WO2015156343A1 - 微粒子分離用チップ、該微粒子分離用チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法 - Google Patents

微粒子分離用チップ、該微粒子分離用チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法 Download PDF

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泰輔 益田
元儀 宋
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Definitions

  • the present invention relates to a fine particle separation chip (hereinafter sometimes simply referred to as “chip”) for separating fine particles of different sizes mixed in a liquid, a fine particle separation system using the chip, and a fine particle separation.
  • the present invention relates to a method, and in particular, a CTC separation chip for selectively capturing circulating tumor cells in blood (hereinafter also abbreviated as “CTC”), and CTC separation using the chip
  • CTC circulating tumor cells in blood
  • the present invention relates to an operating system and a CTC separation method.
  • CTC is defined as tumor cells circulating in the peripheral bloodstream of cancer patients, and is a tumor cell infiltrated into a blood vessel from a primary tumor or a metastatic tumor.
  • the detection of this CTC has recently attracted attention as one of the methods for early detection of metastatic malignant tumors. The reason is that metastatic malignant tumors can be diagnosed more accurately and less invasively than X-ray photographs and tumor marker detection in serum, and can be used as an indicator of patient prognosis and therapeutic effects.
  • CTC is a very rare cell, and it is known that only about one cell is present out of 10 8 to 10 9 blood cells contained in the blood of patients with metastatic cancer. For this reason, much effort has been put into technology development for accurately detecting rare CTCs from peripheral blood. Major detection methods that have been developed so far include immunohistochemistry, PCR, flow cytometry, and the like. However, as described above, since CTC is a very rare cell, blood cannot be directly used for these detection methods. Therefore, it is usually necessary to concentrate CTC as a pretreatment. It is necessary to concentrate the CTC abundance ratio to the compliant level.
  • ISET Isolation by Size of Epithelial Tumor cells
  • ISET is a simple method of filtering blood using a polycarbonate membrane filter having a pore diameter of 8 ⁇ m, and is an inexpensive and user-friendly method.
  • the polycarbonate membrane filter used here has holes formed by a technique called track etching in which etching is performed after irradiation with heavy ions.
  • track etching since the pores are relatively low density and there is a problem that two or more pores overlap each other, the trapping efficiency is 50 to 60% when used for trapping CTC.
  • a method that is simple and efficient is not yet developed.
  • microfluidic devices for CTC detection are also known.
  • a microfluidic device for CTC detection developed by Toner et al. Is called CTC-chip, and 78,000 cylindrical structures (microposts) are formed in a silicon flow path formed by photolithography. .
  • the micropost is coated with an anti-EpCAM antibody, and when blood is fed into the channel, CTC in the blood is captured on the micropost.
  • the captured CTC is subjected to fluorescent immunostaining targeting an epithelial cell marker (cytokeratin), and tumor cells are counted using a fluorescence microscope.
  • cytokeratin epithelial cell marker
  • CTC is detected from the blood of a metastatic cancer patient, and a mutation that produces resistance to a tyrosine kinase inhibitor can be detected from the collected CTC.
  • CTC detection using Cellsearch or CTC-chip has been performed vigorously through experiments using actual samples such as blood from metastatic cancer patients.
  • these methods have been proven with anti-EpCAM antibodies. The principle is to concentrate. Therefore, there is a problem that EpCAM negative or weak positive tumor cells cannot be detected.
  • a microfluidic device that detects CTC using tumor cell size and morphology as an index has been developed.
  • a membrane microfilter, a crescent-shaped cell capture well (see Non-Patent Document 3), and a four-stage channel (see Non-Patent Document 4) are arranged in the channel structure, and blood The blood cells and tumor cells are sorted according to size, and the tumor cells are selectively enriched.
  • operations such as lysis can be continuously performed on the concentrated cells.
  • a CTC recovery efficiency of 80% or more is obtained.
  • a microfluidic device that can capture a CTC by providing a microcavity array (fine through-hole) in a microchannel (see Patent Document 1). ).
  • the microfluidic device is a type that captures CTC in a fine through-hole, there is a problem that the work efficiency is lowered due to clogging of the CTC, and further, it is difficult to collect the separated CTC.
  • the present inventors have (1) a microchannel chip for separating fine particles in which a main channel and a capture site larger than the width of the main channel are formed, or (2) a main channel, Using a branch channel that branches from the main channel and connects to the main channel again, and a microchannel chip for fine particle separation in which a trapping part larger than the width of the branch channel is formed in the branch channel, the gas-liquid interface It has been found that fine particles can be settled using the force generated in the meniscus and only the desired fine particles can be captured at the capture site (see Patent Document 2).
  • a microchannel chip for particle separation in which a main channel including a capture site is formed radially from the center of the substrate on a rotating means, and (2) the particle separation.
  • An advection and accumulation unit including at least a sheath liquid inlet, a sample inlet, a sheath liquid advection and accumulation plane and a sample advection and accumulation plane on the surface of the microchannel chip for use; (3) rotating the rotating means By injecting the sheath liquid and the sample liquid while allowing the sample to be supplied, the sample can be continuously supplied to the micro-channel chip for fine particle separation, and the target fine particles can be efficiently captured and separated.
  • Patent Document 3 An application has been filed (see Patent Document 3).
  • the microchannel chip for separating microparticles described in Patent Documents 2 and 3 has a structure for capturing microparticles using a microchannel and a capture site formed in the microchannel. . Therefore, since the volume per unit time of the liquid that can flow through the microchannel is limited, there is still a problem that it takes time to separate the fine particles.
  • JP 2011-163830 A Japanese Patent Application No. 2012-227717 Japanese Patent Application No. 2013-106824
  • the present invention is an invention made in order to solve the above-mentioned conventional problems.
  • (1) Form a capture site with pillars provided on the substrate, (2)
  • the interval between the pillars is set to an interval at which fine particles to be removed pass but cannot pass the trapped fine particles, and (3)
  • At least three or more pillars forming one capture site are arranged in a positional relationship in which the captured capture target fine particles do not flow out between any adjacent pillars.
  • an object of the present invention is to provide a particle separation chip, a particle separation system using the chip, and a particle separation method.
  • the present invention relates to a particle separation chip, a particle separation system and a particle separation method using the chip, which will be described below.
  • One capture site for capturing the capture target fine particles is formed by at least three or more pillars having one end provided on the substrate and the other end opened upward;
  • the interval Z between any adjacent pillars forming one capture site is Y ⁇ Z ⁇ X,
  • At least three or more pillars forming one capture site are arranged in a positional relationship in which capture target particles captured at the capture site do not flow out between any adjacent pillars. Chip.
  • the interval Z between the adjacent pillars is one selected from 0.8Y ⁇ Z ⁇ 0.8X, Y ⁇ Z ⁇ 0.8X, or 0.8Y ⁇ Z ⁇ X.
  • a suction unit including a lateral groove and a suction hole communicating with the lateral groove, wherein one side surface of two side surfaces sandwiching the lateral groove is formed to be shorter than both end portions and the other side surface of the suction unit.
  • a suction unit characterized by that.
  • the suction unit according to (14), wherein the lateral groove has a width capable of sucking a liquid by capillary force.
  • the lateral groove has a width capable of inserting a suction means.
  • An advection and accumulation unit including at least a sheath liquid inlet, a sample inlet, a sheath liquid advection and accumulation plane and a sample advection and accumulation plane; A rotating means for rotating the fine particle separating chip; and a suction means and / or a suction device for sucking a sheath liquid; A system for separating fine particles.
  • the advection accumulation unit further includes a hole for mounting a sheath liquid suction pad and a sheath liquid suction port.
  • the sample liquid is injected between the microparticle separation chip described in any one of (1) to (10) above and the thin film for sample liquid, and between the microparticle separation chip and the sheath liquid thin plate.
  • a fine particle separation method wherein fine particles to be removed are removed from a fine particle separation chip by a sheath liquid sucked by a suction means and / or a suction device.
  • a sample liquid is injected between the microparticle separation chip described in any one of (1) to (10) above and the cover plate, and the sample liquid is sucked by a suction means and / or a suction device.
  • a fine particle separation method characterized in that a capture target fine particle is captured by a generated meniscus at a capture site provided in the fine particle separation chip.
  • a sheath liquid is injected between the chip for separating fine particles and the cover plate, and the sheath liquid is sucked by a suction means and / or a suction device, so that the remaining fine particles to be removed.
  • the chip for separating fine particles described in (10) above is placed on a rotating means for rotating the chip for separating fine particles.
  • an advection and accumulation unit including at least a sheath liquid inlet, a sample inlet, a sheath liquid advection and accumulation plane and a sample advection and accumulation plane is disposed, While rotating the rotating means, the sheath liquid is injected from the sheath liquid injection port, and the sample is injected from the sample injection port, so that the microparticle separation chip, the sheath liquid advection and accumulation plane and the sample advection and accumulation plane The part is relatively moved, and the target microparticles are captured by the meniscus generated by the relative movement at the capturing site formed on the microparticle separation chip,
  • a fine particle separation method comprising removing fine particles to be removed together with a sheath liquid from a fine particle separation chip by sucking sheath liquid with a sheath liquid suction means and / or a suction device.
  • a capture site is formed by pillars formed on a substrate, particles to be captured pressed downward by advection accumulation are captured at the capture site, and particles to be removed pass through the interval between pillars. Removed outside. Therefore, when the chip of the present invention is used, the sample liquid can be flowed over the entire chip, so that the throughput for separating the capture target fine particles from the sample liquid can be significantly improved. Therefore, for example, only a CTC having a small content can be separated from a whole blood in which red blood cells, white blood cells and the like are mixed without any pretreatment in a short time with high accuracy. CTCs can be efficiently separated even in patient samples with very few CTC cells in blood cells, such as patient follow-up after cancer treatment. It becomes possible.
  • the chip used in the microparticle separation system of the present invention does not use an anti-EpCAM antibody, even a CTC negative or weakly positive tumor cell can be reliably detected.
  • the chip of the present invention allows small cells such as red blood cells and white blood cells to flow out of the chip with the sheath liquid, and large cells such as CTC can be captured at the capture site provided in the flow path. Unlike a conventional filter type device, there is no clogging of the device, and continuous processing is possible.
  • the chip used in the particle separation system of the present invention can be mass-produced using a semiconductor formation process, the cost of CTC inspection can be greatly reduced.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of the chip of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line A-A ′ of FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the shape of the capturing portion of the chip of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the positional relationship of the pillar 3 of the capture site 4 not included in the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of an embodiment of the chip 1 of the present invention.
  • FIG. 6 shows an example in which a single type of polygon is arranged in a plane filling state as a capture site.
  • FIG. 7 is a flowchart showing an example of a manufacturing procedure of the chip of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of the chip of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line A-A ′ of FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the shape of the capturing portion of
  • FIG. 8 shows the outline of the system for separating fine particles of the present invention and the method for separating fine particles.
  • FIG. 9 illustrates the principle of meniscus generation.
  • FIG. 10 shows an outline of another embodiment of the system for separating fine particles of the present invention and a method for separating fine particles.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view taken along the line AA ′ of FIG.
  • FIG. 12 shows an outline of the suction unit.
  • FIG. 13 shows another embodiment of the particulate separation system of the present invention.
  • FIG. 14 shows an overview of the system of the embodiment shown in FIG.
  • FIG. 15 is a drawing-substituting photograph showing an outline of the advection accumulating unit.
  • FIG. 15 is a drawing-substituting photograph showing an outline of the advection accumulating unit.
  • FIG. 16 is a drawing-substituting photograph that is an enlarged photograph of the advection stacking unit obliquely from above.
  • FIG. 17 is a drawing-substituting photo from the side of the advection stacking unit.
  • FIG. 18 shows another embodiment of the particulate separation system of the present invention.
  • FIG. 19 is a drawing-substituting photograph showing the appearance of the chip produced in Example 1.
  • FIG. 20 is a drawing-substituting photograph and an enlarged photograph of the capturing part of the chip produced in Examples 1 to 3.
  • FIG. 21 is a drawing-substituting photograph showing a microparticle separation system used in a CTC separation experiment from a blood sample.
  • FIG. 22 is a side view photograph showing the arrangement relationship between the chip and the cover plate, which is a drawing substitute photograph.
  • FIG. 23 is a graph showing the capture rates of Example 4 and Examples 7-9.
  • FIG. 24 shows a conventional particle separation system using a particle separation microchannel chip.
  • FIG. 1 shows an example of a chip according to the present invention.
  • a plurality of pillars 3 are formed on a substrate 2, and a capturing site for capturing particles to be captured by at least three or more pillars. Is forming.
  • the “pillar” means a column formed on the substrate 2.
  • the term “fine particles” means particles that can be dispersed in a liquid, and the form of the particles is single or in an aggregated state. The size of the fine particles is not particularly limited as long as the meniscus principle can be applied, and may be about 1 mm or less.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line A-A ′ of FIG. 1.
  • One end of the pillar 3 is provided on the substrate 2, and the other end is opened upward. And at least 3 or more pillars 3 form one capture site 4.
  • the trapping target fine particles 5 pressed downward from the open side above the pillar 3 are trapped at the trapping site 4 by advection accumulation described later.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the shape of the capturing portion 4 of the chip 1 of the present invention.
  • FIG. 3 (1) shows an example in which the capture site 4 is formed by three pillars 3.
  • the interval Z between any adjacent pillars 3 forming one capture site is Y ⁇ Z ⁇ X is formed.
  • the “interval Z” means the shortest distance between the outer periphery of any adjacent pillar 3.
  • the interval Z of the pillars 3 is not necessarily the same as long as the relationship of Y ⁇ Z ⁇ X is satisfied, and may be different as shown in FIG.
  • the “size” of the fine particles means a length that makes the interval between the planes shortest when the fine particles are sandwiched between two parallel planes from an arbitrary direction. For example, when the fine particles are spherical, it means the diameter.
  • the capture site 4 is arranged in a positional relationship in which the capture target fine particles 5 captured by the capture site 4 do not flow out between any adjacent pillars 3. is necessary.
  • FIG. 4 shows the positional relationship of the pillar 3 of the capture site 4 not included in the present invention. Even if the interval Z between any adjacent pillars 3 forming one capture site 4 is formed such that Y ⁇ Z ⁇ X, as shown in FIG. Only the case where only is captured can be considered. In that case, when the sample liquid is sucked in the direction of the arrow shown in FIG. 4, the capture target fine particles 5 captured at the capture site 4 flow out of the capture site 4.
  • the capture site 4 of the chip 1 of the present invention needs to be arranged in a positional relationship in which the captured capture target fine particles 5 do not flow out between any adjacent pillars 3.
  • the line having the shortest interval between the planes (dotted line of the trapping target fine particles 5 in FIG. 3A) is included.
  • at least one pillar 3 may be arranged on both sides with the shortest line as a boundary.
  • the capture portion 4 is not limited to the shape in which the pillar 3 is arranged if the relationship of Y ⁇ Z ⁇ X described above and the positional relationship in which the captured capture target fine particles 5 do not flow out between any adjacent pillars 3 are satisfied.
  • polygons such as quadrangular, pentagonal, hexagonal, heptagonal, octagonal, nine-gonal, and pentagonal.
  • the polygon may be a regular polygon or may not be a regular polygon.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of an embodiment of the chip 1 of the present invention.
  • a plurality of capture sites 4 having the same shape may be formed on the substrate 2, or the capture sites 4 having different shapes as shown in FIG. 5 (2).
  • a plurality of layers may be formed on the substrate 2.
  • the capture target fine particles 5 having different sizes can be captured by a single chip 1.
  • the capture sites 4 When a plurality of capture sites 4 are formed, it is preferable to arrange the capture sites 4 adjacent to each other in order to efficiently capture the capture target fine particles 5.
  • the pillar 3 is shared by any capture site 4 and the adjacent capture site 4 so that the capture sites 4 are in a continuously filled state.
  • the “planar filling state” means a state in which one or more finite types of polygons are filled without a gap.
  • the capture target fine particles 5 captured by the capture site 4 may be arranged so as not to flow out between any adjacent pillars 3.
  • the shape is not particularly limited.
  • a combination of a plurality of polygons such as a combination of a regular triangle and a regular hexagon, a combination of a regular triangle and a square, a combination of a square and a regular octagon, and the like can be given.
  • the capture target fine particles 5 having different sizes can be captured by the single chip 1.
  • FIG. 6 shows an example in which a single type of polygon is arranged in a plane-filled state as a capture site
  • FIG. 6 (1) is a regular triangle
  • FIG. 6 (2) is a square
  • FIG. 6 (3) Is a regular hexagon.
  • the cross-sectional shape of the pillar 3 is not particularly limited, and may be appropriately selected from a circle, a polygon, and the like.
  • the pillar 3 may be affixed on the substrate 2.
  • the chip 1 can be efficiently produced by first producing a mold and transferring the mold to the material for the substrate 2. it can.
