JP2012530246A - シース流装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2A
Description
本出願は、2009年6月10日に出願された米国仮特許出願No.61/185,919、2010年3月12日に出願された米国仮特許出願No.61/313,625及び2010年6月10日に出願された米国特許出願No.12/813,285に基づく優先権を主張するものであり、前記各出願の内容は、参照することにより、その全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。
他に規定しない限り、本発明に関連して用いられる科学用語や専門用語は、当業者が一般的に理解している意味で用いられるものとする。
本出願において、「単数」で表わすものは、特に明記しない限り、「複数」も含むものとする。本出願において、 1つを意味する単語「a」又は「an」は特に明記しない限り「少なくとも1つ」を意味する。あるリストを挙げた後に「のうちの少なくとも1つ」と記載した場合には、リストの中の1つ以上の項目を意味し、リストにあるすべての項目が存在する必要があることを意味するものではない。単語「又は」は、特に明記しない限り「及び/又は」を意味する。多項従属クレームの場合、「又は」という表現は、2つ以上の先行する独立項又は従属項を選択肢として言及するものである。さらに、「備える」「有する」「含む」等を意味する単語「comprising」及びその変化形である「comprises」「comprised」は、非限定的な用語である。また、「(構成)要素」や「成分」を意味する単語である「element」や「component」は、特に明記しない限り、1つのユニットを含む要素や成分と複数のユニットを含む要素や成分との両方を包含する。「当業者(skilled practitioner)」という用語を用いる場合、特に明記しない限り、対象となる内容に関係する分野の通常の技術者を意味する。
(マイクロ流体工学を含む)流体力学を説明する様々な用語は、通常の専門用語の意味で用いられる。
本明細書で時に応じて用いる「部分(moiety)」は「部分(portion)」を意味するが、1つの粒子に言及する時にも用いる。「粒子」は輸送及び特性に関してユニット全体として作用する小さな物体を意味する。「被分析物」という用語は、「部分(moiety)」でも「粒子」でもよく、通常用いられる意味で用いられ、分析過程において、存在するか否かの検出対象又は特性の測定対象となる物質を意味する。
核酸やタンパク質等、特定の範疇の分子を議論する場合には、自然に発生する分子の類似型や異性体型等の合成型も含まれる。特に明記しない限り、所望の機能特性が維持されている限り、変性型も同様に包含される。たとえば、CD34細胞表面たんぱく質に選択的なアプタマーには、化学誘導体(たとえば、ペグ化、プロフォーム(pro-form)の形成、酵素やリボゾーム等の別の活性部分(moiety)を用いた誘導体化)が含まれる。
本発明の実施及び利用を目的として、全体的な装置の構成、材料、製造システム、計装システム及び用途に関する考察を行なう。実施例を含む所定の実施形態を説明し、理論的実験例に関しても説明する。
本発明のシース流装置は、(本明細書で説明するように、固体表面との接触がなくなっても)1つの流体層が別の流体層に接触すればシース流として持続する層流を固体表面上に形成するという原理に従って構成される。本発明のシース流装置は、平行な層流の流路平面内で隣接する流体と流体接触する上流側に層流を形成することに利用可能な固体表面を有するものであれば、いかなる構成や構造でもよい。
本発明の装置は、流体力学及び流体の特性を考量して、任意のサイズにスケーリング可能である。一つの実施形態において、本発明の装置を、マイクロ流体回路に合わせてスケーリングしてもよい。他の実施形態において、本発明の装置を1リットルスケール又は数リットルスケールでの使用に適した構成としてもよい。
本明細書で用いられる「流体層」という用語は、実質的に乱流を生じさせることのない個別の流体流路平面を意味する。「流体層」は、固体表面上の層流でもよいし、平行な平面内で隣接する又は当接する流体層に関するシース流でもよい。
一般的態様において、本発明は、少なくとも3つの個別の、順次境界を接する流体層流層を含む装置(及び関連する方法及びシステム)を提供する。層流の流路は、互いに隣接し、互いに平行になるように、順次配置される。各層流の流路は、他の層流の流路と平行で、かつ、流路に対して垂直な方向に層状に重ねて形成される。
流体層の数に関連して、各流体層の厚み(又は深さ)も重要である。当業者であれば、装置の構成及び用途に加えて、流体特性により流体層の厚みが決まることが理解されよう。
一般的に、本発明のシース流装置は、単純に流体を収容したり貯蔵したりする以上の特定の用途が達成されるように流体を移動させる機能を果たす。
一般的に、全体の構成と材料とに基づき、本発明のシース流装置は、物質の流入及び流出を可能にする少なくとも1つのアクセスポートと、流体を収容する少なくとも1つの貯留部と、を備える。流体(や他の物質の)流入や流出に用いられるアクセスポートを、システム全体の一部として、他の装置や機器と共に作動するように構成してもよい。
