JP6839173B2 - 流体力学シャトリングチップ機器、及び、分離した単一細胞を捕捉する方法 - Google Patents
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Description
しかし、この機器は空間が限られているため、捕捉した細胞を24時間までしか成長させられない。リーら(非特許文献2)は細胞同士の相互作用の研究のための単一細胞共培養プラットフォームを設計する同様の概念を使用した。
(a)単一細胞捕捉ユニットの配列を備える流体力学シャトリングチップ機器を提供するステップと、
(b)単一種類の分離した細胞を含む培地を一列に並んだ配列における第1の単一細胞捕捉ユニットの流入経路に装填するステップと、
(c)単一種類の分離した細胞を捕捉部位で捕捉するステップと、
(d)捕捉されていない、余分な細胞を未使用培地で洗い流すステップと、
(e)経路に培地を逆流させ、捕捉された単一種類の分離された細胞を放出し、放出された細胞を大チャンバーに逆流させるステップと、
を含む。
ステップ(a)で提供される流体力学シャトリングチップ機器における単一細胞捕捉ユニットのそれぞれは、
(構成a)長さL1、幅W1、高さH1を有し、前端及び前端の反対側にある後端を有し、後端は捕捉部位を有する流入経路と、
(構成b)直径M及び深さDを有し、流入経路の捕捉部位の後に位置し、捕捉部位から距離gだけ離れた受容部位を有し、1つより多くの単一細胞が付着、成長、増殖及び/又は移動するように形成された内部空間を有する大チャンバーと、
(構成c)長さL2、幅W2、高さH2を有し、捕捉部位と受容部位の間に位置し、流入経路と大チャンバーと流体接続する捕捉経路と、
(構成d)長さL3、幅W3、高さH3を有し、大チャンバーの後に位置し、大チャンバーと流体接続し、前端及び前端と反対の後端を有し、高さH3は大チャンバーの深さDより小さい、チャンバー経路と、
(構成e)長さL4、幅W4、高さH4を有し、流入経路、大チャンバー及びチャンバー経路の横に位置し、第1の端部と第1の端部と反対の第2の端部を有し、第1の端部は捕捉部位のすぐ前の流入経路から分岐し、第2の端部はチャンバー経路の後端でチャンバー経路と合流し、幅W4及び高さH4は捕捉経路の幅W2及び高さH2より大きい、バイパス経路と、
を備える。
(i)単一細胞捕捉ユニットは流体接続し、
(ii)各ユニットの流入経路は、第1のユニットを除き、すぐ次の上流ユニットのチャンバー経路と流体接続し、
(iii)各ユニットのバイパス経路は、最後のユニットを除き、すぐ次の下流ユニットの流入経路と流体接続する。
(a)単一細胞捕捉ユニットの配列を備える流体力学シャトリングチップ機器を提供するステップと、
(b)特定の種類の分離した単一細胞を含む培地を一列に並んだ配列における第1の単一細胞捕捉ユニットの流入経路に装填するステップと、
(c)特定の種類の分離した単一細胞を捕捉部位で捕捉するステップと、
(d)捕捉されていない、余分な細胞を未使用培地で洗い流すステップと、
(e)チャンバー経路を逆流させ、特定の種類の捕捉された単一細胞を放出し、特定の種類の放出された細胞を大チャンバーに逆流させるステップと、
(f)それぞれの繰り返しのステップにおいて分離した単一細胞が異なる種類であることを条件として、ステップ(b)、(c)、(d)、(e)を1回以上繰り返すステップと、
を含む。
ステップ(a)で提供される流体力学シャトリングチップ機器における単一細胞捕捉ユニットのそれぞれの構成は、上述の「一つの態様」の構成と同じである。
他の実施形態において、配列の各カラムにおいて、最後のユニットのチャンバー経路は流出経路と流体接続する。
他の実施形態において、大チャンバーは異なる種類の2つの分離した単一細胞を含む。
他の実施形態において、大チャンバーは異なる種類の複数の分離した単一細胞を含む。
他の実施形態において、大チャンバーは同じ種類の複数の分離した単一細胞を含む。
他の実施形態において、機器は大チャンバーに2つ以上の種類の分離した単一細胞を含む。
本明細書で使用される用語は一般に本発明の文脈内、及びそれぞれの用語が使用される特定の文脈において業界の通常の意味を有する。
本発明の記載に関し熟練者に追加のガイダンスを提供するため、発明を記載するために使用される特定の用語が以下に、又は明細書の他の場所で議論される。便宜上、特定の用語は例えばイタリック体及び/又は引用符を使用して強調され得る。強調の使用は用語の範囲及び意味に影響せず、その用語が強調されているかに拘わらず、同じ文脈において用語の範囲及び意味は同じである。同じことが複数の方法で言えることが理解される。従って、本明細書で議論される1つ又は複数の用語に対し代替の言語及び類義語が使用でき、用語が詳しく述べられるか又は本明細書で議論されるかどうかに応じて特別な重要性も置かれない。特定の用語の類義語が提供される。1つ又は複数の類義語の記載は他の類義語の使用を排除しない。