  • the length of the cross section of the pillar 3 is the longest length among the lines connecting the outer circumferences of the pillars 3 (diameter when the cross section is circular, or polygonal), for reasons such as ease of processing. ) Is preferably 1 ⁇ m or more, and more preferably 2 ⁇ m or more.
  • the upper limit of the cross-sectional length of the pillar 3 is not particularly limited, and may be appropriately determined in consideration of the distance Z determined by the size of the capture target fine particles 5 and the fine particles 6 to be removed, the number of pillars 3 forming the capture site 4, and the like. That's fine.
  • the interval Z between the pillars 3 is smaller than the diameter of CTC (15 to 30 ⁇ m), and blood cells such as red blood cells and white blood cells are present. It may be larger than (about 7 ⁇ m). Since the shapes of CTCs and blood cells easily change as described above, the interval Z between the pillars 3 may be about 6 to 12 ⁇ m. Further, when the gastric cancer cell mass (25-50 ⁇ m) is separated from blood cells or mesothelial cells (about 7-15 ⁇ m) in the peritoneal washing solution, the interval Z may be about 6-24 ⁇ m.
  • the height of the pillar 3 on the substrate 2 only needs to be a height at which the captured particles 5 to be captured do not flow out due to the fluid force of the sample liquid, and may be larger than 0.5 times the size of the particles 5 to be captured. Preferably, 1 or more times is more preferable.
  • the upper limit of the height is not particularly limited, but after the sample liquid is flowed, when the capture target fine particles 5 captured at the capture site 4 are sucked and collected with a capillary or the like, if the pillar 3 is too high, the capillary is captured. It becomes difficult to insert the portion 4 to the vicinity of the substrate surface. Therefore, the height of the pillar 3 is preferably 10 times or less, and more preferably 2 times or less the size of the capture target fine particles 5.
  • the shape of the chip 1 is not particularly limited, and may be a polygon such as a square, a hexagon, and an octagon. As will be described later, when the advection accumulation is generated by rotating the chip 1, the shape of the chip 1 is preferably circular.
  • the chip 1 can be manufactured using a photolithography technique.
  • FIG. 7 is a flowchart showing an example of the manufacturing procedure.
  • the mold substrate 11 is organically cleaned by an ultrasonic cleaner and baked.
  • a negative photoresist 12 is spin-coated on the substrate 11 and prebaked on a hot plate.
  • Exposure is performed using a photomask 13 having the shape of the capture region 4.
  • a template is prepared. Note that a portion between the protrusions formed with the negative photoresist 12 on the substrate 11 is a portion that becomes the pillar 3 after the transfer. 4).
  • the material for the substrate 2 of the chip 1 is poured onto the mold. 5.
  • the material for the substrate 2 to which the pattern of the mold is transferred is separated from the mold.
  • the substrate 2 is bonded to the hard material 14 as necessary. 6).
  • the surface of the substrate 2 is subjected to a hydrophilic treatment.
  • Organic cleaning is not particularly limited as long as it is a cleaning agent generally used in the semiconductor manufacturing field, such as acetone and ethanol.
  • the template substrate 11 is not particularly limited as long as it is a material generally used in the photolithography technical field.
  • the negative photoresist 12 is not particularly limited as long as it is a material generally used in the photolithography technical field, and examples thereof include SU-8 and KMPR. Moreover, it can replace with the negative photoresist 12, and a positive photoresist can also be used, for example, PMER, AZ, etc. are mentioned.
  • the resist removing solution is not particularly limited as long as it is a common removing solution in the semiconductor field, such as dimethylformamide and acetone.
  • the material of the substrate 2 of the chip 1 of the present invention includes polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polystyrene, polyvinyl acetate, polytetrafluoroethylene, ABS resin (acrylonitrile butadiene styrene resin), AS resin, Thermoplastic resins such as acrylic resin (PMMA); thermosetting resins such as phenol resin, epoxy resin, melamine resin, urea resin, unsaturated polyester resin, alkyd resin, polyurethane, thermosetting polyimide, and silicone rubber.
  • the separation target particles 5 captured at the capture site 4 are not collected and analyzed as they are, it is desirable to prepare the substrate 2 with a material that is light transmissive and has no affinity for biomolecules.
  • COP polydimethylsiloxane
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PC polycarbonate
  • plastic made of hard polyethylene, silicon and the like.
  • the chip 1 may be observed with a microscope after capturing the capture target fine particles 5, it is preferable that the substrate 2 be thin. However, as will be described later, when the chip 1 is moved, it may be difficult to move the chip 1 if the substrate 2 is too thin. Therefore, the chip 1 may include the hard material 14. Examples of the hard material 14 include glass, a plus chip, and silicon, and the substrate 2 may be attached.
  • the surface of the chip 1 is hydrophilized so that bubbles can be prevented from entering the groove when liquid is injected.
  • hydrophilic treatment method include plasma treatment, surfactant treatment, PVP (polyvinylpyrrolidone) treatment, photocatalyst, etc.
  • the surface of the chip 1 is plasma treated for 10 to 30 seconds to introduce hydroxyl groups on the surface. can do.
  • FIG. 8 is a diagram showing an outline of the fine particle separation system and the fine particle separation method of the present invention, and shows an embodiment in which a meniscus is generated by relatively moving the chip 1, the thin plate for sample liquid, and the thin plate for sheath liquid.
  • the particulate separation system of the present embodiment includes a chip 1, a sample liquid thin plate 21, a sheath liquid thin plate 22, and a suction means and / or a suction device (not shown) for sucking the sheath liquid.
  • the suction means and / or the suction device may be disposed in contact with the outer periphery 27 of the chip 1 parallel to the moving direction of the sheath liquid thin plate 22 and suck the sheath liquid from above the pillar 3.
  • the sample liquid thin plate 21 and the sheath liquid thin plate 22 are not particularly limited as long as they do not react with the sample or the sheath liquid, such as glass and plastic.
  • the sheath solution is not particularly limited as long as it does not damage the microparticles to be separated.
  • various buffer solutions such as phosphate buffered saline (PBS), Tris buffer, etc.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Tris buffer Tris buffer
  • the sheath liquid is not particularly limited as long as it is a commonly used sheath liquid such as pseudo body fluid (SBF) and general cell culture fluid.
  • FIG. 8 shows an example in which CTC5 is captured from whole blood using whole blood as a sample.
  • the whole blood 23 is injected between the chip 1 and the sample liquid thin plate 21, and the chip 1 and the sample thin plate 21 are relatively moved to generate a meniscus 25.
  • FIG. 9 is a diagram for explaining the principle of meniscus generation.
  • the capillary force between fine particles existing at the gas-liquid interface especially called lateral capillary force
  • the advection accumulation method is used.
  • a method is used in which fine particles are arranged in a closely packed structure.
  • the CTC that is the capture target fine particle 5 is pressed down to be trapped by being dropped into the capture site 4 opened upward.
  • blood cells which are the fine particles 6 to be removed are discharged from the chip 1 through the pillars 3 by the suction force of the suction means and / or the suction device described later.
  • the meniscus is also generated in the sheath liquid, so that the sheath liquid easily enters the substrate 2 from between the pillars 3.
  • the distance between the chip 1, the thin plate 21 for sample liquid, and the thin plate 22 for sheath liquid is preferably 200 to 1000 ⁇ m. If it is smaller than 200 ⁇ m, the amount of introduced sample solution is reduced and the processing capacity is lowered. If it is larger than 1000 ⁇ m, the meniscus force is lowered and sufficient separation cannot be obtained.
  • interval can be adjusted with a microstage.
  • the relative moving speed between the chip 1, the sample liquid thin plate 21 and the sheath liquid thin plate 22 is preferably 20 to 50 ⁇ m / s. When it is slower than 20 ⁇ m / s, the processing time becomes longer and the processing capacity is lowered, and when it is faster than 50 ⁇ m / s, fine particles are not captured and the separation efficiency is reduced.
  • the flow rate of the sheath liquid is preferably 20 to 4500 ⁇ m / s.
  • the flow rate of the sheath liquid varies depending on the interval between the pillars, and becomes faster in a narrower area.
  • the “flow velocity of the sheath liquid” means a flow velocity that flows between pillars and that flows fastest.
  • the flow rate of the sheath liquid may be adjusted by the suction force of the suction means and / or the suction device.
  • the suction device is not particularly limited as long as it can suck liquid, such as a suction pump and a microsyringe.
  • the example shown in FIG. 8 is a form in which the sheath liquid 24 is injected between the tip and the sheath liquid thin plate 22 as necessary, but a sheath liquid container or a sheath liquid is provided at one end of the sheath liquid thin plate 22.
  • the sheath liquid may be automatically supplied by connecting a tube or the like extending from the container.
  • FIG. 10 is a diagram showing an outline of another embodiment of the particulate separation system of the present invention and a particulate separation method, and an embodiment in which a meniscus is generated by sucking a sample liquid without moving the tip 1 and the cover plate relative to each other. Is shown.
  • the fine particle separation system of this embodiment includes at least a chip 1, a cover plate 31 for generating a meniscus by sucking a sample liquid and a sheath liquid superimposed on the chip 1, a suction means and / or a suction device (not shown). It is out.
  • FIG. 10 is a diagram showing an outline of another embodiment of the particulate separation system of the present invention and a particulate separation method, and an embodiment in which a meniscus is generated by sucking a sample liquid without moving the tip 1 and the cover plate relative to each other.
  • the fine particle separation system of this embodiment includes at least a chip 1, a cover plate 31 for generating a meniscus by sucking a sample liquid and a sheath liquid superimposed on the
  • a step portion 7 having the same height as the pillar 3 is formed on the outer periphery of the chip 1, and the lateral groove 33 is formed in the longitudinal direction and can suck the sample liquid and the sheath liquid by capillary force.
  • the sample liquid and the sheath liquid are sucked by the suction means and / or the suction device through the suction unit 35 including the suction hole 34 communicating with the lateral groove 33.
  • both ends 351 and 352 of the suction unit 35 and one side surface 353 can be brought into contact with the stepped portion 7, so that air or the like does not enter and the sample is taken from the other side 354 side. Liquid and sheath liquid can be aspirated.
  • sample liquid and the sheath liquid may be provided with a flat surface portion on which the pillars 3 are not formed on the outer periphery of the chip 1 and can be sucked from the flat surface portion using a suction means and / or a suction device.
  • the sample liquid itself is sheathed if the diluted sample liquid is used. Since it functions as a liquid, it is not essential to flow the sheath liquid after flowing the sample liquid. In the case of high-purity separation of target fine particles, whether or not to flow the sheath liquid may be selected according to the purpose of separation, such as washing away the fine particles to be removed by flowing the sheath liquid.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view taken along the line AA ′ of FIG. 10, and is a view for explaining the principle of meniscus generation in this embodiment.
  • FIG. 11A when the sample liquid and the sheath liquid 32 are injected between the chip 1 and the cover plate 31 and sucked by a suction means and / or a suction device (not shown), the sample liquid and the sheath liquid are removed from the pillar 3. And is discharged from the suction unit 35. At that time, a capillary force is generated in the sample liquid and the sheath liquid 32 between the chip 1 and the cover plate 31, and thus a meniscus as shown in FIG.
  • the moving direction of the sample liquid and the sheath liquid 32 shown in FIG. 11 (2) is the case where the cover plate 31 is arranged in parallel to the chip 1.
  • the cover plate 31 on the unit 35 side is inclined so as to be close to the chip 1
  • the sample liquid and the sheath liquid 32 move to the suction unit 35 side due to the pressure applied to the sample liquid and the sheath liquid 32.
  • FIG. 11 (4) when the cover plate 31 opposite to the suction unit 35 is disposed so as to be close to the chip 1, the sample liquid and the pressure associated with the sheath liquid 32 cause the sample.
  • the liquid and the sheath liquid 32 move to the side opposite to the suction unit 35. 11 (2) to (4), the present invention can be carried out.
  • the sample liquid and the sheath liquid 32 approach the suction unit 35 side. Therefore, it is preferable because the suction force of the suction means and / or the suction device can be reduced.
  • the distance between the chip 1 and the cover plate 31 is preferably 200 to 1000 ⁇ m, as in the case of the thin plate 21 for sample solution, and may be adjusted using a microstage within the range of this distance.
  • the cover plate 31 is tilted, it is preferably tilted by about 6 ° to 18 °.
  • the second cover plate 311 is provided so as not to generate the meniscus of the sample liquid and the sheath liquid 32 on the suction side, and a closed flow path system can be configured. Stable suction can be performed.
  • the cover plate 31 and the second cover plate 311 may be made of the same material as the sample solution thin plate 21 described above. Further, the size of the cover plate 31 is not particularly limited, but in the present embodiment, a meniscus can be generated without moving the cover plate 31, so that it is formed on the chip 1 in order to improve the processing efficiency. It is desirable that the pillar 3 be formed in a size that can cover all of the pillars 3.
  • the size of the second cover plate 311 may be the same as the length of the cover plate 31 in the lateral direction, and the width may be adjusted as appropriate within a range where no meniscus is generated.
  • the embodiment shown in FIG. 11 is an example in which the chip 1 is a quadrangle, but the chip 1 is not limited to a quadrangle, and may be a polygon such as a pentagon or a hexagon, or a circle.
  • the suction unit 35 is arranged on one side of the chip 1.
  • the suction unit 35 is arranged on the outer periphery of the polygonal or circular chip 1, and the cover plate 31 is also many.
  • the sample liquid and the sheath liquid 32 injected into the center of the chip 1 are sucked to the outer periphery of the chip 1 by forming a rectangular or circular shape and forming an injection hole for the sample liquid and the sheath liquid 32 in the center of the cover plate 31.
  • the cover plate 31 has a substantially ring shape covering the outer periphery of the polygon or the circular outer periphery, and the suction unit 35 having a polygon or circle shape is disposed at the center of the approximately ring shape, Advection and accumulation may be generated by sucking the sample liquid and sheath liquid 32 injected from the outer peripheral portion of the chip 1 toward the center of the chip 1.
  • the distance of the surface where the meniscus is generated becomes longer, which is preferable because the processing efficiency of the sample is increased.
  • suction means for the sample liquid and the sheath liquid 32 examples include suction pads such as cloth, cotton, sponge, and chamois, and are directly sucked on the top of the pillar 3 of the chip 1 or on the flat surface where the pillar 3 is not formed.
  • the sample liquid and the sheath liquid 32 may be sucked and discharged by contacting the pad.
  • the sample liquid and the sheath liquid 32 may be sucked / discharged via the suction unit 35.
  • FIG. 12 shows an example of an embodiment of the suction unit 35 in a case where the suction unit 35 is in contact with a flat portion where the pillar 3 is not formed.
  • FIG. 12A is a top view schematically showing the suction unit 35.
  • FIG. (2) is a cross-sectional view of the suction unit 35 taken along the line BB ′. Since it is necessary to pass at least the removed fine particles, the width of the lateral groove 33 is preferably at least 8 ⁇ m or more when the sample is whole blood, and more preferably 10 ⁇ m or more for increasing the processing capability.
  • the width of the lateral groove 33 is not particularly limited as long as capillary force is generated, and may be appropriately adjusted in consideration of the amount of sample liquid to be sucked, sheath liquid, capillary force, etc. For example, a width of about 200 ⁇ m is provided. Also good. Further, in order for the sample liquid and sheath liquid to be sucked to be sucked into the lateral groove 33, a gap needs to be generated when the suction unit 35 is brought into contact with the flat surface portion. Therefore, for example, of the two side surfaces 353 and 354 sandwiching the lateral groove 33 between the end portions 351 and 352 of the suction unit 35, the height of the side surface 353 opposite to the pillar 3 when contacting the flat surface portion 7 is increased.
  • the difference between the side surfaces 353 and 354 is preferably 8 ⁇ m or more, and more preferably 10 ⁇ m or more. If a capillary force is generated, there is no particular upper limit for the difference, and it may be adjusted as appropriate in consideration of the amount of sheath liquid to be sucked, the capillary force, etc. For example, a difference of about 200 ⁇ m may be provided. In addition, as shown in FIG. 10, when providing the level
  • the sample liquid and the sheath liquid 32 sucked into the lateral groove 33 may be sucked and discharged through the suction hole 34 using a suction device such as a pump or a microsyringe.
  • a suction device such as a pump or a microsyringe.
  • the number of the suction holes 34 is not particularly limited, and may be set to a number that does not cause a large difference in the flow rates of the sample liquid flowing between the pillars 3 formed on the substrate 2 and the sheath liquid 32.
  • the width of the lateral groove 33 is increased, the suction means such as the cloth, cotton, sponge, chamois or the like is inserted into the lateral groove 33, and the sample liquid and the sheath liquid 32 absorbed by the suction means are passed through the suction hole 34. Then, suction may be performed with a suction device.