本発明の装置は、さらに、流体を収容し、流体上で所定の機能を果たす少なくとも1つの貯留部を備える。貯留部は、機能的な役割を果たすものでもよいく、この機能を果たすためにさらなる構造要素を備えるものでもよい。たとえば、培養された細胞が必要な場合には、(以下に限定されるものではないが)たとえば、エアレーション装置、ミキサー、温度制御装置等、適当な細胞培養装置を貯留部と一体化させたものでもよい。これらの装置を、本発明のシース流装置の一部として形成してもよいし、(シース流を機器に操作可能に接続した場合に)装置を一時的に取り付けて、関連処理機器の一部としてもよい。機能を果たすシステム内で操作可能なように、貯留部を適合させるようにしてもよい。
一定量の供給及び測定用に、あるいは、連続フロー用に、本発明の装置を構成する又は適合させるようにしてもよい。本発明の装置を、(細胞溶解とタンパク質単離等)多重機能用に構成してもよい。本発明の装置を、一段又は多段処理又はアッセイ用に構成してもよいし、試薬貯蔵用に構成してもよい。本発明の装置を、ろ過機能を持つように構成する又は適合させるようにしてもよい。
機能要素の集積は、様々な方法で実施可能である。一般に、すべての組み合わせで、流れチャネルを介して、アクセスポートと貯留部とを流体的に接続可能である。流れチャネルは、所望の種類の流れに適合するように、また、所望の流体の動きを可能にするような任意の寸法で、形成可能である。
たとえば、(洗浄剤を含有する又は含有しない)水性緩衝液、アルコール(メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等)、有機溶剤(ヘキサン、フッ化炭素、芳香族化合物等)又はこれらの組み合わせと共に用いるように、本発明の装置を構成する又は適合させるようにしてもよい。ある実施形態において、これらの流体は、シース流流体として機能するものでもよい。
本発明の装置は、1つ以上のプリント基板、互いに噛み合う電極、スパッタ又はスクリーン印刷電極、又はキャパシタンス・アレイを備えるものでもよい。たとえば、高分子材料状に回路基板を予め準備して、本発明のシース流装置の製造に用いるようにしてもよい。これらの構成要素を、トラップステーション及び/又は様々な前処理及び後処理モジュール又はステーションの駆動を指示する関連論理回路で制御するようにしてもよい。
本発明の装置の最も有望な用途の1つは、粒子選別であり、多くの方法で、粒子選別を行なうことができる。磁力、音響的な力、磁気泳動力又は光学的な力等の制御可能な力を用いて、流体に懸濁されている応答粒子を動かすことができる。
光学検出が可能になるように、本発明の装置を構成してもよい。実際に適用する場合には、たとえば、測色であれば、蛍光検出可能な又は発光検出可能なマーカーが望ましい。他の光インターフェースとしては、光ファイバー、表面プラズモン共鳴、減衰全反射やその他の光学インターフェースが挙げられる。
(オートクレーブ等他の滅菌法に対する選択された材料の耐久性を考えて、たとえば、酸化エチレンを用いて)本発明の装置を滅菌するようにしてもよい。細胞培養要件に対する表面適合性や、選択された材料や構成にさらなる表面エネルギーを有するものでもよい。本発明の装置は、たとえば、ガス透過性のあるものでもよい。表面への非特異的結合を最小限に抑えるために、ケイ素等で内側を被覆するようにしてもよい。
上述の原理に基づいて、シース流と磁場選別の両方を可能にする様々な構造を考えることができる。ある実施形態において、磁場選別は、トラップモードで、外部磁場を印加した後、非標的種と標的種とを順次溶出させる。すなわち、磁性粒子が付着した種を適当な位置に保持すると共に、付着していない種を溶出させる。この最初の溶出ステップが完了後、磁場にとらえられ、溶出されなかった種を、溶出及び回収できるように、何らかの方法で放出させる。
一般に、層流形成面を備える構成を実現可能な方法により、本発明の装置及び関連機器を製造することができる。
本発明の装置及び方法を、ホスト機器と連動して働くように、又は、システム要件を満たすように、適合させる、又は、構成するようにしてもよい。このような適合又は構成の例としては、(以下に示すものに限定されるものではないが)、1つ以上の真空供給、ポンプ及びバルブの自動制御、圧力流、サンプル充填用の注入ループ、温度制御、電気浸透流、容積型ポンプ機能、予想体積流量、遠心力処理、湿度制御及びガス交換制御等が挙げられる。
シース流装置において、選別の「上流側」すなわち、選別の前に、さまざまな処理を実施するようにしてもよい。このような処理の例として、標的の標識化、細胞の溶解及びディプリーションが挙げられる。標識化は、後述するように、特異的な結合部分(moiety)を有する磁性粒子をサンプルの標的成分又は非標的成分に結合させることを意味する。溶解は、細胞膜又は細胞壁を破壊して、サンプル内に細胞成分(オルガネラ(細胞小器官)、生体分子等)を放出させることを意味する。ディプリーションは、分離前に、サンプル内の特定の1つ又は複数の成分を除去することを意味する。ディプリーションの例としては、音波等の手段でサンプルから赤血球を除去する処理が挙げられる。オンチップ又はオフチップで実行可能な他の前処理操作には、染色、固定化、又は、細胞内への外来物質の導入を行なうための様々な化学手段が含まれる。
