞的数目及其在人体外周血中的绝对浓度非常低，使得针对循环肿瘤细胞的研究变得非常困难，因此对循环肿瘤细胞的分选和捕获是一个重要的研究课题。
目前，常用的细胞分选技术是流式细胞术，但是该技术使用的设备昂贵、体积庞大、需要专业人员进行操作，而且细胞的用量较大，难以在实验室和医院普及推广。微流芯片技术具有微型化、集成化、自动化和细胞试剂用量少、污染风险低等优点。近期，在微流芯片中使用较多的肿瘤细胞捕获方法是利用针对某些肿瘤细胞中上皮细胞粘附分子（epithelialcell adhesion molecule，EpCAM）的特异性表达进行特异性分选。该方法先对基底材料进行特定的表面处理使之具有纳米结构，然后进行表面化学修饰将Anti-EpCAM抗体偶联到基底上来捕获肿瘤细胞。但是EpCAM作为一种上皮细胞表面标记物，在不同类型的肿瘤细胞中的表达程度不同，其使用受到肿瘤细胞种类的限制。另外，对于基底的化学修饰步骤繁琐耗时，增加了不确定因素干扰试验的成功率。另外还有通过操控声表面波的驻波，利用声辐射力来直接操控肿瘤细胞进行分选和捕获；采用介电泳的方法，利用电介质粒子在不均匀电场中受力的不同对细胞进行分选和捕获，但是这些方法都不可避免的对细胞活性产生不良影响。另外，应用目前微流芯片的制备方法得到的芯片，在捕获肿瘤细胞后，缺乏在芯片上分析细胞的能力，需要转移至离心管后才能进行后续试验，该转移过程不易做到并且会造成大量细胞损失。
发明内容
为此，本发明提出了一种可以解决上述问题的或至少能部分解决上述问题的一种微流芯片的制备方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种微流芯片的制备方法，该方法包括如下操作：
掩膜制备操作：设计两种掩膜，在胶片上制备相应的掩膜，所述掩膜包括感光区和非感光区，其中，
第一掩膜的感光区包括第一封闭图形及与所述第一封闭图形间隔一定距离的带状图形，第二掩膜的感光区包括在所述第一封闭图形的基础上平行扩大至与所述带状图形相连形成的第二封闭图形以及所述带状图形；
第一刻蚀操作：将第一掩膜置于玻璃铬板上进行第一次刻蚀，形成高度为15～25um的凹陷部和沟道；
第二刻蚀操作：在玻璃铬板上放置第一掩膜的位置处放置第二掩膜后进行第二次刻蚀，形成高度为25～35um的凹陷部和沟道以及高度为15～25um的隔挡部，得到基片；
键合操作：将所述基片与盖片进行键合。
根据本发明的制备方法得到的微流芯片，由于形成的凹陷部作为捕获肿瘤细胞的区域，其中隔挡部顶端和基片以及隔挡部顶端与凹陷部的底部具有一定距离，形成一个相对的微台阶结构，这样将尺寸较大的肿瘤细胞（一般在25～35um）拦截在捕获区，而尺寸较小的血细胞（一般在15～25um）通过隔挡部上部以及沟道流出，因此可以在捕获区有效地分选到大部分的肿瘤细胞。该芯片操作简便，被捕获的细胞可保持良好的活性，透明地玻璃基底便于对捕获的细胞进行实时的原位观测。对于被捕获与固定在芯片中的肿瘤细胞可进行一系列的后续试验，如免疫荧光染色、荧光原位杂交等，应用该方法制备得到的芯片在与细胞相关的研究和临床领域中具有广阔的应用潜力。其中，在制备掩膜时主要是利用CorelDraw软件设计掩膜图形，采用高分辨率的激光照排机在胶片上制得掩膜。一般在第二刻蚀操作完成后，需要再次放入去铬液中对刻蚀完的玻璃铬板进行除铬，去除裸露的铬层。在键合操作中，是将刻蚀有微结构的玻璃基片与聚二甲基硅氧烷层经过氧等离子处理后使聚二甲基硅氧烷层与玻璃基片键合在一起。
