CN102911864B - 一种血液中稀有细胞的分离仪 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血液中稀有细胞的分离仪，包括微芯片及其附属外围设备，包括存储器和泵；微芯片包括具有凹槽的薄片和载玻片，薄片放置在载玻片上形成一个微流体通道；该微流体通道连接在该存储器与该泵之间，允许该血液样本从存储器流到泵；多个磁铁位于该载玻片旁，沿着载玻片的长度形成梯度的磁场分布，载玻片用来采集稀有细胞；在血液样本内放入磁性纳米粒子，磁性纳米粒子表面带有抗体，通过免疫反应吸附在目标细胞上，然后将稀有细胞已被标记的血液样本置放到存储器内，泵启动后，血液样本通过微流体通道时，血液样本中的附着有磁性纳米粒子的稀有细胞可以被磁铁吸引。

Description

一种血液中稀有细胞的分离仪

技术领域

本发明涉及一种血液检测仪器，尤其是涉及一种血液中稀有细胞的分离仪。

背景技术

血液稀有细胞分离仪是检测与重大疾病相关的血液中稀有细胞的下一代诊断工具，稀有细胞包括流通在血液样本中的循环肿瘤细胞（CTC）、恶性干细胞和病变的具有特定蛋白质标记的细胞等等。相关的研究证实，病人的血液样本中出现的循环肿瘤细胞数量与病人早期诊断和存活率具有很强的相关性。因此，对病人的血液样本的稀有细胞检测和分析是提高肿瘤疾病早期发现率和个性化治疗的关键。

由于病人血液样本的CTCs数量非常小，使CTC检测具有很大的挑战性。流式细胞仪检测方法是最普遍使用的一种CTC检测方法，CTC比一般胞体大，核浆比例高，胞浆内颗粒物质少，表达特异性抗原，流式细胞仪应用其对光散射和免疫荧光识别的特性，将CTC从总的细胞中分离出来。目前最新流式细胞仪BD FACSAria是流式高速细胞分选的新突破，但其难以克服的缺陷是：瞬时的激光打击仍将给细胞带来损伤，分选活性差；由于光谱间存在的交叉，易混入假阳性的细胞；荧光信号所需的补偿难以调配；往往会出现细胞粘连成团的现象，流出道的堵塞时有发生；分选中断后需重新过滤细胞制备样本，这增加了污染的机率，且细胞活性大大受损。单纯以流式细胞术检测肿瘤患者中的CTC的方法仍存争议；另外形态分离方法，从白细胞中分离出的CTCs的数量和密度比较小，同时会留下大量的与CTC形态类似且不足以视为CTC的细胞，如与白细胞一样小的非循环肿瘤细胞。还有免疫检测方法，因CTCs具有高特分离效性，可利用特定的标记物，对目标CTC进行标记，但需要额外增加一个免疫荧光染色筛选步骤。

所以，有必要提供一种操作更方便和分离效果更好的的仪器从病人血液样本中分离稀有细胞和/或病变的特定蛋白质细胞。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作方便、分离效果更好的血液中稀有细胞分离仪。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种血液中稀有细胞的分离仪，包括：

一个提供血液样本的存储器；

一个用于抽取血液样本的泵；

包括一个微芯片，微芯片包括具有凹槽的薄片和载玻片，薄片设置在载玻片上形成一个微流体通道；

该微流体通道连接在该存储器与该泵之间，允许该血液样本从存储器流到泵；

多个磁铁位于该载玻片底部，并沿着载玻片的长度形成梯度的磁场分布，载玻片用来采集微芯片捕获的稀有细胞。

该微流体通道的入口通过第一连接管与存储器连通，该微流体通道的出口通过第二连接管与泵连通，第一连接管与微流体通道的夹角为钝角，第二连接管与微流体通道的夹角为钝角。

还包括用于旋转该微流体通道的方向的旋转手臂。

在旋转手臂的驱动下，该微流体通道在垂直位置、水平位置和对称翻转位置进行交替。

载玻片上的磁场梯度和强度为可调节的。

微流体通道的横截面为六边形。在保证捕获率的前提下，使捕获到的稀有细胞分布广。

存储器上设置有机械缓冲装置。

薄片和载玻片之间为可分离式连接。方便对已捕获的稀有细胞进行后续分析。

存储器位置高于微芯片的位置50mm～150mm。一方面保证血液样本的流通，另一方面又不至于使微流体通道承受过大的压力。

旋转手臂的旋转中心位于微流体通道的外部。

与现有技术相比，本发明的优点是在血液样本内放入磁性纳米粒子，磁性纳米粒子表面带有抗体，通过免疫反应吸附在目标细胞上，然后将稀有细胞已被标记的血液样本置放到存储器内，泵启动后，血液样本通过微流体通道时，血液样本中的附着有磁性纳米粒子的稀有细胞可以被梯度磁场引导，进而被采集在载玻片上，用于后续分析。

