CN103937658B - 一种稀有细胞检测芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稀有细胞检测芯片及其应用，芯片包括基体和基片；基体分上下两层，其间集成有稀有细胞筛选膜。在上下两层均设置有样品进口、样品出口及样品通道，适用于血液样品、缓冲液、细胞培养液和其它生物化学试剂等微量流体的操控。当样品由上层样品入口输入而由下层样品出口输出时，样品中稀有细胞被选择性阻隔在细胞筛选膜的上端。根据需要将缓冲液、细胞培养液或其它生物化学试剂由上层样品入口或下层样品入口输入，由上层样品出口或下层样品出口输出，从而实现各种细胞操作和分析以及相应生物分子学检测。本发明解决了捕获稀有细胞选择性及灵敏度差的问题，适用于人体外周血液中循环肿瘤细胞及胎儿循环细胞的高效捕获、培养及分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种稀有细胞检测芯片，适用于人体外周血液中循环肿瘤细胞及胎儿循环细胞的捕获及与之相关的体外早期诊断、辅助诊断、个体化治疗、化疗药物评估、肿瘤复发监测及药物开发等。
背景技术
癌症是当影响人类健康的头号大敌和最常见的致死因素。虽然人们对癌症的诊断和治疗已有大量的研究和实践，也发展了很多有效的技术和方法，但这些技术和方法对诊断和治疗两个方面的需求还有很大的不足。例如，我们还不能做到很好的早期诊断与化疗评估。目前常用的影像技术，包括超声（US）、计算机断层显像（CT）、核磁共振成像（MRI）和正电子发射计算机断层显像（PET）对直径小于2～3毫米的肿瘤难以确认，且在很多情况下对所观察到的肿瘤浸润能力不易判断。另外，影像技术所用射线对健康也有一定危害。目前常用的另一技术是对从活体组织上取下的病变组织进行组织切片分析。这种方法局限性在于难以确定肿瘤转移的发生，且该方法是侵入性的，有可能对肿瘤组织造成刺激从而促进肿瘤的转移，因而不能作为监测肿瘤进展、治疗效果或复发的常规方法。第三种是基于血液学的检查方法：当原发肿瘤和/或转移肿瘤释放抗原或其它与癌变相关的标志物在人体外周血液中可被检测出时，便提示了肿瘤的存在，但有些其它的原因如炎症等也可导致这些标志物的增加，所以不能确诊。另外，此类血液检查也不能对化疗疗效做出准确快速的判断。研究表明，人体外周血液中癌症细胞的数量、种类和特性可以作为癌症的重要标志物，如果能够快速捕获血液中的癌症细胞，就有希望在早期发现癌症并改变护理治疗。
目前人体外周血液中稀有细胞的捕获主要有两种方案，第一种方案是基于磁珠或固体表面与稀有细胞表面的特异标志物的相互作用来进行捕获的，其问题在于有一部分稀有细胞的表面可能没有这种特异标志物，所以不能保证捕获的高效益；第二种方案是采用特殊的微孔过滤装置将稀有细胞与其它细胞进行分离，这种方法方便可相当地保证捕获的高效益，但问题是目前所提出的方案选择性不高，及在所捕获细胞中除稀有细胞外还有大量的白血细胞。所以，如何同时提高稀有细胞捕获的效率和选择性是当前亟待解决的问题。另外，已报道的用于稀有细胞捕获的过滤装置功能单一，不利于进一步的细胞检测和相关的生物分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稀有细胞检测芯片及其应用，它可用于稀有细胞的捕获、固定和染色，细胞的培养、成像和计数，细胞的驱化性及细胞凋亡的研究，也可用于人体外周血液中循环肿瘤细胞及胎儿循环细胞的捕获及与之相关的体外早期诊断、辅助诊断、个体化治疗、化疗药物评估、肿瘤复发监测及药物开发等。本发明解决了在稀有细胞捕获过程中选择性及灵敏度差的问题，能在短时间内实现高效和可靠地稀有细胞捕获和检测，同时芯片的制作工艺简单、集成化程度高、结构灵巧、操作简便、应用方便、可靠、且效率高。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种稀有细胞检测芯片，它包括一个基体和一个与基体平面吻合并密封粘合的基片，所述基体由上层、下层和集成在上层与下层之间的细胞筛选膜构成，所述上层的一端设置有上层样品入口，另一端设置有上层样品出口，上层样品入口通过上层样品输入通道与一带有上层缺口的上层环形通道相连，而该上层环形通道通过若干条呈辐射状设置的上层扩散通道与一上层圆形样品池相连，该上层圆形样品池通过上层样品输出通道与上层样品出口相连；同样，所述上层的一端和下层的一端设置有一个连通的下层样品入口，另一端设置有连通的下层样品出口，下层样品入口通过下层样品输入通道与一带有下层缺口的下层环形通道相连，而该下层环形通道通过若干条呈辐射状设置的下层扩散通道与一下层圆形样品池相连，该下层圆形样品池通过下层样品输出通道与下层样品出口相连。上层与下层的液体交换由分隔两层的细胞筛选膜来实现，当从上层样品入口输入时，样品通过上层环形通道及上层扩散通道进入上层圆形样品池。当从下层样品入口输入时，样品通过下层环形通道及下层扩散辐射状通道进入下层圆形样品池。通过调节上层样品入口和上层样品出口的压强及下层样品入口和下层样品出口的压强，可控制流体走向，即进入上层圆形样品池的样品可以从上层样品出口或下层样品出口输出，进入下层圆形样品池的样品可以从下层样品出口或上层样品出口输出。