可选地，根据本发明的制备方法，其中在第一掩膜和第二掩膜中包括至少一个带状图形。
根据本发明的制备方法，在第一掩膜和第二掩膜上的带状图形，在进行刻蚀后，形成沟道，当具有一条带状图形时，形成一个沟道，这样小分子细胞可以集中流出，当选择多条带状图形时，小分子细胞流出更加顺畅。
可选地，根据本发明的制备方法，其中所述第一掩膜和所述第二掩膜进一步地包括环状封闭图形，所述环状封闭图形与所述带状图形连接。
当掩膜中设计有带状图形连接的封闭图形时，进行刻蚀后，形成不同的沟道，带状图形形成的沟道中的流出的小分子可以流入封闭图形刻蚀形成的沟道中，这样更利于小分子细胞集中输送至出口，更有利于小分子细胞集中输出。
可选地，根据本发明的制备方法，其中在第一掩膜的第一封闭图形及第二掩膜的第二封闭图形中均包括用于形成微柱的非感光单元。
在第一掩膜和第二掩膜的封闭图形中设置非感光单元，刻蚀以后在凹陷部和隔挡部形成微柱阵列，形成的微柱阵列可以支撑盖板，保证隔挡部和盖板之间的距离，保证了小分子通过的通道距离，有效筛选小分子。
可选地，根据本发明的制备方法，在第一刻蚀操作和第二刻蚀操作包括光刻步骤和腐蚀步骤。
可选地，根据本发明的制备方法，在第一刻蚀操作的光刻步骤中，
将铺设第一掩膜的玻璃铬板曝光9～10s；
将曝光后的玻璃铬板在质量百分比为0.4～0.6%的NaOH水溶液中显影25～35s；
将显影后的玻璃铬板在100～120℃烘烤8～12分钟；
将烘烤后的玻璃铬板在去铬液中浸泡40～60s。
可选地，根据本发明的制备方法，其中在第二刻蚀步骤的光刻操作中，
在第一次刻蚀的玻璃铬板上铺设AZ5214正光刻胶；
将第二掩膜铺设在所述玻璃铬板上后曝光14～16s；
将曝光后的玻璃铬板在显影液中显影1～2分钟；
将显影后的玻璃铬板在115～125℃烘烤8～12分钟；
将烘干的玻璃铬板在去铬液中浸泡40～60s。
在第二次刻蚀时，选用了AZ5214正光刻胶，可以保证在腐蚀的过程中，使非感光区的铬层不被腐蚀掉。其中所述显影过程是在AZ5214显影液中进行的，其中AZ5214显影液的主要成份为2.38%的四甲基氢氧化铵。
可选地，根据本发明的制备方法，其中所述去铬液是由25g硝酸铈铵、6.45mL浓度为70%的高氯酸溶于110mL蒸馏水中所配成。
可选地，根据本发明的制备方法，其中，
在第一刻蚀步骤的腐蚀步骤中，在腐蚀液中腐蚀15～25分钟；
在第二刻蚀步骤的腐蚀步骤中，在腐蚀液中腐蚀8～13分钟；
所述腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成。
根据本发明的方法，利用所述腐蚀液，其腐蚀速度可以控制在1μm/min，因此根据腐蚀速度，可以控制腐蚀时间以及腐蚀深度。
可选地，根据本发明的制备方法，其中，所述盖片是在玻璃板上浇注聚甲基硅氧烷，在75～85℃烘烤2h固化后制备得到。
含有聚甲基硅氧烷层玻璃板作为基片具有的两个缺点：一是聚甲基硅氧烷疏水，容易出现气泡；二是聚甲基硅氧烷属于弹性材料，制备的沟道容易变形，以含有聚甲基硅氧烷层的玻璃板为盖片，以玻璃板为基片，可以克服此缺点。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。其中在附图中，参考数字之后的字母标记指示多个相同的部件，当泛指这些部件时，将省略其最后的字母标记。在附图中：
图1示出了根据本发明一种实施方式的微流芯片制备方法的流程图；
图2示出了根据本发明一种实施方式的第一掩膜示意图；
图3示出了根据本发明一种实施方式的第二掩膜示意图；
