TWI614336B - 細胞晶片及細胞動態透析染色法 - Google Patents

細胞晶片及細胞動態透析染色法 Download PDF

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Abstract

細胞晶片包括第一與第二基板及位於兩者之間的染劑擴散層。染劑擴散層的細胞自組裝區對應第一基板的第一孔洞且與其之間具有間距。細胞自組裝區包括第二孔洞且用以容置含細胞之樣本液。第二孔洞孔徑小於細胞之粒徑，細胞單層排列於細胞自組裝區，而樣本液之液體經由第二孔洞進入第二基板的微流道結構。當染劑經由第一孔洞進入細胞自組裝區時，染劑與微流道結構中的洗滌液之間的濃度差使得染劑由細胞自組裝區朝向微流道結構擴散，藉此細胞被染劑染色，且洗滌液將經由第二孔洞進出，以加速染劑之擴散，因而達成高效率細胞動態透析染色。

Description

細胞晶片及細胞動態透析染色法
本發明是有關於一種晶片，且特別是有關於一種細胞晶片。
特定細胞的觀察與培養，乃是生物醫學研究(bio-medical research)中，最基礎且最重要的部分。現有觀察細胞的方式，多是以顯微鏡(microscopy)為主，包括：光學顯微鏡(optical microscopy)的使用以及螢光顯微鏡(fluorescence microscopy)的應用。然而，大量且高密度的細胞，容易因為互相堆疊而形成多層排列(multiple layer arrangement)，多層排列的堆積則會造成訊號遮蔽(signal shadowing)而產生錯誤的判斷(wrong determination)，造成檢測失誤。因此，為了避免檢測上的失誤，必須讓細胞以陣列式單層排列。
舉例來說，在微量細胞的檢測上，循環癌細胞(circulating tumor cells, CTCs)的多寡與癌症病人的存活率和病情有正相關，因此偵測和計數循環癌細胞是對於癌症治療相當重要的。然而，目前所使用的檢測晶片存在細胞易堆疊及細胞染色步驟繁複而造成細胞流失與死亡的缺點。故，本領域亟需一種能同時使細胞單層排列且提高染色細胞效率的細胞晶片。
本發明提供一種細胞晶片，使細胞自組裝單層排列且快速染色細胞。
本發明另提供一種細胞動態透析染色法，以快速染色細胞。
本發明的細胞晶片包括第一基板、第二基板以及染劑擴散層。第一基板具有至少一第一孔洞。第二基板具有微流道結構。染劑擴散層位於第一基板與第二基板之間，且具有細胞自組裝區。細胞自組裝區對應於至少一第一孔洞且與第一基板之間具有間距，且細胞自組裝區包括多個第二孔洞。細胞自組裝區用以容置含多個細胞之樣本液，各第二孔洞的孔徑小於各細胞之粒徑，樣本液內之細胞單層排列於細胞自組裝區，而樣本液之液體經由第二孔洞進入微流道結構。當染劑經由第一孔洞進入細胞自組裝區時，由於染劑與流動於微流道結構中的洗滌液之間具有濃度差，使得染劑由細胞自組裝區朝向微流道結構進行擴散作用，藉此細胞被染劑染色，且洗滌液將經由染劑擴散層之第二孔洞進出，以加速染劑之擴散，因而達成高效率的動態透析染色。
本發明的細胞動態透析染色法包括以下步驟。提供上述的細胞晶片。將含多個細胞之樣本液經由第一孔洞滴入細胞晶片的細胞自組裝區中。將染劑經由第一孔洞滴入細胞晶片的細胞自組裝區中，以與細胞接觸，其中於滴入染劑的同時，使洗滌液流動於細胞晶片的微流道結構中，由於染劑與流動於微流道結構中的洗滌液之間具有濃度差，使得染劑由細胞自組裝區朝向微流道結構進行擴散作用，藉此細胞被染劑染色，且洗滌液將經由染劑擴散層之第二孔洞進出，以加速螢光染劑之擴散，因而達成高效率的動態透析染色。
在本發明的一實施例中，上述的染劑擴散層的材料為聚二甲基矽氧烷（PDMS）。
在本發明的一實施例中，上述的第二孔洞係陣列排列。