シース流装置において、選別後に様々な処理を実行するようにしてもよい。これらの処理は、選別ステーション内で実施するものでもよいし、選別ステーションの下流側で実施するものでもよい。このような処理には、一般的に、標的種の定量(たとえば、細胞の計数処理)、標的種に関する分子情報の抽出(たとえば、特定のSNPの存在/不存在)、及び/又は、細胞由来生成物の抽出(たとえば、捕捉された幹細胞の分化型)が含まれる。好適な処理の例としては、光学的な方法による標的種の直接的検出、アッセイ、捕捉した細胞又はウィルスの成長、標的種の形質転換(たとえば、捕捉した幹細胞の分化)、発現パターンのプロファイリング及び遺伝的特性評価が挙げられる。発現プロファイル及び/又は遺伝子配列の特性評価を行なうために利用可能な所定のツールとして、mRNAアレイ等のマイクロアレイや、ハイスループット・シークエンシング・ツールがある。詳細に関しては、(上述の)PCT特許出願No. PCT/US2009/040866に記載されている。
上述したように、本発明のシース流装置は、広範囲に適用可能である。磁性粒子で標識した様々な種類の標的種の捕獲及び分離に用いることができる。したがって、本発明のシース流流体装置を、たとえば、体液サンプルの調製及び分析、希少分子又は細胞の分離、化学物質ライブラリーのスクリーニング、臨床検査室におけるポイントオブケア(POC)診断、環境試験及びモニタリング、消費者製品及び食物の品質管理等、さまざまな用途に用いることができる。本発明は、学術分野、産業分野及び臨床分野で特に有用である。学術、産業及び臨床分野において、本発明のシース流装置は、特に、試験や特性評価に加えて、細胞株、タンパク質及びmRNAの増幅、遺伝子コード、分子署名プロテオミクス等、その他処理を行なうための細胞株、タンパク質、遺伝物質等の単離に有用である。シース流装置及び方法を、たとえば、血液サンプルからのCTC単離による癌の診断等、病気の早期発見及び診断に用いることができる。臨床分野での用途としては、臨床試験候補を選出するための潜在患者集団のスクリーニング、及び/又は、治療効果の情報及び/又は今後の治療計画を策定するための情報を得るために行なう、既に臨床試験に登録している患者の体液の検査、補助療法や最新補助療法の有効性の測定などがある。具体的な例を、以下で説明する。
本発明のシース流装置を、これに限定されるものではないが、たとえば、分子ライブラリーのスクリーニング等、科学研究に広範囲に用いることができる。たとえば、本発明の装置をアプタマーライブラリーのスクリーニングに用いることができる。具体的には、本発明の装置でタンパク質の生成及び単離を行なった後、同じ1つの装置内で、タンパク質をアプタマーライブラリーと照合する。本明細書で用いる「アプタマー」という用語は、最も広い意味で用いられ、特定の標的分子に結合するオリゴ核酸又はペプチド分子及び模倣分子等の関連合成分子を意味する。本発明のシース流装置を、アプタマーライブラリー、リボゾームライブラリー、ファージ・ディスプレイ、バクテリアペプチド・ディスプレイ、酵母菌ディスプレイ等の分子又は細胞ライブラリー選別を利用するバイオマーカー(生体指標)/創薬プラットフォームに用いることもできる。さらに、本発明のシース流装置を、細胞の計数、分類、増幅、分化等を含む様々な評価を行なう目的で標的細胞を単離するために用いることもできる。
化学物質の危険性モニタリングや、核酸分析(及び、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた増幅)や、閉鎖環境モニタリング、個人レベルのゲノミクス及び診断、生理環境に供給するのに適したウィルス外被やその他ナノケージ内に包含したアプタマー治療薬の合成やその他の化学物質合成等の化学合成など、特定条件の連続モニタリング等、様々な生物学的又は化学的モニタリング、合成又は分析を目的として、本発明を構成する、又は、適合させるようにしてもよい。家庭用の用途としては、たとえば、pH指示薬、金属指示薬やその他の水質指示薬を用いて、プールや飲料水の水質モニタリングを行なうようにしてもよい。生物医薬品生産工程におけるバイオリアクターのモニタリング等の生産工程管理や食品産業に適するように、本発明の装置を構成する、又は、適合させるようにしてもよい。また、流体制御や分析、ガス制御や分析に適するように、本発明の装置を構成する、又は、適合させるようにしてもよい。たとえば、連続フロー用に本発明の装置を適合させることにより、細胞を選別する速度のモニタリングを行なうことができる。さらに、供給連鎖モニタリング等、生産品質管理に適するように、本発明の装置を構成するようにしてもよい。本発明のシース流装置は、高い選択性で液体サンプルから標的種を捕捉できるため、たとえば、複数種の高度な複合混合物の流体生体サンプルから標的種を高い純度で単離する必要がある治療薬分野等では、多くの従来システムに比べて大きな利点がある。
プレフィル式オンチップキット
本発明の一つの態様は、製造の容易さや使い勝手を考えて、特定の目的に有用な試薬を予め充填した(プレフィル式)シース流装置である。たとえば、生体サンプルの調製に有用な試薬を装置に予め充填する(プレフィルする)ようにしてもよい。この「オンチップキット」型の態様のシース流装置を、上述した様々な用途に適合させることができる。