附图说明

图1为本发明的结构图；

图2为本发明的微流体通道的出入口示意图；

图3为未吸附于细胞上的纳米颗粒和各种稀有细胞在载玻片上三个不同区域被隔离的示意图；

图4为旋转手臂带动微流体通道进行翻转的示意图；

图5为存储器上的机械缓冲装置的结构图；

图6为微芯片与阵列磁铁的示意图；

图7为磁铁加垫片后的示意图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

血液样本中稀有细胞的分离仪，如图1所示，分离仪包括存储器110、微芯片和泵130，微芯片包括薄片120和载玻片140。薄片120与载玻片140两者形成微流体通道121。薄片120的凹槽用载玻片140密封，磁铁150放在载玻片140的下方。微流体通道包括一个入口116和一个出口126。存储器110通过第一连接管115连接到微流体通道121的入口116。同样，泵130通过第二连接管125连接到微流体通道121的出口126。

准备一个硅片，薄膜状的SU8光阻材料（由 MicroChem, Newton, MA制造）均匀地涂在硅片的表面，然后将SU8光阻材料通过光掩膜暴露到紫外线下。SU8光阻未曝光的部分在其还处于液体状态时进行去除，SU8光阻曝光部分留在硅片上，处理后的SU8在硅片表面形成制作微芯片的模具。将PDMS（例如道康宁Sylgard，米德兰，MI制造）和固化剂以质量比10：1比例进行混合，形成液态硅橡胶，将液态硅橡胶浇筑到硅片表面形成的模具上，形成一个具有凹槽的弹性体。对成型后弹性体进行表面处理并修改到一个理想的形状后，即成薄片120，薄片120与载玻片140粘合，形成一个微流体通道121。微流体通道121理想的形状和尺寸如图2所示。载玻片140最好是150ｕm厚。

微流体通道121的形状、进口116和出口126的接入角（θ1, θ2）会影响微流体通道121内流动的血液样本分布。在微流体通道121内的血液样本应避免快速流动，因为快速流动可能会导致血液样本内的稀有细胞机械损伤及血液细胞被冲走。但过于低速流动可能造成停滞，会导致血液凝固或连接管的堵塞。

血液样本101经由存储器110注入微流体通道121。用泵130把通过微流体通道121内的血液样本101的流速调节到2.5-10ml/h。泵130从微流体通道121中抽取血液样本101，可以减少微流体通道121的内压。

血细胞通常比他们的媒介（如缓冲液、血浆等）稠密，为了避免血细胞的停滞，存储器110位置要高于微芯片和泵130的位置。存储器110位置高于微芯片约100mm是最理想的。当存储器110与大气相通时，微流体通道121的内压是由血液样本的密度（ρ）决定的。重力（g）加速度、存储器110内血液样本的高度都与微流体通道121的内压有关。假设ρ = 1.05 g/mL，在微流体通道121中血液样本101的压力约为0.01大气压。这种低气压的配置，最大限度地减少血液样本从微流体通道121泄漏的风险。低气压配置、微芯片与载玻片可逆的粘接技术，使得稀有细胞分离出来后，载玻片140可以从微芯片里移出。

在血液样本101被放置在存储器110内之前，在血液样本内放入磁性纳米粒子，磁性纳米粒子表面带有抗体，通过免疫反应吸附在目标细胞上，磁性纳米粒子材料可以是纳米三氧化二铁（如Veridex，LLC生产的磁流体纳米粒子®）。血液样本101内部的稀有细胞被磁性纳米粒子吸附并“标记”，在血液样本通过微流体通道121的时候，血液样本中的稀有细胞可被磁铁150吸引。因此，血液样本101中稀有细胞就被采集在载玻片140上了。

留在载玻片140上的也有可能是一些未绑定任何稀有细胞的磁性纳米粒子。但是如果非吸附于稀有细胞上的纳米颗粒当作稀有细胞聚集在载玻片的同一区域上，会使后续观察细胞的工作将变得非常困难。因此，磁铁150提供梯度分布的磁场，将非吸附于细胞上的纳米颗粒与附着有磁性纳米粒子的稀有细胞在载玻片上分离，减少干扰。

至少有二种方法来提供一个渐变的沿载玻片140一侧分布的磁场。第一种方法是使用磁铁阵列递增（或递减）磁场势，如图6所示。第二种方法是把磁铁放置在与载玻片140成倾斜角度的位置，以达到所需的梯度磁场；可以通过在磁铁与载玻片之间放置垫片使磁铁倾斜，达到需要的梯度磁场，如图7所示。

为了使载玻片140的表面更好地采集稀有细胞，需要对微芯片进行如下表面功能化处理：在氮气环境中，PDMS材料制成的微芯片在70W的氧气电浆中处理15分钟，然后迅速沉浸在含丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中30分钟，其中丙基三甲氧基硅烷在乙醇溶液中的质量份数为4%（纯度为85％的丙基三甲氧基硅烷由Acros Organics公司生产），然后用乙醇对微芯片冲洗，并将微芯片放在浓度为0.28%的N-（Y maleimidobutyryloxy）丁二酯（GMBS）溶液中反应15分钟，再将微芯片用浓度为10 µg/mL 的PBS缓冲液冲洗。30分钟后，再次用含EpCAM抗体的PBS缓冲液漂洗微芯片，EpCAM的浓度为10 µg/mL，漂洗时间为30分钟，对微芯片进行表面功能化化学修饰。

