CN104619856A - 用于从流体样品中分离细胞的系统、方法及部件 - Google Patents

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Abstract

一种用于从包含多种细胞类型的流体样品中分离预选细胞类型的系统，其包含细胞捕获流体芯片，以及配置成容纳所述细胞捕获流体芯片并且维持所述细胞捕获流体芯片在运行中基本上流体紧密密封的芯片保持器。所述芯片保持器还配置成释放待从芯片保持器中移出的细胞捕获流体芯片以用于进一步处理。所述细胞捕获流体芯片包含基底，设置在所述基底上的激光显微切割膜，以及设置于所述激光显微切割膜上的通道限定层。所述激光显微切割膜具有相对于多种细胞类型中的其他细胞类型适于优先捕获预选细胞类型的表面。所述通道限定层能从所述激光显微切割膜上移除以用于进一步处理所述细胞捕获流体芯片。

Description

用于从流体样品中分离细胞的系统、方法及部件
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年5月29日提交的美国临时申请No.61/652,690和2012年5月29日提交的美国临时申请No.61/652,683的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。
背景
1.技术领域
本发明目前要求保护的实施方案的领域涉及用于从流体样品中分离细胞的系统、方法及部件。
2.背景技术
当发生实体瘤转移时最经常导致患者的与癌症相关之死亡。然而癌症转移的分子机制在很大程度上仍不为人所知，有相当多的证据表明肿瘤细胞在恶性进展的最早期从原发性肿瘤块脱落(Kaiser，J.Medicine.Cancer′s circulation problem.Science 327，1072-4(2010)；Bernards，R.&Weinberg，R.A.A progression puzzle.Nature 418，823(2002)；Criscitiello，C.，Sotiriou，C.&Ignatiadis，M.Circulating tumor cells and emergingblood biomarkers in breast cancer.Current Opinion in Oncology 22，552-8(2010))。这些“脱离”的癌细胞作为转移瘤的细胞起源进入血流并输送到身体的不同组织(Pantel，K.&Brakenhoff，R.H.Dissecting themetastatic cascade.Nature Reviews Cancer 4，448-56(2004))。从原发瘤逃脱的细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)(Pantel，K.&Alix-Panabieres，C.Circulating tumour cells in cancerpatients：challenges and perspectives.Trends in Molecular Medicine 16，398-406(2010))。用于确定肿瘤状态的黄金标准是通过对活组织检查样品进行的组织病理学分析。在早期转移或复发中，难以鉴定活组织检查的转移/复发部位。
CTC可被认为是肿瘤的“液体活组织检查”，因此提供对肿瘤细胞的方便获取以及对潜在的致死性转移瘤的较早获取。然而，CTC的检测和表征已经因大量血液细胞(109个细胞/mL)中CTC的极低丰度(几个至几百个/mL)导致了技术上的挑战(Racila，E.，Euhus，D.，Weiss，A.J.，Rao，C，McConnell，J.，Terstappen，L.W.M.M.&Uhr，J.W.Detection andcharacterization of carcinoma cells in the blood.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 95，4589-4594(1998)；Zieglschmid，V.，Hollmann，C.&Bocher，o.Detection ofdisseminated tumor cells in peripheral blood.Critical Reviews in ClinicalLaboratory Sciences 42，155-96(2005))。已经证实发现CTC的数量随治疗期过程的变化是实体瘤患者的治疗结果、无进展存活和总体存活的独立预测因子(Cristofanilli，M.，Budd，G.T.，Ellis，M.J.，Stopeck，A.，Matera，J.，Miller，M.C.，Reuben，J.M.，Doyle，G.V.，Allard，W.J.，Terstappen，L.W.&Hayes，D.F.Circulating tumor cells，disease progression，and survival inmetastatic breast cancer.The New England journal of medicine 351，781-91(2004))。此外，对见于癌症患者中的这些CTC进行分子分析可获得可指导癌症患者之有效治疗的关键基因组、蛋白质组或代谢物组信息。
虽然许多技术可用于固定CTC，但是它们却不能从非特异性捕获的白细胞(WBC)背景分离单个CTC以用于后续分子和功能分析(例如，全基因组测序，RT-PCR)。因此，依然需要改进的装置和方法来从全血和/或其他体液分离稀有细胞，例如CTC。
发明内容
