CN103897978A - 微流控微生物培养芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微流控微生物培养芯片，包括：液流层，所述液流层中分布有一个以上的培养单元；气动控制层，所述气动控制层中分布有供气管道，所述供气管道与所述培养单元交叉，所述供气管道中通入的氧气压力不足以使得交叉处的培养单元关闭；弹性透气膜，形成于所述液流层和气动控制层之间，所述供气管道中的氧气在交叉处通过弹性透气膜进入培养单元中的溶液。本发明微流控芯片中的氧气浓度产生是依靠氧气在多个交叉点或不同的交叉面积条件下，透过透气膜向溶液中扩散量不同而形成的，溶解氧浓度更主要的取决于交叉点的数量和交叉处面积大小，避免了采用金字塔形气体混合分配结构，节约了芯片面积，提高了芯片中培养单元的集成度。

Description

微流控微生物培养芯片

技术领域

本发明属于微流控领域，特别是涉及一种能够在特定或多种溶解氧浓度条件下进行微生物培养的微流控芯片。

背景技术

对于液体中培养的微生物来说，溶解氧是一个很重要的环境因素。不同的微生物及其不同生长阶段对氧的需求是不同的。溶解氧一方面会通过影响与呼吸链有关的能量代谢，从而影响微生物生长，另一方面也会通过影响酶活性或直接参与物质代谢，进行影响微生物代谢活性。因此研究溶解氧浓度对微生物的影响，采用合适的溶解氧控制方法，对于促进溶液中微生物生长，提高微生物产品的生产效率而言是十分必要的。

传统微生物培养通常是在发酵罐或摇瓶中进行的。采取的溶解氧浓度控制方式主要是向控制溶液中空气通入量或是对溶液进行一定转速的搅拌、振荡，以确保溶液中的溶解氧浓度。然而，在芯片上进行微生物悬浮培养时，很难通过上述的传统方法来控制微量溶液中的溶解氧浓度，传统直接通气的方法加速液体挥发，使微量的培养液迅速挥干，而搅拌和振荡的方法也由于芯片中液体体积微小，黏性力较大而无法用于溶解氧浓度控制。因此需要开发能够适用于微生物芯片化培养的溶氧浓度控制结构。

已有文献报道了一些能够用于溶解氧控制的微流控细胞培养芯片结构，如在文献1（Joe F. Lo Elly Sinkala, David T. Eddington. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab on a Chip, 2010, 10, 2394–2401）中描述了一种产生溶解氧浓度梯度的细胞培养微流控芯片，该芯片上层有一个用于细胞培养的圆柱形静置培养腔，中间是层透气膜，下层是气体管道网络。气体管道网络产生氧气浓度梯度有两种方式，一种是设置两条横向平行的主管道，两管道之间设置多条纵向平行管道，这些管道不与主管道交叉，向两条主管道中分别通入氮气和氧气，气体就会通过扩散进入纵向平行管道，并形成氧浓度梯度；另一种氧气产生方式是将氮气和氧气同时通入金字塔形分支网络沟道进行混合，在数个出口处即形成氧气浓度梯度。含有不同氧浓度的气体通过透气膜扩散到上层的培养腔中，从而改变同一培养腔不同区域中的溶解氧浓度。该芯片适用于研究多种溶解氧浓度对于细胞培养的影响。然而，该芯片的培养腔仍然较大，难以在芯片上进一步提高培养腔的数量。另外，芯片是用于细胞静置状态的培养，不适合用于微生物悬浮培养环境。

另外在文献2（Raymond H. W. Lam, Min-Cheol Kim, Todd Thorsen. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Analytical chemistry, 2009, 81, 5918–5924）中描述了一种能够产生溶解氧浓度梯度的细胞培养芯片，其中的氧气浓度梯度是将氮气和氧气同时充入金字塔形分支管道网络，经过多次混合后在出口处产生氧气浓度梯度。不同氧含量的气体通过扩散透过膜进入到下层不同的细胞培养管道中形成不同的溶解氧条件。在该芯片中，气体管道与细胞培养管道是平行的，细胞在培养管道中贴壁后再注入气体，产生不同的氧浓度进行静置培养。然而由于气体管道和培养管道是平行叠置的，增加了芯片上下层之间对准封装的难度，特别是存在大量培养管道时，精确对准更加困难。气体管道和培养管道间水平距离变动的不确定性还会改变气体扩散距离，从而影响管道中溶解氧含量。另外该芯片仍然是基于细胞静置培养模式，不适合用于悬浮培养微生物。

