TWI598587B - 流體動力式轉運晶片及其用於單細胞捕獲之方法 - Google Patents

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Description

流體動力式轉運晶片及其用於單細胞捕獲之方法
本發明係有關於一種生物微流體晶片，特別地，更有關於一種流體動力式晶片用以捕捉複數單細胞。
近年來微型裝置以其可精準的操作單細胞而被用來設計可作為諸如單細胞捕捉、單細胞配對以及長期培養之用。微型裝置也因為具有高通量、低成本以及可減少試劑的消耗而佔有優勢。山口(Yamaguchi)等人發表了一種簡單裝置其具有高30微米、寬100微米之通道以做單細胞捕捉及培養。前述裝置的捕捉效率為73%。然而此裝置因其有限的空間，使得捕捉到的細胞最多僅能生長24小時。李等人利用一個類似的概念設計一個單細胞共同培養平台以作為細胞間作用的研究。此概念裝置的單細胞配對的效率是50%，然而仍然缺乏足夠的空間以令細胞擴散以及繁殖。
於一方面，本發明有關於一種流體動力式晶片包含一單細胞捕捉單元陣列，而其中的每一單細胞捕捉單元包含：
(a)一入口通道其長為L1、寬為W1以及高為H1，並具有一前端及一後端相對於前 端，其中前端具有一捕捉處；
(b)一大容室其直徑為M以及深度為D，大容室位於入口通道之捕捉處的前方且具有一接收結構以一距離g間隔於捕捉處，大容室並具有一內部空間用來使多於一之單細胞接著、成長、增生及/或轉移；
(c)一侷限通道其長為L2、寬為W2以及高為H2，侷限通道位於捕捉處以及接收處之間且流通於入口通道以及大容室。
(d)一容室通道其長為L3、寬為W3以及高為H3可流通地位於大容室前且具有一前端及一後端相對前端，容室通道的高H3係小於大容室的高D；以及
(e)一迴避通道其長為L4、寬為W4以及高為H4，迴避通道並列於入口通道、大容室以及容室通道且具有一第一端及一第二端相對第一端。第一端係自正位於捕捉處前方的入口通道分支出，而第二端則由容室通道的後端接合於容室通道。迴避通道的寬W4及高H4係分別大於侷限通道的寬W2及高H2。其中每一陣列的欄係：(i)複數之單細胞侷限單元彼此可流通地連接；(ii)除了第一單元以外，每一單元的入口通道係可流通地連接於一緊鄰上游單元之容室通道；以及(iii)除了最後一個單元以外，每一單元的迴避通道係流通地連接於一緊鄰上游單元之入口通道； 於一實施例中，陣列的中每一欄中，除了最後一個單元以外，每一單元的容室通道係流通地連接於一緊鄰下游單元之入口通道。
於另一實施例中，陣列的每一欄中，最後一個單元的容室通道係可流動地連接於一出口通道。
於另一實施例中，陣列的每一欄中，第一個單元的入口通道係可流通地連接於一輸入通道，且最後一個單元之出口通道係可流通地連接於一輸出通道。
於另一實施例中，本發明之裝置更包含：(a)一輸入部可流通地連接於輸入通道；以及(b)一輸出部可流通地連接於輸出通道。
於另一實施例中，介於陣列之欄間的單細胞侷限單元係透過輸入通道及輸出通道彼此流通連接。
入口通道、侷限通道、容室通道以及迴避通道的表面上可進行塗佈或無塗佈。
於一實施例中，容室通道以及迴避通道的表面上可塗佈有蛋白質例如為牛血清蛋白。可視裝置的應用而選用其他種類的表面塗層。
於另一實施例中，大容室包含一獨立的單細胞。
於另一實施例中，大容室包含種類不同之兩獨立單細胞。
於另一實施例中，大容室包含種類不同之複數單細胞。
於另一實施例中，大容室包含種類相同之複數單細胞。
於另一實施例中，本發明之裝置在大容室中包含一或多於一種獨立之單細胞。
於另一實施例中，本發明之裝置在大容室中包含二或更多種類之獨立的單細胞。
於另一實施例中，本發明之裝置更包含一單細胞懸浮液，其中單細胞的尺寸係小於迴避通道之截面但大於侷限通道之截面。
於另一實施例中，本發明之裝置係接置在一透明基板上。基板可為一片玻璃。
於另一實施例中，製成本發明之裝置的材料係選自一群組其係由聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate)以及聚碳酸酯(polycarbonate)、玻璃(glass)、塑膠(plastic)以及任何以上材料之組合所組成。