  • the flow rates of the sample liquid and the sheath liquid flowing between the pillars 3 are adjusted by the suction force of the suction means and / or the suction device. Therefore, the sample liquid and the sheath liquid 32 are simply sucked by the suction means, or the sample liquid and the sheath liquid 32 sucked by the suction means are further sucked by the suction device rather than by the capillary force. By sucking, the suction speed of the sample liquid and the sheath liquid can be kept stable.
  • the suction device and the suction hole 34 may be connected using a tube such as silicon.
  • the material constituting the suction unit 35 is not particularly limited as long as it does not react with the sample liquid or the sheath liquid, such as a resin such as acrylic, nylon, Teflon (registered trademark), or glass.
  • the suction unit 35 can be manufactured by cutting using a cutting tool such as a drill and an end mill, or a mold having the shape of the suction unit 35 and injection molding.
  • the sample liquid is put between the chip 1 and the cover plate 31, the sample liquid is sucked by the suction means and / or the suction device, and then the sheath liquid is used as necessary. Is inserted between the chip 1 and the cover plate 31 and the sheath liquid is sucked, so that, for example, CTC in the blood sample can be trapped in the capturing site, and other blood cells and the like can be washed away together with the sheath liquid.
  • the sample liquid or sheath liquid between the chip 1 and the cover plate 31 may be injected from between the chip 1 and the cover plate 31 using a syringe or the like. Liquid and sheath liquid may be injected.
  • the flow rate of the sample liquid and the sheath liquid 32 is preferably 20 to 4500 ⁇ m / s. If it is slower than 20 ⁇ m / s, the separation efficiency is reduced due to a decrease in the ability to separate and wash blood cells, and if it is faster than 4500 ⁇ m / s, once captured CTC is sucked and the separation efficiency is reduced.
  • the flow rates of the sample liquid and the sheath liquid may be adjusted by the suction force of the suction means and / or the suction device.
  • the sample liquid is first flowed, and then the sheath liquid is flowed as necessary. Therefore, if a highly viscous sample liquid such as whole blood is sucked as it is, a large suction force is required. Therefore, when blood is used as the sample liquid, it may be diluted 2 to 10 times, preferably about 3 to 5 times using a sheath liquid or the like.
  • the meniscus can be generated in all the portions where the chip 1 and the cover plate 31 overlap without changing the position where the meniscus is generated according to the relative movement. Since the position where the meniscus is generated can be moved by sucking, the time required for separation can be sufficiently shortened even when whole blood is diluted.
  • FIG. 13 is a diagram showing another embodiment of the particulate separation system of the present invention.
  • an example using a circular chip 40 is shown, but there is no particular limitation on the shape, such as a polygon, as long as the chip 40 can be placed and rotated on a rotating means of a particle separation system described later.
  • the chip 1 used in the present embodiment is formed with a flat surface portion 41 where the pillar 3 is not formed on the outer peripheral portion, so that suction means and / or suction device can be brought into contact therewith. Moreover, you may provide the center hole 42 in the center part for attachment to a rotation means as needed.
  • a meniscus is generated in the sheath liquid in an area 43 corresponding to a sheath liquid advection and accumulation plane part (hereinafter also referred to as “sheath liquid plane part”) of the advection and accumulation unit described later, and
  • the meniscus is generated in the sample in an area 44 on the outer peripheral side of the area where the meniscus is generated in the sheath liquid and corresponding to the sample advection and accumulation plane part (hereinafter, also referred to as “sample plane part”).
  • sample plane part also referred to as “sample plane part”.
  • FIG. 14 is a diagram showing an overall system image of the embodiment shown in FIG. 13, and is a diagram showing an outline of a particle separation system 50 using a circular chip 40, and a rotating means for mounting and rotating the chip 40. 51, an advection accumulating unit 52, a sheath liquid suction unit and / or a suction device (not shown) are included, and a microparticle extraction unit 53 may be included when taking out the microparticles captured at the capture site. Furthermore, when the captured microparticles are biomaterials containing nucleic acids and PCR is performed after separation, PCR means 54 may be included, and FIG. 14 shows an example in which wells used for PCR are arranged.
  • a sheath fluid injection 55 for feeding sheath fluid to the sheath fluid inlet of the advection accumulation unit described later and a sample injection 56 for feeding sample to the sample inlet may be provided.
  • the sheath liquid injection 55 and the sample injection 56 are not particularly limited as long as liquid can be fed, and may be manually fed using a syringe or a commercially available constant flow pump or the like.
  • the rotating means 51 is not particularly limited as long as the chip 40 can be placed and rotated.
  • a driving means such as a motor is provided under the rotatable disk on which the chip 40 can be placed to rotate the disk. You just have to do it.
  • a drive means is what can carry out rotation control of the disk at a fixed speed.
  • FIG. 15 is a diagram showing an outline of the advection accumulation unit 52.
  • the advection accumulation unit 52 includes at least a sheath liquid inlet 521, a sample inlet 522, a sheath liquid plane part 523, and a sample plane part 524. Further, the advection accumulating unit 52 is provided with a hole 525 for attaching a sheath liquid suction pad or sucking the sheath liquid by capillary force, and a sheath liquid suction port 526 connected to the hole 525 and connected to a sheath liquid suction device (not shown). It may be provided.
  • the surface facing the tip 40 is preferably flat. Further, since meniscus is generated between the sheath liquid plane part 523 and the sample plane part 524 and the chip 40, and it is not necessary to generate meniscus other than the sheath liquid plane part 523 and the sample plane part 524, The sheath liquid plane portion 523 and the sample plane portion 524 need to be thicker than other portions and provided with a step.
  • the hole 525 when a sheath liquid suction pad is attached to the hole 525, the amount of protrusion from the hole 525 where the sheath liquid suction pad is attached is adjusted so that the sheath liquid suction pad contacts the sheath liquid. Therefore, the hole 525 may be formed on the same surface as the other portions, or a flat surface portion in which the hole 525 is provided at the same height as the sheath liquid flat surface portion 523 and the sample flat surface portion 524 is formed. A hole 525 may be formed in the portion.
  • the hole 525 when used as a hole for sucking the sheath liquid by capillary force, the flat part that forms the hole 525 is arranged so that the sheath liquid can be sucked from the flat part 41 by capillary force. You may form thicker than the plane part 523 and the sample plane part 524.
  • the number and position of the sheath liquid suction port 526 formed as long as it communicates with the hole 525 is not particularly limited, and may be adjusted as appropriate.
  • the sheath liquid injection port 521 may be formed in the sheath liquid plane portion 523 and the sample injection port 522 may be formed in the sample plane portion 524, or the advection accumulation unit 52 and the chip 40 are moved relative to each other.
  • the sheath liquid injection port 521 may be formed on the upstream side of the sheath liquid flat surface portion 523, and the sample injection port 522 may be formed on the upstream side of the sample flat surface portion 524.
  • the shape and size of the sheath liquid plane portion 523 are not particularly limited as long as it is formed in the vicinity of the center hole 42.
  • the sample flat surface portion 524 is not particularly limited as long as it has a shape in which a meniscus line is generated on the capture portion 4, but in order to efficiently capture the capture target fine particles 5, It is preferable that the shape and size be such that a meniscus line is generated up to the capturing portion 4 adjacent to the flat portion 41.
  • FIG. 16 is a photograph of an enlarged view of the advection accumulation unit 52 obliquely from above.
  • the advection accumulation unit 52 is attached to a height adjustment means 57 for keeping a distance from the chip 40 placed on the rotation means 51. Yes.
  • the height adjusting means 57 is not particularly limited as long as the height of the advection stacking unit 52 can be adjusted by a screw or the like.
  • the sheath liquid plane part 523 and the sample plane part 524 of the advection accumulation unit 52 are arranged so as to be located at a position 200 to 1000 ⁇ m away from the pillar 3 of the chip 40.
  • the sheath liquid injection port 521 is the sheath liquid injection 55
  • the sample injection port 522 is the sample injection 56
  • the sheath liquid suction port 526 is illustrated via the tube 58 such as silicon. What is necessary is just to connect with the sheath liquid suction apparatus which does not.
  • the sheath liquid suction means is not particularly limited as long as it can contact the flat portion 41 of the chip 40 and suck the sheath liquid.
  • the sheath liquid may be sucked by contacting a sheath liquid suction pad such as cloth, cotton, sponge, chamois or the like directly or through the hole 525 of the advection accumulation unit 52 with the flat surface portion 41.
  • the width of the hole 525 is adjusted to a width where capillary force is generated, and the hole 525 is brought into contact with the flat surface portion 41 so that the sheath liquid is sucked by the capillary force. May be.
  • the width of the hole 525 should be at least 8 ⁇ m or more when the sample is whole blood, and 10 ⁇ m or more in order to increase the processing capability. More preferred.
  • the width of the hole 525 is not particularly limited as long as a capillary force is generated, and may be appropriately adjusted in consideration of the amount of sheath liquid to be sucked, the capillary force, etc. For example, a width of about 200 ⁇ m may be provided. Further, in order for the sample liquid and sheath liquid to be sucked to be sucked into the hole 525, a gap needs to be generated when the hole 525 is brought into contact with the flat surface portion 41. Therefore, for example, when contacting the both ends of the hole 525 and the flat surface portion 41, the height of the side surface opposite to the pillar 3 is made the same, and only the side surface of the hole 525 on the pillar 3 side is more than the other portion.
  • the difference in height is preferably 8 ⁇ m or more, and more preferably 10 ⁇ m or more.
  • the upper limit of the difference is not particularly limited as long as capillary force is generated, and may be appropriately adjusted in consideration of the amount of sheath liquid to be sucked, capillary force, and the like. For example, a difference of about 200 ⁇ m may be provided.
  • the chip 40 is not limited to the above embodiment.
  • the step portion 7 as shown in FIG. 10 is provided instead of the flat portion 41, and the holes 525 of the advection stacking unit 52 are arranged on the pillar 3 side. May be.
  • a groove portion that is lower than the surface of the substrate 2 is provided, and the advection accumulation unit is adjusted so that the sample liquid and the sheath liquid can be sucked from the groove portion. Good.
  • the sheath liquid may be suctioned by the suction means exemplified above, or a suction device such as a suction pump, and the suction port connected to the suction device may be brought into contact with the flat portion 41 to suck the sheath liquid.
  • the flow rate of the sheath liquid is adjusted by the suction force of the sheath liquid suction means. For this reason, the amount of sheath liquid and sample used for separating fine particles increases, and if the sheath liquid suction pad or the hole for generating capillary force is saturated with the sheath liquid, the suction speed of the sheath liquid may not be stable. .
  • the sheath liquid suction means may be used in combination so that the flow rate of the sheath liquid can be kept more stable.
  • a sheath liquid suction pad such as cotton is brought into contact with the sheath liquid to absorb the sheath liquid, and is absorbed into the sheath liquid suction pad from the other end of the sheath liquid suction pad using a suction device such as a suction pump.
  • the sheath liquid may be aspirated.
  • the sheath liquid may be sucked by a suction device from the suction port communicating with the hole 525 while the sheath liquid is sucked by capillary force from one end of the hole 525 that can suck the sheath liquid by capillary force.
  • the advancing and accumulating unit 52 is not provided with the hole 525, and the suction port connected to a suction device such as a sheath liquid suction pump is inserted into a suction pad with a size that generates capillary force or into the suction port. You may make it contact
  • FIG. 17 is a photograph taken from the side of the advection accumulation unit 52, showing a state in which a sheath liquid suction pad 59 is attached to the hole 525 and a tube 58 such as silicon is connected to the sheath liquid suction port 526. .
  • the material constituting the advection accumulation unit 52 is not particularly limited as long as it does not react with the sample or the sheath liquid, such as resin such as acrylic, nylon, and Teflon (registered trademark), or glass.
  • the advection accumulating unit 52 can be manufactured by cutting using a cutting tool such as a drill and an end mill, or a mold having the shape of the advection accumulating unit 52 and injection molding.
  • the advection accumulation unit 52 in the present invention includes a sheath liquid inlet 521, a sample inlet 522, a sheath liquid plane part 523 and a sample plane part 524, and a hole 55 and a sheath liquid suction port 56 that are formed as necessary. As long as it is included, it may be formed of a single member or may be a combination of separately prepared members.
  • the fine particle extraction means 53 is not particularly limited as long as it can extract the fine particles captured at the capture site 4, and examples thereof include a manipulator equipped with a cell suction means.
  • the fine particle extraction means 53 may be automatically collected by a manipulator linked to a detection means for detecting the capture target fine particles 5 captured by the capture site 4, for example, as described in JP 2010-29178 A Cell picking systems such as those described can be used.
  • the detection means when the captured fine particles are CTC, a fluorescence microscope or the like capable of observing CTC fluorescently stained with a CTC-specific antibody such as an anti-EpCAM antibody labeled with FITC or PE is used. it can.
  • CTC detection can be performed using morphological features such as intracellular nuclei and cytoplasm as an index by performing Papanicolaou staining or Giemsa staining.
  • the fine particles extracted by the fine particle extraction means 53 are biomaterials containing nucleic acids and PCR is performed after extraction, the extracted biomaterials may be transferred to the PCR means 54.
  • the PCR means may be a known device.
  • the relative speeds of the two when the chip 40 is rotated are different, but both of them have a relative speed of 50 to 1500 ⁇ m / s.
  • the tip 40 is preferably rotated so as to be in the range of 60 to 1000 ⁇ m / s. If it is slower than 50 ⁇ m / s, the processing time becomes longer and the processing capacity is lowered. If it is faster than 1500 ⁇ m / s, the capture target fine particles 5 are not captured and the separation efficiency is reduced.
  • the advection accumulation unit 52 is fixed and the chip 40 is rotated, but the chip 40 may be fixed and the advection accumulation unit 52 may be rotated.
  • the amount of sample liquid to be injected varies depending on the height of the pillars 3 and the interval between the pillars. For example, in the case of a chip formed in a substantially hexagonal plane filling state in which the height of the pillars 3 is 30 ⁇ m and the interval between the pillars 3 is 6 ⁇ m. Further, 1.0 to 10.0 ⁇ l / s is preferable per 0.72 mm 2 of the cross-sectional area of the chip 40. When the amount is less than 1.0 ⁇ l, the processing time becomes long and the processing capacity is lowered. When the amount is more than 10.0 ⁇ l, it is not preferable because the sample cannot be held between the sample plane portion of the advection integration unit and the chip.
  • the sheath liquid may be injected so as to be the same as the amount of sheath liquid to be sucked. Note that the sample liquid and / or sheath liquid amount per cross-sectional area is the same in other embodiments.
  • the fine particle separation system of the present invention may be provided with a magnetic field generator and / or an electric field generator for increasing the capture efficiency of the capture target fine particles.
  • the disk part of the rotating means 51 corresponding to the part where the capture part 4 is formed may be formed with a permanent magnet or the like, or a permanent magnet or an electromagnet is installed as a magnetic field generator below the disk part.
  • a magnetic field potential field may be generated.
  • an electric field generator is provided on the disk portion corresponding to the capture site or below the disk portion to generate an electric field potential field (in a non-uniform electric field), and the polarization of the CTC and the surrounding medium and the electric field gradient It is also possible to assist the capture of CTC using the electrostatic force (Coulomb force) that is generated.
  • a magnetic field generator and / or an electric field generator may be provided below the capture site 4.
  • the particulate extraction means 53 may be used after removing the cover plate 31 after the advection and accumulation.
  • FIG. 18 is a diagram showing another embodiment of the particulate separation system.
  • the fine particle extraction means 53, the PCR means 54, and the detection means are used in the fine particle separation system shown in FIG. 10, it is necessary to remove the cover plate 31 after the advection accumulation. Therefore, the capture target fine particles 5 cannot be collected unless all the sample liquids are flowed. For example, when living cells such as cancer cells are captured, the cells may be killed.
  • the cover plate 31 is sized to cover a part of the capture portion 4, and the meniscus is generated by moving the cover plate 31 or the chip 1.
  • the cover plate 31 or the chip 1 By moving the cover plate 31 or the chip 1, the upper part of the capture target fine particles 5 captured by the capture site 4 by the meniscus is immediately opened, so that the capture target fine particles 5 are quickly sampled by the particulate extraction means 53. be able to.
  • the moving speed of the cover plate 31 may be the same as the moving speed of the sample thin plate 21 shown in FIG. Further, a hole (not shown) may be provided in the cover plate 31 so that the sample liquid and the sheath liquid can be continuously supplied.
  • Example 1 [Chip fabrication] First, the silicon substrate was subjected to organic cleaning with an ultrasonic cleaner at 45 kHz for 5 minutes in order of acetone, ethanol, and ultrapure water, and baked at 145 ° C. for 20 minutes. Next, SU-8 was spin-coated on a silicon substrate and prebaked at 95 ° C. for 30 minutes on a hot plate. Next, after exposure using a chrome mask to create a trapped region that is adjacent to a regular hexagon and filled in a plane, post-exposure bake is performed on a hot plate at 95 ° C. for 2 minutes, and development is performed using PM thinner did.