进一步的技术方案是：
所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，下层的上部设有用于安置细胞筛选膜的圆形凹口。
所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，细胞筛选膜由固定环和封装在固定环上的微孔阵列滤膜构成，所述微孔阵列滤膜为呈密集分布和规则排列的锥形微孔阵列滤膜或双层微孔阵列滤膜。
所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，上层样品输入通道、上层样品输出通道、下层样品输入通道、下层样品输出通道、上层环形通道、下层环形通道、上层扩散通道和下层扩散通道的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，宽度大于等于20微米，小于等于2毫米。
所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，上层圆形样品池和下层圆形样品池的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直径大于等于2毫米，小于等于30毫米。
所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，所述微孔阵列滤膜的厚度大于等于10微米，小于等于100微米，所述锥形微孔阵列或双层微孔阵列的小孔径直径大于等于1微米，小于等于20微米，大孔径直径大于等于5微米，小于等于100微米，所述微孔阵列滤膜的两个小孔间圆心距离大于等于2微米，小于等于500微米。
所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，圆形凹口的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直径大于等于2毫米，小于等于30毫米。
本发明的稀有细胞检测芯片在细胞捕获、固定及染色、细胞成像及计数过程中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
1）灭菌：将稀有细胞检测芯片置于紫外光线下进行灭菌；
2）细胞筛选膜的表面修饰：先用注射泵在芯片中注入预先配好的蛋白溶液对细胞筛选膜表面进行表面修饰，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
3）细胞捕获：将含有癌细胞的磷酸盐缓冲液注入芯片中，使癌细胞被细胞筛选膜所捕获；
4）细胞固定：将多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕获细胞的固定在细胞筛选膜上，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
5）细胞染色：依次注入Triton-Xl00通透液和牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理；再注入有荧光素标记的抗体，并使之与细胞表面的特异抗原或稀有细胞的标记物相结合；在每次注入新的溶剂之后，注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
6）成像与分析：将细胞筛选膜取出，用荧光显微镜对细胞筛选膜上的捕获的细胞进行成像并分析捕获的细胞的数目以及对应的捕获效率。
本发明的稀有细胞检测芯片在血样内循环肿瘤细胞捕获过程中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1）灭菌：将稀有细胞检测芯片置于紫外光线下进行灭菌；
2）细胞筛选膜的表面修饰：先用注射泵在芯片中注入预先配好的蛋白溶液对细胞筛选膜表面进行表面修饰，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
3）血样处理：将病人血样用磷酸盐缓冲液溶液进行稀释；
4）细胞捕获：将含有癌细胞的磷酸盐缓冲液注入芯片中，使癌细胞被细胞筛选膜所捕获，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
5）细胞固定：将多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕获的细胞固定在细胞筛选膜上，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
6）细胞染色：依次注入Triton-Xl00通透液和牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理；再注入有荧光素标记的抗体，并使之与细胞表面的特异抗原或细胞的癌症标记物相结合；在每次注入新的溶剂之后，注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