图4示出了根据本发明一种实施方式的第一刻蚀流程示意图；
图5示出了根据本发明一种实施方式的第一刻蚀操作后的玻璃铬板截面示意图；
图6示出了根据本发明一种实施方式的第二刻蚀操作后的玻璃铬板截面示意图；
图7示出了根据本发明一种实施方式的微流芯片截面图；
图8示出了根据本发明一种实施方式的微流芯片示意图；
图9示出了根据本发明一种实施方式的微流芯片捕获肿瘤细胞示意图；
图10示出了根据本发明的一种实施方式的微流芯片捕获肿瘤细胞的显微镜图；
图11示出了根据本发明的一种实施方式的微流芯片捕获MCF-7乳腺癌细胞效果图；
图12示出了对根据本发明的一种实施方式的微流芯片捕获到MCF-7乳腺癌细胞的悬浮液进行FDA/PI染色的效果图；
图13示出了利用根据本发明的一种实施方式的微流芯片对肿瘤细胞和血细胞的分选效果图
其中附图标记所示为：
第一掩膜的感光区100、第一封闭图形101、带状图形102、环状封闭图形103、第二掩膜的感光区200、第二封闭图形201、非感光单元300、玻璃铬板400、光刻胶层401、铬层402和玻璃层403、盖片600、出口602、入口601、基片500、凹陷部501、隔挡部502、沟道503。
具体实施方式
本发明提供了许多可应用的创造性概念，该创造性概念可大量的体现于具体的上下文中。在下述本发明实施方式中描述的实施例仅作为本发明的具体实现方式的示例性说明，而不构成对本发明范围的限制。下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步描述。
根据图1示出的本发明一个实施方式微流芯片的制备方法，首先进入掩膜制备操作S1100：设计两种掩膜，在胶片上制备相应的掩膜，所述掩膜包括感光区和非感光区，其中，第一掩膜的感光区100包括封闭图形101及与封闭图形101间隔一定距离的带状图形102，在第一掩膜的基础上将封闭图形101平行扩大至与带状图102形相连，形成第二掩膜的感光区200；之后进入第一刻蚀操作S1200：将第一掩膜置于玻璃铬板400上进行第一次刻蚀，形成高度为15～25um的凹陷部和沟道；将进行第一次刻蚀后的玻璃铬板进入第二刻蚀操作S1300：在玻璃铬板上放置第一掩膜的位置处放置第二掩膜后进行第二次刻蚀，形成高度为25～35um的凹陷部501和沟道503以及高度为15～25um的隔挡部502，得到基片500；最后将得到的基片500进入键合操作S1400：将所述基片500与盖片600进行键合，至此S1400操作结束，微流芯片的制备完成。
根据本发明微流芯片的制备方法，其中第一掩膜和第二掩膜优选包括环状封闭图形103，环状封闭图形103与带状图形102连接；在第一掩膜的第一封闭图形101及第二掩膜的第二封闭图形201中优选包括用于形成微柱的非感光单元300。在第一刻蚀操作S1200和第二刻蚀操作S1300包括光刻步骤和腐蚀步骤；在第一刻蚀操作S1200的光刻过程中，将铺设第一掩膜的玻璃铬板400曝光9～10s，将曝光后的玻璃铬板在质量百分比为0.4～0.6%的NaOH水溶液中显影25～35s，将显影后的玻璃铬板在100～120℃烘干8～12分钟，将烘干后的玻璃铬板在去铬液中浸泡40～60s。在第二刻蚀步骤S1200的光刻操作中，在第一次刻蚀的玻璃铬板上铺设AZ5214正光刻胶后曝光14～16s，将曝光后的玻璃铬板用AZ显影液显影1～2分钟，将显影后的玻璃铬板在115～125℃烘干8～12分钟，将烘干的玻璃铬板在去铬液中浸泡40～60s。其中去铬液是由25g硝酸铈铵、6.45mL浓度为70%的高氯酸溶于110mL蒸馏水中所配成。其中，在第一刻蚀操作S1200的腐蚀步骤中在腐蚀液中腐蚀15～25分钟；在第二刻蚀步骤S1300的腐蚀操作中在腐蚀液中腐蚀8～13分钟，腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成。其中，盖片优选在玻璃板上浇注聚甲基硅氧烷，在75～85℃烘烤2h固化后制备得到。