  • rinsing was performed using ethanol and ultrapure water, and water was removed by a spin dryer or the like, followed by drying to prepare a mold.
  • the produced mold was transferred to polydimethylsiloxane (PDMS). After the transfer, both were separated, and the PDMS on which the mold was transferred was stuck on a glass plate. Thereafter, the surface of PDMS was hydrophilized by plasma treatment (frequency 50 kHz, output 700 W, 30 seconds) to produce a chip.
  • FIG. 19 is a photograph showing the appearance of the chip produced in Example 1.
  • the chip size was 50 mm long and 30 mm wide.
  • part was formed was 26 mm long and 24 mm wide.
  • FIG. 20 (1) is an enlarged photograph of the capture site, where the pillar diameter is about 20 ⁇ m, the distance between the pillars is about 6 ⁇ m, the pillar height is about 30 ⁇ m, and the size of the capture site is about 30 ⁇ m.
  • Example 2 A chip was fabricated in the same procedure as in Example 1 except that a chromium mask having a distance between pillars of about 7 ⁇ m was used instead of the chromium mask in Example 1.
  • FIG. 20 (2) is an enlarged photograph of the capture site prepared in Example 2.
  • Example 3 A chip was fabricated in the same procedure as in Example 1 except that a chromium mask having a distance between pillars of about 8 ⁇ m was used instead of the chromium mask in Example 1.
  • FIG. 20 (3) is an enlarged photograph of the capture site prepared in Example 3.
  • Example 4 [Preparation of blood sample] To 100 ⁇ l of collected human blood added with 160 ⁇ l of PBS (phosphate buffered saline), 1.1 ⁇ 10 4 gastric cancer cell lines (human gastric cancer-derived cell line (GCIY-GFP) were separated by trypsin treatment. A blood sample simulating the blood of a cancer patient was prepared. The average particle size of the cancer cells was 25 ⁇ m.
  • PBS phosphate buffered saline
  • FIG. 21 shows a fine particle separation system used in a CTC separation experiment from a blood sample.
  • a cover plate 31 of 25 mm length and 35 mm width made of glass, and dental use A suction unit 35 (made of plastic, outer diameter: horizontal 38 mm, vertical 18 mm, height 7 mm, insertion part: horizontal 30 mm, vertical 10 mm, depth 5 mm) into which cotton (diameter 10 mm, length 30 mm) was inserted was arranged.
  • Figure 22 is a side photographs showing the placement of the chip 1 and the cover plate 31, distance D G between the tip of the tip 1 and the cover plate 31 is 500 [mu] m, the angle ⁇ between the chip 1 and the cover plate 31, and 10 degrees It adjusted with the micro stage so that it might become.
  • 200 ⁇ l of the blood sample was injected into the tip portions of the chip 1 and the cover plate 31.
  • the chip 1 was moved in the upper direction of FIG. 21 at a constant speed of 40 ⁇ m / s.
  • said moving speed is a speed which can isolate
  • the number of GCIY-GFP cells was counted before flowing the sample, and the capture rate was measured by counting GCIY-GFP captured at the capture site after completion of the separation.
  • Example 5 The capture rate was measured in the same procedure as in Example 4 except that the chip manufactured in Example 2 was used instead of the chip manufactured in Example 1.
  • Example 6 The capture rate was measured in the same procedure as in Example 4 except that the chip manufactured in Example 3 was used instead of the chip manufactured in Example 1.
  • Table 1 shows the capture rates of Examples 4 to 6. As can be seen from Table 1, in the case where the capture target fine particles 5 are easily deformed cells or the like, it is clear that it is preferable to narrow the interval between the pillars.
  • Example 7 The capture rate was measured in the same procedure as in Example 4 except that the moving speed of the cover plate was changed so that 200 ⁇ l of the sample could be separated in 7 minutes.
  • Example 8> The capture rate was measured in the same procedure as in Example 4 except that the moving speed of the cover plate was changed so that 200 ⁇ l of the sample could be separated in 3.5 minutes.
  • Example 9 The capture rate was measured in the same procedure as in Example 4 except that the moving speed of the cover plate was changed to a speed at which 200 ⁇ l of the sample could be separated in 1 minute.
  • FIG. 23 is a graph showing the capture rates of Example 4 and Examples 7-9. As apparent from FIG. 23, even when the chip 1 was moved at such a speed that a 200 ⁇ l sample could be separated in 1 minute, the number of GCIY-GFP cells exceeding 80% could be captured. 24, a conventional micro-channel chip for separating fine particles (manufactured in Example 1 of Japanese Patent Application No. 2012-227717. Length 30 mm, width 30 mm.
  • the supplemental portion is approximately octagonal, and the length of the diagonal line is about 30 ⁇ m, depth is about 30 ⁇ m, microchannel has a width of about 10 ⁇ m, channel depth at the supplemental site is about 20 ⁇ m, channel depth other than the supplemental site is about 50 ⁇ m, center of channel and channel
  • the throughput could be improved by about 20 times by using the chip of the present invention as compared with the conventional microchannel chip for separating fine particles.
  • fine particles having different sizes in a sample can be separated quickly and efficiently without using an antibody or the like. Therefore, it is very effective in clinical settings such as separation of CTC from whole blood, so it can be used as a cancer diagnosis system in medical institutions such as hospitals and emergency centers, research institutions such as university medical departments, and educational institutions. Is possible.

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Abstract

　粒径が異なる微粒子が混在している溶液から、抗体等を使用する必要が無く、また、連続的に短時間で微粒子を分離することができる微粒子分離用チップ、微粒子分離用チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法を提供する。　基板、及び少なくとも３本以上のピラーを含み、一端が前記基板上に設けられ、他端が上方に開放した少なくとも３本以上のピラーで捕捉対象微粒子を捕捉するための一つの捕捉部位を形成し、捕捉対象微粒子の大きさをＸ、除去される微粒子の大きさをＹとした場合、一つの捕捉部位を形成する任意の隣り合うピラー同士の間隔ＺはＹ＜Ｚ≦Ｘであり、一つの捕捉部位を形成する少なくとも３本以上のピラーは、捕捉部位に捕捉された捕捉対象微粒子が任意の隣り合うピラーの間から流出しない位置関係に配置されていることを特徴とする微粒子分離用チップ。

Description

微粒子分離用チップ、該微粒子分離用チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法
　本発明は、液体中に混在するサイズの異なる微粒子を分離するための微粒子分離用チップ（以下、単に「チップ」と記載することがある。）、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法に関するもので、特に、血液中の循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ、以下「ＣＴＣ」と略記することもある。）を選択的に捕捉するためのＣＴＣ分離用チップ、該チップを用いたＣＴＣ分離用システム及びＣＴＣ分離方法に関する。
　ＣＴＣはがん患者の末梢血流を循環する腫瘍細胞と定義され、原発腫瘍又は転移腫瘍から血管中へ浸潤した腫瘍細胞である。このＣＴＣの検出は、転移性悪性腫瘍の早期発見の方法の一つとして近年注目されている。その理由は、Ｘ線写真や血清中の腫瘍マーカー検出よりも低侵襲かつ正確に転移性悪性腫瘍の診断を行え、患者の予後予測や治療効果の指標として利用できる点にある。
　ＣＴＣは非常に稀少な細胞であり、転移性がん患者の血液に含まれる１０8～１０9個の血液細胞の内、わずか１細胞程度しか存在しないことが知られている。そのため、末梢血から稀少なＣＴＣを正確に検出するための技術開発に多大な努力が注がれている。これまでに開発されてきた主要な検出方法には、免疫組織化学法、ＰＣＲ法、フローサイトメトリー法などがある。しかしながら、前述したようにＣＴＣは非常に稀少な細胞であるため、血液をそのままこれらの検出方法に供することは出来ないので、通常は前処理として、ＣＴＣの濃縮操作が必須であり、検出法に則したレベルまでＣＴＣ存在比を濃縮させる必要がある。
　ＣＴＣの濃縮方法として開発されてきた様々な手法の中で、最も広く利用されているのは、細胞表面の特異的抗原を標的とした腫瘍細胞の濃縮である。その多くは、上皮細胞接着分子（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体を固定化した磁気微粒子を血液と混合した後、磁石を用いて腫瘍細胞を濃縮する方法をとっている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、ＥｐＣＡＭの発現量は腫瘍のタイプに依存し大きく変動することが知られている。
　その他の濃縮方法としては、細胞のサイズなどの形態を基準として濃縮する手法がある。白血球に比べてサイズが大きな上皮性腫瘍細胞をフィルトレーションによって選別する方法は、ＩＳＥＴ法（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓｉｚｅ　ｏｆ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ）と呼ばれている。ＩＳＥＴは、孔径８μｍのポリカーボネートメンブレンフィルターを用いて血液をフィルトレーションするという簡便な手法であり、安価かつユーザーフレンドリーな手法である。ここで用いられているポリカーボネートメンブレンフィルターは、重イオンを照射した後、エッチングを行うトラックエッチングという手法によって、孔が形成されている。しかし、孔が比較的低密度であり、二つ又はそれ以上の孔が重なりあったりする問題があるため、ＣＴＣの捕捉に利用した場合、その捕捉効率は５０～６０％とされており、濃縮方法が簡便かつ効率も良い手法は未だ開発されていない。
　ＣＴＣの検出を効率的かつ正確なものにするためには、濃縮と検出といった技術を首尾一貫して行うことが必要である。多段階のハンドリング操作、例えば細胞の染色、洗浄、分離、分注などの操作はＣＴＣのロスを引き起こすため、可能な限りこれらの操作を避け、一体の検出装置中で分析が一貫して行える形が好ましい。Ｃｅｌｌｓｅａｒｃｈ（ＶｅｒｉｄｅｘＴＭ，Ｗａｒｒｅｎ，ＰＡ）はＣＴＣ検出装置として唯一ＦＤＡの認可を受けた装置である。この装置では、全血に対し抗ＥｐＣＡＭ抗体固定化磁気微粒子によるＣＴＣの濃縮を行い、腫瘍細胞に対して免疫染色を行った後、自動化蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、当該装置を用いる場合、一般的に大型の装置導入と訓練されたオペレーターの確保が必要であり、ベッドサイドで短時間且つ正確に検査をすることは困難である。
　一方で、ＣＴＣ検出のための小型のマイクロ流体デバイスも知られている。例えば、Ｔｏｎｅｒらが開発したＣＴＣ検出用マイクロ流体デバイスはＣＴＣ－ｃｈｉｐと呼ばれ、フォトリソグラフィーによって形成されたシリコン製の流路内に、円筒状構造物（マイクロポスト）が７８０００個構成されている。このマイクロポストには、抗ＥｐＣＡＭ抗体がコーティングされており、本流路に血液を送液すると、血液中のＣＴＣがマイクロポスト上に捕捉される。捕捉されたＣＴＣに対して、上皮細胞マーカー（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）をターゲットとした蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる。本装置は、手のひらに乗る小型デバイスでありながら、５ｍＬ以上の血液をそのまま分析に供することができるという大きな利点を持っている。実際に転移性がん患者血液からＣＴＣ検出を行っており、回収したＣＴＣからチロシンキナーゼ阻害薬に対する耐性を生む変異を検出することが出来る。しかしながら、ＣｅｌｌｓｅａｒｃｈやＣＴＣ－ｃｈｉｐを用いたＣＴＣ検出は、転移性がん患者血液などの実サンプルを用いた実験が精力的に行われ実績を挙げているが、これらの手法は抗ＥｐＣＡＭ抗体でＣＴＣを濃縮するという原理になっている。そのため、ＥｐＣＡＭ陰性又は弱陽性の腫瘍細胞は検出できないという問題点が挙げられる。