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は本発明が関連する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合、定義を含む本文献における用語法に準拠するものとする。
本明細書で与えられる数量は概算であり、「ほぼ」、「約」又は「およそ」の用語は、明確に述べられていなければ上の記載に従って推論され得る。
「300μmから4000μmまで」という記述により、その範囲内の全ての整数単位の量が特に本発明の一部として開示されることが意味される。よって、300、301、302・・・3997、3998、3999及び4000μmの整数単位量が本発明の実施形態として含まれる。
「500μmから2000μmまで」という記述により、その範囲内の全ての整数単位の量が特に本発明の一部として開示されることが意味される。よって、500、501、502・・・1997、1998、1999及び2000μmの整数単位量が本発明の実施形態として含まれる。
本明細書で使用されるように、「大チャンバー」は一般的に細胞の拡散、増殖及び/又は移動のために24時間以上細胞の培養をする広々とした空間を有する空間を意味する。
本明細書で使用されるように、「出口経路」は一般に配列のカラムの最後の単一細胞捕捉ユニットの流出経路をHSC機器の出口穴に連結するマイクロチャネルを意味する。配列の各カラムはHSC機器の出口に連結された1つの出口経路を有する。出口経路はHSC機器の出口に接続される前に1つのマイクロチャネルに合流する。カラム間の出口経路は流体接続である。
「2つの単一細胞」及び「2つの分離した単一細胞」の用語は互換性がある。
「熱可塑性プラスチック材料」の用語は一般に特定の温度以上で柔軟、又は成形可能になり、冷却すると凝固するプラスチック材料又はポリマーを意味する。
(略語)「HSC」は流体力学シャトリングチップを意味する。。
本発明の範囲を制限する意図無しに、本発明の実施形態による例としての機器、装置、方法及びそれらに関連する結果が以下に示される。なお、読み手の便宜のため、例において題名又は副題が使用されるが、本発明の範囲を決して制限しない。さらに、特定の理論が本明細書において提案及び開示されるが、それらが正しかろうと正しくなかろうと、発明が特別な理論又は行動の計画を使用せずに本発明により実行される限り、本発明の範囲を決して制限しない。
(機器デザイン及び製造)
マイクロ流体HSC機器は、前述の通り、ソフトリソグラフィー技術を使用してポリジメチルシロキサン(PDMS)を使って製造された。
まず、5μmのネガ型のフォトレジストの厚い層(米国、マサチューセッツ州、ニュートン、マイクロケム製のSU−8)を、シリコンウエハー上でスピンコートし、5μm幅の捕捉経路を有するフォトマスクの下で紫外線に曝した。
第2に、25μmのネガ型のフォトレジストの厚い層を、同じシリコンウエハー上でスピンコートし、25μm幅のバイパス経路を有する別のフォトマスクの下で紫外線に曝した。
内径が0.75mmのパンチャー(ハリスユニコア(商標)、米国テッドペラ製)を使用して1つの入口穴及び1つの出口穴を穴開けし、流体をPDMS機器の流体経路へ導いた。短い酸素プラズマ処理の後、PDMSの複製とガラススライドの両方を接触し、オーブン内に65℃で24時間載置し、永久結合を実現した。
細胞の実験の前に、HSC機器は脱イオン水で満たされ、デシケーター内の脱イオン水で満たされた容器内に浸され、マイクロチャネル内の気泡が除去された。その後、脱ガスしたHSC機器は紫外線に曝され、30分間滅菌された。直後に細胞がPDMS表面に接着するのを防ぐため、1×PBS内の5%のBSA(ウシ血清アルブミン、ベーシングテクノロジー、台湾)がマイクロ流体経路に注入され、37℃で30分間培養された。
人間の乳がんMDA−MD−231及びMCF−7細胞株が研究において細胞モデルとして使用された。MDA−MB−231及びMCF−7細胞は10%のウシ胎仔血清(ハイクローンサーモ、米国)及び1%の抗生物質(グルタミン−ペニシリン−ストレプトミシン、バイオウエスト、フランス)を加えたDMEM培地(ギブコ、米国)内で、加湿した培養器内で37℃、5%の二酸化炭素で培養された。細胞の培養は70から80%の合流を有する製造者の標準プロトコルに従いトリプシン−EDTA(0.25%のPBS、バイオウエスト、米国)を使用して移動された。
全ての細胞の画像が付属の電荷結合素子(レチガ−4000DC、Qイメージング、カナダ)及び制御ソフトウエア(NIS−エレメンツ Ar、ニコン、日本)を有する倒立顕微鏡(ニコンTi−E倒立蛍光顕微鏡、日本)を使用して得られた。