7）成像与分析：将细胞筛选膜取出，用荧光显微镜对细胞筛选膜上的捕获的细胞进行成像并分析以确定癌细胞的个数。
本发明还提供了一种稀有细胞在检测芯片中培养、扩增的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）灭菌：将稀有细胞检测芯片置于紫外光线下进行灭菌；
2）细胞过滤膜的表面修饰：先用注射泵在芯片中注入预先配好的蛋白溶液对细胞筛选膜表面进行表面修饰，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
3）细胞捕获：将含有稀有细胞的磷酸盐缓冲液或血样注入芯片中，使稀有细胞被细胞筛选膜所捕获；
4）细胞培养：待细胞捕获完毕后，缓慢注入细胞培养液后置于细胞培养箱中培养。
本发明的有益效果在于：
1）稀有细胞检测芯片进样速度可以控制在一定的范围内，因此可以调节样品通过细胞筛选膜的流量。
2）当样品通过细胞筛选膜的流量较小时，细胞筛选膜两边的压差也较小，因而确保所捕获的稀有细胞被保留且其活性不受较大的影响。
3）样品由环形通道和与之相连的扩散通道进入样品池的进样方式确保待检样品经过细胞筛选膜时有一横流分量，从而减少待检样品中细胞在微孔阵列滤膜表面没有孔的部分的停留和被捕获时的附加压力。
4)通过锥形微孔或双层微孔阵列时，样品中除稀有细胞外的所有成分都可通过细胞筛选膜，因而确保细胞筛选膜的通透性或细胞筛选膜两边的压差不变，从而使所捕获的稀有细胞被保留且其活性不受压差的影响。
5）细胞筛选膜表面可进行各种生物化学修饰，以增强稀有细胞捕获的选择性或其它特性。
6）当稀有细胞在芯片中被捕获后，可以在芯片中对细胞进行进一步的操作，如细胞培养、细胞处理与成像及分子水平上的检测和分析。
7）当稀有细胞在芯片中被捕获后，也可以将细胞筛选膜取出，并结合其它方法对细胞进行培养、处理与成像以及分子水平上的检测和分析。
8）夹在芯片中的细胞筛选膜上的锥形微孔或双层微孔口径较小的一面可以朝上或朝下，与此稀有细胞可以被限制在上层或下层的样品池中以方便观察。
9）通过调节上层样品入口和上层样品出口的压强及下层样品入口和下层样品出口的压强，可控制流体走向，即进入上层圆形样品池的样品可以从上层样品出口或下层样品出口输出，进入下层圆形样品池的样品可以从下层样品出口或上层样品出口输出。
10）本发明为癌症早期诊断、化疗药物评估、个体化治疗、肿瘤复发监测及肿瘤药物的开发等提供了一种可靠的手段。
11）本发明的细胞过滤器应用方便、可靠、且效率高。
附图说明
图1为本发明的稀有细胞检测芯片结构示意图。
图2为图1中基体的上层结构俯视示意图。
图3为图1中基体的下层结构俯视示意图。
图4为细胞筛选膜结构示意图。
图5为图4的A-A剖视图，其显示为锥形微孔阵列及固定环的结构示意图。
图6为图4的A-A剖视图，其显示为双层微孔阵列及固定环的结构示意图。
图7为锥形微孔阵列滤膜的扫描电镜图，其中(a)锥形微孔小口径的一面，(b)锥形微孔大口径的一面。
图8为图1的稀有细胞检测芯片的实物图。
图9为用不同流速捕获HT29细胞捕获效率图。
图10为不同浓度HT29细胞在芯片中的捕获效率图。
图11为捕获于细胞筛选膜上的HT29细胞免疫荧光图。
图中各附图标记的名称为：
1－基体；2－基片；3-上层；4－下层；5-细胞筛选膜；6－上层样品入口；7-上层样品输入通道；8－上层样品出口；8.1－上层样品输出通道；9-下层样品入口；10-下层样品输入通道；11-下层样品出口；11.1-下层样品输出通道；12-上层环形通道；12.1-上层缺口；13－下层环形通道；13.1-下层缺口；14－上层扩散通道；15－下层扩散通道；16－上层圆形样品池；17－下层圆形样品池；18－圆形凹口；19－锥形微孔阵列；20－双层微孔阵列；21－固定环。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
如图1-6所示是本发明一种稀有细胞检测芯片的基本实施例。它包括一个基体1和一个与基体1平面吻合并密封粘合的基片2，所述基体1由上层3、下层4和集成在上层3与下层4之间的细胞筛选膜5构成，所述上层3的一端设置有上层样品入口6，另一端设置有上层样品出口8，上层样品入口6通过上层样品输入通道7与一带有上层缺口12.1的上层环形通道12相连，而该上层环形通道12通过若干条呈辐射状设置的上层扩散通道14与一上层圆形样品池16相连，该上层圆形样品池16通过上层样品输出通道8.1与上层样品出口8相连；同样，所述上层3的一端和下层4的一端设置有连通的下层样品入口9，另一端设置有连通的下层样品出口11，下层样品入口9通过下层样品输入通道10与一带有下层缺口13.1的下层环形通道13相连，而该下层环形通道13通过若干条呈辐射状设置的下层扩散通道15与一下层圆形样品池17相连，该下层圆形样品池17通过下层样品输出通道11.1与下层样品出口11相连。上层3与下层4的液体交换由分隔两层的细胞筛选膜5来实现。
