CN109868219A - 一种单细胞水平的代谢检测芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单细胞水平的代谢检测芯片及其应用。所述单细胞水平的代谢检测芯片包括一个以上培养检测单元，每一培养检测单元包括液流层、气动控制层以及透气弹性膜，所述透气弹性膜设置于所述液流层和气动控制层之间，所述液流层包括一条以上液流管道，至少一液流管道底部分布有一个以上捕获单元，所述气动控制层至少用于驱使透气弹性膜产生趋向液流层的形变和/或位移，从而使透气弹性膜与选定捕获单元配合捕获从与选定捕获单元相应液流管道内流经的流体所携带的至少一个具有溶氧和/或pH检测功能的微球或单细胞。本发明的检测芯片可以探究单细胞在不同溶氧梯度下的生长状态以及代谢情况，实现对溶氧和酸度变化情况的实时检测。

Description

一种单细胞水平的代谢检测芯片及其应用

技术领域

本发明涉及一种单细胞水平的代谢检测芯片，尤其涉及一种能够检测在不同溶氧梯度下单细胞生长及代谢情况的芯片及其应用，属于微流控芯片及生物技术领域。

背景技术

细胞是生物体结构和功能的基本单位。大多数的研究往往以细胞群体作为研究对象，得到的结果是整个细胞群或组织层面的宏观表征。但是，同种细胞的不同个体间存在着显著的微观不均一性(异质性),基于大量细胞的实验结果难以反映单细胞水平上的生命活动规律。因此迫切需要研发基于单细胞的培养及分析方法，用来研究不同细胞个体间的差异性，了解细胞的遗传与代谢机制。从大量细胞中获得单个细胞是进行单细胞培养与分析的第一步。传统的单细胞获取方法常采用对细胞群进行大量稀释或者显微操作的方法来进行。整个操作步骤复杂繁琐，单细胞获得效率低。

氧气在细胞功能和行为中扮演着重要的地位。细胞的生长速率和代谢以及蛋白的合成很大一部分取决于培养基中氧气的水平。在人体中，氧化的水平非常的重要。当改变氧的含量，从富氧到低氧再到无氧，会发生强烈的生物反应。有研究表明，低氧可以促进再生干细胞的增殖。然而，低氧也可以导致病理学的产生，包括炎症、肿瘤的产生以及心血管疾病等。因此研究在不同的溶氧条件下单细胞生长状态以及代谢情况非常重要。目前，在低氧环境中研究细胞行为的方法有缺氧工作站及缺氧小室，但是这些不能形成氧气浓度梯度。

为了满足以上需要，各种微流体装置已经被开发用于单细胞的捕获以及严格控制氧气量。

微流控技术为研究溶氧梯度的微环境提供了优秀的平台。目前已经有很多研究细胞在不同氧浓度下的行为状况。例如2011年，Chen,et al.报道了一种用于细胞培养的氧浓度梯度芯片，在细胞处于氧浓度梯度的情况下检测了缺氧情况下抗肿瘤药物替拉扎明(TPZ)对肿瘤细胞的影响。然而，现在的技术往往研究的是不同氧浓度梯度下细胞整个群体的行为。因此，他们并没有研究同一培养物中不同个体细胞之间的代谢特征的异质性，没有探究单个细胞在不同氧浓度下的行为。显而易见的是基于大量细胞的实验结果难以反映单细胞水平上的生命活动规律。

2012年，Laimonas Kelbauskas,et al.报道了一种研究单细胞水平下氧的消耗速率的芯片。该芯片可以通过利用微室将细胞进行分离，然后利用非接触的压电配液机器人将氧敏感染料滴入微室内，接着将小室密封，这样就可以测出单细胞水平下氧的消耗。该芯片虽然通量高，但是氧敏感检测手段复杂。进一步的，该课题组在2017年报道了单细胞水平下氧和pH的变化情况，该方法揭示了具有异常能量产生概况的细胞亚群，并且可以确定对电子转移链抑制剂和离子解偶联剂的细胞应答可变性，同样的该方法所用到的仪器较昂贵，检测手段制作过程复杂。