此外，不同类型的磁性纳米粒子可以“标记”不同的稀有细胞。让它们可以采集到载玻片140的不同区域。例如，如图3所示，自由纳米粒子301、附着较少磁性纳米粒子的稀有细胞302和附着较多磁性纳米粒子的稀有细胞303被采集在玻片140的三个不同区域。最后稀有细胞被从血液样本101中分离。载玻片140可以与微芯片分离，在标准的光学显微镜下进行细胞观察。

如图4所示，在分离过程中，微芯片跟随磁铁150通过电动旋转臂160来执行控制旋转。微芯片的方向可以通过旋转电机161的旋转臂160和编码传感器162来控制。

第一状态下：当微流体通道121位于载玻片140上方位置时，载玻片位于磁铁的上方，稀有细胞的重力和受到的磁力方向相同，帮助稀有细胞吸附到载玻片140上。第二状态下：当微流体通道121处于垂直方向，相对较重的红血细胞（红细胞）将沉淀到微流体通道121的底部，可以减少捕获稀有细胞时的干扰。第三状态下：通过将微流体通道121连同载玻片140和磁铁150一起反转，使磁铁150位于载玻片140的上面，此时磁铁对稀有细胞的磁力和稀有细胞重力的方向相反，达到更好分离的目的。通常情况下，磁力和距离的平方成反比。起始状态，稀有细胞由重力作用接近磁铁150，在稀有细胞足够接近磁体150后，微流体通道121旋转到第二状态和第三状态下，使稀有细胞被磁铁150吸附，而其他细胞是因重力分离。微流体通道121做连续的垂直位置、水平位置（第一状态）和对称翻转位置（第三状态）的交替运动，能使细胞分离更有效。

如果旋转中心位于微流体通道121内，过长的连接管（如图1中管115和管125）可能会导致血液样本101在连接管内滞留。把旋转中心放置在存储器110和微流体通道121之间是最可取的。这个位置可以更容易地旋转微流体通道121。这样微流体通道121与磁铁150角度（即直立、倾斜、或翻转）相对位置变化时，直立位置和倾斜位置上就不需要过长的连接管。上述提到的旋转运动，也可以按照细胞的大小和密度用离心力完成。

在存储器上安装机械缓冲装置，用于缓冲存储器在旋转时受到的振荡，避免存储器因振荡而引起的破裂。如图5所示，缓冲装置包括二块夹板和设置在夹板之间的弹簧501和弹簧502，在存储器转动过程中，弹簧501和弹簧502会压缩或伸张，减缓存储器受到的震荡力。

红细胞沉淀的速度与红细胞的密度相关，通过红细胞密度的分布，可以计算红细胞沉淀的精确时间。红细胞的密度分布，计算如下：

A.计算在微流体通道内的流量矢量分布，可通过理论计算或者通过流体动力学软件计算实现。

B.把微流体通道分成若干个区域。（比如100ｕm×100ｕm矩形区域）。

C.对于每个区域，给出初步的血液密度。

D.对于每个区域，红细胞沉淀速度可从以上数据中预测。

E.红细胞流速=血液沉淀速度+流场流速。

F.红细胞密度分布可通过当前密度和红细胞流量来计算 。

Claims (7)

1.一种血液中稀有细胞的分离仪，包括：

一个提供血液样本的存储器；

一个用于抽取血液样本的泵；

其特征在于包括一个微芯片，微芯片包括具有凹槽的薄片和载玻片，薄片设置在载玻片上形成一个微流体通道；

该微流体通道连接在该存储器与该泵之间，允许该血液样本从存储器流到泵；

多个磁铁位于该载玻片底部，沿着载玻片的长度形成梯度的磁场分布，载玻片用来采集微芯片捕获的稀有细胞；

该微流体通道的入口通过第一连接管与存储器连通，该微流体通道的出口通过第二连接管与泵连通，第一连接管与微流体通道的夹角为钝角，第二连接管与微流体通道的夹角为钝角；还包括用于旋转该微流体通道的方向的旋转手臂；

在旋转手臂的驱动下，该微流体通道在垂直位置、水平位置和对称翻转位置进行交替。

2.根据权利要求1所述的一种血液中稀有细胞的分离仪，其特征在于载玻片上的磁场梯度和强度为可调节的。

3.根据权利要求1所述的一种血液中稀有细胞的分离仪，其特征在于微流体通道的横截面为六边形。

4.根据权利要求1所述的一种血液中稀有细胞的分离仪，其特征在于存储器上设置有机械缓冲装置。

5.根据权利要求1所述的一种血液中稀有细胞的分离仪，其特征在于薄片和载玻片之间为可分离式连接。

6.根据权利要求2所述的一种血液中稀有细胞的分离仪，其特征在于存储器位置高于微芯片的位置5mm～10mm。

7.根据权利要求2所述的一种血液中稀有细胞的分离仪，其特征在于旋转手臂的旋转中心位于微流体通道的外部。