　その他の方法としては、腫瘍細胞のサイズと形態を指標として、ＣＴＣを検出するマイクロ流体デバイスが開発されている。これらのデバイスでは、その流路構造内にメンブレンマイクロフィルター、三日月型の細胞捕捉ウェル（非特許文献３参照）、４段階の細さの流路（非特許文献４参照）を配して、血液中の血球細胞と腫瘍細胞をサイズによって選別し、腫瘍細胞を選択的に濃縮している。また、その流路を利用して、濃縮後の細胞に対して溶解などの操作を連続的に行うことが出来る。これらのデバイスを用いたモデル腫瘍細胞の回収効率の評価実験においては、８０％以上のＣＴＣ回収効率を得ている。しかしながら、この評価はあくまでモデル細胞を用いた実験で行われており、実際にＣＴＣ検出時に必要となる細胞の染色操作や洗浄操作といった要素技術項目については検討されていない。さらに、がん患者血液などの実サンプルを用いた実験は行われておらず、実際にＣＴＣ検出に利用できるかどうかは明らかにされていない。
　更に、抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用しない小型のデバイスとしては、マイクロ流路内にマイクロキャビティアレイ（微細貫通孔）を設け、ＣＴＣを捕捉することができるマイクロ流体デバイスが知られている（特許文献１参照）。しかしながら、前記マイクロ流体デバイスは、微細貫通孔にＣＴＣを捕捉するタイプであるので、ＣＴＣの目詰まりによる作業効率の低下、更には分離したＣＴＣの回収が困難であるという問題がある。
　上記問題点を解決するため、本発明者らは、（１）主流路、及び該主流路の幅より大きな捕捉部位が形成された微粒子分離用マイクロ流路チップ、又は（２）主流路、該主流路から分岐し再び主流路に接続する分岐流路、及び該分岐流路に分岐流路の幅より大きな捕捉部位が形成されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、を用いて気液界面のメニスカスで生じる力を利用して微粒子を沈降させ、目的とする微粒子のみを捕捉部位で捕捉することができることを見出し、特許出願を行っている（特許文献２参照）。
　また、本発明者らは、（１）捕捉部位を含む主流路が基板の中心から放射状に形成されている微粒子分離用マイクロ流路チップを回転手段上に載置し、（２）前記微粒子分離用マイクロ流路チップの表面に、シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニットを配置し、（３）前記回転手段を回転させながらシース液及びサンプル液を注入することで、サンプルを前記微粒子分離用マイクロ流路チップに連続的に供給することができ、目的とする微粒子を効率よく捕捉・分離できることを新たに見出し、特許出願を行っている（特許文献３参照）。
　しかしながら、上記特許文献２及び３に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップは、微細なマイクロ流路及び該マイクロ流路に形成された捕捉部位を用いて微粒子を捕捉する構造となっている。そのため、マイクロ流路を流すことができる液体の単位時間当たりの体積は限られていることから、依然として微粒子の分離操作に時間がかかるという問題がある。
特開２０１１－１６３８３０号公報 特願２０１２－２２７７１７号 特願２０１３－１０６８２４号
Ａｌｌａｒｄ　ＷＪ，　Ｍａｔｅｒａ　Ｊ，　Ｍｉｌｌｅｒ　ＭＣ，　Ｒｅｐｏｌｌｅｔ　Ｍ，　Ｃｏｎｎｅｌｌｙ　ＭＣ，　Ｒａｏ　Ｃ，　Ｔｉｂｂｅ　ＡＧ，　Ｕｈｒ　ＪＷ，　Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ　ＬＷ．　２００４．　Ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｃｉｒｃｕｌａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｏｆ　ａｌｌ　ｍａｊｏｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｉｎ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ｏｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．　Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１０（２０）：６８９７－９０４． Ｒｉｅｔｈｄｏｒｆ　Ｓ，　Ｆｒｉｔｓｃｈｅ　Ｈ，　Ｍｕｌｌｅｒ　Ｖ，　Ｒａｕ　Ｔ，　Ｓｃｈｉｎｄｌｂｅｃｋ　Ｃ，　Ｒａｃｋ　Ｂ，　Ｊａｎｎｉ　Ｗ，　Ｃｏｉｔｈ　Ｃ，　Ｂｅｃｋ　Ｋ，　Ｊａｎｉｃｋｅ　Ｆ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒｓ．　２００７．　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ：　ａ　ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ　ｓｙｓｔｅｍ．　Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１３（３）：９２０－８． Ｔａｎ　ＳＪ，　Ｙｏｂａｓ　Ｌ，　Ｌｅｅ　ＧＹ，　Ｏｎｇ　ＣＮ，　Ｌｉｍ　ＣＴ．　２００９．　Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｂｌｏｏｄ．　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ　１１（４）：８８３－９２． Ｍｏｈａｍｅｄ　Ｈ，　Ｍｕｒｒａｙ　Ｍ，　Ｔｕｒｎｅｒ　ＪＮ，　Ｃａｇｇａｎａ　Ｍ．　２００９．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｓｉｚｅ　ａｎｄ　ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ａ　１２１６（４７）：８２８９－９５．
　本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、
（１）基板上に設けたピラーで捕捉部位を形成し、
（２）前記ピラーの間隔を除去される微粒子は通過するが捕捉対象微粒子は通過できない間隔とし、且つ、
（３）一つの捕捉部位を形成する少なくとも３本以上のピラーを、捕捉された捕捉対象微粒子が任意の隣り合うピラーの間から流出しない位置関係に配置した、
チップを形成することで、基板全体にサンプルを流すことができ、スループットを向上できることを新たに見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明の目的は、微粒子分離用チップ、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法を提供することである。
　本発明は、以下に示す、微粒子分離用チップ、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法に関する。
（１）基板、及び少なくとも３本以上のピラーを含み、
　一端が前記基板上に設けられ、他端が上方に開放した少なくとも３本以上のピラーで捕捉対象微粒子を捕捉するための一つの捕捉部位を形成し、
　捕捉対象微粒子の大きさをＸ、除去される微粒子の大きさをＹとした場合、一つの捕捉部位を形成する任意の隣り合うピラー同士の間隔ＺはＹ＜Ｚ≦Ｘであり、
　一つの捕捉部位を形成する少なくとも３本以上のピラーは、捕捉部位に捕捉された捕捉対象微粒子が任意の隣り合うピラーの間から流出しない位置関係に配置されていることを特徴とする微粒子分離用チップ。
（２）前記任意の隣り合うピラー同士の間隔Ｚが、０．８Ｙ＜Ｚ≦０．８Ｘ、Ｙ＜Ｚ≦０．８Ｘ、又は０．８Ｙ＜Ｚ≦Ｘから選択される１種であることを特徴とする上記（１）に記載の微粒子分離用チップ。
（３）前記捕捉部位が複数形成されていることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の微粒子分離用チップ。
（４）前記複数形成されている捕捉部位同士が隣接して配置され、隣接する捕捉部位がピラーを共有していることを特徴とする上記（３）に記載の微粒子分離用チップ。
（５）前記捕捉部位が、多角形の平面充填状態で配置されていることを特徴とする上記（４）に記載の微粒子分離用チップ。
（６）前記多角形が、正３角形、正方形、正６角形から選ばれる一種であることを特徴とする上記（５）に記載の微粒子分離用チップ。
（７）前記捕捉対象微粒子がＣＴＣで、除去される微粒子が血球細胞であることを特徴とする上記（１）～（６）の何れか一に記載の微粒子分離用チップ。
（８）前記基板が多角形又は円形状で、基板の外周には段差部が形成されていることを特徴とする上記（１）～（７）の何れか一に記載の微粒子分離用チップ。
（９）前記基板が多角形で、基板の外周にはピラーが形成されていない平面部が形成されていることを特徴とする上記（１）～（７）の何れか一に記載の微粒子分離用チップ。
（１０）前記基板が円形状で、基板の外周にはピラーが形成されていない平面部が形成されていることを特徴とする上記（１）～（７）の何れか一に記載の微粒子分離用チップ。
（１１）上記（１）～（１０）の何れか一に記載されている微粒子分離用チップ、サンプル液用薄板、シース液用薄板、シース液を吸引する吸引手段及び／又は吸引装置を含むことを特徴とする微粒子分離用システム。
（１２）上記（１）～（１０）の何れか一に記載されている微粒子分離用チップ、カバー板、吸引手段及び／又は吸引装置を含むことを特徴とする微粒子分離用システム。
（１３）横溝及び該横溝に連通する吸引孔を含む吸引ユニットを更に含むことを特徴とする上記（１１）又は（１２）に記載の微粒子分離用システム。
（１４）横溝及び該横溝に連通する吸引孔を含む吸引ユニットであって、前記横溝を挟む２つの側面の一方の側面が、前記吸引ユニットの両端部及び他の側面より短くなるように形成されていることを特徴とする吸引ユニット。
（１５）前記横溝が、毛管力により液体を吸引できる幅であることを特徴とする上記（１４）に記載の吸引ユニット。
（１６）前記横溝が、吸引手段を挿入できる幅であることを特徴とする上記（１４）に記載の吸引ユニット。
（１７）上記（１０）に記載されている微粒子分離用チップ、
　シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニット、
　前記微粒子分離用チップを回転させる回転手段、及び
　シース液を吸引する吸引手段及び／又は吸引装置、
を少なくとも含む微粒子分離用システム。
（１８）前記移流集積ユニットが、シース液吸引パッドを装着する孔及びシース液吸引口を更に含むことを特徴とする上記（１７）に記載の微粒子分離用システム。
（１９）前記移流集積ユニットが、シース液を毛管力で吸引する孔及びシース液吸引口を更に含むことを特徴とする上記（１７）又は（１８）に記載の微粒子分離用システム。
（２０）上記（１）～（１０）の何れか一に記載されている微粒子分離用チップとサンプル液用薄板の間にサンプル液を注入し、微粒子分離用チップとシース液用薄板の間にシース液を注入し、微粒子分離用チップとサンプル液用薄板及びシース液用薄板を相対移動させることで発生するメニスカスにより、捕捉対象微粒子は前記微粒子分離用チップに設けられた捕捉部位に捕捉され、除去される微粒子は吸引手段及び／又は吸引装置により吸引されたシース液により微粒子分離用チップから除去されることを特徴とする微粒子分離方法。
（２１）上記（１）～（１０）の何れか一に記載されている微粒子分離用チップとカバー板の間にサンプル液を注入し、吸引手段及び／又は吸引装置で前記サンプル液を吸引することで発生するメニスカスにより、捕捉対象微粒子を前記微粒子分離用チップに設けられた捕捉部位に捕捉することを特徴とする微粒子分離方法。
（２２）前記サンプル液を吸引した後に、微粒子分離用チップとカバー板の間にシース液を注入し、吸引手段及び／又は吸引装置で前記シース液を吸引することで、残存している除去される微粒子を洗い流すことを特徴とする上記（２１）に記載の微粒子分離方法。
（２３）上記（１０）に記載されている微粒子分離用チップを、該微粒子分離用チップを回転させる回転手段上に載置し、
　前記微粒子分離用チップ上に、シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニットを配置し、
　前記回転手段を回転させながら、前記シース液注入口からシース液を注入し、前記サンプル注入口からサンプルを注入することで前記微粒子分離用チップとシース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を相対移動させ、相対移動により発生したメニスカスにより目的とする微粒子を前記微粒子分離用チップに形成された捕捉部位に捕捉し、
　シース液吸引手段及び／又は吸引装置によりシース液を吸引することで、除去される微粒子をシース液とともに微粒子分離用チップから除去することを特徴とする微粒子分離方法。
　本発明のチップは、基板上に形成したピラーで捕捉部位を形成し、移流集積により下に押し付けられた捕捉対象微粒子は捕捉部位で捕捉され、除去される微粒子はピラーの間隔を通って、チップ外に除去される。そのため、本発明のチップを用いると、チップ全体にサンプル液を流すことができるので、サンプル液から捕捉対象微粒子を分離するスループットを著しく向上することができる。したがって、例えば、赤血球、白血球等が混在している全血中から前処理なしに含有量の少ないＣＴＣのみを短時間で高精度に分離することができ、例えば、がん転移が初期の患者又はがん治療後の患者の経過観察等、血液細胞に含まれるＣＴＣ細胞が非常に少ない患者のサンプルであっても効率よくＣＴＣを分離することができ、簡便な操作によるベッドサイド型がん診断が可能となる。
　本発明の微粒子分離用システムに用いられるチップは、抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用していないので、ＣＴＣ陰性又は弱陽性の腫瘍細胞であっても確実に検出することができる。また、本発明のチップは、赤血球、白血球等のサイズの小さい細胞はシース液によりチップの外に流し、ＣＴＣ等のサイズが大きな細胞は流路に設けた捕捉部位で捕捉することができるので、従来のフィルタタイプのデバイスと異なり、デバイスの目詰まりが無く、連続的に処理することが可能となる。
　更に、本発明の微粒子分離用システムに用いられるチップは、半導体形成プロセスを用いて量産が可能であることから、ＣＴＣ検査のコストを大幅に削減することができる。
図１は、本発明のチップの一例を示す概略図である。 図２は、図１のＡ－Ａ’断面図である。 図３は、本発明のチップの捕捉部位の形状の一例を示す図である。 図４は、本発明に含まれない捕捉部位４のピラー３の位置関係を示す図である。 図５は、本発明のチップ１の実施形態の一例を示す図である。 図６は、捕捉部位として、単一種類の多角形を平面充填状態に配置した例を示している。 図７は、本発明のチップの作製手順の一例を示したフローチャートである。 図８は、本発明の微粒子分離用システムの概略及び微粒子分離方法を示している。 図９は、メニスカスの発生原理を説明している。 図１０は、本発明の微粒子分離用システムの他の実施形態の概略及び微粒子分離方法を示している。 図１１は、図１０のＡ－Ａ′断面図を示している。 図１２は、吸引ユニットの概略を示している。 図１３は、本発明の微粒子分離用システムの他の実施形態を示している。 図１４は、図１３に示す実施形態のシステム全体像を示している。 図１５は、図面代用写真で、移流集積ユニットの概略を示している。 図１６は、図面代用写真で、移流集積ユニットを斜め上から拡大撮影した写真である。 図１７は、図面代用写真で、移流集積ユニットの側面からの写真である。 図１８は、本発明の微粒子分離用システムの他の実施形態を示している。 図１９は、図面代用写真で、実施例１で作製したチップの外観を示している。 図２０は、図面代用写真で、実施例１～３で作製したチップの捕捉部位の拡大写真である。 図２１は、図面代用写真で、血液サンプルからのＣＴＣ分離実験に使用した微粒子分離システムを示している。 図２２は、図面代用写真で、チップとカバー板の配置関係を示す側面写真である。 図２３は、実施例４及び実施例７～９の捕捉率を示すグラフである。 図２４は、従来の微粒子分離用マイクロ流路チップを用いた微粒子分離システムを示している。
　以下に、微粒子分離用チップ、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法について詳しく説明する。
　図１は、本発明のチップの一例を示しており、チップ１は、基板２上に、複数のピラー３が形成されており、少なくとも３以上のピラーで捕捉対象微粒子を捕捉するための捕捉部位を形成している。なお、本発明において、「ピラー」とは、基板２上に形成された柱を意味する。また、「微粒子」とは、液体に分散できる粒子であって、粒子の形態は単独又は凝集状態のものを意味する。微粒子の大きさは、メニスカスの原理が適用できる範囲であれば特に制限はなく、約１ｍｍ以下の大きさであればよい。
　図２は、図１のＡ－Ａ’断面図で、ピラー３の一端は基板２上に設けられ、他端は上方に開放している。そして、少なくとも３本以上のピラー３で一つの捕捉部位４を形成している。後述する移流集積により、ピラー３の上方の開放側から下方に押し付けられた捕捉対象微粒子５は、捕捉部位４で捕捉される。
　図３は、本発明のチップ１の捕捉部位４の形状の一例を示す図である。図３（１）は、捕捉部位４が３本のピラー３で形成されている例を示している。ピラー３は、捕捉対象微粒子５の大きさをＸ、除去される微粒子６の大きさをＹとした場合、一つの捕捉部位を形成する任意の隣り合うピラー３の間隔Ｚが、Ｙ＜Ｚ≦Ｘとなるように形成されている。なお、本発明において、「間隔Ｚ」は、任意の隣り合うピラー３の外周と外周との最短距離を意味する。
　ピラー３の間隔Ｚは、Ｙ＜Ｚ≦Ｘの関係を満たせば同じである必要は無く、図３（２）に示すように、異なっていてもよい。なお、本発明において、微粒子の「大きさ」とは、微粒子を任意の方向から２枚の平行な平面で挟んだ際に、平面の間隔が最短となる長さを意味する。例えば、微粒子が球状の場合は直径を意味する。
　捕捉対象微粒子５が、生体細胞等の形状が変化し易い場合、流体力により変形して捕捉部位４のピラー３の間をすり抜けてしまう可能性がある。また、除去される微粒子も同様に変化し易い場合、ピラー３の間隔が除去される微粒子６の間隔より狭くても、捕捉部位４内に入った除去される微粒子６を捕捉部位４から排出することができる、したがって、任意の隣り合うピラー３の間隔は、捕捉対象微粒子５及び／又は除去される微粒子６の形状の変化割合に応じて適宜選択すればよく、例えば、０．８Ｙ＜Ｚ≦０．８Ｘ、Ｙ＜Ｚ≦０．８Ｘ、又は０．８Ｙ＜Ｚ≦Ｘ等、適宜調整すればよい。
