CN108084366B - 基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液制备方法及在光学氧传感微流控检测芯片中的应用 - Google Patents

基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液制备方法及在光学氧传感微流控检测芯片中的应用 Download PDF

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Abstract

基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液制备方法及在光学氧传感微流控检测芯片中的应用，本发明涉及基于八乙基卟啉铂共聚物乳液的制备方法及其应用，本发明为了提高微流控芯片检测氧含量浓度的精度和速度。制备方法：将聚二甲基硅氧烷、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸三氟乙酯和丙烯酸丁酯混合，加入八乙基卟啉铂和香豆素6，然后加入引发剂、乳化剂和超纯水，在55～65℃的温度下细乳液聚合，超声处理后再回流反应。通过该共聚物乳液制备PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片。本发明基于溶解氧能够猝灭指示剂八乙基卟啉铂所发射磷光的原理，使微流控检测芯片能够精确测量溶解氧，实时直观检测氧气浓度。

Description

基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液制备方法及在光学氧 传感微流控检测芯片中的应用
技术领域
本发明涉及一种基于八乙基卟啉铂(PtOEP)的共聚物乳液的制备方法以及PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片。
背景技术
对生命科学的研究人们开始转向微观，为了适应生命科学从宏观到微观的发展需要，分析技术有了很大程度的进步，同时分析仪器也趋于微型化。微流控分析技术已经成为现如今非常重要的一种化学及生物分析手段，有材料低耗性、原位分析、实时快捷等优点，并且在细胞、分子水平检测等很多方面得以应用，微流控管道尺度与细胞有良好的相容性，可以在体外实现对体内细胞环境的高度模拟，实现细胞培养、试样处理及细胞检测诸多应用，发展为细胞实时检测和研究的一个新平台。
PDMS芯片是目前实验研究应用较多且较常见的分析芯片之一。PDMS是软聚合物，具有良好的物理和化学性质：单体可低温聚合；具有弹性，光学透明度高，可透过280nm以上的光，用于检测的波长范围宽；生物惰性，无毒性，可用于细胞固定；可透过气体，在封闭体系中，可为细胞培养提供氧气；低导电性；可与其他材料，如玻璃、聚苯乙烯等封合制成杂交芯片，这些性质都有利于微流控芯片的制作。
氧不仅与人和动植物的生存息息相关，也与化学、生化反应及物理现象关系密切。在生命科学领域，生化需氧量(Bio-Chemical Oxygen Demand，BOD)是研究生命活动的一项重要生理指标。通过掌握细胞中氧气的含量及其活性来了解细胞和组织的新陈代谢状况，从而作为疾病诊断的依据。在微流控芯片研究及产业化进程中，目前在微流控芯片中主要进行血液、细胞等检测和培养，同时可以进行血液、细胞流动及分离等实验研究，其中芯片中氧浓度的测定对于在芯片中进行的检测、培养等实验研究有着十分重要的意义。
微流控芯片分析系统在分析性能上具有很多优点：(1)时间短，效率高；(2)试剂材料消耗低；(3)易于集成化、便携化，操作简便。微流控芯片的这些优点使其在生物医学、高通量药物合成筛选、农作物的优选优育、环境检测和保护、卫生免疫、司法鉴定、生物战剂的侦检和天体生物学研究等众多领域提供了广阔的应用前景，而氧含量是以上诸多研究领域中的一个重要的实验指标，其中对生物分析研究是最为关键的，同时生物分析也是微流控芯片最重要的一个应用领域。生物分析中的PCR及DNA测序分析、氨基酸及蛋白质分析、单细胞分析、单分子分析以及免疫分析几个方面应用最多。与微流控芯片结合的PCR可以获得较高的热传导率，很大程度缩短PCR所需的时间，同时也可以节约空间减少试剂的消耗，并且也容易与样品分离、电泳检测等功能部件集成，实现实验室的微型化、自动化。在细胞分析方面微流控芯片可以将单细胞操纵、传输、定位、溶胞、分离及检测集成在一块芯片上，分析速度快。在免疫分析方面微流控分析芯片相对于常规的免疫分析能够提高反应效率、简化分析过程、减少分析时间、降低试剂的消耗。
微流控系统具有结构简单，设计原理清晰的优点，因此容易与光学检测器、电化学检测器和质谱检测器等检测器联用。光学检测是目前在微流控芯片中使用最多的检测方法，并且根据光学原理分为荧光检测、吸光检测以及化学发光检测等检测技术。其中在微流控芯片中应用的荧光检测法具有灵敏度高、选择性好、和线性范围较宽、能够进行单分子检测的优点，与微流控芯片分析系统相匹配，成为现如今科学研究领域中应用最广泛的检测方法。
光化学氧传感器通常是基于氧敏感材料的发光寿命或发光强度随氧气含量的变化而工作的。一般是将适当的氧敏感物质(某些有机染料、多环芳烃及过渡金属有机络合物)固定在合适的支持体系中，再通过它在不同浓度的氧气环境中的光学信号(荧光或磷光)的变化来检测氧。主要由发光分子与载体材料组成，对于这类氧传感器的设计与优化，通常是从发光分子和载体材料的选择，以及二者之间的相互作用来考虑。
细乳液聚合是一种新型的聚合方法，是指在高剪切力作用下形成的分散的、稳定的、大小介于50～500nm之间的微小液滴，液滴内包含单体、水、乳化剂和引发剂等成分，聚合在微小液滴内进行，因此称为细乳液聚合。常规乳液聚合主要以胶束成核或均相成核为主，而细乳液的聚合是在单体小液滴中进行，不依赖于单体经水相扩散到胶束这一传质过程，因此，细乳液聚合有利于一些水溶性小的单体反应。同时，细乳液聚合在保留了常规乳液聚合的优点(高聚合速度、高相对分子质量、易散热和低黏度)的基础上，所制得的微球粒径更小一些，使得稳定性有了提高。