本发明微流芯片的制备方法涉及参数较多，因此具体的实施例仅作为对本发明实现方式的示例性说明，而不构成对本发明保护范围的限制。下面将以本发明提供微流芯片的制备方法的具体操作过程作为实施例进行进一步描述。
根据本发明微流芯片制备方法的工艺参数，设计出以下实施例对本发明进行示例性说明。
实施例1
图1示出了根据本发明一个实施方式微流芯片的制备方法，首先进入掩膜制备操作S1100：利用CorelDraw软件设计两种掩膜，采用高分辨率的激光照排机在胶片上制备相应的掩膜，所述掩膜包括感光区和非感光区，如图2示出的第一掩膜的示意图，其中第一掩膜的感光区100包括第一封闭图形101及与封闭图形101间隔一定距离的带状图形102，第一掩膜还包括环状封闭图形103，环状封闭图形103与带状图形102连接，其中在封闭图形103中包括了用于形成微柱的非感光单元300；如图3示出的第二掩膜的示意图，在第一掩膜的基础上将封闭图形101平行扩大至与带状图形102相连，形成第二掩膜的第二封闭图形201，第二掩膜进一步地包括环状封闭图形103，环状封闭图形103与带状图形102连接，在第二掩膜的第二封闭图形201中包括用于形成微柱的非感光单元300；之后进入第一刻蚀操作S1200：将第一掩膜置于玻璃铬板400上进行第一次刻蚀，形成如图5示出的高度为15um的凹陷部501和沟道503，在第一刻蚀操作步骤包括光刻步骤和腐蚀步骤，其中在第一刻蚀操作S1200的光刻操作中，如图4的光刻流程图所示，将铺设第一掩膜的玻璃铬板曝光9s，所述玻璃铬板400包括光刻胶层401、铬层402和玻璃层403，将曝光后的玻璃铬板在质量百分比为0.4%的NaOH水溶液中显影25s，之后用水冲洗掉多余的显影液，将显影后的玻璃铬板在100℃烘干8分钟，在去铬液中浸泡40s，其中去铬液是由25g硝酸铈铵、6.45mL浓度为70%的高氯酸溶于110mL蒸馏水中所配成，将去铬后的玻璃铬板放入腐蚀液中腐蚀15分钟，其中腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成。将进行第一次刻蚀后的玻璃铬板进入第二刻蚀操作S1300：在玻璃铬板上放置第一掩膜的位置处放置第二掩膜后进行第二次刻蚀，形成如图6示出的高度为23um的凹陷部501和沟道503以及高度为15um的隔挡部502，得到基片500，在第一次刻蚀的玻璃铬板上铺设AZ5214正光刻胶；将第二掩膜铺设在玻璃铬板上曝光14s，将曝光后的玻璃铬板在显影液中显影1分钟，将显影后的玻璃铬板在115℃烘烤8分钟，将烘烤后的玻璃铬板在去铬液中浸泡40s，然后将去铬的玻璃铬板在腐蚀液中腐蚀8分钟，所述腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成；最后将得到的基片进入键合操作S1400：将所述基片500与盖片600进行键合，盖片600优选在玻璃板上浇注聚甲基硅氧烷，在75℃烘烤2h固化后制备得到的盖片600；至此S1400操作结束，微流芯片的制备完成.
