CN207749128U - 一种微流控溶氧检测芯片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种微流控溶氧检测芯片。所述微流控溶氧检测芯片包括液流层以及溶氧检测微球捕获层,所述液流层包括一个以上培养检测单元,每一培养检测单元包括一条以上液流管道,所述溶氧检测微球捕获层包括一个以上检测微球空穴,每一检测微球空穴均分布于相应液流管道下方并与该液流管道连通,每一检测微球空穴均用以捕捉被从与该检测微球空穴相应液流管道内流经的流体所携带、但因重力作用沉降至溶氧检测微球捕获层的至少一溶氧检测微球。本实用新型可以实现多通道的细胞培养并实时定域的对培养过程中溶氧含量做出检测,被检测物体直接与溶氧检测微球接触,响应时间短,同时又能有效的避免培养单元间的相互交叉影响。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种微流控溶氧检测芯片,尤其涉及一种能够进行多通道细胞培养并实时定域的溶氧检测的微流控芯片及其制备方法与应用,属于溶氧检测技术领域。
背景技术
在细胞或组织的体外研究中,对于培养条件的控制非常重要。细胞的微环境包括复杂的化学和机械参数,比如表征物理化学性质的氧张力、温度、pH和摩尔渗透压浓度等参数,以及表征细胞与细胞间或细胞与细胞基质间相互作用的生长因子等。这些参数给予生物或医学研究人员提供了一系列的线索和提示,用以调节细胞的结构、功能和行为来实现生物或医学目的。因此研究细胞微环境的变化规律或制造特定的细胞微环境,对探究和验证细胞的生物学行为具有非常重要的意义。为了尽可能的实现体内环境的预测,很多参数需要同时被检测和调控。然而,传统的细胞培养技术,如细胞培养皿或孔板,是不适合用于表征细胞对于随时间变化的刺激而做出的应激响应。
为此,微流控被越来越多的应用到研究细胞的微环境中。微流控技术是上世纪九十年代在分析化学领域发展起来的,它以微管道网络微结构特征,通过微加工技术将微管道、微泵、微阀、微储液器、微检测元件等功能元器件像集成电路一样,集成在芯片材料上。微流控技术具有极高的效率,由于结构微小,很容易在芯片上一次集成数十上百个细胞培养检测单元,筛选效率得以提高;培养液及其他药品的消耗也可大幅减少,从而降低筛选成本;微流控芯片的体积小,可以减少培养箱的使用量,降低微生物培养的所需空间和设备限制;微流控芯片可以进行批量加工生产及预处理(如清洗、灭菌等),成为一次性试验耗材,这样不仅可以降低芯片的制造成本,还可以减少试验准备的工序,最终降低筛选工作的劳动强度。
氧气属于培养条件控制中一个重要的参数。氧气在细胞功能和行为中扮演着重要的地位。细胞的生长速率和代谢以及蛋白的合成很大一部分取决于培养基中氧气的水平。在人体中,氧化的水平非常的重要。当改变氧的含量,从富氧到低氧再到无氧,会发生强烈的生物反应。有研究表明,低氧可以促进再生干细胞的增殖。然而,低氧也可以导致病理学的产生,包括炎症、肿瘤的产生以及心血管疾病等。因此对于实时检测氧气的浓度非常重要。
目前国内外能够进行细胞培养及溶氧检测的微流控芯片有很多,但是已报道的芯片还存在毒性大、加工复杂、培养单元之间容易交叉影响等问题,离培养条件的检测和调控尚有一段距离。
2016年Josef Ehgartner,et al.报道了一种应用光学氧敏感层来检测溶氧水平的芯片。该芯片利用喷涂的方式将氧检测层放入玻璃微孔中,做成的传感器有较宽的氧浓度范围。该传感器可以应用到酶反应的检测,例如葡萄糖氧化酶氧化葡萄萄的反应。但是,该传感器虽然有较宽的氧浓度范围,灵敏度高,但是制作工艺相对复杂,需要的仪器设备规格较高,价格较昂贵。
2013年Lin Wang,et al.报道了一种应用光学氧敏感珠来检测溶氧水平的芯片。该芯片由微孔阵列构成,为开放式结构,向微孔阵列中注入细胞和氧敏感微珠,根据微珠产生的荧光信号则可以对溶氧水平进行检测。该芯片虽然检测通量高,但是无法控制腔室中捕获氧敏感微珠的数目,无法排除分布不均造成的影响;同时捕获的微球在较快的液流流动时,易溜走,从而无法较好的对实验进行重复和校准,准确性会有一定的影响。同时该芯片所用的光学氧敏感珠在合成时步骤较繁杂,所需时间较长,合成量较少,效率低。
实用新型内容
本实用新型的主要目的在于提供一种微流控溶氧检测芯片,以克服现有技术的不足。