发明内容
本发明目的是为了提高微流控芯片检测氧含量浓度的精度和速度，而提供基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液制备方法及在光学氧传感微流控检测芯片中的应用。
本发明基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备方法按以下步骤实现：
将聚二甲基硅氧烷(PDMS)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸三氟乙酯(TFEMA)和丙烯酸丁酯(BA)作为共聚单体进行混合，将指示剂分子八乙基卟啉铂(PtOEP)和参比指示剂香豆素6(C-6)按照质量比为5～7:1分散在混合单体中，然后加入引发剂过硫酸钾(KPS)、乳化剂十二烷基硫酸钠(SDS)和超纯水，在55～65℃的温度下细乳液聚合反应1.5h～2.5h，然后在室温下进行超声处理，再升温至70～75℃回流反应7～9h，得到基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球(PDMS-MMA-BA-TFEMA比色荧光微球)乳液。
基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液在光学氧传感微流控检测芯片中的应用，通过光刻法在硅片刻蚀出槽道，将基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液浇注在硅片表面，固化处理后得到固化有比色荧光微球的硅片；将基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液均匀涂布于经过无水乙醇清洗处理的玻片上成膜，固化处理后得到固化有比色荧光微球的玻片，将固化有比色荧光微球的硅片与固化有比色荧光微球的玻片进行键合，得到PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片。
本发明提供一种能够实时测量氧浓度的PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片。采用溶解氧能够猝灭指示剂八乙基卟啉铂(PtOEP)所发射的磷光这一原理制备相应的荧光微球。利用细乳液聚合技术制得的PDMS-MMA-BA-TFEMA比色荧光微球稳定性好、对氧气的通透性和灵敏度高，线性相关性高，减小环境变化对氧气检测精度的影响，乳液固化制成微流控芯片管道，制得光化学氧传感器检测系统，制备方法简单便捷，检测芯片内氧含量直观迅速。
本发明基于八乙基卟啉铂的共聚物乳液的制备方法及光学氧传感微流控检测芯片包括以下有益效果：
1、本发明基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备工艺过程简单，重现性高；
2、光学氧传感微流控检测芯片对氧气响应快，无需再借助其它氧气传感器设备完成可视化检测芯片内氧气浓度；
3、实时直观检测整个芯片管道各个地方的氧气浓度及变化；
4、简化微流控芯片内氧气含量的检测装置；
5、减小环境变化所导致的荧光微球对氧含量监测精度的影响；
6、Stern-Volmer方程线性相关性高，相关系数R2达到0.85以上，能够用于精确测量溶解氧；
7、以水作为溶剂，更加环保；
8、采用了细乳液聚合的方式，相比于传统的乳液聚合，此种聚合方式的单分散性更好。
附图说明
图1为不同氮氧比例下荧光的相对强度曲线图，沿着图中箭头方向，O2含量依次为0％，20％，40％，60％，80％，100％；
图2为实施例中三元比色荧光微球的S-V曲线图；
图3为实施例中三元比色荧光微球的光稳定性测试图；
图4为应用实施例中PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片在荧光激发下通入O2的芯片管道显微镜拍摄图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备方法按以下步骤实施：
将聚二甲基硅氧烷(PDMS)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸三氟乙酯(TFEMA)和丙烯酸丁酯(BA)作为共聚单体进行混合，将指示剂分子八乙基卟啉铂(PtOEP)和参比指示剂香豆素6(C-6)按照质量比为5～7:1分散在混合单体中，然后加入引发剂过硫酸钾(KPS)、乳化剂十二烷基硫酸钠(SDS)和超纯水，在55～65℃的温度下细乳液聚合反应1.5h～2.5h，然后在室温下进行超声处理，再升温至70～75℃回流反应7～9h，得到基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球(PDMS-MMA-BA-TFEMA比色荧光微球)乳液。
本实施方式基于氧气猝灭八乙基卟啉铂(PtOEP)发射荧光的原理，通过细乳液聚合方法制备比色荧光微球，并结合PDMS微流控芯片制成PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片。
本实施方式以对氧气敏感的八乙基卟啉铂(PtOEP)和对氧气不敏感的参比指示剂香豆素6(C-6)为指示剂，聚二甲基硅氧烷(PDMS)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸三氟乙酯(TFEMA)与丙烯酸丁酯(BA)为共聚物单体，过硫酸钾(KPS)为引发剂，十二烷基硫酸钠(SDS)为乳化剂制备具有氧传感性能的共聚物乳液。首先制备共聚物乳液，然后固化制成微流控芯片管道；测量共聚物乳液的Stern-Volmer曲线与稳定性；在荧光显微镜下拍摄通入不同氧气浓度气体条件下芯片颜色变化图。此方法便捷易行，原理简单，制成的光学氧传感检测系统，稳定性好，通过检测器颜色变化来直观快速确定芯片中氧气浓度，同时引入比色指示剂C-6来减小环境变化对检测精度的影响。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是所述的聚二甲基硅氧烷(PDMS)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸三氟乙酯(TFEMA)和丙烯酸丁酯(BA)的质量比为1:1:2:1。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是2mL混合单体中加入3mg指示剂分子八乙基卟啉铂。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