制备得到的微流芯片如图7所示，包括盖片600和基片500，其中所述盖片600包括入口602和出口601，所述基片500包括凹陷部501、隔挡部502和沟道503，其中悬浮液从入口602注入，直径较大的肿瘤细胞截留在凹陷部501中，小分子的血细胞通过隔挡部与盖片之间的空隙处进入沟道503，并从出口601处流出。
实施例2
图1示出了根据本发明一个实施方式微流芯片的制备方法，首先进入掩膜制备操作S1100：利用CorelDraw软件设计两种掩膜，采用高分辨率的激光照排机在胶片上制备相应的掩膜，所述掩膜包括感光区和非感光区，如图2示出的第一掩膜的示意图，其中第一掩膜的感光区100包括第一封闭图形101及与封闭图形101间隔一定距离的带状图形102，第一掩膜还包括环状封闭图形103，环状封闭图形103与带状图形102连接，其中在封闭图形103中包括了用于形成微柱的非感光单元300；如图3示出的第二掩膜的示意图，在第一掩膜的基础上将封闭图形101平行扩大至与带状图形102相连，形成第二掩膜的第二封闭图形201，第二掩膜进一步地包括环状封闭图形103，环状封闭图形103与带状图形102连接，在第二掩膜的第二封闭图形201中包括用于形成微柱的非感光单元300；之后进入第一刻蚀操作S1200：将第一掩膜置于玻璃铬板400上进行第一次刻蚀，形成如图5示出的高度25um的凹陷部501和沟道503，在第一刻蚀操作步骤包括光刻步骤和腐蚀步骤，其中在第一刻蚀操作S1200的光刻操作中，如图4的光刻流程图所示，将铺设第一掩膜的玻璃铬板曝光10s，所述玻璃铬板400包括光刻胶层401、铬层402和玻璃层403，将曝光后的玻璃铬板在质量百分比为0.6%的NaOH水溶液中显影35s，之后用水冲洗掉多余的显影液，将显影后的玻璃铬板在120℃烘干12分钟，在去铬液中浸泡60s，其中去铬液是由25g硝酸铈铵、6.45mL浓度为70%的高氯酸溶于110mL蒸馏水中所配成，将去铬后的玻璃铬板放入腐蚀液中腐蚀25分钟，其中腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成。将进行第一次刻蚀后的玻璃铬板进入第二刻蚀操作S1300：在玻璃铬板上放置第一掩膜的位置处放置第二掩膜后进行第二次刻蚀，形成如图6示出的高度为38um的凹陷部501和沟道503以及高度为25um的隔挡部502，得到基片500，在第一次刻蚀的玻璃铬板上铺设AZ5214正光刻胶；将第二掩膜铺设在玻璃铬板上曝光16s，将曝光后的玻璃铬板在显影液中显影2分钟，将显影后的玻璃铬板在125℃烘烤12分钟，将烘烤后的玻璃铬板在去铬液中浸泡60s，然后将去铬的玻璃铬板在腐蚀液中腐蚀13分钟，所述腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成；最后将得到的基片进入键合操作S1400：将所述基片500与盖片600进行键合，盖片600优选在玻璃板上浇注聚甲基硅氧烷，在75℃烘烤2h固化后制备得到的盖片600；至此S1400操作结束，微流芯片的制备完成.