於另一實施例中，迴避通道側向迂迴通過單元之一側。
在另一方面，本發明有關於一種捕捉獨立單細胞的方法，其包含：(a)提供一本發明之流體動力式運轉晶片；(b)將一培養介質包含單一種類之獨立單細胞置入陣列的一單行中第一單細胞侷限單元之一入口通道中；(c)在捕捉處捕捉單一種類之獨立單細胞；(d)以一清理培養介質洗去未捕捉到之多餘細胞；以及(e)以一介質回沖這些通道以釋放捕捉到的單一種類獨立單細胞，並使這些被釋放的細胞逆流進入大容室中。
在另一方面，本發明有關於一種捕捉多於一種獨立單細胞之方法，包含：(a)提供一本發明之流體動力式運轉晶片；(b)將一培養介質包含一特定種類之獨立單細胞置入陣列的一單行中第一單細胞侷限單元之一入口通道中；(c)在捕捉處捕捉特定種類之獨立單細胞；(d)以一清理培養介質洗去未捕捉到之多餘細胞；(e)以一介質回流這些通道以釋放捕捉到的特定種類獨立單細胞，並使這些被釋放的細胞逆流進入大容室中；以及(f)重複上述置入、捕捉、清理以及回流之步驟一或更多次，而不同種類的單細胞其在每一步驟的條件也不同。
於另一實施例中，捕捉步驟係在每一捕捉處捕捉獨立單細胞。
於另一實施例中，在回流步驟的體積流速係大於在清理步驟之體積流速。
於另一實施例中，在回流步驟的體積流速係不小於置入細胞步驟中之體積流速。
藉由以下較佳的實施例結合附圖之說明，本發明前述以及其他方面可清楚地呈現。然而一些變化及修改可在不違背本發明之精神及創新概念之範疇下進行。
附圖係繪示本發明一或更多實施例連同書面敘述以解釋本發明之重點。在一些情況下，相同的標號可通用於圖式中以指出實施例中相同或類似的元件。
300‧‧‧第一單元
306‧‧‧上游單元
307‧‧‧單元
310‧‧‧輸入通道
320‧‧‧入口通道
322‧‧‧捕捉處
320a‧‧‧前端
320b‧‧‧後端
330‧‧‧侷限通道
340‧‧‧大容室
342‧‧‧接收結構
350‧‧‧容室通道
350a‧‧‧前端
350b‧‧‧後端
360‧‧‧迴避通道
360a‧‧‧第一端
360b‧‧‧第二端
370‧‧‧細胞
380‧‧‧細胞
390‧‧‧出口通道
392‧‧‧輸出通道
A、B‧‧‧路徑
圖1A至1H係顯示流體動力式晶片之罩體設計的圖形。圖1A及圖1E以上視圖顯示第一層(層1)分別在設計1及2之光罩。圖1B及圖1F以上視圖顯示第二層(層2)分別在設計1及2之光罩。圖1C及圖1G以上視圖顯示第三層(層3)分別在設計1及2之光罩。圖1D及圖1H以上視圖顯示三個層(層1,2及3)分別在設計1及2之光罩。比例尺：5毫米。
圖2顯示設計1中流體動力式晶片(D-F)之SU-8模具(A-C)以及聚二甲基矽氧烷在玻璃上之裝置的照片。(A)一侷限通道(層1)其長3.8微米、寬5.0微米以及高4.3微米之照片。(B)一照片顯示迴避通道(重疊之層1、2及3)其寬25.0微米以極高23.0微米。(C)一照片顯示大容室直徑500.6微米以及高(深度)57.8微米。(D)一顯微影像顯示流體動力結構(箭頭a、b係指不同的流阻；箭頭c係指一細胞捕捉 處)。(E)一放大圖係顯示一單細胞侷限單元。(F)一照片顯示由聚二甲基矽氧烷製成之流體動力式晶片的外觀。Q係定義了體積流率。Q1指出路徑A的體積流率，而Q2指出路徑B的體積流率。比例尺：100微米。
圖3係顯示流體動力式晶片操作程序之一示意圖。(A)一細胞置入步驟顯示了流動方向。(B)當一細胞在捕捉處被捕捉到時會提高進入大容室的流阻，後續的細胞將流向迂迴狀的迴避通道。(C)一細胞清理介質用以在微通道中洗去多餘的細胞。(D)被捕捉到的細胞係釋放於捕捉處並流入大容室中。