为实现前述目的,本实用新型采用的技术方案包括:
本实用新型实施例提供了一种微流控溶氧检测芯片,其包括液流层以及溶氧检测微球捕获层,所述液流层包括一个以上培养检测单元,每一培养检测单元包括一条以上液流管道,所述溶氧检测微球捕获层包括一个以上检测微球空穴,每一检测微球空穴均分布于相应的液流管道下方并与该液流管道连通,每一检测微球空穴均用以捕捉被从与该检测微球空穴相应液流管道内流经的流体所携带、但因重力作用沉降至溶氧检测微球捕获层的至少一溶氧检测微球。
在一实施方案之中,所述溶氧检测微球的制备方法包括:使包含氧敏感性材料、包裹材料预聚体、交联剂、表面活性剂、有机溶剂及水的混合反应体系于40~80℃进行聚合反应5~10h,获得所述溶氧检测微球。
与现有技术相比,本实用新型的有益效果包括:
1)本实用新型提供的微流控溶氧检测芯片结构简单设计合理,仅需上下两层叠合,实施起来简单可行,可以实现单个溶氧检测微球的捕获,且捕获的微球不易脱落,进而可以实现精准的单点检测,可以较好的对实验进行重复和校准,提高了实验的准确性,例如可以实现多通道的细胞培养并实时定域的对培养过程中溶氧的含量做出检测;
2)本实用新型采用乳液聚合法来合成溶氧检测微球,该方法合成微球的效率高,实施起来简单可行;
3)本实用新型提供的微流控溶氧检测芯片制作工艺简单,所需要的溶氧检测试剂量小,同时被检测物体直接与溶氧检测微球接触,响应时间短,同时又能有效的避免培养单元间的相互交叉影响。
附图说明
为了更清楚地说明本实用新型的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行简单的介绍,显而易见地,下面描述的附图仅仅作为本实用新型的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他附图。
图1a是本实用新型一典型实施例中溶氧检测微球的合成装置图。
图1b是本实用新型一典型实施例中所获溶氧检测微球的荧光显微镜图。
图1c是本实用新型一典型实施例中所获溶氧检测微球的扫描电子显微镜图。
图2是本实用新型一典型实施例中微流控溶氧检测芯片的俯视图。
图3是图2中微流控溶氧检测芯片中A部分的局部放大示意图。
图4是图3中微流控溶氧检测芯片沿线B-B的剖面结构示意图。
图5是本实用新型一典型实施例所获微流控溶氧检测芯片的实物照片。
图6是本实用新型一典型实施例所获溶氧检测微球的氧响应性图。
图7是本实用新型一典型实施例中细胞培养液的溶氧测定标定图。
附图标记说明:110-液流层,100-培养检测单元,1101-第一液流管道,1102-第二液流管道,1103-第三液流管道,130-溶氧检测微球捕获层,1301-微柱,1000-溶氧检测微球。
具体实施方式
如前所述,鉴于现有技术的缺陷,本案发明人经长期研究和大量实践,得以提出本实用新型的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
作为本实用新型技术方案的一个方面,其所涉及的系一种微流控溶氧检测芯片,其包括液流层以及溶氧检测微球捕获层,所述液流层包括一个以上培养检测单元,每一培养检测单元包括一条以上液流管道,所述溶氧检测微球捕获层包括一个以上检测微球空穴,每一检测微球空穴均分布于相应的液流管道下方并与该液流管道连通,每一检测微球空穴均用以捕捉被从与该检测微球空穴相应液流管道内流经的流体所携带、但因重力作用沉降至溶氧检测微球捕获层的至少一溶氧检测微球。
在一实施方案之中,所述检测微球空穴的直径稍大于或等于所述溶氧检测微球的直径。
在一实施方案之中,所述溶氧检测微球捕获层包括一个以上微球捕获阵列,所述微球捕获阵列包括复数个凸起的微柱,每一检测微球空穴由相应的三个以上所述微柱围合形成。
进一步的,所述溶氧检测微球的直径约为8~15微米。
进一步的,所述溶氧检测微球的材质既可以只包含氧敏感性材料又可以包含氧敏感性材料和氧不敏感材料(做参比)。
在一实施方案之中,所述溶氧检测微球采用乳液聚合法合成。本实用新型采用乳液聚合法来合成溶氧检测微球,该方法合成微球的效率高,实施起来简单可行。
在一实施方案之中,所述溶氧检测微球的制备方法包括:使包含氧敏感性材料、包裹材料预聚体、交联剂、表面活性剂、有机溶剂及水的混合反应体系于40~80℃进行聚合反应5~10h,获得所述溶氧检测微球.