根据本发明之一个实施方案的用于从包含多种细胞类型的流体样品中分离预选细胞类型的系统，其包含细胞捕获流体芯片和芯片保持器(chip holder)，所述保持器配置成用于容纳所述细胞捕获流体芯片并且维持所述细胞捕获流体芯片在运行中基本上流体紧密密封。所述芯片保持器还被配置成释放待从芯片保持器中移出的细胞捕获流体芯片以用于进一步处理。细胞捕获流体芯片包含基底、设置在所述基底上的激光显微切割膜和设置在所述激光显微切割膜(laser micro-dissection membrane)上的通道限定层。所述激光显微切割膜具有相对于多种细胞类型中的其他细胞类型适于优先捕获预选细胞类型的表面。所述通道限定层可从激光显微切割膜移除来进行细胞捕获流体芯片的进一步处理。所述细胞捕获流体芯片具有适于与流体源相连接的输入端口和用于排出经处理流体的输出端口，以使得在运行中流体样品从流体源流出并通过由激光显微切割膜的至少一部分表面之上的通道限定层所限定的流体通道。根据本发明之一个实施方案的用于在运行中维持细胞捕获流体芯片基本上流体紧密密封的芯片保持器，其包含限定凹陷区的基础部件以使所述细胞捕获流体芯片容纳其中；压力部件，其被配置成放置于细胞捕获流体芯片之上；以及夹具组件(clamp assembly)，其被配置成用于将所述基础部件和所述压力部件夹在一起从而在操作期间维持基本上流体紧密密封。所述夹具组件被进一步配置成松开以释放细胞捕获流体芯片从而从芯片保持器中移出。
根据本发明之一个实施方案的用于从包含多种细胞类型的流体样品中捕获预选细胞类型的细胞捕获流体芯片，其包含基底、设置在所述基底上的激光显微切割膜和设置在所述激光显微切割膜上的通道限定层。所述激光显微切割膜具有相对于多种细胞类型中的其他细胞类型适于优先捕获预选细胞类型的表面。所述通道限定层能从激光显微切割膜上移除以用于进一步处理细胞捕获流体芯片，并且所述细胞捕获流体芯片具有适于与流体源相连接的输入端口和用于排出经处理流体的输出端口，以使得在运行中流体样品从流体源流出并通过由激光显微切割膜的至少一部分表面之上的通道限定层所限定的流体通道。
根据本发明之一个实施方案的用于从包含多种细胞类型的流体样品分离预选细胞类型的方法，包括提供细胞捕获流体芯片，所述细胞捕获流体芯片包含基底、设置在所述基底上的激光显微切割膜和设置在所述激光显微切割膜上的通道限定层。所述激光显微切割膜具有相对于多种细胞类型中的其他细胞类型适于优先捕获预选细胞类型的表面。所述方法还包括提供流体样品，使得其流动通过由激光显微切割膜的至少部分表面之上的通道限定层所限定的流体通道以从流体样品中捕获预选细胞类型，在提供流体样品后，从细胞捕获流体芯片的基底和激光显微切割膜上移除通道限定层，以及在移除通道限定层后，在细胞捕获流体芯片的基底和激光显微切割膜上进行激光显微切割以从流体样品中收集捕获的预选细胞类型。
附图说明
在考虑说明书、附图和实施例的情况下，其他目的和优点将变得明显。
图1示出根据本发明的一个实施方案用于从具有多种细胞类型的流体样品分离预选细胞类型的系统。
图2A、图2B和图2C分别示出图1系统的透视图、正视图和俯视图。
图3是根据本发明的一个实施方案的细胞捕获流体芯片的示意图。
图4A是根据本发明的一个实施方案的芯片保持器的图示。
图4B是图4A的芯片保持器的另一个图示，但处于准备好加载细胞捕获流体芯片的配置。
图5A至图5C示出芯片保持器的一些替代实施方案。
图6A至图6G辅助说明了本发明一个实施方案的一个实施例。a)流过Nano Velcro CTC芯片的血液样品。b)所述装置包含覆盖微流体混沌混合器和透明Nano Velcro基底(通过将静电纺丝PLGA纳米纤维沉积在LMD载玻片上制得)。c)SEM图像示出水平压缩的超长PLGA纳米纤维的形态(直径为约100nm)。d)可将具有固定的CTC的透明Nano Velcro基底与激光显微切割或激光捕获激光显微切割仪器相连接用于单个细胞分离。e)具有从采集自转移性癌症患者的1mL血液分离的45个CTC的Nano Velcro CTC芯片。f)固定在透明Nano Velcro基底上的CTC。g)通过使用LMD技术，在分割的基底上分离单个CTC(插图)。
图7为概述以下的示意图：a)用于在嵌入透明Nano Velcro基底中的PLGA纳米纤维上引入链亲和素涂层的共价缀合方法；以及b)用于将抗生物污损的PEG基团引入在Nano Velcro基底上的替代表面改性方法，从而抑制WBC的非特异性捕获并且增强Nano Velcro基底的稳定性以用于长期储存和便利运输。
图8A示出根据本发明的一个实施方案从患黑素瘤患者的血液样品捕获并分离单个CTC和WBC。在PCR扩增后，检测到内含子中BRAFV600E突变和NRAS缺失(NRAS外显子2的3′端37bp；核苷酸CCCT缺失)。此处采用WBC作为对照样品(野生型)。
图8B示出使用分离自胰腺癌患者的CTC的KRAS突变检测数据。在20个CTC中检测出19个CTC有常见的KRASG12V突变，以及在WBS中的野生型KRAS。值得注意的是在单个CTC中获得的BRAFV600E(黑素瘤)和KRASG12V(胰腺癌)突变两者的Sanger测序数据显示出强的信噪比。
图9示出通过NanoVelcro芯片从收集自转移性黑素瘤患者并且在液氮中保藏超过一个月的冷冻保藏PBMC临床样品分离的CTC(红和蓝是阳性)和WBC(绿和蓝是阳性)。从该PBMC样品分离的CTC数目非常接近从新鲜处理的血样观察到的CTC数目。此外，对于荧光免疫染色而言，这些CTC上的表面标志物的形态和荧光强度保持完整。
图10A至图10C分别示出：a)记录使用Arcturus XTTM激光捕获显微切割(LCM)系统分离CTC的过程的显微照片；i)CTC鉴定；ii)确定IR粘性指状位置(sticky finger position)和UV切割途径；iii)UV激光切割；iv)固定在LCM帽上的经分离CTC。b)表示外显子组测序的覆盖范围的Circos图。其中每个点代表在外显子组富集试剂盒捕获的区域中测序的序列区域，环从内向外代表WBC、合并的CTC、CTC-1和CTC-2。最外面的环代表人参考基因组(hg19)的核型，其中红色区域为着丝粒。c)对CTC和WBC之间的共有突变与CTC中的共有突变进行比较。(CTCp＝合并的CTC)。
发明详述
以下对本发明的一些实施方案进行更详细的描述。在所描述的实施方案中，为清楚起见，使用了特定术语。然而，本发明并不旨在受限于所选的特定术语。相关领域的技术人员将认识到可以使用其他等效部件以及不偏离本发明的广泛概念所开发的其他方法。在该说明书中任何地方引用的所有文献，包括背景和发明详述部分，均通过参考并入本文，如同每一篇被单独并入那样。