有鉴于此，有必要提供一种新型的微流控芯片，能够在特定或多种溶解氧浓度条件下进行微生物培养。

发明内容

本发明的目的提供一种微流控微生物培养芯片，能够在特定或多种溶解氧浓度条件下进行微生物培养。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种微流控微生物培养芯片，包括：

液流层，所述液流层中分布有一个以上的培养单元；

气动控制层，所述气动控制层中分布有供气管道，所述供气管道与所述培养单元交叉，所述供气管道中通入的气体压力不足以使得交叉处的培养单元关闭；

弹性透气膜，形成于所述液流层和气动控制层之间，所述供气管道中的气体在交叉处通过弹性透气膜进入培养单元中的溶液。

作为本发明的进一步改进，所述弹性透气膜构成所述供气管道的一个侧壁。

作为本发明的进一步改进，所述弹性透气膜构成所述培养单元的一个侧壁。

作为本发明的进一步改进，所述液流层、气动控制层和弹性透气膜均由透气性材料制成。

作为本发明的进一步改进，所述透气性材料为聚二甲基硅氧烷。

作为本发明的进一步改进，所述供气管道的至少部分侧壁由所述气动控制层构成。

作为本发明的进一步改进，所述培养单元的至少部分侧壁由所述液流层构成。

作为本发明的进一步改进，所述培养单元包括环状闭合管道，所述气动控制层中还分布有循环驱动沟道，该循环驱动沟道与所述培养单元形成交叉，并驱动所述培养单元中的液体循环流动。

作为本发明的进一步改进，所述液流层中至少分布有第一培养单元和第二培养单元，所述供气管道与所述第一培养单元和第二培养单元的交叉次数和/或交叉面积不同。

作为本发明的进一步改进，所述供气管道中的气体选自氧气、二氧化碳或氨气。

与现有技术相比，本发明微流控芯片中的气体浓度产生是依靠气体在多个交叉点或不同的交叉面积条件下，透过透气膜向溶液中扩散量不同而形成的，溶解氧浓度更主要的取决于交叉点的数量和交叉处面积大小，避免了采用金字塔形气体混合分配结构，节约了芯片面积，提高了芯片中培养单元的集成度。同时无需对入口气体流量进行精确控制，仅需通入即可，操作更加简单。在芯片制作过程中，将气动控制管道与液流管道交叉比将两者平行叠合更容易实现，降低了芯片的制作难度。同时，本发明技术方案能够在控制溶解氧浓度条件的同时进行微生物悬浮培养，与现有技术中只能静置培养相比，培养物的种类和应用范围进一步得到拓展。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a所示为本发明第1实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图；

图1b所示为本发明第1实施例中液流层的结构示意图；

图1c所示为本发明第1实施例中气动控制层的结构示意图；

图1d是图1A所示沿线1D的剖面结构示意图；

图2所示为本发明第2实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图；

图3所示为本发明第3实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图；

图4所示为本发明第4实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图；

图5所示为本发明第5实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图；

图6所示为本发明第6实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图。

具体实施方式

文献1（Joe F. Lo Elly Sinkala, David T. Eddington. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab on a Chip, 2010, 10, 2394–2401）中中培养腔仍然较大，单个直径达到了8mm，占用的芯片面积比较大，因此难以在芯片上进一步提高培养腔的数量。溶解氧浓度梯度是在同一个培养腔中产生的，未能实现同时在多个单元中的实现溶解氧梯度，难以阵列化培养。氮气和氧气注入时需要进行精确的流量控制，操作要求高。芯片是用于细胞静置状态的培养，缺乏驱动培养液流动的动力结构，不适合用于微生物悬浮培养。