　捕捉部位４は、上記のＹ＜Ｚ≦Ｘの関係に加え、捕捉部位４に捕捉された捕捉対象微粒子５が、任意の隣り合うピラー３の間から流出しない位置関係に配置されていることが必要である。図４は、本発明に含まれない捕捉部位４のピラー３の位置関係を示したものである。一つの捕捉部位４を形成する任意の隣り合うピラー３の間隔Ｚが、Ｙ＜Ｚ≦Ｘとなるように形成されていても、図４に示すように、ピラー３が捕捉対象微粒子５の一部分のみしか捕捉していない場合が考えられる。その場合、図４に示す矢印の方向にサンプル液を吸引すると、捕捉部位４で捕捉した捕捉対象微粒子５は捕捉部位４から流出してしまう。したがって、上記のとおり、本発明のチップ１の捕捉部位４は、捕捉された捕捉対象微粒子５が、任意の隣り合うピラー３の間から流出しない位置関係に配置される必要がある。具体的には、捕捉対象微粒子５を任意の方向から２枚の平行な平面で挟んだ際に、平面の間隔が最短となる線（図３（１）の捕捉対象微粒子５の点線）を含むように微粒子を切断して平面にした場合、当該最短となる線を境界に、両側に少なくとも１本のピラー３が配置されるようにすればよい。
　捕捉部位４は、上記のＹ＜Ｚ≦Ｘの関係、及び、捕捉された捕捉対象微粒子５が任意の隣り合うピラー３の間から流出しない位置関係を満たせばピラー３を配置する形状に限定は無く、４角形、５角形、６角形、７角形、８角形、９角形、１０角形等の多角形が挙げられる。前記の多角形は、正多角形であってもよいし、正多角形でなくてもよい。
　図５は、本発明のチップ１の実施形態の一例を示す図である。捕捉部位４は、図５（１）に示すように、同じ形状の捕捉部位４を基板２上に複数形成してもよいし、図５（２）に示すように、形状の異なる捕捉部位４を基板２上に複数形成してもよい。図５（２）に示す実施形態では、大きさの異なる捕捉対象微粒子５を一枚のチップ１で捕捉することができる。
　捕捉部位４を複数形成する場合、捕捉対象微粒子５を効率よく捕捉するためには、捕捉部位４を隣接して配置することが好ましい。捕捉部位４を隣接して配置する場合、任意の捕捉部位４と隣接する捕捉部位４とでピラー３を共有し、捕捉部位４が連続する平面充填状態にすることが好ましい。なお、本発明において、「平面充填状態」とは、１以上の有限種類の多角形を隙間なく埋めた状態を意味する。平面充填状態は、上記のとおり、Ｙ＜Ｚ≦Ｘの関係に加え、捕捉部位４に捕捉された捕捉対象微粒子５が、任意の隣り合うピラー３の間から流出しない位置関係に配置されていれば、形状に特に制限は無い。例えば、正３角形と正６角形の組み合わせ、正３角形と正方形の組み合わせ、正方形と正８角形の組み合わせ等、複数の多角形の組み合わせが挙げられる。多角形を組み合すことで、大きさの異なる捕捉対象微粒子５を一枚のチップ１で捕捉することができる。
　図６は、捕捉部位として、単一種類の多角形を平面充填状態に配置した例を示しており、図６（１）は正３角形、図６（２）は正方形、図６（３）は正６角形、を隣接して設けている。
　ピラー３の断面形状は特に制限は無く、円、多角形等から適宜選択すればよい。ピラー３は、基板２上に貼り付けてもよいが、後述するように、先ず鋳型を作製し、当該鋳型を基板２用の材料に転写することで、効率的にチップ１を作製することができる。転写により作製する場合、加工の容易性等の理由により、ピラー３の断面長（断面が円形の場合は直径、多角形の場合は任意の外周を結んだ線の中で最も長い線の長さ）は、１μｍ以上が好ましく、２μｍ以上がより好ましい。ピラー３の断面長の上限は特に制限は無く、捕捉対象微粒子５及び除去される微粒子６の大きさにより決められる間隔Ｚ、捕捉部位４を形成するピラー３の本数等を考慮し、適宜決定すればよい。
　全血から、ＣＴＣを捕捉し、ＣＴＣ以外の赤血球、白血球等の血球細胞を除去する場合、ピラー３の間隔Ｚは、ＣＴＣの直径（１５～３０μｍ）よりは小さく、赤血球、白血球等の血球細胞（約７μｍ）より大きくすればよい。なお、ＣＴＣ及び血球細胞は、上記のとおり、形状が変化し易いので、ピラー３の間隔Ｚは、６～１２μｍ程度であってもよい。また、腹腔洗浄液において血球細胞または中皮細胞（約７～１５μｍ）から胃がん細胞塊（２５～５０μｍ）を分離する場合は、間隔Ｚは、６～２４μｍ程度であってもよい。
　基板２上のピラー３の高さは、捕捉した捕捉対象微粒子５がサンプル液の流体力により流れ出さない高さであればよく、捕捉対象微粒子５の大きさの０．５倍より大きいことが好ましく、１倍以上がより好ましい。一方、高さの上限は特には無いが、サンプル液を流した後、捕捉部位４で捕捉された捕捉対象微粒子５をキャピラリー等で吸引・回収する場合、ピラー３が高すぎると、キャピラリーを捕捉部位４の基板表面付近まで挿入し難くなる。そのため、ピラー３の高さは、捕捉対象微粒子５の大きさの１０倍以下が好ましく、２倍以下がより好ましい。
　なお、上記に示したチップ１は長方形の例を示しているが、形状に特に限定は無く、正方形、６角形、８角形等の多角形であってもよい。なお、後述するように、チップ１を回転させて移流集積を発生する場合は、チップ１の形状は円形にすることが好ましい。
　チップ１は、フォトリソグラフィー技術を用いて作製することができる。図７は作製手順の一例を示したフローチャートである。
１．先ず、鋳型用の基板１１を超音波洗浄機により有機洗浄し、ベイクする。次いで、ネガティブフォトレジスト１２を基板１１上にスピンコートし、ホットプレート上でプリベイクする。
２．捕捉部位４の形状をしたフォトマスク１３を用い露光する。
３．ホットプレート上でポストエクスポージャーベイクを行い、現像液を用い現像した後、超純水を用いリンスし、スピンドライヤー等で水分をとばし乾燥させることで、鋳型を作製する。なお、基板１１上のネガティブフォトレジスト１２で作製した凸部と凸部の間が、転写後にピラー３となる部分である。
４．チップ１の基板２用の材料を、鋳型の上に流し込む。
５．鋳型のパターンが転写した基板２用の材料を鋳型から分離する。必要に応じて、基板２を硬質材料１４に接着する。
６．基板２の表面を、親水化処理する。
　有機洗浄は、アセトン、エタノール等、半導体製造分野で一般的に用いられている洗浄剤であれば特に制限はされない。また、鋳型用の基板１１としては、フォトリソグラフィー技術分野で一般的に用いられている材料であれば特に限定はされず、例えば、シリコン、シリコンカーバイド、サファイア、リン化ガリウム、ヒ化ガリウム、リン化ガリウム、窒化ガリウム等が挙げられる。
　ネガティブフォトレジスト１２も、フォトリソグラフィー技術分野で一般的に用いられている材料であれば特に制限は無く、例えば、ＳＵ－８、ＫＭＰＲ等が挙げられる。また、ネガティブフォトレジスト１２に代え、ポジティブフォトレジストを用いることもでき、例えば、ＰＭＥＲ、ＡＺ等が挙げられる。また、レジストの除去液としては、ジメチルホルムアミドとアセトン等、半導体分野で一般的な除去液であれば特に制限はない。
　また、本発明のチップ１の基板２の材料としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂（アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂）、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）等の熱可塑性樹脂；フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、熱硬化性ポリイミド、シリコーンゴム等の熱硬化性樹脂が挙げられる。なお、捕捉部位４で捕捉した分離対象微粒子５を回収せず、そのまま分析する場合は光透過性があり生体分子と非親和性の材料で基板２を作製することが望ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、硬質ポリエチレン製等のプラスチック、シリコン等が挙げられる。
　チップ１は、捕捉対象微粒子５を捕捉した後に、顕微鏡等で観察する場合があるため、基板２は薄くした方が好ましい。しかしながら、後述するように、チップ１を移動する場合、基板２が薄すぎるとチップ１を移動し難いこともある。したがって、チップ１は、硬質材料１４を含んでいてもよい。硬質材料１４としては、ガラス、プラスチップ、シリコン等が挙げられ、基板２を貼着すればよい。
　チップ１の表面は親水化処理されることで、液体を注入した際、溝に気泡が入ることを防止できる。親水化処理方法としては、プラズマ処理、界面活性剤処理、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）処理、光触媒等が挙げられ、例えば、チップ１の表面を１０～３０秒間プラズマ処理することで、表面に水酸基を導入することができる。
　次に、チップ１を用いた微粒子分離用システム、及び当該微粒子分離システムを用いた微粒子分離方法について説明する。
　図８は、本発明の微粒子分離用システムの概略及び微粒子分離方法を示す図で、チップ１とサンプル液用薄板及びシース液用薄板を相対移動させることでメニスカスを発生させる実施形態を示している。本実施形態の微粒子分離用システムは、チップ１、サンプル液用薄板２１、シース液用薄板２２、シース液を吸引する図示しない吸引手段及び／又は吸引装置を含んでいる。吸引手段及び／又は吸引装置は、シース液用薄板２２を移動する方向と平行となるチップ１の外周辺２７に当接して配置し、ピラー３の上方からシース液を吸引すればよい。
　サンプル液用薄板２１、シース液用薄板２２は、ガラス、プラスチック等、サンプルやシース液と反応しないものであれば特に制限はない。シース液としては、分離すべき微粒子に損傷等を与えないものであれば特に制限はなく、全血をサンプルとして用いる場合は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等各種緩衝液、疑似体液（ＳＢＦ）、一般的な細胞培養液等、一般的に使用されているシース液であれば特に制限はない。
　図８は、サンプルとして全血を用い、全血中からＣＴＣ５を捕捉する例が示されている。全血２３をチップ１とサンプル液用薄板２１の間に注入し、チップ１とサンプル用薄板２１を相対的に移動させることで、メニスカス２５が発生する。
　図９は、メニスカスの発生原理を説明する図で、本発明では、移流集積法と呼ばれる、気液界面に存在する微粒子間の毛管力（とくに横毛管力：ｌａｔｅｒａｌ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｆｏｒｃｅと呼ばれる）を利用して、微粒子同士を細密充填構造に配列する手法を用いている。微粒子が溶液に分散した懸濁液のメニスカスを基板上に形成すると、メニスカスの先端において、図に示すように微粒子が溶液から頭を出す箇所が形成される。この頭が出ている箇所では、界面張力及び重力により下に押し付けられる力が微粒子に発生しながらメニスカスと共に移動する。
　上記のメニスカスの原理により、捕捉対象微粒子５であるＣＴＣが下に押し付けられることで上方に開放した捕捉部位４に落とし込まれて捕捉される。一方、除去される微粒子６である血球細胞は、後述する吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力によりピラー３の間を通ってチップ１から排出される。また、シース液も同様にメニスカスを発生させることで、シース液がピラー３の間から基板２上に入り易くなる。
　チップ１と、サンプル液用薄板２１及びシース液用薄板２２との間隔は、２００～１０００μｍとすることが好ましい。２００μｍより小さいとサンプル液の導入量が減少し処理能力が低下し、１０００μｍより大きいとメニスカス力が低下し十分な分離が得られない。なお、上記間隔は、マイクロステージで調整することができる。また、チップ１と、サンプル液用薄板２１及びシース液用薄板２２との相対移動速度は、２０～５０μｍ／ｓが好ましい。２０μｍ／ｓより遅いと、処理時間が長くなり処理能力が低下し、５０μｍ／ｓより速いと微粒子が捕捉されずに分離効率が低減する。
　シース液の流速は、２０～４５００μｍ／ｓが好ましい。なお、シース液の流速は、ピラーとピラーの間隔に応じて異なり、狭い場所ほど速くなる。本発明において「シース液の流速」とは、ピラーとピラーの間を流れる流速で、最も速く流れる流速を意味する。シース液の流速が、２０μｍ／ｓより遅いと血球細胞を洗浄する能力の低下により分離効率が低減し、４５００μｍ／ｓより速いと一旦捕捉されたＣＴＣが吸引され分離効率が低減する。シース液の流速は、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力により調整すればよい。吸引装置は吸引ポンプ、マイクロシリンジ等、液体を吸引できるものであれば特に制限はない。なお、図８に示す例は、チップとシース液用薄板２２との間にシース液２４を必要に応じて注入する形式であるが、シース液用薄板２２の一端に、シース液容器又はシース液容器から伸長しているチューブ等を連結することで、シース液を自動的に供給できるようにしてもよい。
　図１０は、本発明の微粒子分離用システムの他の実施形態の概略及び微粒子分離方法を示す図で、チップ１とカバー板を相対移動させずサンプル液を吸引することでメニスカスを発生させる実施形態を示している。本実施形態の微粒子分離用システムは、チップ１、該チップ１に重ねサンプル液及びシース液を吸引することでメニスカスを発生させるためのカバー板３１、図示しない吸引手段及び／又は吸引装置を少なくとも含んでいる。図１０に示す実施形態では、チップ１の外周辺に、ピラー３と同じ高さの段差部７を形成し、長手方向に形成されサンプル液及びシース液を毛管力で吸引することができる横溝３３と該横溝３３に連通する吸引孔３４を含む吸引ユニット３５を介して、吸引手段及び／又は吸引装置によりサンプル液及びシース液を吸引する例を示している。段差部７を形成することで、吸引ユニット３５の両端３５１及び３５２、並びに一方の側面３５３を段差部７と当接することができるので、空気等が入ることなく、もう一方の側面３５４側からサンプル液、シース液を吸引することができる。なお、サンプル液及びシース液は、チップ１の外周辺にピラー３を形成していない平面部を設け、平面部から吸引手段及び／又は吸引装置を用いて吸引できるようにしてもよい。
　また、本実施形態では、吸引手段及び／又は吸引装置を用いてサンプル液を吸引することでサンプル液中に含まれる微粒子を分離することから、希釈したサンプル液を使用すればサンプル液自体がシース液の役割をするので、サンプル液を流した後にシース液を流すことは必須ではない。目的微粒子の高純度な分離の場合はシース液を流すことで残存している除去する微粒子を洗い流す等、分離の目的に応じてシース液を流すか否かの選択を行えばよい。
　図１１は、図１０のＡ－Ａ′断面図で、本実施形態におけるメニスカスの発生原理を説明する図である。図１１（１）に示すように、チップ１とカバー板３１の間にサンプル液、シース液３２を注入し、図示しない吸引手段及び／又は吸引装置で吸引すると、サンプル液及びシース液はピラー３の間をとおり吸引ユニット３５から排出される。その際、チップ１及びカバー板３１との間のサンプル液、シース液３２には、毛細管力が発生するため、図１１（２）に示すようなメニスカスが発生する。
　なお、図１１（２）に示すサンプル液及びシース液３２の移動方向は、チップ１に対してカバー板３１を平行に配置した場合であり、例えば、図１１（３）に示すように、吸引ユニット３５側のカバー板３１をチップ１に近付けるように傾斜して配置すると、サンプル液及びシース液３２に係る圧力のため、サンプル液及びシース液３２は吸引ユニット３５側に移動する。逆に、図１１（４）に示すように、吸引ユニット３５とは反対側のカバー板３１をチップ１に近付けるように傾斜して配置すると、サンプル液及びシース液３２に係る圧力のため、サンプル液及びシース液３２は吸引ユニット３５とは反対側に移動する。図１１（２）～（４）の何れの実施形態でも本発明の実施をすることができるが、図１１（３）に示す実施形態は、サンプル液及びシース液３２が吸引ユニット３５側に近付くことから、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力を小さくすることができるので好ましい。チップ１とカバー板３１の間隔は、上記のサンプル液用薄板２１と同様に、２００～１０００μｍの間が好ましく、この間隔の範囲内で、マイクロステージを用いて調整すればよい。カバー板３１を傾斜する場合は、６°～１８°程度傾けることが好ましい。傾斜角度が６°より小さい場合は、サンプル液及びシース液に係る圧力が不足し、１８°より大きい場合は、微粒子の捕捉に有効なメニスカスの角度より大きくなり過ぎるので好ましくない。図１１（５）に示す実施形態は、吸引側にサンプル液及びシース液３２のメニスカスを発生させないように、第２のカバー板３１１を設けたもので、閉じられた流路系を構成できることから安定した吸引を行うことができる。
　カバー板３１及び第２のカバー板３１１は、上記のサンプル液用薄板２１と同様の材料で作製すればよい。また、カバー板３１の大きさは特に制限は無いが、本実施形態では、カバー板３１を移動することなくメニスカスを発生することができることから、処理効率を向上させるためには、チップ１に形成したピラー３の全てを覆うことができる大きさで形成することが望ましい。また、第２のカバー板３１１の大きさは、横方向の長さはカバー板３１と同じ長さにすればよく、幅はメニスカスが発生しない範囲内で適宜調整すればよい。
　なお、図１１に示した実施形態は、チップ１が４角形の例であるが、チップ１は４角形に限定されず、５角形、６角形等の多角形又は円形でもよい。また、図１１に示した実施形態は、チップ１の外側の一辺に吸引ユニット３５を配置しているが、吸引ユニット３５を多角形又は円形のチップ１の外周に配置し、カバー板３１も多角形又は円形状に形成し、カバー板３１の中央にサンプル液及びシース液３２の注入孔を形成することで、チップ１の中央に注入したサンプル液及びシース液３２を、チップ１の外周に吸い寄せるようにして移流集積を発生させてもよい。更に、上記の実施形態とは逆に、カバー板３１を多角形の外周又は円形の外周部分を覆う略リング状とし、略リング状の中央に多角形又は円形状の吸引ユニット３５を配置し、チップ１の外周部分から注入したサンプル液及びシース液３２を、チップ１の中心に吸い寄せるようにして移流集積を発生させてもよい。チップ１の中心に吸い寄せるようにメニスカスを発生させる場合は、メニスカスが発生する面の距離が長くなり、サンプルの処理効率が上がるので好ましい。
　サンプル液及びシース液３２の吸引手段としては、例えば、布、コットン、スポンジ、セーム皮等の吸引パッドが挙げられ、チップ１のピラー３の上部又はピラー３を形成していない平面部に直接吸引パッドを当接してサンプル液及びシース液３２を吸引・排出すればよい。サンプル液及びシース液３２の吸引・排出は、吸引ユニット３５を介して行ってもよい。
