TWI463011B - 細胞自組裝陣列晶片及其製作方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種細胞晶片及其製作方法，特別是關於一種細胞自組裝陣列晶片及其製作方法。
特定細胞的觀察與培養，乃是生物醫學研究(bio-medical research)中，最基礎且最重要的部分。現有觀察細胞的方式，多是以顯微鏡(microscopy)為主，包括：光學顯微鏡(optical microscopy)的使用以及螢光顯微鏡(fluorescence microscopy)的應用。然而，大量且高密度的細胞，容易因為互相堆疊而形成多層排列(multiple layer arrangement)，多層排列的堆積則會造成訊號遮蔽(signal shadowing)而產生錯誤的判斷(wrong determination)，造成檢測失誤。因此，為了避免檢測上的失誤，必須讓細胞以陣列式單層排列。
單層細胞陣列具有單層、高密度、大量排列等特性。目前讓細胞形成單層細胞陣列的方法包括：化學修飾(chemical modification)、介電泳(dielectrophoresis)作用以及藉由柱狀式(columnar)結構或微凹槽式(microwell)結構侷限等，其中化學修飾僅限於使用在貼附式細胞；介電泳作用電極的設計複雜，並且會占掉一定的排列空間，因此不適合使用在大量的細胞排列，且所使用的介質並非傳統的細胞培養液或是緩衝液，因此可能對細胞
產生毒性或傷害；柱狀式結構侷限細胞的細胞陣列則是用來作為單細胞的細胞培養，由於柱狀式結構的設計需要額外的空間，因此在同時檢測大量細胞時，整體上會浪費掉極大量的空間；以及，凹槽式結構侷限細胞的細胞陣列則是用來做藥物測試觀察單顆細胞的反應以及稀有細胞檢測，然而，由於其微結構的設計會占用部分的空間，而減少每單位面積的細胞密度。
舉例來說，美國公告第6,548,263號揭示一種「作為細胞篩檢之用的微型細胞陣列方法與裝置/Miniaturized cell array methods and apparatus for cell-based screening」，其中對基材作一選擇性官能基(functional group)的修飾，例如氫氧基(hydroxyl group)，使能與此官能基吸引或排斥的細胞產生沉積(precipitation)，再移除未附著的細胞，而達成單層細胞陣列，應用於組織工程。此方法所形成的細胞陣列密度低、不適用於懸浮細胞，而且會造成大量細胞的損失。又，美國公告第7,358,079號專利所揭示之「用以多分析測定之流動細胞陣列及其應用/Flow cell array and the utilization thereof for multianalyte determination」，其係利用數個具有一個入口及出口樣本隔間陣列(array of sample compartments)，用以檢測不同的細胞樣本。此方法之缺點在於使用不便，且不適用於高密度之細胞陣列。
另外，在微量細胞的檢測上，如循環癌細胞(circulating tumor cells,CTCs)，可參考Nagrath等人所
發表之文獻「Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology」(Nature
450,1235-1239,2007)，其中提及以EpCAM抗體修飾微流道上數個微柱(microcolumns)陣列，藉由抗體抗原間的專一性鍵結(specific binding)，使CTCs附著於微柱(microcolurmns)陣列，再移除未附著的細胞，以留下目標細胞，而達到CTCs篩檢的目的。此方法之缺點在於無法將全血樣本內的CTCs全數捕捉，並且在晶片製作時，需要將特定抗體修飾於微柱陣列上，因而降低該晶片在細胞上的通用性。