制备得到的微流芯片如图7所示，包括盖片600和基片500，其中所述盖片600包括入口602和出口601，所述基片500包括凹陷部501、隔挡部502和沟道503，其中悬浮液从入口602注入，直径较大的肿瘤细胞截留在凹陷部501中，小分子的血细胞通过隔挡部与盖片之间的空隙处进入沟道503，并从出口601处流出。
实施例3
图1示出了根据本发明一个实施方式微流芯片的制备方法，首先进入掩膜制备操作S1100：利用CorelDraw软件设计两种掩膜，采用高分辨率的激光照排机在胶片上制备相应的掩膜，所述掩膜包括感光区和非感光区，如图2示出的第一掩膜的示意图，其中第一掩膜的感光区100包括第一封闭图形101及与封闭图形101间隔一定距离的带状图形102，第一掩膜还包括环状封闭图形103，环状封闭图形103与带状图形102连接，其中在封闭图形103中包括了用于形成微柱的非感光单元300；如图3示出的第二掩膜的示意图，在第一掩膜的基础上将封闭图形101平行扩大至与带状图形102相连，形成第二掩膜的第二封闭图形201，第二掩膜进一步地包括环状封闭图形103，环状封闭图形103与带状图形102连接，在第二掩膜的第二封闭图形201中包括用于形成微柱的非感光单元300；之后进入第一刻蚀操作S1200：将第一掩膜置于玻璃铬板400上进行第一次刻蚀，形成如图5示出的高度为20um的凹陷部501和沟道503，在第一刻蚀操作步骤包括光刻步骤和腐蚀步骤，其中在第一刻蚀操作S1200的光刻操作中，如图4的光刻流程图所示，将铺设第一掩膜的玻璃铬板曝光10s，所述玻璃铬板400包括光刻胶层401、铬层402和玻璃层403，将曝光后的玻璃铬板在质量百分比为0.5%的NaOH水溶液中显影30s，之后用水冲洗掉多余的显影液，将显影后的玻璃铬板在110℃烘干10分钟，在去铬液中浸泡50s，其中去铬液是由25g硝酸铈铵、6.45mL浓度为70%的高氯酸溶于110mL蒸馏水中所配成，将去铬后的玻璃铬板放入腐蚀液中腐蚀20分钟，其中腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成。将进行第一次刻蚀后的玻璃铬板进入第二刻蚀操作S1300：在玻璃铬板上放置第一掩膜的位置处放置第二掩膜后进行第二次刻蚀，形成如图6示出的高度为30um的凹陷部501和沟道503以及高度为20um的隔挡部502，得到基片500，在第一次刻蚀的玻璃铬板上铺设AZ5214正光刻胶；将第二掩膜铺设在玻璃铬板上曝光15s，将曝光后的玻璃铬板在显影液中显影1.5分钟，将显影后的玻璃铬板在120℃烘烤10分钟，将烘烤后的玻璃铬板在去铬液中浸泡50s，然后将去铬的玻璃铬板在腐蚀液中腐蚀10分钟，所述腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成；最后将得到的基片进入键合操作S1400：将所述基片500与盖片600进行键合，盖片600优选在玻璃板上浇注聚甲基硅氧烷，在75℃烘烤2h固化后制备得到的盖片600；至此S1400操作结束，微流芯片的制备完成.