オンチップキット型の構成を独立して用いることもできるし、本発明のシース流装置を含む集積システムの少なくとも一部として用いることもできる。本発明のシース流装置の「上流側」又は「下流側」に別の処理モジュールやチャンバを加えるようにしてもよい。たとえば、誘導体化や他の反応を行なうための所望の高分子物質やその他の物質を収容する貯蔵部を設ける等、適当な発現後修飾流体回路を設けるようにしてもよい。具体的な例としては、本発明のシース流装置を、培養した細胞からタンパク質を発現させる流体回路を備える構成として、必要に応じて、対象タンパク質を誘導体化できるペグ化モジュール等、発現したたんぱく質を誘導体化するための追加モジュールを備えるようにしてもよい。
細胞捕獲及び処理
上述したように、本発明のシース流装置は、様々な生体物質の成分の培養、精製若しくは単離又は様々な生体物質の解析に特に有用である。特定の態様において、細胞溶解、ビーズを用いた置換アッセイ、かん流、ろ過、サンプル調製、走化性、全血分離及び様々な他の処理に適するように、本発明の装置を構成する又は適合させるようにしてもよい。
幹細胞処理は、ヒト疾患の様相を変化させて、苦痛を軽減する可能性があるものと医学研究者たちは考えている。自己再生を行なって新しい幹細胞集団を形成するという幹細胞の特性により、拒絶や副作用のリスクなしに、体内の疾患組織や損傷組織の修復及び/又は交換(標的細胞集団に分化させることにより)を実現するという大きな可能性がある。医学研究者たちは、成体幹細胞及び胚性幹細胞技術を用いた、癌、代謝異常、心不全、筋損傷及び神経疾患の治療に期待をかけている。幹細胞治療が有望であると考えられている具体的な疾患には、脳損傷、癌、脊髄損傷、心臓障害、造血、はげ頭、歯の欠損、難聴、失明及び視覚障害、筋委縮性側索硬化症、移植片体宿主拒絶反応、クローン病、神経及び行動の先天性異常、糖尿病、整形外科的障害、傷治療及び不妊症が挙げられる(The Leading Edge of Stem Cell Therapeutics(最先端の幹細胞治療) Singec Iら、Annu. Rev. Med. 58: 313-328, 2007年参照)。
癌による死亡の大部分は、血行性転移拡散及び全身の組織内での腫瘍細胞の増殖に起因するものである。腫瘍由来の生存上皮細胞、循環腫瘍細胞すなわちCTCは、癌患者の末梢血内で同定され、難治性の転移性疾患の原因であると考えられる(Nagrath, S.ら、Isolation of Rare Circulating Tumour Cells in Cancer Patients (癌患者における希少循環腫瘍細胞の単離)Microchip Technology, Nature, Vol 450: 20/27, 1235-1240, 2007参照)。したがって、CTCの研究は、早期転移拡散の生物学(機構)と高い関連性があり、顕性転移のある患者において診断のための強力な情報源となる(Pantel, K.ら、 Detection, Clinical Relevance and Specific Biological Properties of Disseminating Tumour Cells, (播種腫瘍細胞の検出、臨床的関連及び特定の生物学的特性)Nature Reviews, Vol. 8: 329-40, 2008参照)。さらに、癌患者の血液からのCTCの分子解析を行なうことにより、治療過程で腫瘍遺伝子型の変化をモニターすることが可能になる(Detection of Mutations in EGFR in Circulating Lung-Cancer Cells(循環肺癌細胞におけるEGFR変異株の検出)、Maheswaran, S.ら、N Engl J Med, 359:366-77, 2008参照)。単純な採血等により得られた液体サンプルを用いる方法は、非血液癌の検出、特性評価及びモニタリングの情報源として、侵襲的な生検と比べて大きな利点がある。
本発明の一つの実施形態は、流体分離装置であって、(a)流体分離装置内にサンプル流を形成するように構成される少なくとも1つのサンプル流入チャネルと、(b)流体分離装置内でサンプルの流れの周囲にシースを形成する1つ以上の流体の流れを与えることにより、装置に対するサンプルの成分の非特異的結合を抑制するように構成される少なくとも1つのシース流流入チャネルと、(c)サンプル流入チャネルとシース流流入チャネルとに流体連結される選別ステーションであって、サンプル流の流路に沿って配置される選別ステーションと、(d)外部磁場と相互に作用して、選別ステーション内の傾斜磁場を変化させることにより、サンプル流から磁性粒子を偏向させる、及び/又は、捕捉する傾斜磁場発生部と、を備える。一つの実施形態において、磁性粒子は、選別ステーションにより捕捉される。
以下、実施例及び理論的実験例を説明する。実施例1は、複合血液サンプルから希少細胞を磁気泳動選別する本発明の装置を示す。実施例2は、本発明のオンチップキットの実施例を示す。実施例3ないし7は、サンプル流体の一部が生物製剤又は化学薬品である実施例を示す。実施例8及び9は、本発明の装置を、モニタリング、具体的には、各々、環境プロセス及び生物医薬品製造のモニタリングに用いた実施例を示す。実施例10は、本発明の装置をポイントオブケア(POC)診断に用いた実施例を示す。実施例11は、ヒトの臍帯血サンプルから得た造血前駆細胞(HPC)の濃縮比較を示す。