本实施方式混合单体体积是指聚二甲基硅氧烷、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸三氟乙酯和丙烯酸丁酯的体积总和。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是指示剂分子八乙基卟啉铂与十二烷基硫酸钠(SDS)的质量比为4：225。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是指示剂分子八乙基卟啉铂与引发剂过硫酸钾(KPS)的质量比为3：225。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是在转速为300r/min的条件下进行细乳液聚合反应2h，然后在室温下超声处理20min，再升温至70℃回流反应8h。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备全过程在避光条件下进行。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
本实施方式从加入共聚单体至反应结束的整个过程避光反应。
具体实施方式八：本实施方式基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液在光学氧传感微流控检测芯片中的应用，光学氧传感微流控检测芯片的制备过程如下：
通过光刻法在硅片刻蚀出槽道，将基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液浇注在硅片表面，固化处理后得到固化有比色荧光微球的硅片；将基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液均匀涂布于经过无水乙醇清洗处理的玻片上成膜，固化处理后得到固化有比色荧光微球的玻片，将固化有比色荧光微球的硅片与固化有比色荧光微球的玻片进行键合，得到PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是通过光刻法在硅片刻蚀出深度为15μm，宽度为300μm，长为4cm的槽道。其它步骤及参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式八不同的是所述的固化处理是在80℃烘箱中固化24h。其它步骤及参数与具体实施方式八相同。
实施例：本实施例基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备方法按以下步骤实施：
将0.2mg聚二甲基硅氧烷(PDMS)、0.2mg甲基丙烯酸甲酯(MMA)、0.4mg甲基丙烯酸三氟乙酯(TFEMA)和0.2mg丙烯酸丁酯(BA)作为共聚单体进行混合，将0.006g指示剂分子八乙基卟啉铂(PtOEP)和0.001g参比指示剂香豆素6(C-6)分散在混合单体中，先向反应釜中加入0.45g引发剂过硫酸钾(KPS)、0.45g乳化剂十二烷基硫酸钠(SDS)和50ml超纯水，在60℃的温度，转速为300r/min的条件下细乳液聚合反应2h，然后将反应釜室温下超声20min，再升温至70℃回流反应8h，全程反应在避光下进行，得到PDMS-MMA-BA-TFEMA(PtOEP/C-6)比色荧光微球乳液。
三元比色荧光微球的Stern-Volmer曲线测定：
取5μL实施例制得的PDMS-MMA-BA-TFEMA(PtOEP/C-6)比色荧光微球乳液和3mL超纯水于比色皿中，通过改变氧气饱和载液和氮气饱和载液的流量比，将混合气体不断通入比色皿中，在380nm的激发波长下测试，得到不同氮氧比例条件下不同荧光强度的发射光谱。测定由氮气饱和的载液流经传感器的荧光强度I0与各溶解氧浓度下荧光强度I的比值。根据最小二乘法原理求得线性回归方程，建立响应信号I0/I下与溶解氧浓度[Q]的定量分析模型I0/I＝1+Ksv[Q]。本实施例得到的I0/I＝1.25216+2.36441[O2]，R2＝0.87258，如图2所示。
比色荧光微球稳定性的测定：
取5uL的PDMS-MMA-BA-TFEMA(PtOEP/C-6)比色荧光微球乳液和3mL超纯水于比色皿中，在380nm的激发波长下测试2h，观察其荧光强度变化。
三元比色荧光微球的光稳定性的测试图如图3所示，图中最大值为36.996，最小值为35.138，衰减率：5.02％，保持率：94.98％。
应用实施例：本实施例通过光刻法在硅片刻蚀出深度为15μm，宽度为300μm，长为4cm的槽道，硅片表面用表面活性剂进行冲洗处理，将基于八乙基卟啉铂的共聚物乳液浇注在硅片表面，置于80℃烘箱中固化24h，得到固化有比色荧光微球的硅片；将基于八乙基卟啉铂的共聚物乳液均匀涂布于经过无水乙醇清洗处理的玻片上成膜，80℃烘箱中固化24h，得到固化有比色荧光微球的玻片，将固化有比色荧光微球的硅片与固化有比色荧光微球的玻片进行键合，得到PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片，芯片避光保存。
在荧光激发下拍摄的通入O2的芯片管道图如图4所示。
通入氮气时管道主要呈现出的颜色是红色，通入氧气时管道主要呈现出的颜色是绿色。