　図１２は、ピラー３を形成していない平面部に当接する場合の吸引ユニット３５の実施形態の一例を示しており、図１２（１）は吸引ユニット３５の概略を示す上面図で、図１２（２）は吸引ユニット３５のＢ－Ｂ′断面図を示している。横溝３３の幅は、少なくとも除去された微粒子を通過させる必要があることから、サンプルが全血の場合は少なくとも８μｍ以上、処理能力を上げるためには１０μｍ以上とすることがより好ましい。一方、横溝３３の幅は毛管力が発生すれば特に上限は無く、吸引するサンプル液、シース液の量や毛管力等を考慮して適宜調整すればよく、例えば、２００μｍ程度の幅を設けてもよい。また、吸引するサンプル液、シース液が横溝３３に吸引されるためには、吸引ユニット３５を平面部に当接した際に隙間が生じる必要がある。そのため、例えば、吸引ユニット３５の端部３５１及び３５２、並びに横溝３３を挟む２つの側面３５３及び３５４の内、平面部７に当接した際にピラー３とは反対側の側面３５３の高さを同じにしておき、ピラー３側に配置する側面３５４のみ、端部３５１、端部３５２及び側面３５３より短くしておけばよい。側面３５３と３５４の差は、横溝３３の幅と同様、８μｍ以上が好ましく、１０μ以上がより好ましい。毛管力が発生すれば特に差の上限は無く、吸引するシース液量や毛管力等を考慮して適宜調整すればよく、例えば、２００μｍ程度の差を設けてもよい。なお、図１０に示すように、チップ１に段差部７を設ける場合は、側面３５３及び３５４の高さは同じにすればよい。また、横溝３３に吸引したサンプル液及びシース液３２を、ポンプ、マイクロシリンジ等の吸引装置を用い、吸引孔３４を通して吸引・排出してもよい。排出するサンプル液、シース液の量が多く、横溝３３のみでは吸引できない場合は、吸引装置を組合せて用いればよい。吸引孔３４の数は特に制限は無く、基板２上に形成したピラー３の間を流れるサンプル液及びシース液３２の流速に大きな差異が発生しない程度の数を設ければよい。
　また、横溝３３の幅を大きくし、横溝３３に上記の布、コットン、スポンジ、セーム皮等の吸引手段を挿入し、該吸引手段に吸収したサンプル液及びシース液３２を、吸引孔３４をとおして吸引装置で吸引してもよい。本実施形態においては、ピラー３間を流れるサンプル液及びシース液の流速は、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力により調整する。そのため、単に吸引手段でサンプル液及びシース液３２を吸引する、又は、毛管力により横溝３３にサンプル液及びシース液３２を吸引するより、吸引手段に吸引したサンプル液及びシース液を更に吸引装置で吸引することで、サンプル液及びシース液の吸引速度を安定に保つことができる。吸引装置と吸引孔３４は、シリコン等のチューブを用いて連結すればよい。
　吸引ユニット３５を構成する材料は、アクリル、ナイロン、テフロン（登録商標）等の樹脂、又はガラス等、サンプル液やシース液と反応しないものであれば特に制限はない。吸引ユニット３５は、ドリル及びエンドミル等の切削工具を用いた切削加工、又は吸引ユニット３５の形状のモールドを作製し射出成形により作製することができる。
　本実施形態の微粒子分離用システムは、先ず、チップ１とカバー板３１の間にサンプル液を入れ、吸引手段及び／又は吸引装置によりサンプル液を吸引し、次に、必要に応じて、シース液をチップ１とカバー板３１の間に入れ、シース液を吸引することで、例えば、血液サンプル中のＣＴＣを捕捉部位にトラップし、他の血球細胞等はシース液と共に洗い流すことができる。チップ１とカバー板３１の間へのサンプル液又はシース液は、シリンジ等を用いてチップ１とカバー板３１の間から注入してもよいし、カバー板３１に孔を設け、該孔からサンプル液及びシース液を注入してもよい。
　サンプル液及びシース液３２の流速は、２０～４５００μｍ／ｓが好ましい。２０μｍ／ｓより遅いと血球細胞を分離・洗浄する能力の低下により分離効率が低減し、４５００μｍ／ｓより速いと一旦捕捉されたＣＴＣが吸引され分離効率が低減する。サンプル液及びシース液の流速は、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力により調整すればよい。
　なお、本実施形態では、サンプル液を先ず流した後に、必要に応じてシース液を流す。したがって、全血等の粘性の高いサンプル液をそのまま吸引すると、大きな吸引力が必要となる。そのため、サンプル液として血液を用いる場合は、シース液等を用いて、２～１０倍、好ましくは３～５倍程度に希釈してもよい。本実施形態では、相対移動にしたがってメニスカスを発生させる位置を変えるのではなく、チップ１とカバー板３１が重なっている部分の全てにメニスカスを発生することができ、更に、サンプル液及びシース液を吸引することで、メニスカスが発生している位置を移動させることができるので、全血を希釈した場合でも、分離に要する時間を十分短くすることができる。
　図１３は、本発明の微粒子分離用システムの他の実施形態を示す図である。本実施形態では、円形状のチップ４０を用いた例を示しているが、後述する微粒子分離用システムの回転手段に載置し回転することができれば多角形等、形状等に特に制限は無い。本実施形態に用いるチップ１は、外周部分にピラー３が形成されていない平面部４１が形成され、吸引手段及び／又は吸引装置を当接できるようになっている。また、回転手段への取り付けのため、必要に応じて中心部に中心孔４２を設けてもよい。
　本実施形態では、後述する移流集積ユニットのシース液移流集積用平面部（以下、「シース液平面部」と記載することもある。）に対応するエリア４３でシース液にメニスカスを発生させ、そして、シース液にメニスカスを発生させるエリアより外周側であって、サンプル移流集積用平面部（以下、「サンプル平面部」と記載することもある。）に対応するエリア４４でサンプルにメニスカスを発生させる。そして、移流集積ユニットの孔に対応するエリア４５から、サンプル液及びシース液を排出することができる。
　図１４は、図１３に示す実施形態のシステム全体像を示す図で、円形状のチップ４０を用いた微粒子分離用システム５０の概略を示す図で、チップ４０を載置して回転させる回転手段５１、移流集積ユニット５２、図示しないシース液吸引手段及び／又は吸引装置を少なくとも含んでおり、捕捉部位で捕捉した微粒子を取り出す場合は微粒子抽出手段５３を含んでもよい。更に、捕捉した微粒子が核酸を含む生体材料で、分離後にＰＣＲを行う場合はＰＣＲ手段５４を含んでいてもよく、図１４ではＰＣＲに用いられるウェルを配置した例を示している。また、後述する移流集積ユニットのシース液注入口にシース液を送液するシース液インジェクション５５及びサンプル注入口にサンプルを送液するサンプルインジェクション５６を設けてもよい。シース液インジェクション５５及びサンプルインジェクション５６は、送液できるものであれば特に制限は無く、シリンジ等を用いて手動で送液してもよいし、市販の定流量ポンプ等を用いてもよい。また、送液に動力を使用せず、ボトル等から重量により滴下してもよく、その場合、点滴の流量調整に用いられるクレンメを設けて流量を調整してもよい。
　回転手段５１は、チップ４０を載置して回転できるものであれば特に制限は無く、例えば、チップ４０を載置できる回転可能な円盤の下にモーター等の駆動手段を設けて、円盤を回転するようにすればよい。なお、発生するメニスカスの大きさを一定にすることが好ましいことから、駆動手段は円盤を一定速度で回転制御できるものであることが好ましい。
　図１５は、移流集積ユニット５２の概略を示す図である。移流集積ユニット５２は、シース液注入口５２１、サンプル注入口５２２、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４が少なくとも形成されている。また、移流集積ユニット５２には、シース液吸引パッドを装着又はシース液を毛管力で吸引する孔５２５、該孔５２５に連通し図示しないシース液吸引装置と接続するためのシース液吸引口５２６が設けられていてもよい。シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４は、チップ４０と相対移動することでメニスカスを発生させるため、チップ４０に相対する面は平面形状であることが好ましい。また、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４とチップ４０との間でメニスカスが発生し、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４以外ではメニスカスが発生する必要は無いことから、移流集積ユニットのシース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４は、他の部分より厚くし段差を設ける必要がある。一方、孔５２５に関しては、孔５２５にシース液吸引パッドを装着する場合は、シース液吸引パッドがシース液に当接するように、シース液吸引パッドを装着する孔５２５からの突出量を調整すればよいので、孔５２５は前記他の部分と同じ面に形成してもよいし、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４と同じ高さとなる位置に孔５２５を設ける平面部を形成し、該平面部に孔５２５を形成してもよい。また、孔５２５を、シース液を毛管力で吸引する孔として用いる場合には、平面部４１から毛管力によりシース液を吸引できる間隔となるように、孔５２５を形成する平面部を、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４より厚めに形成してもよい。また、シース液吸引口５２６は孔５２５に連通していれば形成する個数、位置は特に制限は無く、適宜調整すればよい。
　図１５に示すように、シース液注入口５２１はシース液平面部５２３内に、サンプル注入口５２２はサンプル平面部５２４内に形成されてもよいし、移流集積ユニット５２とチップ４０を相対移動させる際に、シース液平面部５２３の上流側にシース液注入口５２１を、サンプル平面部５２４の上流側にサンプル注入口５２２を形成してもよい。また、シース液は、中心孔４２から平面部１の方向に流れることから、シース液平面部５２３は、中心孔４２付近に形成されていれば形状及び大きさに特に制限は無い。一方、サンプル平面部５２４は、捕捉部位４の上でメニスカスのラインが発生するような形状であれば特に制限は無いが、効率的に捕捉対象微粒子５を捕捉するためには、中心孔４２から平面部４１に隣接する捕捉部位４までメニスカスラインが発生するような形状及び大きさとすることが好ましい。
　図１６は、移流集積ユニット５２を斜め上から拡大撮影した写真で、移流集積ユニット５２は、回転手段５１に載置されたチップ４０との間隔を保つための高さ調整手段５７に取り付けられている。高さ調整手段５７は、螺子等により移流集積ユニット５２の高さを調整できるものであれば特に制限は無い。移流集積ユニット５２のシース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４は、チップ４０のピラー３から２００～１０００μｍ離れた位置に位置するように配置されている。ピラー３と移流集積ユニット５２のシース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４との間隔が２００μｍ以下であるとサンプル液の導入量が減少し処理能力が低下し、１０００μｍ以上であるとメニスカス力が低下し十分な分離が得られない。また、移流集積ユニット５２を使用する際には、シリコン等のチューブ５８を介して、シース液注入口５２１はシース液インジェクション５５、サンプル注入口５２２はサンプルインジェクション５６、及びシース液吸引口５２６は図示しないシース液吸引装置に接続すればよい。
　シース液吸引手段は、チップ４０の平面部４１に当接してシース液を吸引できるものであれば特に制限は無い。例えば、布、コットン、スポンジ、セーム皮等のシース液吸引パッドを直接又は移流集積ユニット５２の孔５２５を介して平面部４１に当接してシース液を吸引すればよい。
　また、孔５２５にシース液吸引パッドを挿入する代わりに、孔５２５の幅を毛管力が発生する幅に調整し、孔５２５を平面部４１に当接することで、毛管力によりシース液を吸引してもよい。その場合、孔５２５の幅は、少なくともシース液と共に除去された微粒子を通過させる必要があることから、サンプルが全血の場合は少なくとも８μｍ以上、処理能力を上げるためには１０μｍ以上とすることがより好ましい。一方、孔５２５の幅は毛管力が発生すれば特に上限は無く、吸引するシース液量や毛管力等を考慮して適宜調整すればよく、例えば、２００μｍ程度の幅を設けてもよい。また、吸引するサンプル液、シース液が孔５２５に吸引されるためには、孔５２５を平面部４１に当接した際に隙間が生じる必要がある。そのため、例えば、孔５２５の両端、並びに平面部４１に当接した際にピラー３とは反対側の側面の高さを同じにしておき、孔５２５のピラー３側の側面のみ、他の部分より高さを低くしておけばよい。高さの差は、８μｍ以上が好ましく、１０μ以上がより好ましい。差の上限は毛管力が発生すれば特に上限は無く、吸引するシース液量や毛管力等を考慮して適宜調整すればよく、例えば、２００μｍ程度の差を設けてもよい。なお、チップ４０は上記実施形態に限定されず、例えば、平面部４１に換え、図１０に示すような段差部７を設け、移流集積ユニット５２の孔５２５がピラー３側になるように配置してもよい。また、平面部４１に換え、基板２の表面より低くなっている溝部を設け、溝部からサンプル液、シース液を吸引できるような大きさ及び配置となるように、移流集積ユニットを調整してもよい。
　シース液は、上記に例示した吸引手段による吸引の他、吸引ポンプ等の吸引装置を用い、該吸引装置に接続する吸引口を平面部４１に当接してシース液を吸引してもよい。なお、本発明においては、チップ４０の形状を問わず、シース液の流速は、シース液吸引手段の吸引力で調整する。そのため、微粒子の分離に使用するシース液量及びサンプル量が多くなり、シース液吸引パッド又は毛管力を発生させる孔が、シース液で飽和状態になるとシース液の吸引速度が安定しなくなるおそれがある。そのため、シース液の流速をより安定に保てるよう、上記のシース液吸引手段を組合せて用いてもよい。例えば、コットン等のシース液吸引パッドの一端をシース液に接触させてシース液を吸収しつつ、吸引ポンプ等の吸引装置を用いて、シース液吸引パッドの他端からシース液吸引パッドに吸収されたシース液を吸引してもよい。また、シース液を毛管力で吸引できる孔５２５の一端から毛管力によりシース液を吸引しつつ、前記孔５２５に連通する吸引口から吸引装置でシース液を吸引してもよい。更に、移流集積ユニット５２に前記孔５２５を設けず、シース液吸引ポンプ等の吸引装置に接続する吸引口を毛管力が発生する大きさ又は吸引口に吸引パッドを差し込み、前記吸引口を平面部４１に当接するようにしてもよい。
　図１７は、移流集積ユニット５２の側面からの写真で、孔５２５に、シース液吸引パッド５９を装着し、シース液吸引口５２６にシリコン等のチューブ５８を連結している状態を示す写真である。
　移流集積ユニット５２を構成する材料は、アクリル、ナイロン、テフロン（登録商標）等の樹脂、又はガラス等、サンプルやシース液と反応しないものであれば特に制限はない。移流集積ユニット５２は、ドリル及びエンドミル等の切削工具を用いた切削加工、又は移流集積ユニット５２の形状のモールドを作製し射出成形により作製することができる。なお、本発明における移流集積ユニット５２は、シース液注入口５２１、サンプル注入口５２２、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４、更に必要に応じて形成される孔５５及びシース液吸引口５６が含まれていれば、単一の部材で形成されていても、別々に作製した部材を組み合わせてもよい。
　微粒子抽出手段５３は、捕捉部位４で捕捉された微粒子を抽出できるものであれば特に制限は無く、例えば、細胞吸引手段を備えたマニピュレータ等が挙げられる。前記微粒子抽出手段５３は、捕捉部位４に捕捉された捕捉対象微粒子５を検出する検出手段と連動したマニピュレータにより自動的に回収できるようにすればよく、例えば、特開２０１０－２９１７８号公報に記載されているような細胞ピッキングシステムを用いることができる。また、検出手段としては、捕捉された微粒子がＣＴＣの場合、ＦＩＴＣやＰＥで標識された抗ＥｐＣＡＭ抗体等のＣＴＣ特異的な抗体を用いて蛍光染色したＣＴＣを観察できる蛍光顕微鏡等を用いることができる。また、光学顕微鏡を用いて明視野観察を行う場合には、パパニコロウ染色やギムザ染色を行うことで細胞内の核、細胞質等の形態的特徴を指標としてＣＴＣ検出を行うことが出来る。
　微粒子抽出手段５３で抽出した微粒子が核酸を含む生体材料で、抽出後にＰＣＲを行う場合は、ＰＣＲ手段５４に抽出した生体材料を移せばよい。また、ＰＣＲ手段は公知の装置を用いればよい。
　シース液平面部５２３とサンプル平面部５２４は半径方向の位置が異なるので、チップ４０を回転させた場合の両者の相対速度は異なるが、何れも、チップ４０との相対速度が５０～１５００μｍ／ｓの範囲となるようチップ４０を回転させることが好ましく、６０～１０００μｍ／ｓがより好ましい。５０μｍ／ｓより遅いと処理時間が長くなり処理能力が低下し、１５００μｍ／ｓより速いと捕捉対象微粒子５が捕捉されずに分離効率が低減する。なお、図１４に示すシステムでは、移流集積ユニット５２を固定しチップ４０を回転させているが、チップ４０を固定して移流集積ユニット５２を回転させてもよい。
　注入するサンプル液量は、ピラー３の高さ及びピラーの間隔により異なるものの、例えば、ピラー３の高さが３０μｍ、ピラー３の間隔が６μｍの略６角形の平面充填状態に形成したチップの場合、チップ４０の断面積０．７２ｍｍ2あたり、１．０～１０．０μｌ／ｓが好ましい。１．０μｌより少ないと処理時間が長くなり処理能力が低下し、１０．０μｌより多いと移流集積ユニットのサンプル平面部とチップの間にサンプルを保持できなくなり好ましくない。また、シース液は、吸引されるシース液の量と同じになるように注入すればよい。なお、上記断面積あたりのサンプル液及び／又はシース液量は、他の実施形態でも同様である。
　本発明の微粒子分離システムには、捕捉対象微粒子の捕捉効率を上げるための磁場発生装置及び／又は電場発生装置等を設けてもよい。例えば、捕捉部位４が形成されている部分に対応する回転手段５１の円盤部分を永久磁石等で形成してもよいし、円盤部分の下側に磁場発生装置として永久磁石又は電磁石を設置して磁場ポテンシャル場を発生させてもよい。ＥｐＣＡＭ抗体等を標識した磁性粒子を特異的に吸着させたＣＴＣ、又は磁性粒子を非特異的に吸着させたＣＴＣ（エンドサイトーシスから取り込む）等、捕捉対象微粒子に磁性を帯びさせた上で、本発明の微粒子分離用システムを用いると、磁性標識されていない他の微粒子から精度よく目的とする微粒子を分離することが可能である。
　また、捕捉部位に対応する円盤部分又は当該円盤部分の下側に、電場発生装置として電極を設けて電場ポテンシャル場（不均一電場中）を発生させ、ＣＴＣと周囲媒質の分極と電場の勾配により生じる静電気力（クーロン力）を用いてＣＴＣの捕捉をアシストすることも可能である。チップを回転しない場合は、捕捉部位４の下方に磁場発生装置及び／又は電場発生装置等を設ければよい。
　図１４に示す実施形態の微粒子抽出手段５３、ＰＣＲ手段５４、検出手段等は、図８及び１０に示す微粒子分離システムに適用してもよい。なお、図１０に示す実施形態に微粒子抽出手段５３、ＰＣＲ手段５４、検出手段を用いる場合、移流集積終了後、カバー板３１を取り除いた後に、微粒子抽出手段５３を用いればよい。
　図１８は、微粒子分離用システムの他の実施形態を示す図である。上記のとおり、図１０に示す微粒子分離システムに微粒子抽出手段５３、ＰＣＲ手段５４、検出手段を用いる場合、移流集積終了後、カバー板３１を取り除く必要がある。そのため、全てのサンプル液を流した後でないと捕捉対象微粒子５を回収することができず、例えば、癌細胞等の生きている細胞を捕捉する場合は、細胞が死滅する恐れがある。図１８に示す実施形態では、カバー板３１を、捕捉部位４の一部を覆う大きさとし、カバー板３１又はチップ１を移動することでメニスカスを発生させている。カバー板３１又はチップ１を移動させることで、メニスカスにより捕捉部位４に捕捉された捕捉対象微粒子５の上方は直ぐに開口状態となるので、捕捉対象微粒子５を、微粒子抽出手段５３により迅速にサンプリングすることができる。カバー板３１の移動速度は、図８に示すサンプル用薄板２１の移動速度と同じでよい。また、カバー板３１に、図示しない孔を設け、サンプル液、シース液を連続的に供給できるようにしてもよい。