在一实施方案之中,所述溶氧检测微球的制备方法包括:
提供包含氧敏感性材料(也可以称为氧敏感性染料)、包裹材料预聚体、交联剂和有机溶剂的均匀混合体系,将所述均匀混合体系与表面活性剂的水溶液均匀混合,并于40~80℃下进行聚合反应5~10h,获得所述溶氧检测微球溶液。
优选的,所述包裹材料预聚体与交联剂的质量比为5:1~10:1。
进一步的,溶氧检测微球合成时,除了可以选择用PDMS作为包裹含氧敏感性材料的材质,还可以选择将PDMS与少量的PS混合用来包裹含氧敏感性材料。
优选的,所述溶氧检测微球的材质既可以只包含氧敏感性材料又可以包含氧敏感性材料和氧不敏感材料(做参比)。
进一步的,所述氧敏感性材料包括PtTFPP、PtOEP、PtOEPK等,但不限于此。
更进一步的,所述氧敏感性材料的浓度为1~4mmol/L。
优选的,所述氧不敏感材料包括PFO(聚芴)、MFY(荧光黄)等,但不限于此。
进一步的,表面活性剂可以选择为SDS(十二烷基硫酸钠)、PVA(聚乙烯醇)等,但不限于此。
进一步优选的,当所述表面活性剂选用SDS时,SDS的浓度范围为0.05~0.2mol/L;当所述表面活性剂选用PVA时,所述混合反应体系中PVA的含量为1~15wt%。
优选的,所述交联剂包括硅烷偶联剂,进一步的,所述交联剂具有链烯基(主要为乙烯基),以及末端具有Cl-、NH2-、SH-、环氧基、N3-、(甲基)丙烯酰氧基和异氰酸酯基等官能团中的至少一种的烃基,尤其优选为含有乙烯基的交联剂。
优选的,所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、苯乙烯和甲苯等既可以溶解氧敏感性材料又可以溶解PDMS等包裹材料预聚体的溶剂,但不限于此。
进一步的,溶氧检测微球合成时,微球的大小可以通过调控溶剂的量和/或表面活性剂的浓度来控制。例如当溶剂的使用范围为3~5毫升时,合成的溶氧检测微球粒径为8~15微米左右。
在一实施方案之中,所述溶氧检测微球的制备方法还包括:以常压蒸馏、减压蒸馏等方式中的任一种将所述溶氧检测微球溶液中的有机溶剂去除。进一步的,优选采用减压蒸馏的方式,因为以减压蒸馏方式合成的溶氧检测微球分散性较好,粒径更均一。
本实用新型的溶氧检测微球选择包裹材料为PDMS,或PDMS中掺杂少量的PS,具有特别好的氧气透过性,其扩散系数为2.5*10-9m2s-1;而传统的溶氧检测微球选择的包裹材料为PS,其拥有中等的氧气透过性,其扩散系数为1.1*10-11m2s-1,因此本实用新型的溶氧检测微球对于氧响应性要优于传统的溶氧检测微球。
本实用新型提供的微流控溶氧检测芯片制作工艺简单,所需要的溶氧检测试剂量小,同时被检测物质可以直接与溶氧检测微球接触,响应时间短,灵敏度高,准确性好。
在一实施方案之中,所述微柱的形状包括圆柱型、长方体、梯台、圆锥体、开放式槽型结构(新月型)中的任意一种或两种以上的组合,但不限于此。
进一步的,所述微柱的直径为10微米到50微米之间,高度为10微米到20微米之间。
在一实施方案之中,所述的一个以上液流管道经设置在所述芯片上的接口与外界连通。
优选的,所述的一个以上液流管道包括至少一环形液流管道。
例如,具体的,所述培养检测单元可以包括依次连通的第一液流管道、第二液流管道和第三液流管道。
优选的,所述第二液流管道为环状管道,所述第一液流管道和第三液流管道的一端分别设置于所述第二液流管道的两端部,另一端与所述微流控溶氧检测芯片外部连通。
本实用新型提供的微流控溶氧检测芯片结构简单设计合理,仅需上下两层叠合,实施起来简单可行,可以实现单个溶氧检测微球的捕获,且捕获的微球不易脱落,以及精准的单点检测,可以较好的对实验进行重复和校准,提高了实验的准确性,进而实现多通道的细胞培养并实时定域的对培养过程中溶氧的含量做出检测。
本实用新型的微流控溶氧检测芯片的溶氧检测方法包括:
提供前述的微流控溶氧检测芯片;
向所述微流控溶氧检测芯片的液流层中注入溶氧检测微球溶液,并使所述溶氧检测微球溶液按照预定流速在液流管道内流动,且使所述溶氧检测微球溶液中的溶氧检测微球在重力作用下沉降至溶氧检测微球捕获层,继而被检测微球空穴捕获;以及
利用所述检测微球空穴捕获的溶氧检测微球检测输入所述微流控溶氧检测芯片的液体中的溶氧含量。