因此，上述現有之細胞陣列晶片在實際使用上仍具有下述問題，例如：不適用於高密度之細胞陣列、易造成大量細胞的損失，以及由於加入抗體的修飾，而削減了晶片對不同細胞種類的通用性。另外，上述現有之細胞陣列晶片及其設備之購置及操作成本也較高。故，有必要提供一種細胞自組裝陣列晶片裝置及其製作方法，以解決習用技術所存在的問題。
本發明之主要目的在於提供一種細胞自組裝陣列晶片，其具有細胞自組裝區以及至少一牽引通道，其構造上可輔助流體受重力垂直向下沉降，再轉向成水平輻射向外移動，藉由因外側蒸發作用而產生由內向外之拉力作用，使得該細胞自組裝區內之液體部分蒸散減少，因
而使該細胞以自組裝方式陣列排列於該細胞自組裝區，故整體構造簡單、方便組裝，無須以特定抗體對基材表面進行修飾，因而可節省該晶片在使用上的成本，適用於大量高密度之細胞檢測，且通用於各種細胞樣本，故能解決習知細胞陣列晶片過於複雜的設計、浪費使用上的空間、排列上細胞數量的限制以及無法廣泛使用於各種細胞樣本等技術問題。
本發明之次要目的在於提供一種細胞自組裝陣列晶片之製作方法，其中可依序疊合第一基板、間隔件及第二基板成一體，也可在依序疊合之後另包含：利用至少二固定元件夾持固定該第一基板、間隔件及第二基板。因此，確實簡化了細胞自組裝陣列晶片的整體構造與製作流程，有利於相對降低製作成本。
為達上述之目的，本發明提供一種細胞自組裝陣列晶片，其包含：一第一基板，開設有至少一第一開孔；一第二基板，用以作為一平台；及數個間隔件，間隔的環狀排列固設於該第二基板上，以定義一細胞自組裝區以及至少一牽引通道，該細胞自組裝區對應於該第一開孔，且該第一基板、該間隔件及該第二基板依序疊合成一體；其中該細胞自組裝區用以容置一含細胞之懸浮液，並使該懸浮液內之細胞受重力而垂直向下沉降於該細胞自組裝區的表面，且該牽引通道之高度小於該細胞之
粒徑，該懸浮液之一液體部分水平輻射向外進入該牽引通道，並因外側蒸發作用而產生由內向外之拉力作用，使得該細胞自組裝區內之液體部分蒸散減少，因而使該細胞以自組裝方式陣列排列於該細胞自組裝區。
在本發明之一實施例中，另包含：至少二個固定元件，用以夾持固定該第一基板、該間隔件及該第二基板。
在本發明之一實施例中，其中該第一基板之一上表面及該第一開孔之一內壁面係具有一抗沾黏修飾層。
在本發明之一實施例中，其中該第二基板之厚度小於該第一基板之厚度。
在本發明之一實施例中，其中該間隔件係等間距排列在該第二基板上之數個弧形光阻條。
本發明之次要目的在於提供一種細胞自組裝陣列晶片之製作方法，其包含步驟：提供一第一基板，其開設有一第一開孔；提供一第二基板作為一平台；於該第二基板上間隔的環狀排列固設數個間隔件，以定義一細胞自組裝區以及至少一牽引通道；以及依序疊合該第一基板、該間隔件及該第二基板成一體；其中該細胞自組裝區用以容置一含細胞之懸浮液，並使該懸浮液內之細胞受重力而垂直向下沉降於該細胞自組裝區的表面，且該牽引通道之高度小於該細胞之粒徑，該懸浮液之一液體部分水平輻射向外進入該牽引
通道，並因外側蒸發作用而產生由內向外之拉力作用，使得該細胞自組裝區內之液體部分蒸散減少，因而使該細胞以自組裝方式陣列排列於該細胞自組裝區。
在本發明之一實施例中，其中在依序疊合該第一基板、該間隔件及該第二基板成一體的步驟之後，另包含：利用至少二固定元件夾持固定該第一基板、該間隔件及該第二基板。
在本發明之一實施例中，其中在提供該第一基板的步驟中，該第一基板之一上表面及該第一開孔之一內壁面係形成一抗沾黏修飾層。
在本發明之一實施例中，其中該第二基板之厚度小於該第一基板之厚度。
在本發明之一實施例中，其中在於該第二基板上間隔的環狀排列固設該間隔件的步驟中，包含：塗佈一光阻材料於該第二基板上；以及以曝光及顯影技術在該光阻材料上定義出等間距排列之數個弧形光阻條，以做為該些間隔件。
為了讓本發明之上述及其他目的、特徵、優點能更明顯易懂，下文將特舉本發明較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下。再者，本發明所提到的方向用語，例如「上」、「下」、「前」、「後」、「左」、「右」、「內」、「外」或「側面」等，僅是參考附加圖式的方向。因此，