当从上层样品入口6输入时，样品通过上层环形通道12及上层扩散通道14进入上层圆形样品池16。当从下层样品入口9输入时，样品通过下层环形通道13及下层扩散通道15进入下层圆形样品池17。通过调节上层样品入口6和上层样品出口8的压强及下层样品入口9和下层样品出口11的压强，可控制流体走向，即进入上层圆形样品池16的样品可以从上层样品出口8或下层样品出口11输出，进入下层圆形样品池17的样品可以从下层样品出口11或上层样品出口8输出。
细胞捕获由细胞筛选膜5实现，该细胞筛选膜5被放置在下层4上部的圆形凹口18处，其中的微孔阵列滤膜上密集分布和规则排列有锥形微孔阵列19或双层微孔阵列20，并封装在一固定环21上，夹在芯片中的细胞筛选膜5上锥形微孔或双层微孔口径较小的一面朝上。样品过滤时，样品中的稀有细胞可被阻隔在细胞筛选膜5的锥形微孔或双层微孔口径较小的一面，过滤后的样品通过下层圆形样品池17。可在上层样品输入通道7中布置特定的结构并修饰特异性抗体，预筛选样品中的部分细胞。
上层样品输入通道7、上层样品输出通道8.1、下层样品输入通道10、下层样品输出通道11.1、上层环形通道12、下层环形通道13、上层扩散通道14和下层扩散通道15的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，宽度大于等于20微米，小于等于2毫米。上层圆形样品池16和下层圆形样品池17的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直径大于等于2毫米，小于等于30毫米。微孔阵列滤膜的厚度大于等于10微米，小于等于100微米，所述锥形微孔阵列或双层微孔阵列的小孔径直径大于等于1微米，小于等于20微米，大孔径直径大于等于5微米，小于等于100微米，所述微孔阵列滤膜的两个小孔间圆心距离大于等于2微米，小于等于500微米。圆形凹口18的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直径大于等于2毫米，小于等于30毫米。
在芯片中所捕获的稀有细胞可用显微成像及显微荧光成像的方法加以分析。
实施例2
如图7、8所示，是本发明一种稀有细胞检测芯片的实施例。
图7为锥形微孔阵列滤膜的扫描电镜图，其中(a)为锥形微孔小口径的一面，(b)为锥形微孔大口径的一面。细胞筛选膜5的厚度为40微米。固定环21的厚度为60微米。细胞筛选膜5上密集分布和规则排列的锥形微孔的小口径直径为6.5微米，大口径直径为25微米，其周期为40微米。所述的微孔阵列滤膜的制作材料为聚乙二醇。
图8为图1的稀有细胞检测芯片的实物图。上层样品输入通道7、上层样品输出通道8.1、下层样品输入通道10、下层样品输出通道11.1的宽度为500微米，上层环形通道12、下层环形通道13的宽度为400微米。上层扩散通道14和下层扩散通道15的宽度为200微米，长度为1毫米，每个扩散通道相互间隔角度为45度。上层圆形样品池16和下层圆形样品池17的直径为6毫米。细胞筛选膜5的厚度为100微米。所述的基片2为玻璃片。本实例中基体1材料为聚合物聚二甲基硅氧烷。
实施例3
使用实施例2中稀有细胞检测芯片用于捕获PBS溶液中参杂直肠癌细胞HT29，包括下述步骤：
1）灭菌：将稀有细胞检测芯片置于紫外光线下进行灭菌；
2）细胞筛选膜5的表面修饰：先用注射泵在芯片中注入20μl的MaxGel溶液（1︰100比例稀释在PBS溶液中），在细胞培养箱中培育小时后，移去残留溶液，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
3）细胞捕获：将10ml含有直肠癌细胞HT29的磷酸盐缓冲液注入芯片中，使癌细胞被细胞筛选膜5所捕获；
4）细胞固定：将浓度为4%的多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕获的细胞固定在细胞筛选膜5上，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
5）细胞染色：依次注入浓度为0.2%Triton-Xl00通透液和浓度为1%牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理；再注入有荧光素标记的抗体，并使之与细胞表面的特异抗原或细胞的癌症标记物相结合；在每次注入新的溶剂之后，注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
6）成像与分析：将细胞筛选膜5取出，用荧光显微镜对细胞筛选膜5上的捕获的HT29细胞进行成像并分析捕获的细胞的数目以及对应的捕获效率。
图9为磷酸盐缓冲液在不同流速时HT29细胞的捕获效率图。
图10为磷酸盐缓冲液在流速分别为0.2和0.5毫升/分时HT29细胞的捕获效率图。
实施例4
使用实施例2中稀有细胞检测芯片用于捕获血样中直肠癌细胞HT29，包括下述步骤：
1）灭菌：将稀有细胞检测芯片置于紫外光线下进行灭菌；
2）细胞筛选膜5的表面修饰：先用注射泵在芯片中注入20μl的MaxGel溶液（1︰100比例稀释在PBS溶液中），在细胞培养箱中培育小时后，移去残留溶液，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