有鉴于此，有必要提供一种可以研究不同的溶氧梯度下单细胞水平的生命活动规律的芯片，同时对溶氧条件进行实时检测。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种单细胞水平的代谢检测芯片及其与应用，以克服现有技术的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种单细胞水平的代谢检测芯片，其包括一个以上培养检测单元，每一培养检测单元包括液流层、气动控制层以及透气弹性膜，所述透气弹性膜设置于所述液流层和气动控制层之间，所述液流层包括一条以上液流管道，其中至少一液流管道底部分布有一个以上捕获单元，所述气动控制层至少用于驱使透气弹性膜产生趋向液流层的形变和/或位移，从而使透气弹性膜与选定捕获单元配合捕获从与选定捕获单元相应液流管道内流经的流体所携带的至少一个具有溶氧和/或pH检测功能的微球或单细胞。

本发明实施例还提供了一种单细胞水平的代谢检测方法，其包括：

提供前述的单细胞水平的代谢检测芯片；

向所述芯片的液流层中注入包含溶氧检测微球和pH检测微球的载液，并使所述载液按照预定流速在选定的液流管道内流动；

以气动控制层驱使透气弹性膜将所述载液中的部分溶氧检测微球和pH检测微球挤压入选定捕获单元，实现溶氧检测微球和pH检测微球的捕捉，再清除所述选定液流管道内未被捕获单元捕捉的溶氧检测微球和pH检测微球；

至少向所述选定液流管道内注入包含细胞的细胞培养液，再以气动控制层驱使透气弹性膜将所述细胞培养液内的单细胞挤压入所述选定的捕获单元，实现单细胞的捕捉；以及

对所述单细胞进行培养，并在培养过程中和/或培养结束后，以被捕获的溶氧检测微球和pH检测微球检测所述单细胞的培养体系中的溶氧含量和酸度情况。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

1)本发明提供的单细胞水平的代谢检测芯片结构简单设计合理，首先利用微柱阵列卡住所需要研究的单细胞，可以较高的捕获住单细胞，且捕获的细胞不易脱落；同时，利用设计的不同氧浓度梯度产生结构，来探究单细胞在不同溶氧梯度下的生长状态以及代谢情况，同时实现在单细胞培养过程中对溶氧和酸度变化情况的实时检测，为研究单细胞水平上的生命活动规律提供了一种方案；进一步的也可以用来研究单细胞在不同溶氧条件下与药物的相互作用；

2)本发明提供的单细胞水平的代谢检测芯片集成了单细胞捕获、溶氧调控与溶氧和酸度检测于一体，制作工艺简单，单位面积上集成的单元数量也能大幅提高，具有更高的培养分析效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行简单的介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅作为本文发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1是本发明一典型实施例中单细胞水平的代谢检测芯片的俯视图。

图2是图1中单细胞水平的代谢检测芯片中A部分的局部放大示意图。

图3是图1中单细胞水平的代谢检测芯片沿线B-B的剖面结构示意图。

图4是本发明一典型实施例中单细胞水平的代谢检测芯片中形成的溶氧梯度示意图。

附图标记说明：110-液流层，1101-液流管道，120-气动控制层，130-透气弹性膜，1201、1202、1203、1204-气动控制管道，1301-微柱，1001-溶氧检测微球，1002-pH检测微球，1000-单细胞。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是首先利用微柱结构卡住所需要研究的单细胞，然后利用设计的不同氧浓度梯度产生结构，可成功探究单细胞在溶氧梯度下的生长及代谢情况，为研究单细胞水平上的生命活动规律提供了一种方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的系一种单细胞水平的代谢检测芯片，其包括一个以上培养检测单元，每一培养检测单元包括液流层、气动控制层以及透气弹性膜，所述透气弹性膜设置于所述液流层和气动控制层之间，所述液流层包括一条以上液流管道，其中至少一液流管道底部分布有一个以上捕获单元，所述气动控制层至少用于驱使透气弹性膜产生趋向液流层的形变和/或位移，从而使透气弹性膜与选定捕获单元配合捕获从与选定捕获单元相应液流管道内流经的流体所携带的至少一个具有溶氧和/或pH检测功能的微球或单细胞。