使用的方向用語是用以說明及理解本發明，而非用以限制本發明。
本發明用以提供一種細胞自組裝陣列晶片，其特別設計成具有細胞自組裝區以及至少一牽引通道，其構造上可輔助流體受重力垂直向下沉降，再轉向成水平輻射向外移動，藉由因外側蒸發作用而產生由內向外之拉力作用，使得該細胞自組裝區內之液體部分蒸散減少，因而使該細胞以自組裝方式陣列排列於該細胞自組裝區，故整體構造簡單、方便組裝，無須以特定抗體對基材表面進行修飾，而可節省該晶片在使用上的成本，適用於大量高密度之細胞檢測，且通用於各種細胞樣本，故能解決習知細胞陣列晶片過於複雜的設計、浪費使用上的空間、排列上細胞數量的限制以及無法廣泛使用於各種細胞樣本等技術問題。
請參照第1及2圖所示，其揭示本發明較佳實施例之一種細胞自組裝陣列晶片10，其包含：一第一基板11、一第二基板12以及數個間隔件13。該第一基板11開設有至少一第一開孔14，用以作為樣本液的注入口，例如一細胞懸浮液。該第二基板12用以作為一平台，且該第二基板13之厚度小於該第一基板11之厚度。該間隔件13間隔的環狀排列固設於該第二基板12上，以定義一細胞自組裝區15以及至少一牽引通道16。該第一基板11、該間隔件13以及該第二基板12依序疊合成一體，其中該第一及第二基板11,12之材料可為玻璃
或聚二甲基矽氧烷(PDMS)，而該間隔件13較佳為一光阻材料(例如SU-8)經由曝光顯影所製成。
請再參照第1及2圖所示，該第一基板11開設有至少一第一開孔14，例如2個、3個、4個或更多，用以作為一樣本液的注入口，例如一細胞懸浮液。該第一基板11之一上表面及該第一開孔14之一內壁面較佳係具有一抗沾黏修飾層(未繪示)，例如1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl trichlorosilane,FOTS)，用以避免該樣本液的溢出或該樣本液中細胞或微米球沾附在該第一基板11上所造成之細胞或微米球的損失。又，該第二基板12之厚度較佳為小於該第一基板11之厚度，然而，若該第一或第二基板11,12之厚度太薄，會導致機械強度不足，又若該第一或第二基板11,12之厚度太厚，則又不利於光學系統的觀測，例如光學顯微鏡或螢光顯微鏡。因此，在本實施例中，該第一基板11之厚度較佳為1~2公釐(mm)之間，該第二基板12之厚度較佳為0.5~1公釐之間。
請再參照第2圖所示，在本實施例中，該數個間隔件13以間隔的環狀排列，固設於該第二基板12上，以定義一細胞自組裝區15以及至少一牽引通道16，其中該間隔件13係等間距排列在該第二基板12上之數個弧形光阻條。該細胞自組裝區15係指被該數個間隔件13所圍繞的一個中央區域的空間，且該細胞自組裝區15之直徑係大於該第一開孔14之孔徑；而該牽引通道16
可為一個或數個，例如2個、3個、4個或更多。
請參照第3及4圖所示，在本實施例中，當使用該細胞自組裝陣列晶片10時，本發明首先係以一滴管(dropper)20或一微量吸管(pipetman)取一樣本液，例如細胞懸浮液，自該第一開孔14加入該樣本液於該細胞自組裝陣列晶片10中，藉由液體及細胞本身之重力而沉降於在該第二基板上12之細胞自組裝區15，而懸浮液之液體部分則進入牽引通道16中，例如第3圖所示之對向的牽引通道16，並因液體部分在該牽引通道16之外側與外部大氣產生蒸發作用，進而產生由內向外之拉力作用，使得液體水平向外蒸散因而逐漸減少在該細胞自組裝區15內之懸浮液所含之液體部分。如此，該樣本液中的懸浮顆粒40，例如細胞，因液體部分的減少及細胞本身重力的沉降而以自組裝方式陣列排列於該細胞自組裝區15。此外，值得一提的是，該牽引通道16之高度必需設計成小於該細胞之平均粒徑，因此該牽引通道16可以阻擋細胞自該牽引通道16流出，以免造成細胞數量的損失(如第5圖所示)。