3）血样处理：分别取正常人血样5毫升，PBS溶液4毫升，含有直肠癌细胞HT29的PBS溶液1毫升，并混合；
4）细胞捕获：将10ml含有直肠癌细胞HT29的磷酸盐缓冲液注入芯片中，使癌细胞被细胞筛选膜5所捕获；
5）细胞固定：将浓度为4%的多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕获在细胞筛选膜5上的细胞固定，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
6）细胞染色：依次注入浓度为0.2%Triton-Xl00通透液和浓度为1%牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理；再注入有荧光素标记的抗体，并使之与细胞表面的特异抗原或细胞的癌症标记物相结合；在每次注入新的溶剂之后，注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
7）成像与分析：将细胞筛选膜5取出，用荧光显微镜对细胞筛选膜5上的捕获的HT29细胞进行成像并分析捕获的细胞的数目以及对应的捕获效率。
图11为血样通过细胞过滤膜5后所捕获的HT29细胞荧光。DAPI标识为所有细胞核，CK标识的为HT29细胞角蛋白，CD45标识的为白细胞，Merge为DAPI、CK与CD45的组合图。标尺长度为100微米。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种稀有细胞检测芯片，其特征在于，它包括一个基体(1)和一个与基体(1)平面吻合并密封粘合的基片(2)，所述基体(1)由上层(3)、下层(4)和集成在上层(3)与下层(4)之间的细胞筛选膜(5)构成，所述上层(3)的一端设置有上层样品入口(6)，另一端设置有上层样品出口(8)，所述上层样品入口(6)通过上层样品输入通道(7)与一带有上层缺口(12.1)的上层环形通道(12)相连，所述上层环形通道(12)通过若干条呈辐射状设置的上层扩散通道(14)与一上层圆形样品池(16)相连，所述上层圆形样品池(16)通过上层样品输出通道(8.1)与上层样品出口(8)相连，同样，所述上层(3)的一端和下层(4)的一端设置有连通的下层样品入口(9)，另一端设置有连通的下层样品出口(11)，所述下层样品入口(9)通过下层样品输入通道(10)与一带有下层缺口(13.1)的下层环形通道(13)相连，所述下层环形通道(13)通过若干条呈辐射状设置的下层扩散通道(15)与一下层圆形样品池(17)相连，所述下层圆形样品池(17)通过下层样品输出通道(11.1)与下层样品出口(11)相连。
2.如权利要求1所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，所述下层(4)的上部设有用于安置细胞筛选膜(5)的圆形凹口(18)。
3.如权利要求1或2所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，所述细胞筛选膜(5)由固定环(21)和封装在固定环(21)上的微孔阵列滤膜构成，所述微孔阵列滤膜为呈密集分布和规则排列的锥形微孔阵列(19)滤膜或双层微孔阵列(20)滤膜。
4.如权利要求1或2所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，所述上层样品输入通道(7)、上层样品输出通道(8.1)、下层样品输入通道(10)、下层样品输出通道(11.1)、上层环形通道(12)、下层环形通道(13)、上层扩散通道(14)和下层扩散通道(15)的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，宽度大于等于20微米，小于等于2毫米。
5.如权利要求1或2所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，所述上层圆形样品池(16)和下层圆形样品池(17)的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直径大于等于2毫米，小于等于30毫米。
6.如权利要求3所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，所述微孔阵列滤膜的厚度大于等于10微米，小于等于100微米，所述锥形微孔阵列(19)或双层微孔阵列(20)的小孔径直径大于等于1微米，小于等于20微米，大孔径直径大于等于5微米，小于等于100微米，所述微孔阵列滤膜的两个小孔间圆心距离大于等于2微米，小于等于500微米。
7.如权利要求2所述的稀有细胞检测芯片，其特征在于，所述圆形凹口(18)的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直径大于等于2毫米，小于等于30毫米。
8.一种根据权利要求1所述稀有细胞检测芯片在细胞捕获、固定及染色、细胞成像及计数过程中的应用，除诊断和治疗病因的方法外，其特征在于：包括以下步骤：
1)灭菌：将稀有细胞检测芯片置于紫外光线下进行灭菌；