この実施例は、本発明のシース流装置が、磁気泳動トラップステーションへの非標的血液細胞の非特異的結合を実質的に防ぐ流体層を形成する様子を示す。
これは理論的実験例である。所定の流体回路に従って、本発明のシース流装置を製造する。所定の貯蔵部に所望の流体を予め充填する(プレフィルする)自動流体供給機器を用いて、この装置を製造する。貯蔵部を密閉(シール)するが、ここで、プレフィル貯蔵部の一部のシールが所定の張力によって破れて、内部の流体が別の貯蔵部と流体連結されるように構成する。複数の貯蔵部を特定の目的に合わせてプレフィルし、流体回路により、空気力等、適当な力を印加して、流体を所定の領域に流す。流体が貯蔵部から出て、図1及び図2を参照して上述したように所定の流体回路の一部である本発明の装置に流入することにより、本発明のシース流が形成される。一例において、自動機器は、空気ピストンを用いて、装置の流体回路に合わせた所定の時間的パターンで力を印加して、シース流を形成する。
これは理論的実験例である。本発明のシース流装置を、個体から採取した体液からバイオマーカーを選別する流体回路を備えるように構成する。バイオマーカーの存在は、特定の病態であることを示す。バイオマーカーは細胞、タンパク質、核酸又はこれらのいずれかの分解生成物から選択される。病態は、癌、神経疾患及び感染症の中から選択される。癌バイオマーカーは、循環腫瘍細胞、タンパク質及び核酸の中から選択される。神経疾患バイオマーカーは、細胞、これに限定されるものではないがAβ(1−42)(アミロイドβペプチド42)タンパク質又はそのフラグメント(断片)若しくはオリゴマーを含むタンパク質、又は、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS又はルー・ゲーリック病)、認知症、多発性硬化症及びプリオン病から選択される神経疾患用の他のバイオマーカーから選択される。感染症用のバイオマーカーは、感染性病原体及び二次病原体又は有害な効果のある検出可能なマーカーから選択され、以下に限定されるものではないが、ウィルス、バクテリア、真菌、プリオン及び他の感染性病原体を含む。ウィルスは、たとえば、HIVウィルス、(あらゆる型の)肝炎ウィルス、(あらゆる型の)インフルエンザウィルス、あらゆる型のパピローマウィルス(HPV)、狂犬病ウィルス又はその他のウィルス感染性病原体でもよい。バイオマーカーは、上記の生命体や感染性病原体の一部でもよい。たとえば、バイオマーカーは、ウィルス外被に関係するたんぱく質でもよい。
これは理論的実験例である。本発明のシース流装置を、アプタマーを用いて流体サンプルに含まれる希少分子を検出する流体回路を備えるように構成する。アプタマーは、検出可能なマーカーと関連付けられたものでもよい。アプタマーを、アプタマーが標的種に結合する条件下で、流体懸濁液にさらす。アプタマー及び標的種は、本発明のシース流装置の貯蔵部内に設置されるトラップステーション内に捕捉される。非標的物質は、トラップステーションからアプタマー/標的種を取り除くのには不十分な空気力(又は他の力)により流体(たとえば、バッファー)と共に洗浄除去される。この理論的実験例を用いて、たとえば、尿、血液又は他の体液中の物質を検出することができる。たとえば、尿に含まれる微量のコカインやその他の不法に摂取された薬剤を検出することができる。たとえば、参照することによりあらゆる目的で本明細書に組み込まれる、Swensen, J. S.ら、Continuous, real-time monitoring of cocaine in undiluted blood serum via a microfluidic, electrochemical aptamer-based sensor. (マイクロ流体電気化学アプタマーセンサーを用いた不希釈血清中に含まれるコカインの連続的なリアルタイムモニタリング) J. Am. Chem. Soc. doi:10.1021/ja806531z (2009)を参照のこと。
これは理論的実験例である。本発明のシース流装置を、薬物に関して、非合法か否かや、その存在や用量を含めた(ヒトや動物等の)個体のモニタリングを行なう流体回路に合わせて、構成する。本発明の装置を、医学的に処方された用量、薬物動態、体や脳の能力向上、非合法(メタンフェタミン、コカイン、マリファナ(カンナビノイド))やグルコース(インスリン)等の内分泌関連物質を検出又はモニタリングするように構成してもよい。たとえば、本発明のシース流装置を、血液や尿等の体液に含まれる医薬品又は医薬品分解又は下流代謝製剤の検出に適した試薬を予め充填した(プレフィルした)貯蔵部(又はチャンバ)を備えるように構成する。シース流装置を、血液(等の)サンプルを貯蔵部に供給した後、適当な試薬をプレフィルした貯蔵部を手動張力等の力を印加して開放するように、構成する。体液と試薬とを結合させることにより、患者への投薬が適切であるか否かを視覚的に検出することができる。