圖4顯示MCF-7單細胞在大容室中被捕捉之系列影像。欄(A)中，最上方之第一影像顯示來自上游單元迴避通道的兩單細胞進入下游單元之入口通道；一第二影像顯示兩單細胞流向下游單元的捕捉處；一第三影像顯示在前面(地一細胞)的細胞係於下游單元之入口通道的捕捉處被捕捉到；底部的影像顯示單細胞(第二細胞)迴避了捕捉處。在欄(B)中，上方之第一影像顯示第一細胞在捕捉處被捕捉；一第二影像顯示第一細胞於捕捉處被釋放；一第三影像顯示第一細胞流入容室通道；一底部影像顯示第一細胞進入大容室中。比例尺：100微米。
圖5顯示COMSOL下之流速模擬。顯示了流速的區域及流線。侷限通道的流速係高於迴避通道以及大容室內之流速。
圖6顯示設計1之流體動力式晶片中捕捉MCF-7單細胞之效率。(A)一影像其顯示在捕捉處捕捉到之單細胞(以實線圓圈標示)。(B)一影像其顯示在大容室中捕捉到之單細胞(以虛線圓圈標示)。(C)捕捉處的單細胞侷限效率與大容室中的單細胞捕捉效率。細胞係染上鈣黃綠素-AM綠色螢光染料。比例尺：100微米。
圖7係一影像其顯示MDA-MB-231與MCF-7單細胞在設計2之流體動力式晶片的配對結果。MCF-7細胞係染上鈣黃綠素-AM綠色螢光染料(標示為實線圓圈)，而MDA-MB-231細胞係染上紅色DiI螢光顏料(標示為虛線圓圈)。"1A+1B"之術語表示“一MDA-MB-231單細胞以及一MCF-7 cell單細胞”。">1A+1B"之術語表示“多於一MDA-MB-231單細胞以及一MCF-7 cell單細胞”。比例尺：1毫米。
圖8顯示大容室中單細胞與複數單細胞之捕捉效率。"1A"之術語表示“一MDA-MB-231單細胞”。"1B"之術語表示“一MCF-7 cell單細胞”。"1A+1B"之術語表示“一MDA-MB-231單細胞以及一MCF-7 cell單細胞”。">1A+1B"之術語表示“多於一MDA-MB-231單細胞以及一MCF-7 cell單細胞”。
在本發明所使用的術語係在其技術領域普遍地具有其本身原本意義，包括在本發明的上下文中以及在說明書上下文中所使用的術語。使用於描述本發明或者是說明書其他地方的某些術語係於下列討論，以提供本發明之描述的額外指導給熟悉本領域的技術人員。為方便起見，某些術語係會被強調，例如使用斜體字及/或引號。此強調的使用並不會影響一術語的範圍及意義；無論其是否有被強調，在相同的上下文中，一術語的範圍及意義是相同的。應了解的是，相同的事物係可以多種方式敘述。因此，在文中所討論的任何一個或多個術語係可使用不同語言及同義字，無論是否一術語是詳盡的或是在文中被討論，均無其他涵義可以取代。提供有對於某些術語的同義字。一或多個同義字的列舉並不排除其他同義字的使用。在說明書中任何地方且包括在本文中所 討論的術語之舉例的使用，係僅為作例證使用，且並未限制本發明的範圍與意義以及任何例示術語。同樣地，本發明並未限制在本說明書中的不同實施例。
除非不同的定義，在文中所使用的所有技術與科學術語係具有相同意義，係如熟悉本技術領域之人員所理解的。發生衝突時，係將調節包括有定義之本發明實施例。
如下文所使用的「大約」，係意指在所給予之數值或範圍的百分之二十之內，較佳者，其係為百分之十之內，更進一步的話，其係為百分之五以內。係為中所給予的數值是大約值，其意指假若沒辦法確切定義的話，則以「大約」來表示。
如下文所使用，當敘述一個數字或一個範圍時，本技藝所屬領域係傾向於包含一適當、合理的範圍。
對於大約40到大約100微米來說，其係意指在其範圍內的所有整數總數。因此，40、41、42...97、98、99以及100微米整數總數係已包括在本發明的實施例中。
對於大約300到大約4000微米來說，其係意指在其範圍內的所有整數總數。因此，300、301、302...3997、3998、3999以及4000微米整數總數係已包括在本發明的實施例中。
對於大約1微米到大約2500微米來說，其係意指在其範圍內的所有整數總數。因此，1、2、3、4...2497、2498、2499以及2500微米整數總數係已包括在本發明的實施例中。
對於大約200大約200微米來說，其係意指在其範圍內的所有整數總數。因此，500、501、502...1997、1998、1999以及2500微米整數總數係已包括在本發明的實施例中。
以下所使用之“一單細胞侷限單元”可指“一單元”。