2)细胞筛选膜的表面修饰：先用注射泵在芯片中注入预先配好的蛋白溶液对细胞筛选膜表面进行表面修饰，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
3)细胞捕获：将含有癌细胞的磷酸盐缓冲液注入芯片中，使癌细胞被细胞筛选膜所捕获；
4)细胞固定：将多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕获的细胞固定在细胞筛选膜上，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
5)细胞染色：依次注入Triton-Xl00通透液和牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理；再注入有荧光素标记的抗体，并使之与细胞表面的特异抗原或稀有细胞的标记物相结合；在每次注入新的溶剂之后，注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
6)成像与分析：将细胞筛选膜取出，用荧光显微镜对细胞筛选膜上的捕获的细胞进行成像并分析捕获的细胞的数目以及对应的捕获效率。
9.一种根据权利要求1所述稀有细胞检测芯片在血样中循环肿瘤细胞捕获过程中的应用，除诊断和治疗病因的方法外，其特征在于，包括如下步骤：
1)灭菌：将稀有细胞检测芯片置于紫外光线下进行灭菌；
2)细胞筛选膜的表面修饰：先用注射泵在芯片中注入预先配好的蛋白溶液对细胞筛选膜表面进行表面修饰，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
3)血样处理：将病人血样用磷酸盐缓冲液溶液进行稀释；
4)细胞捕获：将含有癌细胞的磷酸盐缓冲液注入芯片中，使癌细胞被细胞筛选膜所捕获，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
5)细胞固定：将多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕获的细胞固定在细胞筛选膜上，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
6)细胞染色：依次注入Triton-Xl00通透液和牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理；再注入有荧光素标记的抗体，并使之与细胞表面的特异抗原或细胞的癌症标记物相结合；在每次注入新的溶剂之后，注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
7)成像与分析：将细胞筛选膜取出，用荧光显微镜对细胞筛选膜上的捕获的细胞进行成像并分析以确定癌细胞的个数。
10.一种权利要求1所述稀有细胞检测芯片在细胞培养、扩增过程中的应用，除诊断和治疗病因的方法外，其特征在于，包括以下步骤：
1)灭菌：将稀有细胞检测芯片置于紫外光线下进行灭菌；
2)细胞筛选膜的表面修饰：先用注射泵在芯片中注入预先配好的蛋白溶液对细胞筛选膜表面进行表面修饰，然后注入磷酸盐缓冲液进行清洗；
3)细胞捕获：将含有稀有细胞的磷酸盐缓冲液或血样注入芯片中，使稀有细胞被细胞筛选膜所捕获；
4)细胞培养：待细胞捕获完毕后，缓慢注入细胞培养液后置于细胞培养箱中培养。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Tang Yadong Inventor after: Shi Jian Inventor after: Li Sisi Inventor after: Wang Li Inventor after: Chen Yong Inventor before: Tang Yadong Inventor before: Shi Jian Inventor before: Li Sisi Inventor before: Wang Li Inventor before: Chen Yong |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180109 Address after: 36, No. 38 North Tower three King Star Plaza, Guangzhou Road, Haizhuqu District, Guangdong province 510005 Chau Street Guangzhou International Biological Island world second layer self 239-251 Patentee after: Guangzhou Angola Biological Technology Co. Ltd. Address before: No. 666, Wuhan hi tech Zone, Wuhan City, Wuhan, Hubei Patentee before: Wuhan Jieguan Bio-technology Co., Ltd. |