在本發明的一實施例中，上述的細胞自組裝區與第一基板之間的間距小於細胞的粒徑。
在本發明的一實施例中，上述的微流道結構包括洗滌液注入口、洗滌液排出口以及位於洗滌液注入口與洗滌液排出口之間的微流道。
在本發明的一實施例中，上述的第一基板更包括洗滌液注入口與洗滌液排出口，分別與微流道結構的洗滌液注入口與洗滌液排出口連通。
在本發明的一實施例中，更包括至少二個固定元件，用以夾持固定第一基板、染劑擴散層以及第二基板。
在本發明的一實施例中，上述的第二基板包括第三基板與第四基板，第四基板位於第三基板與染劑擴散層之間，第三基板為透光基板，以及第四基板具有暴露出第三基板的微流道開口圖案。
在本發明的一實施例中，上述的第一基板更包括至少一蒸散孔。
在本發明的一實施例中，上述的使洗滌液流動於細胞晶片的微流道結構中的方法包括藉由注射幫浦使洗滌液持續注入微流道結構與自微流道結構排出。
在本發明的一實施例中，上述的將含多個細胞之樣本液經由第一孔洞滴入細胞晶片的細胞自組裝區中之後，更包括經由細胞晶片的第一基板的至少一蒸散孔將樣本液之液體抽出，使得細胞隨著流體被側向抽出之拉力而以單層的形式舖平於細胞自組裝區。
基於上述，本發明藉由結合具有孔洞的染劑擴散層以及微流道結構，使得細胞晶片同時具有細胞自組裝排列與細胞染色的功能。再者，由於藉由擴散作用與動態透析方式來達到細胞染色，相較於現行離心機所運用的高速旋轉之密度梯度離心法原理，本發明不僅較為溫和，能保持細胞高度活性，使檢測的細胞可用於後續培養，且能大幅縮短細胞染色時間，以達到高效率動態細胞染色。此外，在進行細胞染色之前，細胞已單層陣列排列於染劑擴散層上，故能排除細胞堆疊的現象，使得影像判讀更加準確。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
為了讓本發明之上述及其他目的、特徵、優點能更明顯易懂，下文將特舉本發明較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下。再者，本發明所提到的方向用語，例如「上」、「下」、「前」、「後」、「左」、「右」、「內」、「外」或「側面」等，僅是參考附加圖式的方向。因此，使用的方向用語是用以說明及理解本發明，而非用以限制本發明。
圖1A是依照本發明的實施例的一種細胞晶片的示意圖，以及圖1B是圖1A的細胞晶片的爆炸示意圖。請同時參照圖1A與圖1B，細胞晶片10包括第一基板100、染劑擴散層200以及第二基板300。
第一基板100具有至少一第一孔洞102，用以作為樣本液的注入口。在本實施例中，樣本液例如是包含適當數目細胞的細胞懸浮液。第一基板100例如是更包括至少一蒸散孔104。在本實施例中，是以第一基板100包括多個蒸散孔104為例，且蒸散孔104例如是扁豆狀，其環狀排列於第一孔洞102周圍，但本發明不以此為限。第一孔洞102的孔徑例如是3mm至6mm。在本實施例中，第一基板100可更包括洗滌液注入口106與洗滌液排出口108，分別位於第一孔洞102的相對兩側，諸如位於第一基板100的相對兩端。洗滌液注入口106與洗滌液排出口108例如與注射幫浦（syringe pump）連接。在本實施例中，第一基板100可更包括至少一對固定件容置孔110，位於第一基板100的相對兩端，且彼此對稱設置。在本實施例中，是以第一基板100具有四個固定件容置孔110為例，但本發明不以此為限。第一基板100之材料可為塑料，諸如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。在一實施例中，第一基板100之上表面及第一孔洞102之一內壁面較佳係具有一抗沾黏修飾層(未繪示)，例如1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl trichlorosilane,FOTS)，用以避免樣本液的溢出或樣本液中細胞沾附在第一基板100上所造成之細胞的損失。特別注意的是，本發明未對第一孔洞102、蒸散孔104以及固定件容置孔110的數目、形狀以及配置方式等加以限制。