以下所使用之“大容室”應通常表示一容室具有容置空間其可供細胞培養超過24小時，並可供細胞擴散、繁殖以及移動。
以下所使用之“一輸入通道”通常應表示為一微通道其連接一陣列欄之第一單細胞侷限單元之入口通道至一流體動力式轉運晶片之進入孔洞。每一陣列欄具有一進入通道連接到一流體動力式轉運晶片之輸入口。輸入通道匯入一微通道然後再連接到流體動力式轉運晶片的輸入口。介於欄之間的輸入通道係可流通地連接。
以下所使用之“一輸出通道”通常應表示為一微通道其連接一陣列欄之最後一個單細胞侷限單元之出口通道至流體動力式轉運晶片之出口孔洞。每一陣列欄具有一出口通道連接至流體動力式轉運晶片之輸出口。輸出通道匯入微通道後再連接到流體動力式轉運晶片之輸出口。介於欄之間的輸出通道係可流通地連接。
“一單細胞”以及“一獨立單細胞”之術語係可互換。
“兩單細胞”以及“兩獨立單細胞”之術語係可互換。
“熱塑性材料”之術語通常代表塑膠材料或聚合物，在一特定溫度以上具可彎折或可塑性並可藉由冷卻加以固化。
縮寫：流體動力式轉運晶片(hydrodynamic shuttling chip,HSC)
範例
以下本發明所根據之實施例係在無意限制發明的範圍、實施的設備、裝置、方法及其相關結果之下提供。應注意的是範例中所使用之標題或副標題係用以方便閱讀者，不應用來限制本發明之範圍。而且，以下所提出或揭 露的一些理論無論正確與否皆不應限制本發明之範圍，因為本發明之實施係根據發明而與任何特定理論或行為方案無關。
方法
裝置之設計以及製法。微流體動力式轉運晶片係藉由前述之軟蝕刻技術作用在聚二甲基矽氧烷下而製成。首先，旋轉塗佈一5微米厚之負光阻(SU-8,MicroChem,Newton,MA,USA)在一矽晶圓上，並在一具有5微米寬侷限通道之掩膜下方以紫外光進行曝光。第二，旋轉塗佈一25微米厚之負光阻在同一矽晶圓上，並在一具有25微米寬迴避通道之掩膜下方以紫外光進行曝光。第三，旋轉塗佈一50微米厚之負光阻在同一矽晶圓上，並在一具有500微米口徑的大通道之掩膜下方以紫外光進行曝光，以製作設計1(圖1A至1D)。而製作設計2時，係旋轉塗佈一50微米厚之負光阻在同一矽晶圓上，並在一具有200微米口徑的大通道之掩膜(圖1E至1H)下方以紫外光進行曝光。接著操作者可使用模具，且在此模具上將與其交聯物以10：1之比例混合之Sylgard 184(Dow coming,USA)聚二甲基矽氧烷預聚合物加以純化，並可在一攝氏65度之傳統烤爐中過夜以進行固化。經固化之聚二甲基矽氧烷係自模具脫離。一具有0.75毫米內徑之沖床(HARRIS UNT-CORETM,Ted Pella,USA)可用以沖製一輸入口及一輸出口以將流體導入聚二甲基矽氧烷裝置之流道。經過簡短的氧氣電漿處理後，可將聚二甲基矽氧烷及玻璃的複製品彼此接觸並置放於一攝氏65度之烤爐中24小時以永久地黏合。
流體動力式轉運晶片是準備作為捕捉複數單細胞之用。在進行細胞實驗之前，流體動力式轉運晶片係充滿了去離子水並浸泡於一裝有去離子水且在一乾燥劑中的容器中以去除微流道中的氣泡。之後，除去氣體後的流體動力 式轉運晶片係暴露於紫外光中以進行30分鐘的消毒。為避免細胞馬上黏在流體動力式轉運晶片表面上，可將5%的BSA(Bovine serum albumin，台灣伯新科技生產的牛血清蛋白)搭配一倍的磷酸鹽緩衝液注射進微流道且在攝氏37度、30分鐘下培養。
細胞培養及維持。於本研究中，人類乳癌MDA-MB-231及MCF-7細胞株係作為試樣。MDA-MB-231及MCF-7細胞之培養係在一杜爾貝科的最低基本培養基裝置(DMEM，美商Gibco所生產)中進行，此裝置具有10%之透析牛血清(fetal bovine serum，美商(Hyclone Thermo所生產)以及1%的抗體(谷氨酰胺-青黴素-鏈黴素，法商Biowest所生產)且置於一攝氏37度以及5%二氧化碳之恆溫箱中。細胞的培養係利用胰蛋白酶-EDTA(在磷酸鹽緩衝液中的濃度為0.25%，法商Biowest生產)其根據製造商的標準在70%至80%間合流。