本发明的一些实施方案提供了用于将CTC细胞固定在嵌入聚合物之微流体装置上的系统和方法。其还可包括使用激光显微切割(LMD)或激光捕获显微切割(LCMD)技术来分离单个CTC以用于例如后续分子分析。这可用于例如医疗医院的患者监测、医药公司的患者的药物效力研究以及学术实验室的研究目的。
图1提供了用于从包含多种细胞类型的流体样品分离预选细胞类型的系统100的图示。图2A至图2C示出系统100的另外的视图。系统100包含细胞捕获流体芯片102(图3)和配置成容纳细胞捕获流体芯片102并在运行中维持细胞捕获流体芯片基本上流体紧密密封的芯片保持器104(另参见图4)。所述芯片保持器104被进一步配置成释放待从芯片保持器104移出的细胞捕获流体芯片102以用于进一步处理。
系统100还具有第二芯片保持器105。然而，本发明的概念并不限制系统所具有的芯片保持器为任意特定数量。根据本发明的多种实施方案可以有一个、两个、三个、四个或更多个芯片保持器。细胞捕获流体芯片102(图3)包含基底106、设置在基底106上的激光显微切割膜108和设置在激光显微切割膜108上的通道限定层110。激光显微切割膜108可以是单层材料或者可以具有两层或更多层。在一些实施方案中，不考虑激光显微切割膜108为一层材料还是多层材料，其表面111相对于多种细胞类型中的其他细胞类型适于优先捕获预选细胞类型。通道限定层110可从激光显微切割膜108移除以进一步处理细胞捕获流体芯片102。
在图3的实施例中，细胞捕获流体芯片102具有玻璃基底106。然而，本发明不仅限于玻璃基底。此外，可根据本发明的一些实施方案来使用具有玻璃基底和激光显微切割膜的常规激光显微切割载玻片。在该情况下，可对上表面(远离基底)进行改性和/或可使一层或更多层材料沉积于其上来为激光显微切割膜108提供期望的表面111。然而，本发明的广泛概念并不限于该实施例。
细胞捕获流体芯片102具有适于与流体源(114、116、118和/或120)相连接的输入端口112和用于排出经处理流体的输出端口122，使得从流体源流流出的流体样品在运行中通过由激光显微切割膜108的至少部分表面111之上的通道限定层110所限定的流体通道124。
在一些实施方案中，所述通道限定层110可以是但不限于PDMS(聚二甲基硅氧烷)层，其具有在其下侧开口的流体通道124从而与激光显微切割膜108的表面111相接触。所述流体通道124可以是(例如)蜿蜒的通道以增加通道的有效长度并且(例如)增大表面111的有效利用。当通道限定层110被芯片保持器104压在一起时形成流体紧密密封，使得来自样品的流体流动通过流体通道124来让样品流体暴露从而与表面111接触。流体通道124可具有导致湍流的结构(也称为混沌混合器)以避免层流。这可有助于增大预选细胞类型与表面111相接触的可能性。在一些实施方案中，通道限定层110可以是厚的PDMS结构，例如约50μm至500nm的厚度。在一些实施方案中，通道限定层110对可见光可以是基本透明的以利于观察和/或测定流体流动通过流体通道124。
激光显微切割膜108具有结构改性或化学改性的至少一种，从而相对于多种细胞类型中的其他细胞类型优先捕获预选的细胞类型。在一些实施方案中，激光显微切割膜108的表面111可包含化学改性以相对于多种细胞类型中的其他细胞类型优先捕获循环癌细胞(CTC)。在一些实施方案中，激光显微切割膜108的表面111可包含聚合物。所述聚合物可以沉积于激光显微切割层上和/或可以是激光显微切割层的一部分。在一些实施方案中，表面111的聚合物可包含以下的至少一种：聚(乳酸-共-乙二醇酸)(PLGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚交酯(PLA)或壳聚糖(聚-(D)葡糖胺)。在一些实施方案中，表面111的聚合物还可包含聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，表面111可以是纳米结构化表面。术语纳米结构旨在包括连接至表面111、沉积于表面111或与表面111整合的结构，例如纳米纤维、纳米线、纳米颗粒、纳米柱(nanopillar)、纳米盘(nanodisk)和其他类似结构。术语纳米结构旨在包括具有至少两个这样的正交维度的结构，所述正交维度在一些实施方案中小于1μm，在一些实施方案中小于500nm，在一些实施方案中小于300nm，在一些实施方案中小于200nm并且等于或远大于约1nm。例如，纳米纤维、纳米线和纳米柱的长度可大于10μm，在一些情况下大于1μm，但是其横截面尺寸为纳米尺度。
在一些实施方案中，表面111可包含沉积于表面上的聚合物纳米纤维。所述聚合物纳米纤维可通过例如静电纺丝(electrospinning)或纳米压印(nanoimprinting)形成为至少部分表面111。然而，本发明的广泛概念并不限于这些实施例。
在一些实施方案中，表面111可包含与例如聚合物涂层连接的至少一种CTC捕获剂。在一些实施方案中，CTC捕获剂可通过例如至少一种生物素或链亲和素缀合与聚合物涂层连接。所述CTC捕获剂可包括但不限于以下的至少一种：EpCAM、CA19-9、CD146或CD147抗体。
在一些实施方案中，表面111可具有化学改性以相对于所述多种细胞类型中的其他细胞类型优先从母体血液中捕获胎儿的有核红细胞(fNRBC)。所述化学改性可包括将至少CD71和CD147抗体连接于表面111上。
在一些实施方案中，可使用系统100来从例如体液和解离的(dissociated)组织分离稀有细胞。当将抗-EpCAM接枝于聚合物基底上时，基底可用于从例如收集自转移性乳腺癌患者的腹水中捕获乳腺癌细胞。当将抗CA19-9接枝于聚合物基底上时，基底可用于从例如解离的胰腺癌组织(包含约10％的癌细胞和90％的基质细胞)中捕获胰腺癌细胞。在一些实施方案中，可将分离的单个胰腺癌细胞用于后续分子和功能分析。当将混合物抗体试剂(例如，抗-CD71和抗-CD147)接枝于聚合物基底上时，基底可用于从例如6至15周妊娠的母体血液中捕获胎儿的有核红细胞(fNRBC)。此外，可将通过LCM技术分离的单个fNRBC用于例如下游分析。然而，本发明的广泛概念并不限于这些实施例。