染劑擴散層200位於第一基板100與第二基板300之間。染劑擴散層200具有細胞自組裝區210，細胞自組裝區210對應於第一孔洞102設置且與第一基板100之間具有間距h。間距h例如是小於細胞的粒徑（或多個細胞的平均粒徑）。在本實施例中，間距h例如是小於或等於5μm。具體而言，染劑擴散層200具有凹槽202，凹槽202對應於細胞自組裝區210。細胞自組裝區210包括多個第二孔洞204。第二孔洞204例如是陣列排列。在本實施例中，第二孔洞204的孔徑d小於細胞的粒徑（或多個細胞的平均粒徑），例如是小於或等於7 μm。第二孔洞204之間的間距s例如是大於第二孔洞204的孔徑d。第二孔洞204之間的間距s例如是介於10μm至30μm之間，諸如20 μm。在本實施例中，是以染劑擴散層200為圓形為例，但本發明不以此為限。在本實施例中，染劑擴散層200的面積例如是等於或大於第一孔洞102的面積。染劑擴散層200之材料可為具有高透光度與高生物相容性高的材料，諸如聚二甲基矽氧烷（PDMS）。染劑擴散層200的厚度介於30μm至50μm之間，諸如40μm。
在本實施例中，染劑擴散層200的尺寸例如是大於或等於第一基板100，因此染劑擴散層200可更包括洗滌液注入口212、洗滌液排出口214以及固定件容置孔220，分別對應設置於第一基板100的洗滌液注入口106、洗滌液排出口108以及固定件容置孔110。在另一實施例中，當染劑擴散層200的尺寸小於第一基板100，可省略洗滌液注入口212、洗滌液排出口214以及固定件容置孔220的配置。換言之，藉由固夾第一基板100與第二基板300，染劑擴散層200可直接架在第二基板300上且固夾於第一基板100與第二基板300之間。
在本實施例中，染劑擴散層200的形成方法例如是包括以下步驟。首先，提供基板（未繪示），並以黃光微影製程於基板上形成作為母模的柱狀陣列結構（未繪示）。基板例如是矽晶圓。柱狀陣列結構的材料例如是負光阻，諸如SU-8。接著，將染劑擴散材料注入基板表面並填入柱狀陣列結構之間的間隙中，於固化染劑擴散材料之後，翻模以得到具有多個第二孔洞的染劑擴散層200。而後，使染劑擴散層200與基板及母模剝離。在本實施例中，染劑擴散材料例如是聚二甲基矽氧烷。染劑擴散材料的固化方法例如是加熱法。
第二基板300具有微流道結構320。在本實施例中，第二基板300例如是包括第三基板310與第四基板312，第四基板312位於第三基板310與染劑擴散層200之間。第四基板312例如是包括貫穿第四基板312的微流道開口圖案，藉由下方的第三基板310作為底板以形成有容置空間的微流道結構320。也就是說，當第四基板312疊合於第三基板310上，第四基板312的微流道開口圖案會暴露出第三基板310，而藉由組合第三基板310與第四基板312，以形成具有容置空間的微流道結構320。在本實施例中，微流道結構320例如包括洗滌液注入口322、洗滌液排出口324以及位於洗滌液注入口322與洗滌液排出口324之間的微流道326。洗滌液注入口322與洗滌液排出口324例如是分別與洗滌液注入口106與洗滌液排出口108連通。微流道326具有對應於染劑擴散層200的區域。具體而言，微流道326的該區域例如是大於或等於細胞自組裝區210且彼此重合。在本實施例中，微流道326的該區域例如是大於或等於第一基板100中的第一孔洞102。