複數單細胞之捕捉、分離以及培養。在進行每一細胞捕捉實驗前，每一細胞係預先染上4mM的細胞膜染料DiIC12(3)(美商BD Biosciences所生產)或4Mm的可透膜之活體細胞標記染料calcein-AM(美商Invitrogen及Life Technologies所生產)30分鐘以便容易地在流體動力式轉運晶片中辨識出各細胞。為了進行設計1之流體動力式轉運晶片中每一單細胞捕捉實驗，可利用一注射泵(美商Harvard Apparatus及Harvard Bioscience所生產)以及一鐵氟龍管(內徑0.51毫米；外徑0.82毫米，台灣永匯豐科技所生產)將1微升且1.0 x 106cells/mL濃度的MCF-7細胞(總共1 x 103個細胞)以每分鐘10微升的流速注入微流道中。接著，5微升的杜爾貝科的最低基本培養基裝置以每分鐘0.3微升的流速注入微流道中。之後，一10微升之杜爾貝科的最低基本培養基裝置回流係以每分鐘200微升的流速來釋放並移動細胞進入大容室中。“複數單細胞捕捉”之術語表示一個流體 動力式轉運晶片可用以在一大容室中一次補捉單一細胞，且藉由重複這些程序就可在一大容室中捕捉獨立之複數單細胞。“分離”表示當細胞分別在大容室中被捕捉時可物理性地分開(即使微流道係流通連接於大容室)。這樣的特徵可使操縱單一細胞時降低對其他細胞的干擾。
細胞成像。所有細胞成像可由一倒置顯微鏡(日商Nikon Ti-E倒置螢光顯微鏡)具有一附電荷耦合器件(加拿大Qimaging生產之Retiga-4000DC)以及一控制軟體(日商NIS-ElementsAr以及Nikon提供)來獲得。
結果
裝置設計及操作。微流道裝置係由聚二甲基矽氧烷並黏合到一玻璃基板上。在製作聚二甲基矽氧烷之部分，三層結構的SU-8母模係由微影蝕刻所製成。我們係製作了兩個流體動力式轉運晶片。圖1A至1D分別顯示了設計一中第一層到第三層光罩以及三層光罩重疊的上視圖。
圖2係顯示SU-8模(A至C)以及設計1完成的聚二甲基矽氧烷在玻璃上之流體動力式轉運晶片(D至F)。圖2A顯示第一層具有SU-8 structure之侷限通道330(每一通道係長3.8微米、寬5.0微米以及高4.3微米)。第二層創造了迴避通道360(每一通道係寬25.0微米以及高23.0微米)以及大容室340(每一大容室係口徑500微米以及高23.0微米)其係連接透過侷限通道連接於迴避通道(圖2B)。第三層光罩(高57.8微米)係建造在第二層光罩上以增加大容式的高度以及容量(圖2C)。因此，設計1裝置的大容室之最後高度可為57.8微米。對設計2而言，每一侷限通道可為5.1μm長、6.5微米寬以及4.9微米高。迴避通道係25微米寬以及23.3微米高，然而每一大容室係口徑500微米以及高82.0微米。
請參閱圖2D，為確保每一細胞捕捉處僅侷限一單細胞，流速Q1以及流速Q2(流速Q1以及流速Q2分別微穿過路徑A及路徑B之流速)之設計係使第一進入細胞穿過路徑A(即朝向侷限通道330移動，如箭頭a所標示的方向)而非路徑B(即朝向迴避通道360移動，如箭頭b所標示的方向)，而導致細胞被侷限於捕捉處(如箭頭c所標示)。路徑A的流阻會在細胞侷限於捕捉處時增加，因此Q1與Q2的比值下降而導致下一個進入細胞穿越路徑B而非路徑A。達西-韋史巴赫方程可用於計算微流道的流阻(式1)：
P是流體的驅動壓力，C(α)是一微流道的長寬比例(0<α<1)常數，μ為流體黏滯度，L代表通道長度，Q是體積流速，R是周長以及A是微流道的截面面積。
為了確保所設計的侷限通道330在層流系統中的任何流速皆可作用，細胞的中心可位於路徑A的流線內。我們定義了細胞中心到進入通道的內壁為X以及進入通道的寬度為Y。當Q1/Q2的比例大於(Y-X)/X時(式2)，於任何層流區域中的流速下，細胞皆會被侷限在捕捉處。
對設計1之流體動力式轉運晶片而言，其製品具有的Q1/Q2值為3.563大於2.125之門檻值(如表1)，以確保第一進入細胞穿過路徑A而非路徑B且侷限於捕捉處。圖2E顯示流體動力式轉運晶片中捕捉處322以及大容室340的一放大圖，而圖2F顯示整個流體動力式轉運晶片200內含384個大容室以及一入口與一出口孔洞。設計2的流體動力式晶片的Q1/Q2值為3.391大於2.125之門檻值(如表 1)。表1係顯示微流道的阻值比例。