在一实施方案之中，所述气动控制层包括一条以上气动控制管道，其中至少一气动控制管道与至少一液流管道在一个以上的捕获区域处交叉，当向所述的至少一条气动控制管道通入具有设定压力的气体时，所述的至少一条气动控制管道能够驱使所述透气弹性膜在选定的捕获区域处产生所述的趋向液流层的形变和/或位移，所述选定的捕获单元分布于所述选定的捕获区域内。

在一实施方案之中，在向所述至少一气动控制管道内通入含有氧气的流体时，至少在所述捕获区域处，所述至少一气动控制管道内的氧气能够透过透气弹性膜进入液流管道。

在一实施方案之中，所述捕获单元包括分布于液流管道内的微柱阵列，所述微柱阵列包括复数个微柱，其中相邻的三个以上微柱围合形成一捕获空穴，所述捕获空穴用于捕捉所述的微球或单细胞。

在一实施方案之中，所述培养检测单元还包括至少一微阀，每一微阀包括分布于所述气动控制层内的一气动控制管道，所述气动控制管道与一液流管道在选定位置处交叉，当向所述气动控制管道通入压力不小于一阈值的气体时，所述气动控制管道能够驱使所述透气弹性膜产生所述的趋向液流层的形变和/或位移，从而将至少一液流管道在选定位置处关闭，即为氧浓度梯度产生结构。

气动控制管道中的气体会在与液流管道(为环状闭合管道)的交叉处，通过透气弹性膜扩散到环状闭合管道的培养液中。通过改变气动控制管道与液流管道交叉的面积和交叉点的数量就可以改变气体扩散进入培养液的量，从而改变培养检测单元中的溶解氧浓度；另外也可以改变气动控制管道通入气体的浓度来改变培养检测单元中的溶解氧的浓度。如管道大小、形状、冲入气体成分完全一致，则可实现相同的溶解度浓度。气动控制管道中的气体可以为氧气或含氧的气体。通过气动控制管道结构的设计可以实现在培养检测单元中的氧浓度梯度，进而可以研究单细胞在氧浓度梯度下的代谢行为。

在一实施方案之中，所述培养检测单元还包括至少一微泵，每一微泵包括分布于所述气动控制层内的两条以上气动控制管道，所述两条以上气动控制管道与至少一液流管道在不同位置处交叉，当在设定时段向所述两条以上气动控制管道内分别输入具有不同压力的气体时，所述两条以上气动控制管道能够分别驱使所述透气弹性膜的不同局部区域产生不同程度的形变和/或位移，从而在所述至少一液流管道内产生能够驱使液流单向流动的力。

在一实施方案之中，所述液流层中捕获单元均匀分布于相应的气动控制管道下方并与该气动控制管道连通。

进一步的，每个培养检测单元中的捕获单元间隔分布于相应液流管道底部，例如，以500μm、1500μm、2500μm、3500μm间隔排布。

在一实施方案之中，所述捕获空穴包括用以捕捉pH检测微球的空穴、用以捕捉溶氧检测微球的空穴和用以捕捉细胞的空穴。

其中，一开始时气动控制管道也可以用于溶氧检测微球或pH检测微球或单细胞的捕获，气动控制管道在冲入一定压力条件下产生驱使所述透气弹性膜产生不同程度的形变和/或位移，从而在所述透气弹性膜与液流层之间形成用于截留流经液流管道的液体内单个溶氧检测微球或pH检测微球或单细胞的捕获区域。

进一步的，用以捕捉细胞的空穴的直径稍小于或等于单个细胞的直径。

同样的，用以捕捉pH检测微球的空穴的直径稍小于或等于单个溶氧检测微球的直径。

同样的，用以捕捉溶氧检测微球的空穴的直径稍小于或等于单个pH检测微球的直径。

优选的，所述微球包括pH检测微球及溶氧检测微球，所述pH检测微球、溶氧检测微球及细胞的直径均不同。

进一步的，所述溶氧检测微球的直径小于pH检测微球的直径小于细胞的直径。

进一步的，所述溶氧检测微球的材质既可以只包含氧敏感性材料又可以包含氧敏感性材料和氧不敏感材料(做参比)。

在一实施方案之中，所述溶氧检测微球采用乳液聚合法合成。本发明采用乳液聚合法来合成溶氧检测微球，该方法合成微球的效率高，实施起来简单可行。

在一实施方案之中，所述溶氧检测微球的制备方法包括：使包含氧敏感性材料、包裹材料预聚体、交联剂、表面活性剂、有机溶剂及水的混合反应体系于40～80℃进行聚合反应5～10h，获得所述溶氧检测微球.