优选的,所述溶氧检测方法还包括:以水或水溶液冲洗除去未被检测微球空穴捕获的溶氧检测微球。
进一步的,所述的液体包括细胞培养液。
优选的,所述溶氧检测方法还包括:在向所述微流控溶氧检测芯片输入选定液体后,通过光学成像检测被检测微球空穴捕获的溶氧检测微球产生的光强度信号,从而测定所述选定液体中的溶氧含量。
下面将结合本实用新型实施例中的附图,对本实用新型实施例中的技术方案进行详细的描述,显然,所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本实用新型保护的范围。
请参阅图2-图4所示,本实用新型一典型实施例的微流控溶氧检测芯片由上下两个层叠的结构层组成。底层是溶氧检测微球捕获层130,上层是液流层110。溶氧检测微球捕获层130包含若干凸起的微柱1301,微柱1301的直径为10微米,高度为10微米,相邻的3、4个或更多个微柱间围成的区域即为捕获单个溶氧检测微球1000的检测微球空穴,每个溶氧检测微球的直径约为10微米左右。液流层110中有数个培养检测单元100,每个培养检测单元100包括有第一液流管道1101、第二液流管道1102、第三液流管道1103。其中第二液流管道1102为环状管道,第一液流管道1101、第三液流管道1103有接口与芯片外连通。
本实用新型的微流控溶氧检测芯片的制备过程及检测原理如下:
本实用新型的技术方案采用了加入有机溶剂的乳液聚合法来合成溶氧检测微球。首先将溶解有氧敏感性材料的有机溶剂加入到PDMS等包裹材料预聚体和交联剂中,使其成一个连续相;然后将其加入到表面活性剂的水溶液使连续相均匀分散;接着保持一定的温度(40~80℃),使PDMS等包裹材料在液滴中慢慢聚合,当聚合反应达到一定程度之后,利用蒸馏的办法把挥发性溶剂抽提出来,留下溶氧检测微球的悬浮液。最后将溶氧检测微球浓度稀释到合适水平,通入到微流控溶氧检测芯片的第一液体管道1101中。此时进入第二液体管道1102中的溶氧检测微球在重力作用和水流同时作用下,被捕获在溶氧检测微球捕获层的微球捕获阵列当中。捕获的单个溶氧检测微球产生的光强度信号被外界光学探测器收集,从而可以对液体管道中的溶氧水平进行检测。
其中,作为一更为具体的实施案例之一,本实用新型的微流控溶氧检测芯片的制备过程及检测原理如下所述:
首先利用乳液聚合法来合成溶氧检测微球:1)配制一定浓度的表面活性剂溶液,将其溶解,并加入烧瓶中,实验装置图如图1a所示,调节温度旋钮升温;2)配制一定浓度的氧敏感性材料溶液,加入到已经混合好的一定量的PDMS预聚体和交联剂中;3)调节转速按钮,升至所需转速,用注射泵将步骤2)制备的溶液以10ul/min的流速将其滴入到烧瓶中。于40~80℃保温搅拌8h,得到溶氧检测微球溶液。
然后向各培养检测单元100中的第二液流管道1102中通入上述溶氧检测微球溶液,待溶氧检测微球被捕获在下层的微球捕获阵列中后,如图3和图4所示,用水将液流管道中多余的溶氧检测微球冲走。
最后向各培养检测单元100中的第一液流管道1101中通入含细胞的培养液,开始细胞培养。培养一段时间后进行溶氧的检测,通过光学成像检测,收集光强度信号,据此进行培养过程中溶氧含量的测定。
本实用新型的一更为典型的实施例可以包括如下实施过程:
一、溶氧检测微球的合成:采用乳液聚合的方法来合成上述微球。
实验过程如下:
a)配制0.2MSDS和8wt%PVA的表面活性剂溶液,各取15ml加入100ml的烧瓶中,实验装置图如图1a所示,调节温度旋钮升温到40度,转速调至300rpm左右。
b)取一个离心管,加入已经混合好的PDMS预聚体和交联剂0.6g(固化比10:1)。
c)再取一支离心管,将氧敏感染料PtTFPP与氧不敏感染料PFO以质量比4:2的比例溶解到4ml的三氯甲烷里,PtTFPP的最终浓度为1mmol/l。
d)将上述b)和c)混合,震荡5min,使其完全均匀混合。
e)用注射泵将上述d)制备的溶液用10ul/min的速率滴入烧瓶内。
f)保温旋转分散2h,然后打开真空泵开关减压至0.08Mpa左右,减压过程结束后,保温1h,即可得到溶氧检测微球的悬浊液,经检测,所获溶氧检测微球的荧光显微镜图如图1b所示,扫描电子显微镜图如图1c所示。