在一些实施方案中，系统100还可包含适于在细胞捕获流体芯片102被芯片保持器104容纳时与细胞捕获流体芯片102流体连通的流体供应和控制组件122。流体供应和控制组件122可包含流体源例如114、116、118和/或120。在一些实施方案中，流体供应和控制组件122还可包含一个或更多个废物容器，例如废物容器124。还可将芯片保持器104(或取决于所期望平行地使用之数目的多个保持器)与流体供应和控制组件122一起配置成可连接的并可从其移除以便于处理和操作。
在一些实施方案中，流体供应和控制组件122可以为用于从表面111上的血液样品捕获稀有细胞的高效的血液处理装置。然而，也可使用其他流体样品。其还可在一些实施方案中提供多种功能，例如被用于测试芯片保持器104中的泄漏(leak)，精确的加载和运行流体样品并将经固定的细胞固着于激光显微切割膜108的表面111上。流体供应和控制组件122的部件可包括例如两个八阀门的Hamilton PSD/3注射泵，四个顶部加载流体的储罐(114、116、118、120)，用于血液加载的两个1mL的注射管，两个废物容器，外科手术级的阀连接器和塑料管。然而，本发明的广泛概念并不限于该实施例。在一些实施方案中，虽然仅占用小的台面面积(footprint)，但流体供应和控制组件122可具有这样的尺寸，使得其可安装在实验室工作台顶的顶部。流体供应和控制组件122的一些优点可包括稀有细胞分离的自动化并且避免了血液处理的人为失误。
图4A示出芯片保持器104的更详细的视图。其显示细胞捕获流体芯片102被加载并夹持在芯片保持器104内。芯片保持器被特别设计成将通道限定层110均匀压向激光显微切割膜108以确保流体样品通过装置时无泄漏发生。
芯片保持器104具有旋转锁定机械装置(turn-locking mechanism)125，其中压力是逐渐增大的并且不要求使用者施加太大的力，如其他机械装置所需。具有细胞捕获流体芯片102加载于其中的芯片保持器104的入口和出口还被设计成用户友好的。通过转动互补的连接器管将入口和出口(126、128)密封于流体供应和控制组件122。另一些实施方案要求将连接器管(connector tube)戳入装置中。此外，芯片保持器104还可包含对准标记用于将通道限定层110精确放置在激光显微切割膜108之上。芯片保持器104具有滑入机械装置，使得芯片保持器104的顶件(top-piece)130能够沿着底件(bottom-piece)134的轨道(132、133)滑动而能够几乎毫不费力地组装。其还具有向下压在通道限定层100的角上的四个弹簧组件(136、138、140、142)以确保在通道限定层110和激光显微切割膜108之间形成紧密密封。
图4B示出图4A的芯片保持器，但是移除顶部和底部部分，原因是该配置将用于加载细胞捕获流体芯片102。在该实施例中，细胞捕获流体芯片102被称为Nano Velcro芯片。在一些实施方案中，芯片保持器104可具有安全闩以确保一旦芯片保持器102被组装，则其不可被人为操作的意外碰撞拆开。底件134还具有特别设计成用于匹配Nano Velcro基底的凹陷，并且具有较宽的凹陷以使通道限定层110精确对准在Nano Velcro基底之上。顶件使用了旋入机械装置，其从弹簧负载的螺钉(spring-loadedscrew)向通道限定层110缓慢施加相等压力，从而确保与Nano Velcro基底形成紧密的防泄漏密封。此外，顶件130还可具有连接器管，其利用针固定器(need-lock)从而快速地将芯片保持器104与流体供应和控制组件122相连接。
图5A至5C是芯片保持器104的一些替代实施方案(分别为204、304、404)的举例说明。然而，芯片保持器204要求使用者施加显著的力来拧紧螺钉从而确保装置被适当地密封。芯片保持器304的点击(click-on)上锁机械装置的强度不需要与芯片保持器204一样大，但是所述点击机械装置有时可因其突然施加的瞬时压力而损坏激光显微切割膜108和/或基底106。芯片保持器404类似于芯片保持器104，但是不合用于与流体供应和控制组件122相连接的改进的入口和出口(126、128)。
本发明的一些实施方案可包括例如常规激光显微切割部件如红外和/或紫外激光器。
实施例
以下实施例有助于解释本发明的一些概念。然而，本发明的一般性概念不限于特定实施例。
本发明的一些实施方案可提供将CTC固定在聚合物基底上，随后使用激光显微切割仪器(即利用用于切割的高功率嵌入式UV激光器)或激光捕获显微切割(即，利用固态IR激光器以温和地将细胞嵌入凝胶中，其保持了细胞组分的生物分子完整性)或其组合分离单一细胞CTC的能力。目前，不存在可高效地实现CTC的固定和分离两者并且细胞生存力良好的用于后续分子分析的系统和方法。本发明的一些实施方案可使临床医生能够通过例如从癌症患者收集CTC来动态记录肿瘤随治疗过程的进展和/或演变。全面理解和认识肿瘤如何在遗传/转录水平上产生对药物的抗性，可以为设计更好药物来抑制癌增殖提供深入的理解。
将CTC固定于聚合物基底上。通常发现CTC丰度小(部分原因是较差的CTC捕获性能)并且具有较差的样品纯度(原因是WBC的非特定捕获)，这限制了其在分子分析方法中的使用(例如，测序和RT-PCR)。
图6A至图6C示出本发明的一个实施方案的一个实施例。在该实施例中，激光显微切割膜108和基底106将被称为透明Nano Velcro基底。其基于静电纺丝聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物并具有可用于固定CTC的纳米纤维(参见图6B和图6C)。通过使用缀合化学过程(Wang，S.，Wang，H.，Jiao，J.，Chen，K.J.，Owens，G.E.，Kamei，K.，Sun，J.，Sherman，D.J.，Behrenbruch，CP.，Wu，H.&Tseng，H.R.Three-dimensionalnanostructured substrates toward efficient capture of circulating tumor cells.Angewandte Chemie International Edition 48，8970-3(2009)；Sekine，J.，Luo，S.C.，Wang，S.，Zhu，B.，Tseng，H.R.&Yu，H.H.Functionalized conductingpolymer nanodots for enhanced cell capturing：the synergistic effect of captureagents and nanostructures.Advanced Materials 23，4788-92(2011))，可将癌特异性捕获剂引入到透明Nano Velcro基底上用于从全血样中以极好的效率捕获CTC。用于对固定在透明Nano Velcro基底上的细胞进行平行染色的3色ICC方案使得能够从WBC背景(参见图6E和6F)和其他细胞碎片中明确鉴定CTC。