在一实施方案之中，所述溶氧检测微球的制备方法包括：

提供包含氧敏感性材料(也可以称为氧敏感性染料)、包裹材料预聚体、交联剂和有机溶剂的均匀混合体系，将所述均匀混合体系与表面活性剂的水溶液均匀混合，并于40～80℃下进行聚合反应5～10h，获得所述溶氧检测微球溶液。

优选的，所述包裹材料预聚体与交联剂的质量比为5：1～10：1。

进一步的，溶氧检测微球合成时，除了可以选择用PDMS作为包裹含氧敏感性材料的材质，还可以选择其他的代替如PS，或是将PDMS与PS混合用来包裹含氧敏感性材料。

优选的，所述溶氧检测微球的材质既可以只包含氧敏感性材料又可以包含氧敏感性材料和氧不敏感材料(做参比)。

进一步的，所述氧敏感性材料包括PtTFPP、PtOEP、PtOEPK等，但不限于此。

更进一步的，所述氧敏感性材料的浓度为1～4mmol/L。

优选的，所述氧不敏感材料包括PFO(聚芴)、MFY(荧光黄)等，但不限于此。

进一步的，表面活性剂可以选择为SDS(十二烷基硫酸钠)、PVA(聚乙烯醇)等，但不限于此。

进一步优选的，当所述表面活性剂选用SDS时，SDS的浓度范围为0.05～0.2mol/L；当所述表面活性剂选用PVA时，所述混合反应体系中PVA的含量为1～15wt％。

优选的，所述交联剂包括硅烷偶联剂，进一步的，所述交联剂具有链烯基(主要为乙烯基)，以及末端具有Cl-、NH₂-、SH-、环氧基、N₃-、(甲基)丙烯酰氧基和异氰酸酯基等官能团中的至少一种的烃基，尤其优选为含有乙烯基的交联剂。

优选的，所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、苯乙烯和甲苯等既可以溶解氧敏感性材料又可以溶解PDMS等包裹材料预聚体的溶剂，但不限于此。

进一步的，溶氧检测微球合成时，微球的大小可以通过调控溶剂的量和/或表面活性剂的浓度来控制。例如当溶剂的使用范围为3～5毫升时，合成的溶氧检测微球粒径为8～15微米左右。

在一实施方案之中，所述溶氧检测微球的制备方法还包括：以常压蒸馏、减压蒸馏等方式中的任一种将所述溶氧检测微球溶液中的有机溶剂去除。进一步的，优选采用减压蒸馏的方式，因为以减压蒸馏方式合成的溶氧检测微球分散性较好，粒径更均一。

其中，所述pH检测微球的制备方法与溶氧检测微球的制备方法较为相似，其直径大小亦可以根据表面活性剂的浓度和有机溶剂的量进行调整。

在一实施方案之中，所述微柱的形状包括圆柱型、长方体、梯台、圆锥体、开放式槽型结构(新月型)中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。

进一步的，所述微柱的直径为10微米，高度为10微米。

在一实施方案之中，所述液流管道经设置在所述芯片上的接口与外界连通。

优选的，所述液流管道包括至少一环形液流管道。

优选的，所述透气弹性膜的材质包括聚二甲基硅氧烷，但不限于此。

本发明提供的单细胞水平的代谢检测芯片结构简单设计合理，首先利用微柱阵列卡住所需要研究的单细胞，可以较高的捕获住单细胞，且捕获的细胞不易脱落；同时，利用设计的不同氧浓度梯度产生结构，来探究单细胞在不同溶氧梯度下的生长状态以及代谢情况，同时实现在单细胞培养过程中对溶氧和酸度变化情况进行实时检测，为研究单细胞水平上的生命活动规律提供了一种方案；进一步的也可以用来研究单细胞在不同溶氧条件下与药物的相互作用。