文献2（Raymond H. W. Lam, Min-Cheol Kim, Todd Thorsen. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Analytical chemistry, 2009, 81, 5918–5924）中由于气体管道和其下的培养管道是平行叠置的，增加了芯片上下层之间对准封装的难度，特别是存在大量培养管道时，精确对准更加困难。气体管道和培养管道间水平距离变动的不确定性还会改变气体扩散距离，从而影响管道中溶解氧含量。氮气和氧气注入时也需要进行精确的流量控制，操作要求高。另外该芯片仍然是基于细胞静置培养模式，不适合用于悬浮培养微生物。

针对上述不足，本发明实施例公开了一种微流控微生物培养芯片，包括：

液流层，所述液流层中分布有一个以上的培养单元；

气动控制层，所述气动控制层中分布有供气管道，所述供气管道与所述培养单元交叉，所述供气管道中通入的气体压力不足以使得交叉处的培养单元关闭；

弹性透气膜，形成于所述液流层和气动控制层之间，所述供气管道中的气体在交叉处通过弹性透气膜进入培养单元中的溶液。

优选的，液流层位于气动控制层的下方，在其他实施例中，液流层也可以位于气动控制层的上方。

溶解液浓度产生是基于气动控制管道与液体管道交叉接触面积，无需进行精确的气流量控制，操作简单。两层管道无需精确平行叠置，芯片制作工艺更加简化，培养单元体积微小，易于实现多个单元的集成。

在上述微流控微生物培养芯片中，优选的，弹性透气膜构成所述供气管道的一个侧壁，弹性透气膜构成所述培养单元的一个侧壁，如此，弹性透气膜与供气管道相邻，供气管道中的气体可直接透过弹性透气膜；弹性透气膜与培养单元相邻，透过弹性透气膜的气体可直接进入培养单元中。

在上述微流控微生物培养芯片中，优选的，液流层、气动控制层和弹性透气膜均由透气性材料制成，该透气性材料优选为聚二甲基硅氧烷。当液流层、气动控制层采用透气性材料制成时，供气管道中的气体很容易透过这些透气性材料进入培养单元中。透气性材料还可以选自热塑性聚氨酯、聚氨基甲酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯等可透气的材料。

在上述微流控微生物培养芯片中，优选的，气动控制层中还分布有循环驱动沟道，该循环驱动沟道与所述培养单元形成交叉，并驱动所述培养单元中的液体循环流动。由于循环驱动沟道中溶液是流动的，可实现微生物悬浮培养。

在上述微流控微生物培养芯片中，优选的，液流层中至少分布有第一培养单元和第二培养单元，所述供气管道与所述第一培养单元和第二培养单元的交叉次数和/或交叉面积不同。通过改变交叉次数、交叉面积或者同时改变交叉次数和面积，以实现不同培养单元中具有不同的气体浓度，因此可以在多个培养单元中实现氧气浓度梯度。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

图1a至1d所示为本发明第1实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图。

参图1a至1d所示，微流控微生物培养芯片由三个上下层叠的结构层组成。底层是液流层110，上层是气动控制层120，两层之间有弹性透气膜130相隔。液流层110中分布有培养单元100，每个培养单元100包括有一位于液流层中的环状闭合管道1101，两端有接口与芯片外连通。气动控制层120中分布有供气管道1202和循环驱动沟道1201。供气管道1202和循环驱动沟道1201的两端均与外界相连，当向循环驱动沟道1201中按特定时序注入高压气体，循环驱动沟道1201下的弹性透气膜130会按次序向下发生弯曲，驱动下方的环状闭合管道1101中液体往特定方向流动。供气管道1202为一根或数根与外界气源相连的管道。

微流控微生物培养芯片中，除环状闭合管道1101的两条分支管道宽度为50微米外，其余管道宽度均为100微米。环状闭合管道1101两端与外界连通。供气管道1202和循环驱动沟道1201宽度均为100微米，所有管道深度为10微米。弹性透气膜厚度为20微米。各层均用聚二甲基硅氧烷制成，依次叠合。