これは理論的実験例である。本発明のシース流装置を、特定の目的に応じて化学物質ライブラリーのスクリーニングを行なう流体回路を備えるように構成する。たとえば、ファージディスプレイを用いることにより、標的タンパク質に対して、アプタマーライブラリーをスクリーニングするようにしてもよい。アプタマー/タンパク質複合体を分析して、結合しているアプタマー及びその結合特性を同定し、濃縮されたアプタマーを再びライブラリーのスクリーニングにかけるようにしてもよい。たとえば、タンパク質部分(moiety)上の特定のエピトープに対する結合親和性又は結合等、特定の特性を有するアプタマー部分(moiety)を選択する反復処理により、このようなスクリーニングを行なうようにしてもよい。この実施例のシース流装置は、所定のタンパク質のファージ・ディスプレイ集団を保持し、必要に応じて培養する貯蔵部と、スクリーニング対象となるアプタマーライブラリーの流入ポート又はアプタマーライブラリーをプレフィルしたチャンバと、を備える。あるいは、所望のタンパク質(又は他の選択用基質)が供給される、アプタマーライブラリーを保持する貯蔵部を備えるものでもよい。アプタマーライブラリーとタンパク質(又は他の基質)とを混合する貯蔵部に力を加えて、結合反応を促進するようにしてもよい。
これは理論的実験例である。本発明のシース流装置を、マイクロ流体回路を備えるように構成し、核酸選別に用いる。DNAのサンプル又はDNAを含有する細胞を、特定のDNA配列に結合する(さらに、必要に応じて、細胞を溶解して内部のDNAを露出させる)のに適した試薬を供給する貯蔵部及びチャネルと流体連結された装置内にセットする。たとえば、DNAプライマーを用いて、特定の対応DNA配列に結合させる。プライマーを(ゲノムや法医学サンプル等の)対象DNAを含有する貯蔵部に加える。洗浄流体をチャンバに加えて、結合していない部分(moiety)を洗浄除去する。プライマー/DNAを適用試薬にさらして、ポリメラーゼ連鎖反応を複数回実施する。張力を加える自動機器を用いて試薬を適切に混合する。
これは理論的実験例である。本発明のシース流装置を、環境モニタリング又は環境分析に適した材料と流体回路とを備えるように構成する。環境流体サンプルの処理は、(上述した)体液から得られた水性流体処理とかなりの部分が共通するが、(温度、太陽光、塩分や他の環境条件等、極端な条件に耐えさせられた)物質を対象とし、安定した電力が利用できないような現場使用に合うような変更が施されている。たとえば、飲料水のモニタリングを住宅所有者が希望する場合、ある期間にわたって飲料水を採取して、一度に分析する必要がある。あるいは、石油又はガスを含有する特定の地層に関係することが知られている種である、石油やガスの掘削用の指標微生物のモニタリングに本発明のシース流装置を用いることもできる。当業者であれば、このような条件下でのサンプル使用に耐えられる物質を選択することができるであろう。本発明のシース流装置を、さらに、シース流路内の流体の流れに十分な圧力を手動で(手工具や携帯工具)加えるような構成にしてもよい。環境モニタリングには、たとえば、飲料水や環境水(塩水源や淡水源)、土壌(土壌改善等)、PCB又はスーパーファンド用地浄化モニタリング、環境放射線モニタリング、(藻類やオキアミ等の)再生やその他の生態学的な目標、及び、居住環境モニタリング(飲料水やプールの水を含む水、空気及び土壌モニタリング又は分析)が含まれる。水銀、鉛、鉄等の重金属や(試掘用に)金や銀に選択的に結合するアプタマー(又は他の選択的結合分子)を含有するプレフィル型装置を用いるようにしてもよい。また、ヒ素、過度の薬剤環境汚染、MBEや他の有機溶剤等、環境有害物質をモニタリングすることも可能である。大陸棚域等の海洋域の酸性化を、(比色分析片等の)酸性化指標を用いて調べることもできる。
これは理論的実験例である。本発明のシース流装置を、生物製剤の生産において、生物学的過程のモニタリングに用いることができる。たとえば、様々な段階で別々のバイオリアクターからタンパク質を採取して、タンパク質生産のロット間変動をモニタリングするようにしてもよい。同様に、ワクチン生産のモニタリングも可能である。本発明のシース流装置を用いて、品質保証を目的として、さまざまな生物製剤や生物薬剤のモニタリングを行なうことができる。
これは理論的実験例である。本発明のシース流装置を、臨床検査室で通常実施される様々なポイントオブケア(POC)血液分析に適するように、構成する。本発明のシース流装置を、患者の血液を1つの貯蔵部に集めた後、張力をかけて、複数の貯蔵部に流して、分割する。個々の貯蔵部に分割された血液サンプルを、染色剤若しくは染料又は抗体等、臨床検査室での試験に用いられる部分(moiety)に各々さらす。あるいは、又は、これに加えて、分割した血液を、肝臓酵素、血糖、甲状腺、タンパク質Cやその他の血液部分(moiety)等、用途により適した別の試薬にさらすようにしてもよい。
上述の実施例1で説明した、シース流と磁気トラップとを用いる本発明の装置を、シース流を形成することはできないが、磁性粒子で標識した細胞を磁気捕捉する細胞分離用装置である(ドイツ、ベルギッシュ・グラッドバッハ、Miltenyi Biotec社から)市販のMACS(登録商標)細胞分離カラムと、対照比較した。
Claims (50)
- シース流装置であって、