作为本发明技术方案的另一个方面，其所涉及的系前述单细胞水平的代谢检测芯片的应用。

例如，作为本发明技术方案的另一个方面，其所涉及的系一种单细胞水平的代谢检测方法，其包括：

提供前述的单细胞水平的代谢检测芯片；

向所述芯片的液流层中注入包含溶氧检测微球和pH检测微球的载液，并使所述载液按照预定流速在选定的液流管道内流动；

以气动控制层驱使透气弹性膜将所述载液中的部分溶氧检测微球和pH检测微球挤压入选定捕获单元，实现溶氧检测微球和pH检测微球的捕捉，再清除所述选定液流管道内未被捕获单元捕捉的溶氧检测微球和pH检测微球；

至少向所述选定液流管道内注入包含细胞的细胞培养液，再以气动控制层驱使透气弹性膜将所述细胞培养液内的单细胞挤压入所述选定的捕获单元，实现单细胞的捕捉；以及

对所述单细胞进行培养，并在培养过程中和/或培养结束后，以被捕获的溶氧检测微球和pH检测微球检测所述单细胞的培养体系中的溶氧含量和酸度情况。

优选的，所述检测方法还包括：在对所述单细胞开始进行培养时和/或培养的过程中，向所述气动控制层的至少一气动控制管道内输入包含氧气的流体，并使其中的氧气透过透气弹性膜进入所述选定液流管道，进而改变所述选定液流管道内的溶氧度。

进一步的，所述含氧流体包括含氧气体、含氧液体或产氧/去氧性的化学试剂。

优选的，所述含氧气体可以是氧气或含氧的气体，例如氮气和二氧化碳中的至少一种与氧气的组合，但不限于此。

优选的，所述溶氧检测方法还包括：通过光学成像检测溶氧检测微球和pH检测微球产生的光强度信号，从而测定所述单细胞的培养体系中的溶氧含量和酸度情况。

本发明提供的单细胞水平的代谢检测芯片集成了单细胞捕获、溶氧调控与溶氧和酸度检测于一体，制作工艺简单，单位面积上集成的单元数量也能大幅提高，具有更高的培养分析效率。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-图3所示，本发明一典型实施例的单细胞水平的代谢检测芯片由三个上下层叠的结构层组成。底层是液流层110，上层是气动控制层120，两层之间有透气弹性膜130相隔。液流层110中有液流管道1101(亦即环状闭合管道)，其宽为100微米，高为20微米左右，两端均与外连通，在液流管道1101局部区域底部有6个凸起的微柱1301，其直径为10微米，高为10微米，其中中间四个微柱间围成的区域即为用以捕捉细胞的空穴，一边一个微柱和围成用以捕捉细胞的空穴的微柱间的空隙即为用以捕捉溶氧检测微球的空穴，另一边一个微柱和围成用以捕捉细胞的空穴的微柱间的空隙即为用以捕捉pH检测微球的空穴。气动控制层120中有气动控制管道1201、1202、1203、1204。其中，所述气动控制层中分布的气动控制管道1204亦可称为供气管道，气动控制管道1201为循环驱动管道，其用以形成微泵，气动控制管道1202和1203用以形成微阀。其中，供气管道为一根或数根与外界气源相连的管道，所有管道深度为10微米左右。