在本實施例中，第四基板312例如是更包括至少一對固定件容置孔330，與第一基板100的固定件容置孔110對應設置。在本實施例中，是以第四基板312具有四個固定件容置孔330為例，但本發明不以此為限。第三基板310為利於進行光學觀測的高透光性基板，諸如玻璃基板。第四基板312之材料可為塑料，諸如聚甲基丙烯酸甲酯。在本實施例中，第三基板310與第四基板312例如是藉由諸如AB膠等黏著層貼合。在另一實施例中，可以直接在高透光基板中形成作為微流道結構的凹槽（此凹槽不會穿透基板），如此可省略第三基板與第四基板中一者。
在本實施例中，第一基板100與第四基板312具有適當厚度，第一基板100之厚度為做為樣本液的置入區，以提供足夠的體積進行動態透析擴散所需液體，第四基板則作為動態透析等層液體流經之通道，且厚度不能太厚以利光學系統焦距檢測，同時第一基板100與第四基板材質為高透光性，有利於光學系統的觀測，例如光學顯微鏡或螢光顯微鏡。在本實施例中，第一基板100厚度例如是大於第四基板312的厚度。其中，第一基板100之厚度例如為4~6公釐(mm)之間。第四基板312之厚度例如為1~4公釐之間。
在本實施例中，細胞晶片10例如是更包括至少二個固定元件400，以夾持固定第一基板100與第二基板300，以將染劑擴散層200夾於第一基板100與第二基板300之間，且精準控制第一基板100與染劑擴散層200之間距h。如此一來，完成細胞晶片10的組裝。固定元件400可以是螺絲等元件，但本發明不以此為限。在組裝第一基板100、染劑擴散層200以及第二基板300之後，染劑擴散層200會懸置在微流道結構320上方。
圖2A與圖2B是依照本發明的實施例的一種細胞晶片的使用方法之流程示意圖。請參照圖2A，首先，提供細胞晶片10。在本實施例中，在提供細胞晶片10之後，更包括建立微流道系統。也就是說，於第二基板300的微流道結構320中注入洗滌液12，使洗滌液12持續流動於細胞晶片10的微流道結構320中。洗滌液12例如為磷酸緩衝鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）等無色緩衝溶液。在本實施例中，可藉由諸如注射幫浦（未繪示）等裝置使洗滌液12持續地由洗滌液注入口106注入微流道結構320，並由洗滌液排出口108自微流道結構320排出。
然後，將含多個細胞40之樣本液30經由第一孔洞102滴入細胞晶片10的細胞自組裝區210中。舉例來說，以滴管(dropper)20或微量吸管(pipetman)取樣本液30，例如細胞懸浮液，經由第一孔洞102將樣本液30加入細胞晶片10中。藉由液體及細胞40本身之重力，樣本液30之細胞40沉降於染劑擴散層200之細胞自組裝區210。在本實施例中，例如藉由液體由蒸散孔104蒸散的側向拉力作用，使得細胞40單層舖平於染劑擴散層200的細胞自組裝區210上，而懸浮液之液體部分則經由第二孔洞204進入微流道結構320中。在一實施例中，更包括直接由蒸散孔104將樣本液30之液體抽出，以增加側向拉力，進而加速細胞40以單層的形式舖平於細胞自組裝區210。如此一來，樣本液30中的細胞40以自組裝方式陣列排列於細胞自組裝區210，以完成高密度細胞陣列的自組裝。此外，值得一提的是，由於將第二孔洞204的孔徑d設計成小於細胞40之粒徑，因此染劑擴散層200可以阻擋細胞自第二孔洞204流出，以免造成細胞數量的損失並且可使液體染劑經由此染劑擴散層之通道進行擴散。