(a)シース流平面領域の上流側に位置する第1の層流形成面と、
(b)前記シース流平面領域に平行であり、サンプルシース流平面領域の上流側に位置するサンプル層流形成面と、
(c)サンプル層流からシース流層流に標的種を偏向させるように構成される粒子移動ステーションと、を備え、
前記サンプル層流形成面により前記サンプル層流が形成され、前記シース流平面領域内に前記シース流層流が形成される
シース流装置。 - 請求項1に記載のシース流装置であって、
さらに、
(d)第2のシース流平面領域の上流側に位置する第2の層流形成面を備える
シース流装置。 - 請求項2に記載のシース流装置であって、
前記工程(a)、(b)及び(d)の前記層流形成面は、実質的に乱流を生じさせることのない個別のシース流平面を十分に維持可能である
シース流装置。 - 請求項3に記載のシース流装置であって、
前記工程(b)の前記サンプル層流形成面は、上面と底面とを備え、
前記工程(d)の前記第2の層流形成面は、前記サンプル層流形成に用いられる面と反対側の面上に位置する
シース流装置。 - 請求項4に記載のシース流装置であって、
前記粒子移動ステーションは、磁力、音響的な力、磁気泳動力及び光学的な力のうち少なくとも1つを用いる
シース流装置。 - 請求項5に記載のシース流装置であって、
磁気泳動粒子分離に適した
シース流装置。 - 請求項6に記載のシース流装置であって、
さらに、試薬を収容する少なくとも1つの貯留部を備える
シース流装置。 - 請求項6に記載のシース流装置であって、
前記標的種は幹細胞であり、
前記サンプル層流は全血を含む
シース流装置。 - 請求項6に記載のシース流装置であって、
マイクロ流体装置である
シース流装置。 - 請求項6に記載のシース流装置であって、
さらに、試薬を収容する貯留部を備え、
前記試薬が、バッファー(緩衝液)、多数の磁気ビーズ、幹細胞増殖剤、アプタマー、タンパク質を含有する組成物、バクテリア細胞培養物及びバクテリオファージ集団を含有する組成物のうち少なくとも1つを含有する
シース流装置。 - シース流装置において流体サンプルから標的種を分離する方法であって、
(a)前記シース流装置の平面に沿ってバッファー・シース層流を形成する工程と、
(b)前記バッファー・シース層流に隣接して流体サンプル層流を形成する工程と、
(c)前記流体サンプル層流から前記バッファー・シース層流内に前記標的種を偏向させる工程と、を備え、
前記バッファー・シース層流と前記流体サンプル層流とが隣接する方法。 - 請求項11に記載の方法であって、
さらに、前記流体サンプルの層流に隣接して、第2のバッファー・シース層流を形成する工程を備え、
前記工程(b)は、前記第1のバッファー・シース層流と前記第2のバッファー・シース層流との間に前記流体サンプル層流を形成することを備える
方法。 - 請求項12に記載の方法であって、
前記第1のバッファー・シース層流及び前記第2のバッファー・シース層流並びに前記流体サンプル層流を形成することにより、実質的に乱流を生じさせることのない個別の流れ平面を十分に維持可能である方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
前記流体サンプル層流から前記バッファー・シース層流内に前記標的種を偏向させる工程は、磁力、音響的な力、磁気泳動力及び光学的な力のうち少なくとも1つを用いることを備える 方法。 - 請求項14に記載の方法であって、
前記標的種は、細胞、バクテリア、ウィルス、タンパク質及び核酸のうち少なくとも1つを含む方法。 - 請求項15に記載の方法であって、
前記標的種は、前記バッファー・シース層流がその上を通過するトラップ・ステーション内に単離される方法。 - 請求項16に記載の方法であって、
前記トラップ・ステーションは、磁力を用いて、磁性粒子で選択的に標識された標的種を捕捉する方法。 - 請求項17に記載の方法であって、
前記標的種は循環腫瘍細胞であり、前記流体サンプルは全血である方法。 - 患者を分析する方法であって、
(a)患者から腫瘍細胞を含むサンプルを採取する工程と、
(b)分離法により前記腫瘍細胞を前記サンプルから分離する工程であって、
(i)前記腫瘍細胞に対する特異親和性を有する磁性粒子を用いて前記サンプルを標識して、標識サンプルを生成することと、
(ii)前記標識サンプルから前記磁性粒子を偏向させ、及び/又は、捕捉して、これにより、前記サンプルから前記腫瘍細胞を分離するのに有効な傾斜磁場を有する選別領域を備える流体装置に、前記標識サンプルを通すことと、を備え、バッファー溶液のシース内に前記サンプルを流すことによって、前記流体装置への前記サンプルの非特異的な結合を抑制する工程と、
(c)前記工程(b)で前記サンプルから分離された前記腫瘍細胞の特性評価を行なう工程と
を備える方法。 - 請求項19に記載の方法であって、
前記工程(c)の特性評価を行なうことは、状態を診断する、臨床試験のためのスクリーニングを行なう、治療法の有効性を評価する、及び、手術の有効性を査定するための情報を与えることである方法。 - 請求項19に記載の方法であって、
前記サンプルは、前記患者から採取した流体サンプルである方法。 - 請求項19に記載の方法であって、