本发明的单细胞水平的代谢检测芯片的检测原理如下：

三个微柱围成一个与溶氧检测微球相等或略小的区域，即用以捕捉溶氧检测微球的空穴。当溶氧检测微球在此区域垂直方向流过时，气动控制管道1204周期性反复加压使透气弹性膜产生形变，向对侧周期性挤压液流管道1101，如此有溶氧检测微球流经位于溶氧检测微球捕获空穴对应的区域时，溶氧检测微球即被挤压卡在微柱之间的捕获空穴，完成单个溶氧检测微球的捕获。pH检测微球的捕获方式与上述溶氧检测微球相似，且pH检测微球大于溶氧检测微球。捕获的单个溶氧检测微球和pH检测微球产生的光学信号被外界光学探测器收集，从而可以对液体管道1101中的溶氧和酸度水平进行检测。四个微柱围成一个与细胞大小相等或略小的区域，即用以捕捉细胞的空穴，当细胞在此区域垂直方向流过时，气动控制管道1204周期性反复加压使透气弹性膜产生形变，向对侧周期性挤压液流管道1101，如此有细胞流经位于细胞捕获空穴对应的区域时，细胞即被挤压卡在微柱之间的捕获空穴，完成单细胞的捕获。将液流管道中多余细胞冲洗出管道后，该段液流管道即含有单个细胞。换液时，仅需向捕获有单细胞的液流管道注入新液即可。气动控制管道1204中的气体会在与液流管道1101(环状闭合管道)的交叉处，通过透气弹性膜130扩散到液流管道1101(环状闭合管道)的培养液中。通过改变气动控制管道1204与液流管道1101交叉的面积和交叉点的数量就可以改变气体扩散进入培养液的量，从而改变培养检测单元中的溶解氧浓度；另外也可以改变气动控制管道1204通入气体的浓度来改变培养检测单元中的溶解氧的浓度。如管道大小、形状、冲入气体成分完全一致，则可实现相同的溶解度浓度。气动控制管道1204中的气体可以为氧气或含氧的气体。通过气动控制管道1204结构的设计可以实现在培养检测单元中的氧浓度梯度，进而可以研究单细胞在氧浓度梯度下的代谢行为。

其中，作为一更为具体的实施案例之一，本发明的单细胞水平的代谢检测芯片的应用检测过程如下所述：

结合图1-图3，先向液流管道1101中注入包含溶氧检测微球1001和pH检测微球1002的混合溶液，然后向气动控制管道1204中周期性充入高压流体，待捕获空穴捕获了单个溶氧检测微球1001和pH检测微球1002后，撤去气动控制管道1204中的气压，向液流管道中1101中注入清洗液，将多余的未捕获的溶氧检测微球或pH检测微球冲出，则得到捕获的单个溶氧检测微球和pH检测微球。接着向液流管道1101中注入细胞悬液，然后向气动控制管道1204中周期性充入高压流体，待捕获空穴捕获了单细胞1000后，撤去气动控制管道1204中的气压，向液流管道1101中注入清洗液，将多余的未捕获的细胞冲出，则得到捕获的单细胞1000。接着向气动控制管道1204中充入含氧气的气体，充气后可封闭气动控制管道1204两端的接口，保持常压，也可以在培养过程中持续以较低压力向气动控制管道1204冲入湿润的含氧气体，实现细胞在不同氧浓度梯度的液流管道中培养，并对其培养过程中的溶氧和酸度情况进行实时检测。