如上所述，本發明較佳實施例之細胞自組裝陣列晶片10，其構造簡單且方便組裝，無需以特定抗體對該基材表面進行修飾，因而可以節省該晶片在使用上的成本，適用於大量高密度之細胞檢測，又通用於各種細胞樣本，故能解決習知細胞陣列晶片過於複雜的設計、浪費使用上的空間、排列上細胞數量的限制以及無法廣泛
使用於各種細胞樣本等技術問題。
再者，如第6A及6B圖所示，本發明較佳實施例進一步提供一種細胞自組裝陣列晶片10之製作方法，其包含步驟：提供一第一基板11，其開設有一第一開孔14；提供一第二基板12作為一平台；於該第二基板12上間隔的環狀排列固設數個間隔件13，以定義一細胞自組裝區15以及至少一牽引通道16；以及依序疊合該第一基板11、該間隔件13及該第二基板12成一體；其中該細胞自組裝區15用以容置一含細胞之懸浮液，及該牽引通道16之高度小於該細胞之粒徑。如第6C及6D圖所示，在本實施例中，必要時，該細胞自組裝陣列晶片10之製作方法在依序疊合該第一基板11、該間隔件13及該第二基板12成一體的步驟之後，另可選擇性包含：利用至少二固定元件50夾持固定該第一基板11、該間隔件13及該第二基板12，以便精準控制該第一基板11及第二基板12之間距(即該牽引通道16之高度)。
更詳細來說，請再參照第6A圖所示，在本實施例中，該第二基板12上間隔的環狀排列固設該間隔件13的步驟中，包含：塗佈一光阻材料，例如SU-8，於該第二基板12上；以及，以曝光及顯影技術在該光阻材料上定義出等間距排列之數個弧形光阻條，以作為該些間隔件13。其中，該第一及第二基板11,12之材料可為玻璃或聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)，
而該間隔件13為一光阻材料，例如SU-8，但不限於此；在其他實施方式中，該間隔件13之材料亦可為紫外光固化樹脂、熱固化樹脂或其他固化樹脂，例如環氧樹脂等。
此外，請再參照第6A至6D圖所示，在本實施例中，本發明細胞自組裝陣列晶片10的使用方法係可與上述製造方法同時進行，其使用方法之步驟大致包含：在該第二基板12上加入適量的無色緩衝溶液(phosphate buffered saline,PBS)，蓋上該第一基板11，用以移除多餘的無色緩衝液，再使用該固定元件50，用以夾持固定該第一基板11、該間隔件13及該第二基板12，以便完成該細胞自組裝陣列晶片10的組裝；接著，將含有適量細胞數量的細胞懸浮液滴入該第一基板11之該第一開孔14，放置於水平處靜待5~10分鐘，藉由重力及來自該牽引通道之蒸散作用，便可完成高密度細胞陣列的自組裝；隨後，即可置於光學顯微鏡或螢光顯微鏡下，進行觀測。此外，值得一提的是，若是要對該樣本液進行特定的檢測或實驗，則必須在使用該細胞自組裝陣列晶片10前，預先對該樣本液進行預處理(pre-treatment)，以避免額外處理的過程中，造成該細胞自組裝陣列的破壞。
如上所述，相較於習用之細胞自組裝陣列晶片，雖同樣能夠進行樣本液的檢測，卻因為習知細胞自組裝晶片之微結構浪費過多可利用之空間，而不適用於高密度
之細胞陣列，又因為使用過程中容易造成大量細胞的損失，以及部分習知之細胞自組裝晶片，因加入抗體的修飾，反而削減了細胞種類的通用性。因此，根據先前所述，本發明之細胞自組裝陣列晶片結構簡單，方便組裝，同時也簡化了習知細胞自組裝陣列晶片的製作及使用流程，並可於晶片組裝上增加多樣的應用方式，故確實有效解決以該晶片進行光學觀察之問題，並可直接以本發明之細胞自組裝陣列晶片進行活細胞之培養，適用於各種研究或檢驗目的，因而增加本發明之細胞自組裝陣列晶片的適用範圍。
雖然本發明已以較佳實施例揭露，然其並非用以限制本發明，任何熟習此項技藝之人士，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
10‧‧‧細胞自組裝陣列晶片
11‧‧‧第一基板
12‧‧‧第二基板
13‧‧‧間隔件
14‧‧‧第一開孔