　以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
＜実施例１＞
〔チップの作製〕
　先ず、シリコン基板をアセトン・エタノール・超純水の順に、４５ｋＨｚで５分間ずつ超音波洗浄機により有機洗浄し、１４５℃で２０分間ベイクした。次に、シリコン基板上にＳＵ－８をスピンコートし、ホットプレート上で、９５℃で３０分間、プリベイクした。次に、正六角形が隣接して平面充填状態となる捕捉部位を作製するためのクロムマスクを用い露光後、ホットプレート上で、９５℃で２分間、ポストエクスポージャーベイクを行い、ＰＭシンナーを用い現像した。現像後は、エタノールならびに超純水を用いリンスし、スピンドライヤー等で水分をとばし乾燥させ、鋳型を作製した。作製した鋳型を、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に転写し、転写後、両者を分離し、鋳型が転写されたＰＤＭＳをガラス板上に貼付した。その後、ＰＤＭＳ表面をプラズマ処理（周波数５０ｋＨｚ，出力７００Ｗ、３０秒間）により親水化し、チップを作製した。
　図１９は実施例１で作製したチップの外観を示す写真で、チップの大きさは縦５０ｍｍ、横３０ｍｍであった。また、捕捉部位が形成されている大きさは、縦２６ｍｍ、横２４ｍｍであった。
　図２０（１）は、捕捉部位の拡大写真で、ピラーの直径は約２０μｍ、ピラーとピラーの間隔は約６μｍ、ピラーの高さは約３０μｍ、捕捉部位の大きさは約３０μｍであった。
＜実施例２＞
　実施例１のクロムマスクに代え、ピラーとピラーの間隔が約７μｍとなるクロムマスクを用いた以外は、実施例１と同様の手順でチップを作製した。図２０（２）は実施例２で作製した捕捉部位の拡大写真である。
＜実施例３＞
　実施例１のクロムマスクに代え、ピラーとピラーの間隔が約８μｍとなるクロムマスクを用いた以外は、実施例１と同様の手順でチップを作製した。図２０（３）は実施例３で作製した捕捉部位の拡大写真である。
＜実施例４＞
〔血液サンプルの作製〕
　採取したヒト血液４０μｌにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を１６０μｌ添加したものに、１．１×１０4個の胃がん細胞株（ヒト胃がん由来の細胞株（ＧＣＩＹ－ＧＦＰ）をトリプシン処理でバラバラにしたもの）を懸濁し、がん患者の血液を模した血液サンプルを作製した。なお、がん細胞の平均粒径は２５μｍであった。
〔微粒子分離用システムの作製及び血液サンプルからのＣＴＣ分離実験〕
　図２１は、血液サンプルからのＣＴＣ分離実験に使用した微粒子分離システムを示しており、実施例１で作製したチップ１上に、ガラスで作製した縦２５ｍｍ、横３５ｍｍのカバー板３１、及び歯科用コットン（直径１０ｍｍ，長さ３０ｍｍ）を挿入した吸引ユニット３５（プラスチック製、外形：横３８ｍｍ、縦１８ｍｍ、高さ７ｍｍ、挿入部分：横３０ｍｍ、縦１０ｍｍ、深さ５ｍｍ）を配置した。図２２は、チップ１とカバー板３１の配置関係を示す側面写真で、チップ１とカバー板３１の先端との間隔ＤGは５００μｍ、チップ１とカバー板３１との角度φは、１０度となるようにマイクロステージで調整した。次に、チップ１とカバー板３１の先端部分に上記血液サンプル２００μｌを注入した。次に、チップ１を、図２１の上方の方向に、４０μｍ／ｓの一定速度で移動させた。なお、上記の移動速度は、サンプル２００μｌを、１．５分で分離できる速度である。サンプルを流す前にＧＣＩＹ－ＧＦＰの細胞数をカウントしておき、分離終了後に捕捉部位で捕捉されたＧＣＩＹ－ＧＦＰをカウントすることで、捕捉率を測定した。
＜実施例５＞
　実施例１で作製したチップに換え、実施例２で作製したチップを用いた以外は、実施例４と同様の手順で捕捉率を測定した。
＜実施例６＞
　実施例１で作製したチップに換え、実施例３で作製したチップを用いた以外は、実施例４と同様の手順で捕捉率を測定した。
　表１は、実施例４～６の捕捉率を示している。表１から明らかなように、捕捉対象微粒子５が変形しやすい細胞等の場合は、ピラーの間隔を狭くした方が好ましいことが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜実施例７＞
　カバー板の移動速度を、サンプル２００μｌを７分で分離できる速度にした以外は、実施例４と同様の手順で捕捉率を測定した。
＜実施例８＞
　カバー板の移動速度を、サンプル２００μｌを３．５分で分離できる速度にした以外は、実施例４と同様の手順で捕捉率を測定した。
＜実施例９＞
　カバー板の移動速度を、サンプル２００μｌを１分で分離できる速度にした以外は、実施例４と同様の手順で捕捉率を測定した。
　図２３は、実施例４及び実施例７～９の捕捉率を示すグラフである。図２３から明らかなように、２００μｌのサンプルを１分で分離できる速度でチップ１を移動した場合であっても、８０％を超えるＧＣＩＹ－ＧＦＰの細胞数を捕捉することができた。なお、図２４に示す、従来の微粒子分離用マイクロ流路チップ（特願２０１２－２２７７１７号の実施例１で作製。縦３０ｍｍ、横３０ｍｍ。補足部位は略８角形で、対角線の長さは約３０μｍ、深さは約３０μｍ。マイクロ流路は、幅は約１０μｍ、補足部位における流路の深さは約２０μｍ、補足部位以外の流路の深さは約５０μｍ、流路と流路の中心間距離は約６０μｍ。）を用いた微粒子分離システムを用いた場合、実用的なサンプルの分離能力は、１０μｌ／ｍｉｎであった。したがって、従来の微粒子分離用マイクロ流路チップと比較して、本発明のチップを用いることでスループットを約２０倍程度向上することができた。
　本発明のチップを含む微粒子分離用システムを使用することで、サンプル中のサイズの異なる微粒子を、抗体等を用いることなく迅速かつ高効率で分離することができる。したがって、全血からのＣＴＣの分離等、臨床の場において非常に有効であることから、病院や救急センターなどの医療機関や大学医学部などの研究機関、教育機関において、がん診断のシステムとして利用が可能である。

Claims (23)

  1. 　基板、及び少なくとも３本以上のピラーを含み、
    　一端が前記基板上に設けられ、他端が上方に開放した少なくとも３本以上のピラーで捕捉対象微粒子を捕捉するための一つの捕捉部位を形成し、
    　捕捉対象微粒子の大きさをＸ、除去される微粒子の大きさをＹとした場合、一つの捕捉部位を形成する任意の隣り合うピラー同士の間隔ＺはＹ＜Ｚ≦Ｘであり、
    　一つの捕捉部位を形成する少なくとも３本以上のピラーは、捕捉部位に捕捉された捕捉対象微粒子が任意の隣り合うピラーの間から流出しない位置関係に配置されていることを特徴とする微粒子分離用チップ。
  2. 　前記任意の隣り合うピラー同士の間隔Ｚが、０．８Ｙ＜Ｚ≦０．８Ｘ、Ｙ＜Ｚ≦０．８Ｘ、又は０．８Ｙ＜Ｚ≦Ｘから選択される１種であることを特徴とする請求項１に記載の微粒子分離用チップ。
  3. 　前記捕捉部位が複数形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の微粒子分離用チップ。
  4. 　前記複数形成されている捕捉部位同士が隣接して配置され、隣接する捕捉部位がピラーを共有していることを特徴とする請求項３に記載の微粒子分離用チップ。
  5. 　前記捕捉部位が、多角形の平面充填状態で配置されていることを特徴とする請求項４に記載の微粒子分離用チップ。
  6. 　前記多角形が、正３角形、正方形、正６角形から選ばれる一種であることを特徴とする請求項５に記載の微粒子分離用チップ。
  7. 　前記捕捉対象微粒子がＣＴＣで、除去される微粒子が血球細胞であることを特徴とする請求項１～６の何れか一項に記載の微粒子分離用チップ。
  8. 　前記基板が多角形又は円形状で、基板の外周には段差部が形成されていることを特徴とする請求項１～７の何れか一項に記載の微粒子分離用チップ。
  9. 　前記基板が多角形で、基板の外周にはピラーが形成されていない平面部が形成されていることを特徴とする請求項１～７の何れか一項に記載の微粒子分離用チップ。
  10. 　前記基板が円形状で、基板の外周にはピラーが形成されていない平面部が形成されていることを特徴とする請求項１～７の何れか一項に記載の微粒子分離用チップ。
  11. 　請求項１～１０の何れか一項に記載されている微粒子分離用チップ、サンプル液用薄板、シース液用薄板、シース液を吸引する吸引手段及び／又は吸引装置を含むことを特徴とする微粒子分離用システム。
  12. 　請求項１～１０の何れか一項に記載されている微粒子分離用チップ、カバー板、吸引手段及び／又は吸引装置を含むことを特徴とする微粒子分離用システム。
  13. 　横溝及び該横溝に連通する吸引孔を含む吸引ユニットを更に含むことを特徴とする請求項１１又は１２に記載の微粒子分離用システム。
  14. 　横溝及び該横溝に連通する吸引孔を含む吸引ユニットであって、前記横溝を挟む２つの側面の一方の側面が、前記吸引ユニットの両端部及び他の側面より短くなるように形成されていることを特徴とする吸引ユニット。
  15. 　前記横溝が、毛管力により液体を吸引できる幅であることを特徴とする請求項１４に記載の吸引ユニット。
  16. 　前記横溝が、吸引手段を挿入できる幅であることを特徴とする請求項１４に記載の吸引ユニット。
  17. 　請求項１０に記載されている微粒子分離用チップ、
    　シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニット、
    　前記微粒子分離用チップを回転させる回転手段、及び
    　シース液を吸引する吸引手段及び／又は吸引装置、
    を少なくとも含む微粒子分離用システム。
  18. 　前記移流集積ユニットが、シース液吸引パッドを装着する孔及びシース液吸引口を更に含むことを特徴とする請求項１７に記載の微粒子分離用システム。
  19. 　前記移流集積ユニットが、シース液を毛管力で吸引する孔及びシース液吸引口を更に含むことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の微粒子分離用システム。
  20. 　請求項１～１０の何れか一項に記載されている微粒子分離用チップとサンプル液用薄板の間にサンプル液を注入し、微粒子分離用チップとシース液用薄板の間にシース液を注入し、微粒子分離用チップとサンプル液用薄板及びシース液用薄板を相対移動させることで発生するメニスカスにより、捕捉対象微粒子は前記微粒子分離用チップに設けられた捕捉部位に捕捉され、除去される微粒子は吸引手段及び／又は吸引装置により吸引されたシース液により微粒子分離用チップから除去されることを特徴とする微粒子分離方法。
  21. 　請求項１～１０の何れか一項に記載されている微粒子分離用チップとカバー板の間にサンプル液を注入し、吸引手段及び／又は吸引装置で前記サンプル液を吸引することで発生するメニスカスにより、捕捉対象微粒子を前記微粒子分離用チップに設けられた捕捉部位に捕捉することを特徴とする微粒子分離方法。
  22. 　前記サンプル液を吸引した後に、微粒子分離用チップとカバー板の間にシース液を注入し、吸引手段及び／又は吸引装置で前記シース液を吸引することで、残存している除去される微粒子を洗い流すことを特徴とする請求項２１に記載の微粒子分離方法。
  23. 　請求項１０に記載されている微粒子分離用チップを、該微粒子分離用チップを回転させる回転手段上に載置し、
    　前記微粒子分離用チップ上に、シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニットを配置し、
    　前記回転手段を回転させながら、前記シース液注入口からシース液を注入し、前記サンプル注入口からサンプルを注入することで前記微粒子分離用チップとシース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を相対移動させ、相対移動により発生したメニスカスにより目的とする微粒子を前記微粒子分離用チップに形成された捕捉部位に捕捉し、
    　シース液吸引手段及び／又は吸引装置によりシース液を吸引することで、除去される微粒子をシース液とともに微粒子分離用チップから除去することを特徴とする微粒子分離方法。
     
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10717084B2 (en) * 2015-11-09 2020-07-21 Georgia Tech Research Corporation Microfluidic devices for cellular sorting
US10253350B2 (en) 2016-09-20 2019-04-09 International Business Machines Corporation Separation of molecules using nanopillar arrays
WO2019113379A1 (en) * 2017-12-06 2019-06-13 California Institute Of Technology System for analyzing a test sample and method therefor
CN111615630B (zh) * 2018-02-16 2023-09-15 阿斯特瑞格诊断公司 微流体装置
JP7311870B2 (ja) * 2018-06-01 2023-07-20 学校法人 中央大学 粒子分離用装置及び粒子分離方法
US20220228190A1 (en) * 2019-05-01 2022-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Massively parallel on-chip construction of synthetic microbial communities
JP2024071067A (ja) * 2022-11-14 2024-05-24 東京応化工業株式会社 ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09504362A (ja) * 1993-06-08 1997-04-28 ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・ユーエスエイ・インコーポレーテッド 巨大分子及び細胞の分画用のマイクロリソグラフ配列
JP2001296219A (ja) * 2000-02-09 2001-10-26 Aloka Co Ltd サンプル処理装置
JP2003315349A (ja) * 2001-12-20 2003-11-06 Samsung Electronics Co Ltd カーボンナノチューブを含むバイオチップ及びそれを用いて試料を分離する方法
JP2004045357A (ja) * 2001-08-03 2004-02-12 Nec Corp 分離装置およびその製造方法
JP2008539711A (ja) * 2005-05-03 2008-11-20 オックスフォード・ジーン・テクノロジー・アイピー・リミテッド 個々に細胞を解析するための装置及び方法
JP2012530246A (ja) * 2009-06-10 2012-11-29 シンベニオ・バイオシステムズ・インコーポレーテッド シース流装置及び方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6027623A (en) * 1998-04-22 2000-02-22 Toyo Technologies, Inc. Device and method for electrophoretic fraction
US6451264B1 (en) * 2000-01-28 2002-09-17 Roche Diagnostics Corporation Fluid flow control in curved capillary channels
US6881315B2 (en) 2001-08-03 2005-04-19 Nec Corporation Fractionating apparatus having colonies of pillars arranged in migration passage at interval and process for fabricating pillars
CA2500392C (en) * 2002-09-27 2012-11-27 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and uses thereof
IT1391408B1 (it) * 2008-10-02 2011-12-23 Silicon Biosystems Spa Camera di separazione
EP2995953B1 (en) * 2009-03-24 2017-11-29 Biocept, Inc. Devices and methods of cell capture and analysis
JP5704590B2 (ja) 2010-02-05 2015-04-22 国立大学法人東京農工大学 サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた循環腫瘍細胞の検出
US9968932B2 (en) * 2012-10-15 2018-05-15 National University Corporation Nagoya University Microchannel chip for microparticle separation, microparticle separation method and system for microparticle separation using chip

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09504362A (ja) * 1993-06-08 1997-04-28 ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・ユーエスエイ・インコーポレーテッド 巨大分子及び細胞の分画用のマイクロリソグラフ配列
JP2001296219A (ja) * 2000-02-09 2001-10-26 Aloka Co Ltd サンプル処理装置
JP2004045357A (ja) * 2001-08-03 2004-02-12 Nec Corp 分離装置およびその製造方法
JP2003315349A (ja) * 2001-12-20 2003-11-06 Samsung Electronics Co Ltd カーボンナノチューブを含むバイオチップ及びそれを用いて試料を分離する方法
JP2008539711A (ja) * 2005-05-03 2008-11-20 オックスフォード・ジーン・テクノロジー・アイピー・リミテッド 個々に細胞を解析するための装置及び方法
JP2012530246A (ja) * 2009-06-10 2012-11-29 シンベニオ・バイオシステムズ・インコーポレーテッド シース流装置及び方法

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