本发明的一更为典型的实施例可以包括如下实施过程：

一、溶氧检测微球的合成：采用乳液聚合的方法来合成上述微球。

实验过程如下：

a)配制0.2Mol SDS和14wt％PVA的表面活性剂溶液，各取15ml加入100ml的烧瓶中，调节温度旋钮升温到40度，转速调至300rpm左右。

b)取一个离心管，加入已经混合好的PDMS预聚体和交联剂0.6g(固化比10：1)。

c)再取一支离心管，将氧敏感染料PtTFPP与氧不敏感染料PFO以质量比4：2的比例溶解到4ml的三氯甲烷里，PtTFPP的最终浓度为1mmol/l。

d)将上述b)和c)混合，震荡5min，使其完全均匀混合。

e)用注射泵将上述d)制备的溶液用10μl/min的速率滴入烧瓶内。

f)保温旋转分散2h，然后打开真空泵开关减压至0.08Mpa左右，减压过程结束后，保温1h，即可得到溶氧检测微球的悬浊液。

二、pH检测微球的合成：采用乳液聚合的方法来合成上述微球。

实验过程如下：

a)配制0.2Mol SDS和8wt％PVA的表面活性剂溶液，各取15ml加入100ml的烧瓶中，调节温度旋钮升温到40度，转速调至300rpm左右。

b)取一个离心管，加入已经混合好的PDMS预聚体和交联剂0.6g(固化比10：1)。

c)再取一支离心管，以mHPTS：mPFO＝1：1的比例溶解到4ml的三氯甲烷里。

d)将上述b)和c)混合，震荡5min，使其完全均匀混合。

e)用注射泵将上述d)制备的溶液用10μl/min的速率滴入烧瓶内。

f)保温旋转分散2h，然后打开真空泵开关减压至0.08Mpa左右，减压过程结束后，保温1h，即可得到pH检测微球的悬浊液。

本案发明人还参照前述制备过程，以本说明书中列出的其它原料及工艺条件进行了溶氧检测微球、pH检测微球的制备。

三、溶氧检测微球和pH检测微球通入芯片

将合成的溶氧检测微球和pH检测微球按照1：1的比例混合后稀释到合适水平，向各培养检测单元中的液流管道1101中通入上述检测微球混合溶液，待溶氧检测微球1001和pH检测微球1002被捕获在下层的捕获阵列中后如图3所示，用水将液流管道中多余的溶氧检测微球或pH检测微球冲走。最后向气动控制管道1204中连续通入湿润的空气，在培养检测单元的液流管道中形成如图4的溶氧梯度。最后向各培养检测单元中的液流管道1101中通入含细胞的培养液，进行溶氧梯度下的细胞培养。培养一段时间后进行溶氧的检测和酸度的检测，通过光学成像检测，收集光强度信号，据此进行培养过程中溶氧梯度下的代谢的测定。测定结果显示，藉由本发明的前述代谢检测芯片，可以精确、高效地实现单细胞水平的溶氧梯度下的代谢的测定。

综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明的单细胞水平的代谢检测芯片可以探究单细胞在不同溶氧梯度下的生长状态以及代谢情况，实现对溶氧和酸度变化情况的实时检测，还可以用来研究单细胞在不同溶氧条件下与药物的相互作用。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于包括一个以上培养检测单元，每一培养检测单元包括液流层、气动控制层以及透气弹性膜，所述透气弹性膜设置于所述液流层和气动控制层之间，所述液流层包括一条以上液流管道，其中至少一液流管道底部分布有一个以上捕获单元，所述气动控制层至少用于驱使透气弹性膜产生趋向液流层的形变和/或位移，从而使透气弹性膜与选定捕获单元配合捕获从与选定捕获单元相应液流管道内流经的流体所携带的至少一个具有溶氧和/或pH检测功能的微球或单细胞。

2.根据权利要求1所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：所述气动控制层包括一条以上气动控制管道，其中至少一气动控制管道与至少一液流管道在一个以上的捕获区域处交叉，当向所述的至少一条气动控制管道通入具有设定压力的气体时，所述的至少一条气动控制管道能够驱使所述透气弹性膜在选定的捕获区域处产生所述的趋向液流层的形变和/或位移，所述选定的捕获单元分布于所述选定的捕获区域内。

3.根据权利要求2所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：在向所述至少一气动控制管道内通入含有氧气的流体时，至少在所述捕获区域处，所述至少一气动控制管道内的氧气能够透过透气弹性膜进入液流管道。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：所述捕获单元包括分布于液流管道内的微柱阵列，所述微柱阵列包括复数个微柱，其中相邻的三个以上微柱围合形成一捕获空穴，所述捕获空穴用于捕捉所述的微球或单细胞。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：所述培养检测单元还包括至少一微阀，每一微阀包括分布于所述气动控制层内的一气动控制管道，所述气动控制管道与一液流管道在选定位置处交叉，当向所述气动控制管道通入压力不小于一阈值的气体时，所述气动控制管道能够驱使所述透气弹性膜产生所述的趋向液流层的形变和/或位移，从而将至少一液流管道在选定位置处关闭。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：所述培养检测单元还包括至少一微泵，每一微泵包括分布于所述气动控制层内的两条以上气动控制管道，所述两条以上气动控制管道与至少一液流管道在不同位置处交叉，当在设定时段向所述两条以上气动控制管道内分别输入具有不同压力的气体时，所述两条以上气动控制管道能够分别驱使所述透气弹性膜的不同局部区域产生不同程度的形变和/或位移，从而在所述至少一液流管道内产生能够驱使液流单向流动的力。

7.根据权利要求4所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：所述捕获空穴包括用以捕捉pH检测微球的空穴、用以捕捉溶氧检测微球的空穴和用以捕捉细胞的空穴。