流體動力式轉運晶片所適用的細胞尺寸係依侷限通道以及迴避通道的尺寸。細胞尺寸必須小於迴避通道的截面以避免細胞堵塞在迴避通道，但細胞尺寸需大於侷限通道的截面，以避免細胞穿越侷限通道而沒侷限在捕捉處。
請參閱圖2D-F以及圖3，流體動力式轉運晶片200包含單細胞侷限單元陣列，而每一單細胞侷限單元包含：(a)一入口通道320具有長度L1、寬W1以及高H1，並具有一前端320a及一後端320b相對於前端320a，其中前端具有一捕捉處322；(b)一大容室340具有直徑M以及深度D，大容室340位於入口通道之捕捉處322的後方且具有一接收結構342以一距離g間隔於捕捉處322，大容室並具有一內部空間用來使多於一之單細胞接著、成長、增生及/或轉移；(c)一侷限通道330長L2、寬W2以及高H2，侷限通道330位於捕捉處322以及接收結構342之間且流通連接於入口通道320以及大容室340；(d)一容室通道350其長L3、寬W3以及高H3可流通地位於大容室340後方且具有一前端350a及一後端350b相對前端350a，容室通道的高H3係小於大容室的高D；以及(e)一迴避通道360其長L4、寬 W4以及高H4，迴避通道360並列於入口通道320、大容室340以及容室通道350且具有一第一端360a及一第二端360b相對第一端360a。第一端360a係自正位於捕捉處前方的入口通道320分支出，而第二端360b則由容室通道350的後端350b接合於容室通道350。迴避通道360的寬W4及高H4係分別大於侷限通道330的寬W2及高H2。
流體動力式轉運晶片的作程序如以下步驟：
請參閱圖3A，一細胞懸浮液由單元300之輸入通道310注入。個別細胞進入一陣列欄中之第一單元300之入口通道320。第一單細胞370侷限於第一單元300之入口通道320之捕捉處322。陣列欄中的單元300......,306,307係流通地連接。每一陣列欄之最後一單元307具有一出口通道390連接於輸出通道392。請參閱圖3B，當一個別細胞370侷限於單元306之入口通道320之捕捉處322時，將導致流往大容室340的流路的流阻增加，接下來的細胞380將迂迴地流往單元306之迴避通道360，然後進入一個緊鄰之上游單元307之入口通道320並侷限於其捕捉處322。請參閱圖3C，一細胞捕捉裝置係用於清洗微流道中多餘的細胞。請參閱圖3D，一培養裝置可用於透過單元307之輸出通道392及出口通道390回沖微流道。單元307中捕捉到的細胞380係自單元307之入口通道320之捕捉處322釋放，然後透過單元306的容室通道350流入緊鄰之上游單元306的大容室340中。
對設計1而言，1)藉由一注射泵將一微升的細胞懸浮液以每分鐘10微升的流速注入輸入通道。個別細胞流入單一欄之第一單元之進口通道，而第一細胞係侷限於捕捉處(如圖3A所示)。當一細胞侷限於捕捉處，將導致流往大容室的流路的流阻增加，接續的細胞將迂迴地流往迴避通道(如圖3B)並進入一緊鄰之上游單元的入口通道(如圖3B)。2)5微升的清理裝置藉由一注射泵以每分鐘0.3微 升的流速注入通道中(如圖3C)以將多餘的細胞洗出微流道。3)最後，一0.6微升的清理裝置之回流以每分鐘10微升的速度導入微流道中，以將捕捉到的細胞自捕捉處釋放並傳輸這些細胞進入大容室中(如圖3D)。因為流入大容室的流阻係小於穿過迴避通道的流阻，因此被釋放的細胞可流入大容室中而非迴避通道。此外，因為大容室之加大的截面面積，大容室中的流速可大幅的減低，可避免注入大容室中的細胞被流體帶走而被困在接收結構與侷限通道的交界。就MCF-7細胞的示範而言，整體程序可在20分鐘內呈現。藉由重複以上步驟，其他細胞類型之個別細胞可注入大容室中。