聚合物富集测定。通过使用如在文献(Zhang，N.，Deng，Y.，Tai，Q.，Cheng，B.，Zhao，L.，Shen，Q.，He，R.，Hong，L.，Liu，W.，Guo，S.，Liu，K.，Tseng，H.-R.，Xiong，B.&Zhao，X.-Z.Electrospun TiO2Nanofiber-BasedCell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectaland Gastric Cancer Patients.AdvancedMaterials 24，in press(2012)；Li，D.，Wang，Y.L.&Xia，Y.N.Electrospinning of polymeric and ceramicnanofibers as uniaxially aligned arrays.Nano Letters 3，1167-1171(2003))中所报导的静电纺丝设备将PLGA纳米纤维沉积在LMD膜载玻片上来制备透明Nano Velcro基底。通过制备乙腈的5％PLGA聚合物溶液然后将其放置在用于静电纺丝的不锈钢针内来开始该过程。在静电纺丝沉积期间，经由注射泵来注射PLGA聚合物溶液，并且在针和位于LMD膜载玻片之后的金属基底之间施加高压直流电。通过控制用于沉积PLGA纳米纤维的时间，纳米纤维在LMD膜载玻片上的密度可由此得到控制。通过一系列研究(Sekine，J.，Luo，S.C.，Wang，S.，Zhu，B.，Tseng，H.R.&Yu，H.H.Functionalized conducting polymer nanodots for enhanced cellcapturing：the synergistic effect of capture agents and nanostructures.Advanced Materials 23，4788-92(2011))，我们鉴定出10分钟的沉积时间获得具有适当密度的水平压缩的超长PLGA纳米纤维(Zhang，N.，Deng，Y.，Tai，Q.，Cheng，B.，Zhao，L.，Shen，Q.，He，R.，Hong，L.，Liu，W.，Guo，S.，Liu，K.，Tseng，H.-R.，Xiong，B.&Zhao，X.-Z.Electrospun TiO2Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating TumorCells from Colorectal and Gastric Cancer Patients.AdvancedMaterials 24，出版中(2012))，从而实现最佳CTC捕获性能。在较早期过程之后，将进行表面化学反应(即，将链亲和素直接缀合到PLGA纳米纤维上)(Wang，S.，Wang，H.，Jiao，J.，Chen，K.J.，Owens，G.E.，Kamei，K.，Sun，J.，Sherman，D.J.，Behrenbruch，CP.，Wu，H.&Tseng，H.R.Three-dimensional nanostructured substrates toward efficient capture ofcirculating tumor cells.Angewandte Chemie International Edition 48，8970-3(2009))33(即，参见图7)。
激光显微切割和激光捕获显微切割技术。根据本发明的一个实施方案，我们的激光显微切割技术使用UV激光器来从透明Nano Velcro基底分离特异性鉴定的CTC。在激光切割出包含CTC的区域后，通过重力作用使其落入小体积的管中。因此，该方法提供了用于CTC收集的快速可靠的无接触且无污染方法。激光捕获显微切割技术利用了固态IR激光器以在凝胶帽上温和的捕获单个CTC。因此，该捕获方法是可保护CTC的生物分子完整性的温和方法。最后，激光显微切割和激光捕获显微切割技术是相兼容的方法，这意味着其可在需要时一起使用。
可在S.Hou，Q.Shen，L.Zhao，J.Yu，C.Ng，X.Kong，D.Wu，M.Song，X.Shi，X.Xu，W.-H.OuYang，R.He，X.-Z.Zhao，B.Xiong，T.Lee，C.Brunicardi，M.A.Garcia，A.Ribas，R.S.Lo，H.-R.Tseng(2013)PolymerNanofiber-Embedded Microchips for Detection，Isolation，and MolecularAnalysis of Single Circulating Melanoma Cells.Angew.Chem.Int.编辑52：3379-3383.(内部覆盖显著(Internal Cover Highlight))；和L.Zhao，Y.-T.Lu，F.Li，K.Wu，S.Hou，J.Yu，Q.Shen，D.Wu，M.Song，W.-H.OuYang，Z.Luo，T.Lee，C.Shao，X.Xu，M.A.Garcia，L.W.K.Chung，M.Rettig，H.-R.Tseng，E.M.Posadas(2013)High-Purity ProstateCirculatingTumor Cell Isolation by a Polymer Nanofiber-EmbeddedMicrochip for Whole Exome Sequencing，Adv.Mater.25：出版中(内部覆盖显著)中参见另外的实例和数据，其全部内容通过引用并入本文。