機器デザイン及び操作 マイクロチャネル機器はPDMSから作られ、ガラス基板に隣接する。PDMS部分を作るため、3層のSU−8の原盤型がフォトリソグラフィーを使用して微細加工された。私どもは2つのHSCデザインを作成した。図1Aから1Dはデザイン1における、第1の層のフォトマスク、第2の層のフォトマスク、第3の層のフォトマスク、及び3つの層のフォトマスクの重なりのそれぞれの上面図を示す。図1Eから1Hはデザイン2における第1の層のフォトマスク、第2の層のフォトマスク、第3の層のフォトマスク、及び3つの層のフォトマスクの重なりのそれぞれの上面図を示す。
(a)長さL1、幅W1、高さH1を有し、前端320a及び前端と反対の後端320bを有し、後端は捕捉部位322を有する流入経路320。
(b)直径Mと深さDを有し、流入経路320の捕捉部位322の後に位置し、捕捉部位322から距離gだけ離れた受容部位342を有し、1つより多くの単一細胞が付着、成長、増殖及び/又は移動に適した内部空間を有する大チャンバー340。
(c)長さL2、幅W2及び高さH2を有し、捕捉部位322と受容部位342との間に位置し、流入経路320と大チャンバー340と流体接続する捕捉経路330。
(d)長さL3、幅W3及び高さH3を有し、大チャンバー340の後に位置し大チャンバー340と流体接続し、前端350aと前端350aと反対の後端350bを有し、高さH3は大チャンバー340の深さDより小さい、チャンバー経路350。
(e)長さL4、幅W4及び高さH4を有し、流入経路320、大チャンバー340及びチャンバー経路350の横に位置し、第1の端部360aと第1の端部360aの反対にある第2の端部360bを有し、第1の端部360aは捕捉部位322のすぐ前の流入経路320から分岐し、第2の端部360bはその後端350bでチャンバー経路と結合し、幅W4及び高さH4は捕捉経路の幅W2及び高さH2より大きい、バイパス経路360。
図3Aを参照する。細胞懸濁液がユニット300の入口経路310に装填される。個々の細胞はカラムの配列内の第1のユニット300の流入経路320に入る。第1の単一細胞370が第1のユニット300の流入経路320の捕捉部位322で捕捉される。カラムの配列内のユニット300、…306、307は流体接続される。各カラムの配列の最後のユニット307は出口経路392に連結される流出経路390を有する。
図3Bを参照する。、個々の細胞370がユニット306の流入経路320の捕捉部位322で捕捉されると、結果として大チャンバー340への流体経路の流れ抵抗が増加し、後に続く細胞380がユニット306の蛇行するバイパス経路360へ向かって流れ、すぐ隣の下流ユニット307の流入経路320に入り、その捕捉部位322で捕捉される。
図3Dを参照する。培地がユニット307の出口経路392及び流出経路390を通ってマイクロチャネルを逆流させるのに使用される。ユニット307内の捕捉された細胞380はユニット307の流入経路320の捕捉部位322から放出され、ユニット306のチャンバー経路350を通ってすぐ隣の上流ユニット306の大チャンバー340へ流れる。
1)1μLの細胞懸濁液が注射器ポンプを使用することにより10μL/分の流速で入口経路に装填される。個々の単一細胞は単一のカラムの第1のユニットの流入経路に流入し、第1の細胞は捕捉部位で捕捉される(図3A)。細胞が捕捉部位で捕捉されると、結果として大チャンバーへの流体経路の流れ抵抗が増加し、後に続く細胞は蛇行するバイパス経路(図3B)に向かって流れ、すぐ次の下流ユニットの流入経路に入る(図3B)。
2)5マイクロリットルの未使用培地が注射器ポンプを使用することにより0.3μL/分の流速で経路に装填され(図3C)、マイクロチャネルから余分な細胞を洗い流す。
3)最後に、0.6μLの未使用培地の10μL/分での逆流がマイクロチャネルに導入され、捕捉部位から捕捉された細胞を放出し、これらの細胞を大チャンバーに移動した(図3D)。
大チャンバーへの流れ抵抗はバイパス経路を経由するより小さいため、放出された細胞はバイパス経路ではなく大チャンバーに流入する。更に、大チャンバーの拡大された断面積のため、大チャンバーの中で流速は大幅に減少し、それは大チャンバー内の装填された細胞が流れによって運び去られ、受容部位と捕捉経路の交点で捕捉されることを防止する。MCF−7細胞の実演のため、全体の手順は20分で実行される。
上記のステップを繰り返すことにより他の細胞種類の個々の細胞が大チャンバーに装填され得る。
1)5マイクロリットルの細胞懸濁液が注射器ポンプを使用することにより0.3μL/分の流速で経路に装填される。このステップにおいて個々の単一細胞は捕捉部位で捕捉される。