對設計2而言，包含以下三操作步驟：1)藉由一注射泵將5微升的細胞懸浮液以每分鐘0.3微升的流速注入通道中。在此步驟中個別的單細胞係侷限於捕捉處。2)5微升的清理裝置藉由一注射泵以每分鐘0.3微升的流速注入通道中以將多餘的細胞洗出微流道。3)最後，一10微升的清理裝置之回流以每分鐘200微升的速度導入微流道中，以將捕捉到的細胞自捕捉處釋放並傳輸這些細胞進入大容室中。以上整體程序可在40分鐘內呈現。
圖4顯示MCF-7單細胞捕捉於大容室之序列影像。請參閱欄(A)：最上方之影像顯示迴避通道以及入口通道接口附近的兩單細胞，第一細胞係在一下游單元之入口通道中，第二細胞係在一上游單元之迴避通道中。第二影像顯示第一細胞流往下游單元之容室捕捉處，且第二細胞已流入下游單元之入口通道中。第三影像顯示第一細胞受限於下游單元的捕捉處，且第二細胞跟在第一細胞後面。底部影像顯示第二細胞迴避了捕捉處且流入下游單元之迴避通道。
COMSOL模擬。COMSOL之層流模組係基於操作程序下用於模擬流速。穿過侷限通道的流速遠高於穿過侷限通道的流速，這表示注射入的細胞會 朝向侷限通道流動(如圖5)。模擬結果亦顯示容室之大截面面積可大幅地降低大容室中的流線流速。
圖6顯示設計1之流體動力式轉運晶片中之MCF-7細胞捕捉效率。細胞係染上鈣黃綠素-AM綠色螢光染料以便觀察。圖6A顯示單細胞在捕捉處遭到捕捉(以實線圓圈標示)，圖6A顯示大容室中被捕捉的細胞(以虛線圓圈標示)。圖6C顯示在捕捉處之單細胞侷限效率以及單細胞捕捉於大容室中。
圖7顯示在設計2之流體動力式轉運晶片中MDA-MB-231與MCF-7單細胞之配對結果。上視照片係大容室中已配對的單細胞。MCF-7細胞(以實線圓圈標示)係染上鈣黃綠素-AM綠色螢光染料，MDA-MB-231細胞係染上紅色DiL螢光染料。比例尺：1毫米。"1A"之術語表示“一MDA-MB-231單細胞”。"1B"之術語表示“一MCF-7單細胞”。"1A+1B"之術語表示“一MDA-MB-231單細胞以及一MCF-7單細胞”。">1A+1B"之術語表示“多於一MDA-MB-231單細胞以及一MCF-71單細胞”，提示：一MCF-7單細胞與一MDA-MB-231單細胞，外加額外的一MCF-7單細胞或一MDA-MB-231單細胞。
圖8顯示大容室中單一以及複數單細胞之捕捉效率。
前述本發明的示範實施例之說明僅是為了說明與描述本發明，並非用來詳盡無遺地描述本發明或是用來將本發明限制在所揭露的態樣中。在按照上述教示後可對前述實施例態樣進行調整與改變。本發明所提的實施例與範例是為了解釋本發明的原理以及應用，以使在此領域具有通常知識者能利用本發明之各種實施例與範例，使在此領域具通常知識者仔細考量後對本發明的實施例與範例進行改變以供其特定用途。對於在此領域中具有通常知識者而言，不 違背本發明精神與範圍之替代性的實施例是顯而易見的。本發明的主張範圍是由所附申請專利範圍定義而不侷限在前述的說明與示範實施例之內容。
300‧‧‧第一單元
306‧‧‧上游單元
307‧‧‧單元
310‧‧‧輸入通道
320‧‧‧入口通道
322‧‧‧捕捉處
320a‧‧‧前端
320b‧‧‧後端
330‧‧‧侷限通道
340‧‧‧大容室
342‧‧‧接收結構
350‧‧‧容室通道
350a‧‧‧前端
350b‧‧‧後端
360‧‧‧迴避通道
360a‧‧‧第一端
360b‧‧‧第二端
370‧‧‧細胞
380‧‧‧細胞
390‧‧‧出口通道
392‧‧‧輸出通道

Claims (14)

  1. 一種流體動力式轉運晶片包含一單細胞侷限單元陣列，每一單細胞侷限單元包含：(a)一入口通道具有高L1、寬W1以及高H1，該入口通道並具有一前端以及一後端相對該前端，其中該後端具有一捕捉處；(b)一大容室具有直徑M以及深度D，該大容室位於入口通道之該捕捉處的後方並具有一接收結構以一距離g間隔於該捕捉處，該大容室並具有一內部空間用來使多於一個之單細胞附著、成長、增生及/或轉移；(c)一侷限通道其長L2、寬W2以及高H2，該侷限通道位於該捕捉處以及該接收結構之間且流通於該入口通道以及該大容室；(d)一容室通道其長L3、寬W3以及高H3，該容