在单个CTC中测序点突变。通过使用透明Nano Velcro基底方法，我们能够从黑素瘤患者中分离出12个单个CTC(无WBC污染)，并且将各个CTC转移至500-μL Eppendorf管中用于接着的分子分析。我们能够在这些CTC上进行PCR和外显子组测序来确认在这些单一CTC中存在BRAFv600E突变和NRAS缺失(图8)。更令人激动的是，已经在同一患者的活组织检查组织中观察到了这些突变。
用于生物库应用的储存循环肿瘤细胞的方法
循环肿瘤细胞(CTC)(Pantel，K.&Alix-Panabieres，C.Circulatingtumour cells in cancer patients：challenges and perspectives.Trends inMolecular Medicine 16，398-406(2010).)。当发生实体瘤转移时最经常导致患者的与癌症相关的死亡。然而癌症转移的分子机制在很大程度上仍不为人所知，有相当多的证据表明肿瘤细胞在恶性发展的最早期从原发性肿瘤块脱落(Kaiser，J.Medicine.Cancer′s circulation problem.Science 327，1072-4(2010)；Bernards，R.&Weinberg，R.A.A progression puzzle.Nature 418，823(2002)；Criscitiello，C，Sotiriou，C.&Ignatiadis，M.Circulating tumor cells andemerging blood biomarkers in breast cancer.Current Opinion in Oncology 22，552-8(2010))。这些“脱离”的癌细胞作为转移瘤的细胞起源进入血流并输送到身体的不同组织(Pantel，K.&Brakenhoff，R.H.Dissecting themetastatic cascade.Nature Reviews Cancer 4，448-56(2004))。从原发瘤逃脱的细胞被称为CTC。用于确定肿瘤状态的黄金标准是通过对活组织检查样品进行的组织病理学分析。在转移或复发的早期阶段中，难以鉴定活组织检查的转移/复发部位。
CTC可被认为是肿瘤的“液体活组织检查”，因此提供对肿瘤细胞的方便获取以及对潜在的致死性转移瘤的较早获取。然而，CTC的检测和表征已经因大量血液细胞(109个细胞/mL)中CTC的极低丰度(几个至几百个/mL)导致了技术上的挑战(Racila，E.，Euhus，D.，Weiss，A.J.，Rao，C，McConnell，J.，Terstappen，L.W.M.M.&Uhr，J.W.Detection andcharacterization of carcinoma cells in the blood.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 95，4589-4594(1998)；Zieglschmid，V.，Hollmann，C.&Bocher，O.Detection ofdisseminated tumor cells in peripheral blood.Critical Reviews in ClinicalLaboratory Sciences 42，155-96(2005))。已经证实发现CTC的数量随治疗期过程的变化是实体瘤患者的治疗结果、无进展存活和总体存活的独立预测因子(Tan，S.J.，Yobas，L.，Lee，G.Y.，Ong，C.N.&Lim，C.T.Microdevicefor the isolation and enumeration of cancer cells from blood.BiomedicalMicrodevices 11，883-92(2009))。此外，对见于癌症患者中的这些CTC进行分子分析可获得可指导癌症患者之有效治疗的关键基因组、蛋白质组或代谢物组信息。可从外周血液获得CTC构成了方便且最低程度侵入的方法来记录癌症进展的不同阶段，这可有助于更好地了解疾病发展并促进新治疗方法的开发。如果可在CTC库(bank)中收集并保藏CTC，则其可使得研究者能够回溯分析处于疾病不同进化阶段的CTC。
已经建立了许多组织储藏(banking)的方法，但是不存在针对CTC的这样的方案和概念。
本发明的一个实施方案保存了循环肿瘤细胞(CTC)并且侵入性最小，因为其仅需要从癌症患者中抽取血液。CTC的获取可提供肿瘤块之状态的窗口而不需要进行活组织检查。因此有可能通过在治疗过程内从癌症患者收集的这些CTC来动态记录肿瘤进展和/或演变。理想地，全面理解和认识肿瘤如何在遗传和/或转录水平上产生对药物的抗性，可以为设计更好的药物来抑制癌增殖提供深入理解。
CTC存在于收集自癌症患者的血液样品中。储藏CTC最直接的方法是储藏全血。然而，当经酸性-柠檬酸盐-葡萄糖(ACD)、柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖(CPD)或柠檬酸盐-磷酸盐-二葡萄糖(CP2D)处理时，在1℃至6℃，常规的血液储存限于21天。当经柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺嘌呤(CPDA1)处理时，其可延长至35天(WBC为5周，RBC为6周)，并且还包括冷藏。此外，要关注的是WBC可攻击CTC，其导致CTC的短寿命。全血的长期储存相对不常见，而且需要可干扰CTC在这些血液中的生存力的添加剂和溶剂。
储藏CTC，根据本发明的一个实施方案移除血清和RBC并收集外周血单核细胞(PBMC)以用于深低温保藏。目前，我们已经制定了用于深低温保藏CTC的三种不同方案。
Ficoll Paque方法：
1.用缓冲剂将全血稀释为2倍体积。
2.在50ml圆锥管中15mL的Ficoll-Paque上小心地使经稀释的细胞悬液分层。