2)5マイクロリットルの未使用培地が注射器ポンプを使用することにより0.3μL/分の流速で経路に装填され、マイクロチャネルから余分な細胞を洗う。
3)最後に、10μLの未使用培地の200μL/分の逆流がマイクロチャネルに導入され、捕捉部位から捕捉された細胞を放出し、これらの細胞を大チャンバーに移動する。全体の手順は40分で実行され得る。
用語「1A」は「1つの単一MDA−MB−231細胞」を指す。
用語「1B」は「1つの単一MCF−7細胞」を指す。
用語「1A+1B」は「1つの単一MDA−MB−231細胞及び1つの単一MCF−7細胞」を指す。
用語「>1A+1B」は「1つより多くの単一MDA−MB−231細胞及び1つの単一MCF−7細胞」を指す。
310・・・・・・・・・・入口経路
320・・・・・・・・・・流入経路
320a、350a・・・・前端
320b、350b・・・・後端
322・・・・・・・・・・捕捉部位
330・・・・・・・・・・捕捉経路
340・・・・・・・・・・大チャンバー
342・・・・・・・・・・受容部位
350・・・・・・・・・・チャンバー経路
360・・・・・・・・・・バイパス経路
360a・・・・・・・・・第1の端部
360b・・・・・・・・・第2の端部
370、380・・・・・・単一細胞
390・・・・・・・・・・流出経路
392・・・・・・・・・・出口経路
Q1、Q2・・・・・・・・体積流量
Claims (14)
- 分離した単一細胞を捕捉する方法であって、
(a)単一細胞捕捉ユニットの配列を備える流体力学シャトリングチップ機器を提供するステップであって、前記単一細胞捕捉ユニットのそれぞれは、
(構成a)長さL1、幅W1、高さH1を有し、前端及び前記前端の反対側にある後端を有し、前記後端は捕捉部位を有する流入経路と、
(構成b)直径M及び深さDを有し、前記流入経路の前記捕捉部位の後に位置し、前記捕捉部位から距離gだけ離れた受容部位を有し、1つより多くの単一細胞が付着、成長、増殖及び/又は移動するように形成された内部空間を有する大チャンバーと、
(構成c)長さL2、幅W2、高さH2を有し、前記捕捉部位と前記受容部位の間に位置し、前記流入経路と前記大チャンバーとを流体連結する捕捉経路と、
(構成d)長さL3、幅W3、高さH3を有し、前記大チャンバーの後に位置し、前記大チャンバーと流体接続し、前端及び前記前端の反対側にある後端を有し、前記高さH3は前記大チャンバーの深さDより小さいチャンバー経路と、
(構成e)長さL4、幅W4、高さH4を有し、前記流入経路、前記大チャンバー及び前記チャンバー経路の横に位置し、第1の端部と前記第1の端部の反対側にある第2の端部を有し、前記第1の端部は前記捕捉部位のすぐ前の前記流入経路から分岐し、前記第2の端部は前記チャンバー経路の前記後端で前記チャンバー経路と合流し、前記幅W4及び前記高さH4は前記捕捉経路の前記幅W2及び前記高さH2より大きいバイパス経路と、
を備え、
前記配列の各カラムにおいて、
(i)前記単一細胞捕捉ユニットは流体接続し、
(ii)各ユニットの前記流入経路は、第1のユニットを除き、すぐ次の上流ユニットの前記チャンバー経路と流体連結し、
(iii)各ユニットの前記バイパス経路は、最後のユニットを除き、すぐ次の下流ユニットの前記流入経路と流体接続する、
ステップと、
(b)単一種類の分離した細胞を含む培地を、一列に並んだ前記配列における第1の単一細胞捕捉ユニットの前記流入経路に装填するステップと、
(c)前記単一種類の分離した細胞を前記捕捉部位で捕捉するステップと、
(d)捕捉されていない、余分な細胞を未使用培地で洗い流すステップと、
(e)経路に培地を逆流させ、捕捉された前記単一種類の分離した細胞を放出し、放出された細胞を前記大チャンバーに逆流させるステップと、
を含む分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 1つより多くの種類の分離した単一細胞を捕捉する方法であって、
(a)単一細胞捕捉ユニットの配列を備える流体力学シャトリングチップ機器を提供するステップであって、前記単一細胞捕捉ユニットのそれぞれは、
(構成a)長さL1、幅W1、高さH1を有し、前端及び前記前端の反対側にある後端を有し、前記後端は捕捉部位を有する流入経路と、
(構成b)直径M及び深さDを有し、前記流入経路の前記捕捉部位の後に位置し、前記捕捉部位から距離gだけ離れた受容部位を有し、1つより多くの単一細胞が付着、成長、増殖及び/又は移動するように形成された内部空間を有する大チャンバーと、
(構成c)長さL2、幅W2、高さH2を有し、前記捕捉部位と前記受容部位の間に位置し、前記流入経路と前記大チャンバーとを流体連結する捕捉経路と、