室通道可流通地位於該大容室後方且具有一前端及一後端相對該前端，該容室通道的該高H3係小於該大容室的該高D；以及(e)一迴避通道其長L4、寬W4以及高H4，該迴避通道並列於該入口通道、該大容室以及該容室通道且具有一第一端及一第二端相對該第一端，該第一端係自正位於該捕捉處前方的該入口通道分支出，而該第二端則由該容室通道的該後端接合於該容室通道，該迴避通道的該寬W4及該高H4係分別大於該侷限通道的該寬W2及該高H2；其中在每一陣列欄中：(i)複數之該單細胞侷限單元彼此可流通地連接；(ii)除了第一單元以外，每一單元的該入口通道係可流通地連接於一緊鄰之上游單元之該容室通道；以及 (iii)除了最後一個單元以外，每一單元的該迴避通道係流通地連接於一緊鄰之下游單元之該入口通道。
  2. 如請求項1之流體動力式轉運晶片，其進一步設置有一出口通道，其中，每一陣列欄之最後一個單元的該容室通道係流通於該出口通道。
  3. 如請求項2之流體動力式轉運晶片，其進一步設置有一輸入通道及一輸出通道，其中每一陣列欄之第一個單元之入口通道係流通連接於該輸入通道，且該最後一個單元之該出口通道係流通連接於該輸出通道。
  4. 如請求項3之流體動力式轉運晶片，更包含(a)一輸入部流通連接於該輸入通道；以及(b)一輸出部流通連接於該輸出通道。
  5. 如請求項4之流體動力式轉運晶片，其中位於該陣列欄中之該單細胞侷限單元係透過該輸入通道及該輸出通道彼此流通連接。
  6. 如請求項1之流體動力式轉運晶片，其中該入口通道、該侷限通道、該容室通道以及該迴避通道之表面係塗佈有白蛋白。
  7. 如請求項1之流體動力式轉運晶片，更包含一或多種獨立單細胞於該大容室中。
  8. 如請求項7之流體動力式轉運晶片，更包含至少兩種獨立單細胞於該大容室中。
  9. 如請求項1之流體動力式轉運晶片，更包含一單細胞懸浮液，其中該單細胞的尺寸係小於該迴避通道的截面但大於該侷限通道之截面。
  10. 如請求項1之流體動力式轉運晶片，其中該流體動力式轉運晶片係黏合於一透明基板。
  11. 如請求項1之流體動力式轉運晶片，其中該流體動力式轉運晶片係選自一群組其係由聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate)以及聚碳酸酯(polycarbonate)、玻璃(glass)、熱塑性材料(thermoplastic materials)以及任何以上材料之組合所組成。
  12. 如請求項1之流體動力式轉運晶片，其中該迴避通道側向迂迴地穿過該單元之一側。
  13. 一種捕捉獨立單細胞之方法，包含：(a)提供一如請求項1中之流體動力式運轉晶片；(b)將包含單一種類之獨立單細胞之一培養介質置入陣列的一單行中的第一個單細胞侷限單元之該入口通道中；(c)在該捕捉處捕捉單一種類之獨立單細胞；(d)以一清理培養介質洗去未捕捉到之多餘細胞；以及(e)以一介質回沖這些通道以釋放捕捉到的單一種類獨立單細胞，並使這些被釋放的細胞逆流進入該些大容室中；其中，穿過路徑A之流速與穿過路徑B之流速之比值，應大於該進入通道的寬度減去細胞中心到進入通道的內壁後之數值比上細胞中心到進入通道的內壁之比值。
  14. 一種捕捉多種類獨立單細胞之方法，包含：(a)提供一如請求項1之流體動力式運轉晶片；(b)將一培養介質包含一特定種類之獨立單細胞置入陣列的一單行中第一單細胞侷限單元之該入口通道中；(c)在捕捉處捕捉該特定種類之獨立單細胞； (d)以一清理培養介質洗去未捕捉到之多餘細胞；(e)以一介質回沖這些通道以釋放捕捉到的該特定種類獨立單細胞，並使這些被釋放的細胞逆流進入大容室中；以及(f)依照不同種類獨立單細胞的條件重複上述置入、捕捉、清理以及回流之步驟一或更多次；其中，穿過路徑A之流速與穿過路徑B之流速之比值，應大於該進入通道的寬度減去細胞中心到進入通道的內壁後之數值比上細胞中心到進入通道的內壁之比值。
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