Claims (10)

1.基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
将聚二甲基硅氧烷、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸三氟乙酯和丙烯酸丁酯作为共聚单体进行混合，将指示剂分子八乙基卟啉铂和参比指示剂香豆素6按照质量比为5～7:1分散在混合单体中，然后加入引发剂过硫酸钾和乳化剂十二烷基硫酸钠，加入超纯水后在55～65℃的温度下细乳液聚合反应1.5h～2.5h，然后在室温下进行超声处理，再升温至70～75℃回流反应7～9h，得到基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液。
2.根据权利要求1所述的基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备方法，其特征在于所述的聚二甲基硅氧烷、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸三氟乙酯和丙烯酸丁酯的质量比为1:1:2:1。
3.根据权利要求1所述的基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备方法，其特征在于2mL混合单体中加入3mg指示剂分子八乙基卟啉铂。
4.根据权利要求1所述的基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备方法，其特征在于指示剂分子八乙基卟啉铂与十二烷基硫酸钠的质量比为4：225。
5.根据权利要求1所述的基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备方法，其特征在于指示剂分子八乙基卟啉铂与引发剂过硫酸钾的质量比为3：225。
6.根据权利要求1所述的基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备方法，其特征在于在转速为300r/min的条件下进行细乳液聚合反应2h，然后在室温下超声处理20min，再升温至70℃回流反应8h。
7.根据权利要求1所述的基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备方法，其特征在于基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液的制备全过程在避光条件下进行。
8.如权利要求1所述制备方法得到的基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液在光学氧传感微流控检测芯片中的应用，其特征在于将基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液用于制备PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片的制备过程如下：
通过光刻法在硅片刻蚀出槽道，将基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液浇注在硅片表面，固化处理后得到固化有比色荧光微球的硅片；将基于八乙基卟啉铂的比色荧光微球乳液均匀涂布于经过无水乙醇清洗处理的玻片上成膜，固化处理后得到固化有比色荧光微球的玻片，将固化有比色荧光微球的硅片与固化有比色荧光微球的玻片进行键合，得到PtOEP/PDMS光学氧传感微流控检测芯片。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于通过光刻法在硅片刻蚀出深度为15µm，宽度为300µm，长为4cm的槽道。
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