制备得到的微流芯片如图7所示，包括盖片600和基片500，其中所述盖片600包括入口602和出口601，所述基片500包括凹陷部501、隔挡部502和沟道503，其中悬浮液从入口602注入，直径较大的肿瘤细胞截留在凹陷部501中，小分子的血细胞通过隔挡部与盖片之间的空隙处进入沟道503，并从出口601处流出。
实施例4
图1示出了根据本发明一个实施方式微流芯片的制备方法，首先进入掩膜制备操作S1100：利用CorelDraw软件设计两种掩膜，采用高分辨率的激光照排机在胶片上制备相应的掩膜，所述掩膜包括感光区和非感光区，如图2示出的第一掩膜的示意图，其中第一掩膜的感光区100包括第一封闭图形101及与封闭图形101间隔一定距离的带状图形102，第一掩膜还包括环状封闭图形103，环状封闭图形103与带状图形102连接，其中在封闭图形103中包括了用于形成微柱的非感光单元300；如图3示出的第二掩膜的示意图，在第一掩膜的基础上将封闭图形101平行扩大至与带状图形102相连，形成第二掩膜的第二封闭图形201，第二掩膜进一步地包括环状封闭图形103，环状封闭图形103与带状图形102连接，在第二掩膜的第二封闭图形201中包括用于形成微柱的非感光单元300；之后进入第一刻蚀操作S1200：将第一掩膜置于玻璃铬板400上进行第一次刻蚀，形成如图5示出的高度为22um的凹陷部501和沟道503，在第一刻蚀操作步骤包括光刻步骤和腐蚀步骤，其中在第一刻蚀操作S1200的光刻操作中，如图4的光刻流程图所示，将铺设第一掩膜的玻璃铬板曝光9s，所述玻璃铬板400包括光刻胶层401、铬层402和玻璃层403，将曝光后的玻璃铬板在质量百分比为0.5%的NaOH水溶液中显影28s，之后用水冲洗掉多余的显影液，将显影后的玻璃铬板在115℃烘干11分钟，在去铬液中浸泡45s，其中去铬液是由25g硝酸铈铵、6.45mL浓度为70%的高氯酸溶于110mL蒸馏水中所配成，将去铬后的玻璃铬板放入腐蚀液中腐蚀23分钟，其中腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成。将进行第一次刻蚀后的玻璃铬板进入第二刻蚀操作S1300：在玻璃铬板上放置第一掩膜的位置处放置第二掩膜后进行第二次刻蚀，形成如图6示出的高度为33um的凹陷部501和沟道503以及高度为22um的隔挡部502，得到基片500，在第一次刻蚀的玻璃铬板上铺设AZ5214正光刻胶；将第二掩膜铺设在玻璃铬板上曝光15s，将曝光后的玻璃铬板在显影液中显影2分钟，将显影后的玻璃铬板在120℃烘烤11分钟，将烘烤后的玻璃铬板在去铬液中浸泡50s，然后将去铬的玻璃铬板在腐蚀液中腐蚀10分钟，所述腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成；最后将得到的基片进入键合操作S1400：将所述基片500与盖片600进行键合，盖片600优选在玻璃板上浇注聚甲基硅氧烷，在80℃烘烤2h固化后制备得到的盖片600；至此S1400操作结束，微流芯片的制备完成.
制备得到的微流芯片如图7所示，包括盖片600和基片500，其中所述盖片600包括入口602和出口601，所述基片500包括凹陷部501、隔挡部502和沟道503，其中悬浮液从入口602注入，直径较大的肿瘤细胞截留在凹陷部501中，小分子的血细胞通过隔挡部与盖片之间的空隙处进入沟道503，并从出口601处流出。
根据本发明实施例1-4中微流芯片制备方法得到的微流芯片，能够简便有效地捕获悬浮于磷酸盐缓冲盐溶液中的肿瘤细胞，同时芯片的透明玻璃基底便于对捕获的细胞进行实时原位观测；被捕获的细胞可保持良好的活性，被捕获与固定在芯片中的细胞可进行一系列后续实验；制备得到的微流芯片对不同尺寸的细胞能够进行有效地分选。
通过图9示出的肿瘤细胞的捕获原理图也可以看出，直径较大的细胞被捕获到凹陷部501，直径较小的血细胞则从沟道503流出。
另外，选用实施例3制备得到的微流芯片，对肿瘤细胞进行捕获和分选实验，并对捕获得到的肿瘤细胞进行了染色实验。
通过图10示出的根据本发明微流芯片的肿瘤细胞的捕获效果图可以看出，大分子的肿瘤细胞被阻挡在凹陷部501内被捕获，小分子的细胞流出。
通过图11示出的利用本发明微流芯片对MCF-7乳腺癌细胞的捕获效果非常明显。
通过图12示出的对微流芯片捕获得到的MCF-7细胞悬浮液进行FDA/PI染色的图片中可以看出，捕获得到的肿瘤细胞发射出强烈的黄绿色且只有极少数的橘红色，表明其具有良好的活性。