(構成d)長さL3、幅W3、高さH3を有し、前記大チャンバーの後に位置し、前記大チャンバーと流体接続し、前端及び前記前端の反対側にある後端を有し、前記高さH3は前記大チャンバーの深さDより小さいチャンバー経路と、
(構成e)長さL4、幅W4、高さH4を有し、前記流入経路、前記大チャンバー及び前記チャンバー経路の横に位置し、第1の端部と前記第1の端部の反対側にある第2の端部を有し、前記第1の端部は前記捕捉部位のすぐ前の前記流入経路から分岐し、前記第2の端部は前記チャンバー経路の前記後端で前記チャンバー経路と合流し、前記幅W4及び前記高さH4は前記捕捉経路の前記幅W2及び前記高さH2より大きいバイパス経路と、
を備え、
前記配列の各カラムにおいて、
(i)前記単一細胞捕捉ユニットは流体接続し、
(ii)各ユニットの前記流入経路は、第1のユニットを除き、すぐ次の上流ユニットの前記チャンバー経路と流体連結し、
(iii)各ユニットの前記バイパス経路は、最後のユニットを除き、すぐ次の下流ユニットの前記流入経路と流体接続する、
ステップと、
(b)特定の種類の分離した単一細胞を含む培地を一列に並んだ前記配列における第1の単一細胞捕捉ユニットの前記流入経路に装填するステップと、
(c)前記特定の種類の分離した単一細胞を前記捕捉部位で捕捉するステップと、
(d)捕捉されていない、余分な細胞を未使用培地で洗い流すステップと、
(e)前記チャンバー経路を逆流させ、前記特定の種類の捕捉された単一細胞を放出し、前記特定の種類の放出された細胞を前記大チャンバーに逆流させるステップと、
(f)それぞれの繰り返しのステップにおいて、前記分離した単一細胞が異なる種類であることを条件として、前記ステップ(b)、(c)、(d)、(e)を1回以上繰り返すステップと、
を含む分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
前記配列の各カラムにおいて、各ユニットの前記チャンバー経路は、最後のユニットを除き、すぐ隣の下流ユニットの前記流入経路と流体接続する、請求項1または2に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
前記配列の各カラムにおいて、前記最後のユニットの前記チャンバー経路は流出経路と流体接続する、請求項3に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
前記配列の各カラムにおいて、前記第1のユニットの前記流入経路は入口経路と流体接続され、前記最後のユニットの前記流出経路は出口経路と流体接続する、請求項4に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
(a)前記入口経路と流体接続する入口と、
(b)前記出口経路と流体接続する出口と、を更に備える、請求項5に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
前記配列のカラム間の前記単一細胞捕捉ユニットは入口経路及び出口経路を介して流体接続する、請求項1または2に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
前記流入経路、前記捕捉経路、前記チャンバー経路及び前記バイパス経路の表面はアルブミンで覆われている、請求項1または2に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
前記大チャンバー内に1つ又は複数の種類の分離した単一細胞を更に含む、請求項1または2に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
少なくとも2種類の分離した単一細胞を前記大チャンバー内に含む、請求項9に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
単一細胞懸濁液を更に含み、前記単一細胞のサイズは前記バイパス経路の断面より小さいが、前記捕捉経路の断面より大きい、請求項1または2に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
透明な基板に隣接する、請求項1に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ガラス、熱可塑性プラスチック材料及びそれらの組合せから成る群から選択される材料から作製される、請求項1または2に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。 - 前記流体力学シャトリングチップ機器は、
前記バイパス経路は前記ユニットの片側に沿って横方向に蛇行する、請求項1または2に記載の分離した単一細胞を捕捉する方法。
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