15‧‧‧細胞自組裝區
16‧‧‧牽引通道
20‧‧‧滴管
30‧‧‧樣本液
40‧‧‧懸浮顆粒
50‧‧‧固定元件
第1圖：本發明較佳實施例之細胞自組裝陣列晶片之一第一基板之上視圖。
第2圖：本發明較佳實施例之細胞自組裝陣列晶片之一第二基板之上視圖。
第3圖：本發明較佳實施例之細胞自組裝陣列晶片之剖視圖。
第4圖：本發明較佳實施例之細胞自組裝陣列晶片之剖視圖。
第5圖：本發明較佳實施例之細胞自組裝陣列晶片之局部放大圖。
第6A、6B、6C及6D圖：本發明較佳實施例之細胞自組裝陣列晶片之使用方法之流程示意圖。
10‧‧‧細胞自組裝陣列晶片
11‧‧‧第一基板
12‧‧‧第二基板
16‧‧‧牽引通道
40‧‧‧懸浮顆粒
Claims (10)
- 一種細胞自組裝陣列晶片，其包含：一第一基板，開設有至少一第一開孔；一第二基板，用以作為一平台；及數個間隔件，間隔的環狀排列固設於該第二基板上，以定義一細胞自組裝區以及至少一牽引通道，該細胞自組裝區對應於該第一開孔，且該第一基板、該間隔件及該第二基板依序疊合成一體；其中該細胞自組裝區用以容置一含細胞之懸浮液，並使該懸浮液內之細胞受重力而垂直向下沉降於該細胞自組裝區的表面，且該牽引通道之高度小於該細胞之粒徑，該懸浮液之一液體部分水平輻射向外進入該牽引通道，並因外側蒸發作用而產生由內向外之拉力作用，使得該細胞自組裝區內之液體部分蒸散減少，因而使該細胞以自組裝方式陣列排列於該細胞自組裝區。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞自組裝陣列晶片，另包含：至少二個固定元件，用以夾持固定該第一基板、該間隔件及該第二基板。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞自組裝陣列晶片，其中該第一基板之一上表面及該第一開孔之一內壁面係具有一抗沾黏修飾層。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞自組裝陣列晶片，其中該第二基板之厚度小於該第一基板之厚度。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞自組裝陣列晶片，其中該間隔件係等間距排列在該第二基板上之數個弧形光阻條。
- 一種細胞自組裝陣列晶片之製作方法，其包含步驟：提供一第一基板，其開設有一第一開孔；提供一第二基板作為一平台；於該第二基板上間隔的環狀排列固設數個間隔件，以定義一細胞自組裝區以及至少一牽引通道；以及依序疊合該第一基板、該間隔件及該第二基板成一體；其中該細胞自組裝區用以容置一含細胞之懸浮液，並使該懸浮液內之細胞受重力而垂直向下沉降於該細胞自組裝區的表面，且該牽引通道之高度小於該細胞之粒徑，該懸浮液之一液體部分水平輻射向外進入該牽引通道，並因外側蒸發作用而產生由內向外之拉力作用，使得該細胞自組裝區內之液體部分蒸散減少，因而使該細胞以自組裝方式陣列排列於該細胞自組裝區。
- 如申請專利範圍第6項所述之細胞自組裝陣列晶片之製作方法，其中在依序疊合該第一基板、該間隔件及該第二基板成一體的步驟之後，另包含：利用至少二固定元件夾持固定該第一基板、該間隔件及該第二基板。
- 如申請專利範圍第6項所述之細胞自組裝陣列晶片之製作方法，其中在提供該第一基板的步驟中，該第一基板之一上表面及該第一開孔之一內壁面係形成一抗沾黏修飾層。
- 如申請專利範圍第6項所述之細胞自組裝陣列晶片之製作方法，其中該第二基板之厚度小於該第一基板之厚度。
- 如申請專利範圍第6項所述之細胞自組裝陣列晶片之製作方法，其中在於該第二基板上間隔的環狀排列固設該間隔件的步驟中，包含：塗佈一光阻材料於該第二基板上；以及以曝光及顯影技術在該光阻材料上定義出等間距排列之數個弧形光阻條，以做為該些間隔件。
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