3.在室温下，以400×g离心30至40分钟。
4.吸出上层，使中间相的单核细胞层不被破坏。
5.小心地将单核细胞层转移至新的圆锥管中。
6.用缓冲液填充圆锥管，混合，并且在室温下以300×g离心10分钟。移除上清液。
7.最后，将细胞重悬在培养基和10％DMSO的混合物中并放置在液氮中。
Buffy Coat方法：
1.用缓冲剂将全血稀释为2倍体积。
2.在50ml圆锥管中的小体积高密度溶液(即，蔗糖、氯化铯)之上小心地使经稀释悬液分层。
3.在室温下以200×g对经稀释的全血样品进行10分钟的旋转。
4.移除经浓缩的白细胞带。
5.小心地将单核细胞层转移至新的圆锥管中。
6.用缓冲液填充圆锥管，混合，并且在室温下以300×g离心10分钟。移除上清液。
7.最后，将细胞重悬在培养基和10％DMSO的混合物中并放置在液氮中。红细胞裂解
1.用1倍体积的红细胞裂解缓冲剂稀释全血。
2.在室温下以300×g对全血溶液进行10分钟旋转。移除上清液。
3.用缓冲液重悬细胞，混合，并且在室温下以300×g离心10分钟。移除上清液。
4.最后，将细胞重悬在培养基和10％DMSO的混合物中并放置在液氮中。
在深低温保藏后CTC完整性保持不变。在上述方案下保藏的PBMC样品可经历使用CTC富集技术(例如，Nano Velcro芯片，参见H.-R.Tseng，S.Wang，H.Wang，K.Liu(2010)Microfluidic Lab-on-a-Chip Device forCapturing Circulating Tumor Cells，and Use for Diagnosis of MetastaticCancer.PCT Int.Appl.WO 2010108003，其全部内容通过引用并入本文)或通过以上方法的CTC富集方法。
在该说明书中说明和讨论的一些实施方案仅旨在教导本领域的技术人员如何进行并使用本发明。在所描述的本发明的一些实施方案中，为了清楚起见而采用了特定术语。然而，本发明并不旨在受限于所选的特定术语。如本领域技术人员按照上述教导所理解，可修改或改变本发明的上述实施方案而不偏离本发明。因此应理解除了特定描述之外，可在权利要求和其等同方案的范围内实施本发明。

Claims (38)

1.用于从包含多种细胞类型的流体样品中分离预选细胞类型的系统，所述系统包含：
细胞捕获流体芯片；以及
芯片保持器，其配置成用于容纳所述细胞捕获流体芯片并且用于维持所述细胞捕获流体芯片在运行中基本上流体紧密密封，
其中所述芯片保持器还配置成释放待从所述芯片保持器中移出的细胞捕获流体芯片以用于进一步处理，
其中所述细胞捕获流体芯片保持器包含：
基底，
设置在所述基底上的激光显微切割膜，以及
设置在所述激光显微切割膜上的通道限定层，
其中所述激光显微切割膜具有相对于所述多种细胞类型中的其他细胞类型适于优先捕获预选细胞类型的表面，
其中所述通道限定层能从所述激光显微切割膜上移除以进一步处理所述细胞捕获流体芯片，并且
其中所述细胞捕获流体芯片具有适于与流体源相连接的输入端口和用于排出经处理流体的输出端口，以使得在运行中所述流体样品从所述流体源流出并通过由所述激光显微切割膜的至少一部分所述表面之上的所述通道限定层所限定的流体通道。
2.根据权利要求1所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述通道限定层限定所述流体通道，以使得所述流体通道的至少一部分具有混沌混合结构以导致至少部分地湍流。
3.根据权利要求1所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述激光显微切割膜的所述表面具有结构改性或化学改性中的至少一种从而相对于所述多种细胞类型中的其他细胞类型优先捕获预选细胞类型。
4.根据权利要求3所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述激光显微切割膜的所述表面包含化学改性以相对于所述多种细胞类型中的其他细胞类型优先捕获循环癌细胞(CTC)。
5.根据权利要求4所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述激光显微切割膜的所述表面包含聚合物。
6.根据权利要求5所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述激光显微切割膜的所述表面的所述聚合物包含以下的至少一种：聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚已酸内酯(PCL)、聚交酯(PLA)或壳聚糖(聚-(D)葡糖胺)。
7.根据权利要求6所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述聚合物还包含聚乙二醇(PEG)。
8.根据权利要求5所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述聚合物至少部分地形成纳米纤维。
9.根据权利要求6所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述聚合物至少部分地形成纳米纤维。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述聚合物包含通过生物素或链亲和素缀合中的至少一种与其连接的CTC捕获剂。
11.根据权利要求10所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述CTC捕获剂包含以下的至少一种：EpCAM、CA19-9、CD146或CD147抗体。
12.根据权利要求3所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述激光显微切割膜的所述表面包含化学改性以相对于所述多种细胞类型中的其他细胞类型而优先从母体血液中捕获胎儿的有核红细胞(fNRBC)。