請參照圖2B，然後，將染劑50經由第一孔洞102滴入細胞晶片10的細胞自組裝區210中，以與細胞40接觸，其中於滴入染劑50的同時，使洗滌液12流動於細胞晶片10的微流道結構320中。舉例來說，以滴管20或微量吸管取染劑50，例如免液螢光染劑，經由第一孔洞102將染劑50加入細胞晶片10中，使得染劑50流經細胞自組裝區210而與細胞40接觸以染色細胞40。由於染劑50與流動於微流道結構320中的洗滌液12之間具有濃度差，使得染劑50由細胞自組裝區210朝向微流道結構320進行擴散作用，因而使細胞40被染劑50染色。前述的濃度差除了指剛滴入細胞自組裝區210的染劑與微流道結構320中的洗滌液12之間的濃度差以外，亦包括已滴入細胞自組裝區210的染劑與已進入微流道結構320中而被洗滌液12稀釋的染劑之間的濃度差。此外，在本實施例中，進入微流道結構320中的洗滌液12會持續地進出染劑擴散層200的第二孔洞204，以加速染劑之擴散，因而達成動態透析染色。
藉由染劑進行擴散作用並且由微流道內持續通入之洗滌液的動態透析染色方式，能大幅加速細胞的染色速度，諸如縮短傳統染色的一半時間，以完成高效率的細胞染色。在本實施例中，是以在滴入染劑50之前就使洗滌液12持續流動於細胞晶片10的微流道結構320中為例，但本發明不以此為限。在其他實施例中，也可以在滴入染劑50的同時或之後才使洗滌液12持續流動於細胞晶片10的微流道結構320中。特別一提的是，若是要對樣本液進行特定的檢測或實驗，則必須在使用細胞晶片10前，預先對該樣本液進行預處理，以避免額外處理的過程中，造成細胞自組裝陣列的破壞。再者，為了避免外來物質影響細胞染色，可於細胞晶片10上覆蓋上蓋（未繪示），以遮蔽第一孔洞102。
隨後，當對細胞40進行染色一段適當時間後，將細胞晶片10置於光學顯微鏡或螢光顯微鏡下，以進行觀測。由於細胞40在被染色前是以單層形式陣列排列於細胞自組裝區210，因此在顯微鏡觀察下，能排除細胞堆疊的現象，使得影像判讀更為準確。
綜上所述，本發明的細胞晶片結合細胞自組裝陣列晶片與染色晶片，且使用染劑擴散層作為承載細胞與染劑的平台。在細胞動態透析染色法中，由於藉由擴散作用與動態透析方式來達到高效率細胞染色，因此能減少傳統染色中的細胞流失以及細胞死亡的缺點，而具有大幅縮短細胞染色時間且保持細胞活性的優點。此外，由於細胞能先在染劑擴散層表面上排列成單層，再進行染色，因此在螢光影像判讀上可以排除細胞堆疊的現象，使得影像判讀更為準確，並使檢測更加便利與快速。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
10‧‧‧細胞晶片
12‧‧‧洗滌液
20‧‧‧滴管
30‧‧‧樣本液
40‧‧‧細胞
50‧‧‧染劑
100‧‧‧第一基板
102‧‧‧第一孔洞
104‧‧‧蒸散孔
106、212、322‧‧‧洗滌液注入口
108、214、324‧‧‧洗滌液排出口
110、220、330‧‧‧固定件容置孔
200‧‧‧染劑擴散層
202‧‧‧凹槽
204‧‧‧第二孔洞
210‧‧‧細胞自組裝區
300‧‧‧第二基板
310‧‧‧第三基板
312‧‧‧第四基板
320‧‧‧微流道結構
326‧‧‧微流道
400‧‧‧固定元件
d‧‧‧孔徑
h、s‧‧‧間距
圖1A是依照本發明的實施例的一種細胞晶片的示意圖，以及圖1B是圖1A的細胞晶片的爆炸示意圖。 圖2A與圖2B是依照本發明的實施例的一種細胞晶片的使用方法之流程示意圖。
10‧‧‧細胞晶片
100‧‧‧第一基板
102‧‧‧第一孔洞
104‧‧‧蒸散孔
106、212、322‧‧‧洗滌液注入口
108、214、324‧‧‧洗滌液排出口
110、220、330‧‧‧固定件容置孔
200‧‧‧染劑擴散層
202‧‧‧凹槽
204‧‧‧第二孔洞
210‧‧‧細胞自組裝區
300‧‧‧第二基板
310‧‧‧第三基板
312‧‧‧第四基板
320‧‧‧微流道結構
400‧‧‧固定元件
d‧‧‧孔徑
h、s‧‧‧間距

Claims (12)