原理说明

环状闭合管道1101中含有微生物的培养液在循环驱动沟道1201的作用下单向循环流动，实现微生物的悬浮培养，此原理已在专利201110316751.0中揭示，不再赘述。供气管道1202为通氧管道，该管道从环状闭合管道1101上方穿越，供气管道1202中的气体会在与环状闭合管道1101的交叉处，通过弹性透气膜130扩散到环状闭合管道1101的培养液中，并进一步随液流循环流动而分散到整个培养液中。通过改变供气管道1202与环状闭合管道1102交叉的面积和交叉点的数量就可以改变气体扩散进入培养液的速度，从而改变培养单元中的溶解氧浓度，另外也可以改变供气管道1202通入气体的浓度来改变培养单元中的溶解氧浓度。如管道大小、性状、充入气体成分完全一致，则可实现相同的溶解氧浓度。供气管道1202中的气体可以是氧气，也可以是含氧气的气体，供气管道1202中的气压可以与外界大气压相同，也可以略高于外界大气压，但该气压不能使弹性透气膜130完全封闭下方的液流管道，也可为负压，但其中氧气分压应高于环状闭合管道1101中液体中的氧气分压。

动作关系说明

向各培养单元100中的环状闭合管道1101中通入含微生物的培养液，待充满培养液后，向供气管道1202充入含氧气的气体，充气后可封闭供气管道1202两端接口，保持常压，也可以在培养过程中持续以较低压力向气动控制供气管道1202充入含氧气体。向循环驱动沟道1201中按特定时序充入高压气体，推动培养液循环流动，开始微生物悬浮培养培养。

图2所示为本发明第2实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图。

参图2所示，微流控微生物培养芯片包括1个培养单元，每个培养单元包含了位于液流层的环状闭合管道2101，除环状闭合管道2101的两条分支管道宽度为50微米外，其余管道宽度均为100微米。环状闭合管道2101两端与外界连通。芯片气动控制层中分布有供气管道2202和循环驱动沟道2201，宽度均为100微米，供气管道2202为一多次弯折的管道，在环状闭合管道2101上方多次穿越，所有管道深度为10微米。气动控制层与液流层之间有一弹性透气膜相隔，弹性透气膜厚度为20微米。各层均用聚二甲基硅氧烷制成，依次叠合。

实施例2与实施例1原理和工作关系相同，不再赘述。

图3所示为本发明第3实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图。

参图3所示，微流控微生物培养芯片包括1个培养单元，每个培养单元包含了位于液流层的环状闭合管道3101，除环状闭合管道3101的两条分支管道宽度为50微米外，其余管道宽度均为100微米。环状闭合管道3101两端与外界连通。芯片气动控制层中分布有供气管道3202和循环驱动沟道3201，供气管道3202为带分支的管道，在环状闭合管道3101上方多次穿越，所有管道深度为10微米。气动控制层与液流层之间有一弹性透气膜相隔，弹性透气膜厚度为20微米。各层均用聚二甲基硅氧烷制成，依次叠合。

实施例3与实施例1原理和工作关系相同，不再赘述。

图4所示为本发明第4实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图。

参图4所示，微流控微生物培养芯片包括多个培养单元，每个培养单元包含了位于液流层的环状闭合管道4101，除环状闭合管道4101的两条分支管道宽度为50微米外，其余管道宽度均为100微米。环状闭合管道4101两端与外界连通。芯片气动控制层中分布有供气管道4202和循环驱动沟道4201，宽度均为100微米，供气管道4202为带分支的管道，在不同环状闭合管道4101上方有不同次数的穿越，所有管道深度为10微米。气动控制层与液流层之间有一弹性透气膜相隔，弹性透气膜厚度为20微米。各层均用聚二甲基硅氧烷制成，依次叠合。本实施例能在不同的培养单元中产生不同的溶解氧浓度。

实施例4与实施例1原理和工作关系相同，不再赘述。

图5所示为本发明第5实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图。

参图5所示，微流控微生物培养芯片包括多个培养单元，每个培养单元包含了位于液流层的环状闭合管道5101，除环状闭合管道5101的两条分支管道宽度为50微米外，其余管道宽度均为100微米。环状闭合管道5101两端与外界连通。芯片气动控制层中分布有供气管道5202和循环驱动沟道5201，宽度均为100微米，供气管道5202为一多次弯折的管道，以不同的穿越次数穿越不同的环状闭合管道5101上方，所有管道深度为10微米。气动控制层与液流层之间有一弹性透气膜相隔，弹性透气膜厚度为20微米。各层均用聚二甲基硅氧烷制成，依次叠合。本实施例能在不同的培养单元中产生不同的溶解氧浓度。