8.根据权利要求4或7所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：所述微球包括pH检测微球及溶氧检测微球，所述pH检测微球、溶氧检测微球及细胞的直径均不同。

9.根据权利要求8所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：所述溶氧检测微球的材质包括氧敏感性材料或氧敏感性材料与氧不敏感材料的组合。

10.根据权利要求9所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于，所述溶氧检测微球的制备方法包括：使包含氧敏感性材料、包裹材料预聚体、交联剂、表面活性剂、有机溶剂及水的混合反应体系于40～80℃进行聚合反应5～10h，获得所述溶氧检测微球；

优选的，所述溶氧检测微球的制备方法包括：提供包含氧敏感性材料、包裹材料预聚体、交联剂和有机溶剂的均匀混合体系，以及，将所述均匀混合体系与表面活性剂的水溶液均匀混合，之后于40～80℃进行聚合反应5～10h，获得所述溶氧检测微球；优选的，所述包裹材料预聚体与交联剂的质量比为5：1～10：1；优选的，所述氧敏感性材料包括PtTFPP、PtOEP和PtOEPK中任意一种；优选的，所述氧敏感性材料的浓度为1～4mmol/L；优选的，所述包裹材料包括PDMS和/或PS；优选的，所述交联剂包括硅烷偶联剂，尤其优选的，所述交联剂具有链烯基和/或以及末端具有Cl-、NH₂-、SH-、环氧基、N₃-、(甲基)丙烯酰氧基和异氰酸酯基中至少一种官能团的烃基；优选的，所述表面活性剂包括SDS和/或PVA；优选的，当所述表面活性剂选用SDS时，SDS的浓度范围为0.05～0.2mol/L；优选的，当所述表面活性剂选用PVA时，所述混合反应体系中PVA的含量为1～15wt％；优选的，所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、苯乙烯和甲苯中的任意一种或两种以上的组合；优选的，所述混合体系中还包含氧不敏感材料；优选的，所述氧不敏感材料包括聚芴或荧光黄。

11.根据权利要求4所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：所述微柱的形状包括圆柱型、长方体、梯台、圆锥体、开放式槽型结构中的任意一种或两种以上的组合。

12.根据权利要求1所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：所述的液流管道经设置在所述芯片上的接口与外界连通；优选的，所述的液流管道包括至少一环形液流管道。

13.根据权利要求1所述的单细胞水平的代谢检测芯片，其特征在于：所述透气弹性膜的材质包括聚二甲基硅氧烷。

14.一种单细胞水平的代谢检测方法，其特征在于包括：

提供权利要求1-13中任一项所述的单细胞水平的代谢检测芯片；

向所述芯片的液流层中注入包含溶氧检测微球和pH检测微球的载液，并使所述载液按照预定流速在选定的液流管道内流动；

以气动控制层驱使透气弹性膜将所述载液中的部分溶氧检测微球和pH检测微球挤压入选定捕获单元，实现溶氧检测微球和pH检测微球的捕捉，再清除所述选定液流管道内未被捕获单元捕捉的溶氧检测微球和pH检测微球；

至少向所述选定液流管道内注入包含细胞的细胞培养液，再以气动控制层驱使透气弹性膜将所述细胞培养液内的单细胞挤压入所述选定的捕获单元，实现单细胞的捕捉；以及

对所述单细胞进行培养，并在培养过程中和/或培养结束后，以被捕获的溶氧检测微球和pH检测微球检测所述单细胞的培养体系中的溶氧含量和酸度情况。

15.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于还包括：在对所述单细胞开始进行培养时和/或培养的过程中，向所述气动控制层的至少一气动控制管道内输入包含氧气的流体，并使其中的氧气透过透气弹性膜进入所述选定液流管道，进而改变所述选定液流管道内的溶氧度。

16.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于：所述包含氧气的流体包括含氧气体、含氧液体或产氧/去氧性的化学试剂；优选的，所述含氧气体包括氧气或者氮气和二氧化碳中的至少一种与氧气的组合。

17.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于还包括：检测溶氧检测微球和pH检测微球产生的光强度信号，从而测定所述单细胞的培养体系中的溶氧含量和酸度情况。