  1. 一種細胞晶片，包括： 一第一基板，具有至少一第一孔洞； 一第二基板，具有一微流道結構；以及 一染劑擴散層，位於該第一基板與該第二基板之間，具有一細胞自組裝區，該細胞自組裝區對應於該至少一第一孔洞且與該第一基板之間具有一間距，該細胞自組裝區包括多個第二孔洞； 其中該細胞自組裝區用以容置含多個細胞之一樣本液，各該第二孔洞的孔徑小於各該細胞之粒徑，該樣本液內之該些細胞單層排列於該細胞自組裝區，而該樣本液之液體經由該些第二孔洞進入該微流道結構，當一染劑經由該第一孔洞進入該細胞自組裝區時，由於該染劑與流動於該微流道結構中的一洗滌液之間具有濃度差，使得該染劑由該細胞自組裝區朝向該微流道結構進行擴散作用，藉此該些細胞被該染劑染色，且其中該洗滌液將經由該染劑擴散層之該些第二孔洞進出，以加速該染劑之擴散，因而達成動態透析染色。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的細胞晶片，其中該染劑擴散層的材料為聚二甲基矽氧烷（PDMS）。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的細胞晶片，其中該些第二孔洞係陣列排列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的細胞晶片，其中該細胞自組裝區與該第一基板之間的該間距小於各該細胞的粒徑。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的細胞晶片，其中該微流道結構包括一洗滌液注入口、一洗滌液排出口以及位於該洗滌液注入口與該洗滌液排出口之間的一微流道。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的細胞晶片，其中該第一基板更包括一洗滌液注入口與一洗滌液排出口，分別與該微流道結構的該洗滌液注入口與該洗滌液排出口連通。
  7. 如申請專利範圍第5項所述的細胞晶片，其中該染劑擴散層更包括一洗滌液注入口與一洗滌液排出口，分別與該微流道結構的該洗滌液注入口與該洗滌液排出口連通。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的細胞晶片，更包括至少二個固定元件，用以夾持固定該第一基板、該染劑擴散層以及該第二基板。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的細胞晶片，其中該第一基板更包括至少一蒸散孔。
  10. 一種細胞動態透析染色法，包括： 提供如申請專利範圍第1項所述的細胞晶片； 將含多個細胞之一樣本液經由該第一孔洞滴入該細胞晶片的該細胞自組裝區中；以及 將一染劑經由該第一孔洞滴入該細胞晶片的該細胞自組裝區中，以與該些細胞接觸，其中於滴入該染劑的同時，使一洗滌液流動於該細胞晶片的該微流道結構中，由於該染劑與流動於該微流道結構中的該洗滌液之間具有濃度差，使得該染劑由該細胞自組裝區朝向該微流道結構進行擴散作用，藉此該些細胞被該染劑染色，且該洗滌液將經由該染劑擴散層之該些第二孔洞進出，以加速該染劑之擴散，因而達成動態透析染色。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的細胞動態透析染色法，其中使一洗滌液流動於該細胞晶片的該微流道結構中的方法包括藉由一注射幫浦使該洗滌液持續注入該微流道結構與自該微流道結構排出。
  12. 如申請專利範圍第10項所述的細胞動態透析染色法，其中將含多個細胞之一樣本液經由該第一孔洞滴入該細胞晶片的該細胞自組裝區中之後，更包括經由該細胞晶片的該第一基板的至少一蒸散孔將該樣本液之液體抽出，使得該些細胞以單層的形式舖平於該細胞自組裝區。
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