实施例5与实施例1原理和工作关系相同，不再赘述。

图6所示为本发明第6实施例中微流控微生物培养芯片的结构示意图。

参图6所示，微流控微生物培养芯片包括多个培养单元，每个培养单元包含了位于液流层的环状闭合管道6101，除环状闭合管道6101的两条分支管道宽度为50微米外，其余管道宽度均为100微米。环状闭合管道6101两端与外界连通。芯片气动控制层中分布有供气管道6202和循环驱动沟道6201，宽度均为100微米，供气管道6202为一不同宽度的管道，管道宽处宽度为200微米，窄处宽度50微米，以不同宽度的管道部分穿越不同的环状闭合管道上方，所有管道深度为10微米。气动控制层与液流层之间有一弹性透气膜相隔，弹性透气膜厚度为20微米。各层均用聚二甲基硅氧烷制成，依次叠合。本实施例能在不同的培养单元中产生不同的溶解氧浓度。

综上所述，本发明微流控芯片中的气体浓度产生是依靠氧气在多个交叉点或不同的交叉面积条件下，透过透气膜向溶液中扩散量不同而形成的，溶解氧浓度更主要的取决于交叉点的数量和交叉处面积大小，避免了采用金字塔形气体混合分配结构，节约了芯片面积，提高了芯片中培养单元的集成度。同时无需对入口气体流量进行精确控制，仅需通入即可，操作更加简单。在芯片制作过程中，将气动控制管道与液流管道交叉比将两者平行叠合更容易实现，降低了芯片的制作难度。同时，本发明技术方案能够在控制溶解氧浓度条件的同时进行微生物悬浮培养，与现有技术中只能静置培养相比，培养物的种类和应用范围进一步得到拓展。

另外，本发明中的供气管道还可以用于其他气体或挥发性物质的添加，如二氧化碳、氨气、乙酸等，不局限于氧气。气体可为单一种类气体，也可为两种及以上的混合气体。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种微流控微生物培养芯片，其特征在于，包括：

液流层，所述液流层中分布有一个以上的培养单元；

气动控制层，所述气动控制层中分布有供气管道，所述供气管道与所述培养单元交叉，所述供气管道中通入的气体压力不足以使得交叉处的培养单元关闭；

弹性透气膜，形成于所述液流层和气动控制层之间，所述供气管道中的气体在交叉处通过弹性透气膜进入培养单元中的溶液。

2.根据权利要求1所述的微流控微生物培养芯片，其特征在于：所述弹性透气膜构成所述供气管道的一个侧壁。

3.根据权利要求1所述的微流控微生物培养芯片，其特征在于：所述弹性透气膜构成所述培养单元的一个侧壁。

4.根据权利要求1所述的微流控微生物培养芯片，其特征在于：所述液流层、气动控制层和弹性透气膜均由透气性材料制成。

5.根据权利要求4所述的微流控微生物培养芯片，其特征在于：所述透气性材料为聚二甲基硅氧烷。

6.根据权利要求4所述的微流控微生物培养芯片，其特征在于：所述供气管道的至少部分侧壁由所述气动控制层构成。

7.根据权利要求4所述的微流控微生物培养芯片，其特征在于：所述培养单元的至少部分侧壁由所述液流层构成。

8.根据权利要求1所述的微流控微生物培养芯片，其特征在于：所述培养单元包括环状闭合管道，所述气动控制层中还分布有循环驱动沟道，该循环驱动沟道与所述培养单元形成交叉，并驱动所述培养单元中的液体循环流动。

9.根据权利要求1所述的微流控微生物培养芯片，其特征在于：所述液流层中至少分布有第一培养单元和第二培养单元，所述供气管道与所述第一培养单元和第二培养单元的交叉次数和/或交叉面积不同。

10.根据权利要求1所述的微流控微生物培养芯片，其特征在于：所述供气管道中的气体选自氧气、二氧化碳或氨气。

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