13.根据权利要求12所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述化学改性包括将至少CD71和CD147抗体与所述激光显微切割膜的所述表面连接。
14.根据权利要求1所述的用于分离预选细胞类型的系统，其还包含适于在所述细胞捕获流体芯片被所述芯片保持器容纳时与所述细胞捕获流体芯片流体连通的流体供应和控制组件。
15.根据权利要求14所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述流体供应和控制组件与所述芯片保持器相互配置，使得所述芯片保持器在所述细胞捕获流体芯片容纳于其中时可与所述流体供应和控制组件相连接并可从所述流体供应和控制组件移除。
16.根据权利要求1所述的用于分离预选细胞类型的系统，其还包含激光器，其波长和功率使得将所述激光显微切割膜在其选定的部分切割从而移出所述激光显微切割膜的选定部分以用于进一步处理。
17.根据权利要求16所述的用于分离预选细胞类型的系统，其中所述激光器是紫外激光器。
18.根据权利要求17所述的用于分离预选细胞类型的系统，其还包含红外激光器和红外敏感附着元件，
其中所述红外敏感粘附元件适于布置成最靠近所述激光显微切割膜的激光切割部分，使得所述红外敏感附着元件附着于其上以利于移出所述激光切割部分。
19.用于维持细胞捕获流体芯片在运行中基本上流体紧密密封的保持器，其包含：
基础部件，其限定了凹陷区使所述细胞捕获流体芯片容纳于其中；
压力部件，其被配置成放置在所述细胞捕获流体芯片上；以及
夹具组件，其被配置成将所述基础部件和所述压力部件夹在一起从而在操作期间维持基本上流体紧密密封，
其中所述夹具组件被进一步配置成松开以释放所述细胞捕获流体芯片从而从所述芯片保持器中移出。
20.根据权利要求19所述的芯片保持器，其中所述基础部件适于选择性地与流体供应和控制组件相连接和从其移除。
21.根据权利要求20所述的芯片保持器，其还包含配置成让使用者逐渐加压的旋转锁定组件。
22.根据权利要求21所述的芯片保持器，其还包含布置成跨越所述细胞捕获流体芯片而均衡施力的多个弹簧。
23.用于从包含多种细胞类型的流体样品中捕获预选细胞类型的细胞捕获流体芯片，所述细胞捕获流体芯片包含：
基底；
设置在所述基底上的激光显微切割膜；以及
设置在所述激光显微切割膜上的通道限定层，
其中所述激光显微切割膜具有相对于所述多种细胞类型中的其他细胞类型适于优先捕获预选细胞类型的表面，
其中所述通道限定层能从所述激光显微切割膜移除以进一步处理所述细胞捕获流体芯片，并且
其中所述细胞捕获流体芯片具有适于与流体源相连接的输入端口和用于排出经处理流体的输出端口，以使得在运行中所述流体样品从所述流体源流出并通过由所述激光显微切割膜的至少一部分所述表面之上的所述通道限定层所限定的流体通道。
24.根据权利要求23所述的细胞捕获流体芯片，其中所述通道限定层限定所述流体通道，以使得所述流体通道的至少一部分具有混沌混合结构以导致至少部分地湍流。
25.根据权利要求23所述的细胞捕获流体芯片，其中所述激光显微切割膜的所述表面具有结构改性或化学改性中的至少一种从而相对于所述多种细胞类型中的其他细胞类型优先捕获预选细胞类型。
26.根据权利要求25所述的细胞捕获流体芯片，其中所述激光显微切割膜的所述表面包含化学改性以相对于所述多种细胞类型中的其他细胞类型优先捕获循环癌细胞(CTC)。
27.根据权利要求26所述的细胞捕获流体芯片，其中所述激光显微切割膜的所述表面包含聚合物。
28.根据权利要求27所述的细胞捕获流体芯片，其中所述激光显微切割膜的所述表面的所述聚合物包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚已酸内酯(PCL)、聚交酯(PLA)或壳聚糖(聚-(D)葡糖胺)中的至少一种。
29.根据权利要求28所述的细胞捕获流体芯片，其中所述聚合物还包含聚乙二醇(PEG)。
30.根据权利要求27所述的细胞捕获流体芯片，其中所述聚合物至少部分地形成纳米纤维。
31.根据权利要求28所述的细胞捕获流体芯片，其中所述聚合物至少部分地形成纳米纤维。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的细胞捕获流体芯片，其中所述聚合物包含通过生物素或链亲和素缀合中的至少一种与其连接的CTC捕获剂。
33.根据权利要求32所述的细胞捕获流体芯片，其中所述CTC捕获剂包含以下的至少一种：EpCAM、CA19-9、CD146或CD147抗体。
34.根据权利要求25所述的细胞捕获流体芯片，其中所述激光显微切割膜的所述表面包含化学改性以相对于所述多种细胞类型中的其他细胞类型优先从母体血液中捕获胎儿的有核红细胞(fNRBC)。
35.根据权利要求34所述的细胞捕获流体芯片，其中所述化学改性包括将至少CD71和CD147抗体与所述激光显微切割膜的所述表面连接。
36.用于从包含多种细胞类型的流体样品中分离预选细胞类型的方法，其包括：
提供细胞捕获流体芯片，所述细胞捕获流体芯片包含：
基底，
设置在所述基底上的激光显微切割膜，以及
设置在所述激光显微切割膜上的通道限定层，
其中所述激光显微切割膜具有相对于所述多种细胞类型中的其他细胞类型适于优先捕获预选细胞类型的表面；
提供所述流体样品以使得其流动通过由所述激光显微切割膜的至少部分所述表面之上的所述通道限定层限定的流体通道，从而从所述流体样品中捕获预选细胞类型；
在所述提供所述流体样品后，从所述细胞捕获流体芯片的所述基底和所述激光显微切割膜上移除所述通道限定层；以及
在所述移除所述通道限定层后，在所述细胞捕获流体芯片的所述基底和所述激光显微切割膜上进行激光显微切割以收集从所述流体样品捕获的预选细胞类型。
37.根据权利要求36所述的分离预选细胞类型的方法，其中所述进行激光显微切割包括将紫外激光器定向到所述激光显微切割膜上，从而选择性地切掉所述激光显微切割膜中具有与其连接的预选细胞类型的部分。
38.根据权利要求36所述的分离预选细胞类型的方法，其中所述从所述激光显微切割膜和所述基底中移除所述通道限定层包括从流体密封的芯片保持器移出所述细胞捕获流体芯片。
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