通过图13可以直观地看出肿瘤细胞被捕获，而红细胞快速地通过捕获区并溜走，说明根据本发明的微流芯片对不同尺寸的细胞具有良好的分选作用。
应该注意的是，上述实施例对本发明进行说明而不是对本发明进行限制，并且本领域技术人员在不脱离所附权利要求范围的情况下可设计出替换实施例。在权利要求中，不应将位于括号之间的任何参考符号构造成对权利要求的限制。单词“包含”不排除存在未列在权利要求中的元件或步骤。
Claims (10)
1.一种微流芯片的制备方法，该方法包括如下操作：
掩膜制备操作(S1100)：设计两种掩膜，在胶片上制备相应的掩膜，所述掩膜包括感光区和非感光区，其中，
第一掩膜的感光区(100)包括第一封闭图形(101)及与所述第一封闭图形(101)间隔一定距离的带状图形(102)，第二掩膜的感光区(200)包括在所述第一封闭图形(101)的基础上平行扩大至与所述带状图形(102)相连形成的第二封闭图形(201)以及所述带状图形(102)；
第一刻蚀操作(S1200)：将第一掩膜置于玻璃铬板上，对玻璃铬板进行第一次刻蚀，形成高度为15～25um的凹陷部和沟道；
第二刻蚀操作(S1300)：在玻璃铬板上与第一掩膜位置重合处放置第二掩膜后对玻璃铬板进行第二次刻蚀，形成高度为25～35um的凹陷部和沟道以及高度为15～25um的隔挡部，得到基片；
键合操作(S1400)：将所述玻璃基片与含有聚甲基硅氧烷层的玻璃板盖片进行键合；其中，
所述玻璃铬板包括光刻胶层、铬层和玻璃层；
所述盖片包括入口和出口，所述盖片通过在玻璃板上浇注聚甲基硅氧烷，在75～85℃烘烤2h固化后制备得到。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中在第一掩膜的感光区(100)和第二掩膜的感光区(200)中包括至少一个所述带状图形(102)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述第一掩膜和所述第二掩膜进一步地包括环状封闭图形(103)，所述环状封闭图形(103)与所述带状图形(102)连接。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中在第一掩膜感光区(100)的第一封闭图形(101)及第二掩膜的第二封闭图形(201)中均包括用于形成微柱的非感光单元(300)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，在第一刻蚀操作(S1200)和第二刻蚀操作(S1300)包括光刻步骤和腐蚀步骤。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中在第一刻蚀操作(S1200) 的光刻步骤中，
将铺设第一掩膜的玻璃铬板曝光9～10s；
将曝光后的玻璃铬板在质量百分比为0.4～0.6％的NaOH水溶液中显影25～35s；
将显影后的玻璃铬板在100～120℃烘烤8～12分钟；
将烘烤后的玻璃铬板在去铬液中浸泡40～60s。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其中在第二刻蚀操作(S1300)的光刻步骤中，
在第一次刻蚀的玻璃铬板上铺设AZ5214正光刻胶；
将第二掩膜铺设在所述玻璃铬板上后曝光14～16s；
将曝光后的玻璃铬板在显影液中显影1～2分钟；
将显影后的玻璃铬板在115～125℃烘烤8～12分钟；
将烘干的玻璃铬板在去铬液中浸泡40～60s。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其中所述去铬液是由25g硝酸铈铵、6.45mL浓度为70％的高氯酸溶于110mL蒸馏水中配成。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其中，
在第一刻蚀操作(S1200)的腐蚀步骤中，在腐蚀液中腐蚀15～25分钟；
在第二刻蚀操作(S1300)的腐蚀步骤中，在腐蚀液中腐蚀8～13分钟；
所述腐蚀液由体积比为1:0.5:0.5的2molL-1HF：2molL-1NH4F：2molL-1HNO3溶液配成。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述盖片是在玻璃板上浇注聚甲基硅氧烷，在75～85℃烘烤2h固化后制备得到。
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