本案发明人还参照前述制备过程,以本说明书中列出的其它原料及工艺条件进行了溶氧检测微球的制备。
二、溶氧检测微球通入微流控溶氧检测芯片
将合成的溶氧检测微球浓度稀释到合适水平,向前述的各培养检测单元100中的第二液流管道1102中通入上述溶氧检测微球溶液,待溶氧检测微球被捕获在下层的捕获微球阵列中后如图5所示,用水将管道中多余的微球冲走。最后向各培养检测单元100中的第一液流管道1101中通入含细胞的培养液,开始细胞培养。培养一段时间后进行溶氧的检测,通过光学成像检测,收集光强度信号,根据图7和以下的溶氧标定方程来进行培养过程中溶氧含量的测定。
方程 | y=ax+b |
标图 | R0/R |
斜率 | 0.96x±0.045 |
截距 | 0.16x±0.010 |
方差 | 0.98833 |
其中,荧光强度比与溶氧浓度的关系(亦即溶氧标定方程)为R0/R=0.16[O2]+0.96,方差为:0.98833。
其中,R0代表通入饱和氮气水时氧敏感染料与氧不敏感染料的荧光强度比,R代表任意含氧量时氧敏感染料与氧不敏感染料的荧光强度比。
将测定的荧光强度比代入此标定方程可以得出溶氧含量。
综上所述,藉由本实用新型的上述技术方案,本实用新型的微流控溶氧检测芯片可以实现多通道的细胞培养并实时定域的对培养过程中溶氧的含量做出检测,采用乳液聚合法来合成溶氧检测微球,效率高,被检测物体直接与溶氧检测微球接触,响应时间短。
需要说明的是,在本文中,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
应当理解,上述实施例仅为说明本实用新型的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本实用新型的内容并据以实施,并不能以此限制本实用新型的保护范围。凡根据本实用新型精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种微流控溶氧检测芯片,其特征在于包括液流层以及溶氧检测微球捕获层,所述液流层包括一个以上培养检测单元,每一培养检测单元包括一条以上液流管道,所述溶氧检测微球捕获层包括一个以上检测微球空穴,每一检测微球空穴均分布于相应的液流管道下方并与该液流管道连通,每一检测微球空穴均用以捕捉被从与该检测微球空穴相应液流管道内流经的流体所携带、但因重力作用沉降至溶氧检测微球捕获层的至少一溶氧检测微球。
2.根据权利要求1所述的微流控溶氧检测芯片,其特征在于:所述检测微球空穴的直径稍大于或等于所述溶氧检测微球的直径。
3.根据权利要求1或2所述的微流控溶氧检测芯片,其特征在于:所述溶氧检测微球捕获层包括一个以上微球捕获阵列,所述微球捕获阵列包括复数个凸起的微柱,每一检测微球空穴由相应的三个以上所述微柱围合形成。
4.根据权利要求1所述的微流控溶氧检测芯片,其特征在于:所述溶氧检测微球的直径为8~15微米。
5.根据权利要求3所述的微流控溶氧检测芯片,其特征在于:所述微柱的形状包括圆柱型、长方体、梯台、圆锥体、开放式槽型结构中的任意一种或两种以上的组合。
6.根据权利要求3所述的微流控溶氧检测芯片,其特征在于:所述微柱的直径为10~50微米,高度为10~20微米。
7.根据权利要求1所述的微流控溶氧检测芯片,其特征在于:所述的一个以上液流管道经设置在所述芯片上的接口与外界连通。
8.根据权利要求7所述的微流控溶氧检测芯片,其特征在于:所述的一个以上液流管道包括至少一环形液流管道。
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2017
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CB03 | Change of inventor or designer information | ||
CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Gan Mingzhe Inventor after: Wang Dandan Inventor after: Cui Jinhui Inventor before: Gan Mingzhe Inventor before: Wang Dandan |