前記サンプルは、前記患者の生検により採取されたものではない方法。 - 請求項19に記載の方法であって、
前記サンプルは血液サンプルである方法。 - 請求項23に記載の方法であって、
前記腫瘍細胞は、非血液癌由来の循環腫瘍細胞である方法。 - 請求項19に記載の方法であって、
前記特性評価を行なうことは、前記腫瘍細胞の計数である方法。 - 請求項19に記載の方法であって、
前記特性評価を行なうことは、前記腫瘍細胞の分子特性評価を行なうことである方法。 - 請求項26に記載の方法であって、
前記分子特性評価は、前記腫瘍細胞における遺伝子変異である方法。 - 患者の治療計画をモニタリングして、必要に応じて調整する方法であって、
(a)一次治療計画を実施中の患者から腫瘍細胞を含むサンプルを採取する工程と、
(b)分離法により前記腫瘍細胞を前記サンプルから分離する工程であって、
(i)前記腫瘍細胞に対する特異親和性を有する磁性粒子を用いて前記サンプルを標識して、標識サンプルを生成することと、
(ii)前記標識サンプルから前記磁性粒子を偏向させ、及び/又は、捕捉して、これにより、前記サンプルから前記腫瘍細胞を分離するのに有効な傾斜磁場を有する選別領域を備える流体装置に、前記標識サンプルを通すことと、を備え、バッファー溶液のシース内に前記サンプルを流すことによって、前記流体装置への前記サンプルの非特異的な結合を抑制する工程と、
(c)前記工程(b)で前記サンプルから分離された前記腫瘍細胞の特性評価を行なって、前記患者に対する今後の治療を提案する工程と
備える方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
前記一次治療計画は化学療法レジメンである方法。 - 請求項29に記載の方法であって、
前記今後の治療は異なる化学療法レジメンである方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
前記患者に対する今後の治療を提案する工程は、前記一次治療計画の今後の有効性を予測することを備える方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
前記患者に対する今後の治療を提案する工程は、前記患者に関して前にはわかっていなかった前記腫瘍細胞の特徴を考慮した、前記一次治療計画とは異なる二次治療計画を特定することを備える方法。 - 請求項32に記載の方法であって、
さらに、
(d)前記患者に前記二次治療計画を実施した後で、前記患者から腫瘍細胞を含むサンプルを採取する工程と、
(e)前記工程(d)で採取された前記サンプルと腫瘍細胞に対して前記工程(b)及び前記工程(c)を実施する工程と
を備える方法。 - 細胞由来生成物を提供する方法であって、
(a)標的細胞を含むサンプルを採取する工程と、
(b)分離法により前記標的細胞を前記サンプルから分離する工程であって、
(i)前記標的細胞に対する特異親和性を有する磁性粒子を用いて前記標的細胞を標識して、前記サンプル内に標識細胞集団を生成することと、
(ii)前記サンプルから前記標識細胞集団の少なくとも一部を偏向させ、及び/又は、捕捉して、これにより、前記サンプルから前記標的細胞を分離するのに有効な傾斜磁場を有する選別領域を備える流体装置に、前記サンプルを通すことと、を備え、バッファー溶液のシース内に前記サンプルを流すことによって、前記流体装置への前記サンプルの非特異的な結合を抑制する工程と、
(c)前記工程(b)で前記サンプルから分離した前記標的細胞から細胞由来生成物を得る工程と
を備える方法。 - 請求項34に記載の方法であって、
さらに、前記工程(b)で前記サンプルから分離した前記標的細胞を処理して、前記細胞由来生成物を生成する工程を備える方法。 - 請求項35に記載の方法であって、
前記標的細胞は幹細胞であり、
前記標的細胞を処理する工程は、前記幹細胞を処理して、有効な治療薬を得ることを備える
方法。 - 請求項36に記載の方法であって、
前記幹細胞を処理して、有効な治療薬を得ることは、前記標的細胞を分化させて、より特異的な細胞型を生成することを備える方法。 - 請求項34に記載の方法であって、
前記サンプルは、患者から採取した流体サンプルである方法。 - 請求項38に記載の方法であって、
前記流体サンプルは、血液サンプルである方法。 - 請求項34に記載の方法であって、
さらに、前記工程(b)で前記サンプルから分離した前記標的細胞の特性評価を行なう工程を備える方法。 - 請求項40に記載の方法であって、
前記特性評価を行なうことは、前記標的細胞の計数である方法。 - 請求項40に記載の方法であって、
前記特性評価を行なうことは、前記標的細胞の分子特性評価を行なうことである方法。 - 請求項42に記載の方法であって、
前記分子特性評価は、前記標的細胞の遺伝子配列である方法。 - 流体分離装置であって、
(a)前記流体分離装置内にサンプル流を形成するように構成される少なくとも1つのサンプル流入チャネルと、
(b)前記流体分離装置内に1つ以上の流体シースを形成して、前記装置の表面から前記サンプル流を離すことにより、前記装置に対する前記サンプルの成分の非特異的結合を抑制するように構成される少なくとも1つのシース流流入チャネルと、
(c)前記サンプル流入チャネルと前記シース流流入チャネルとに流体連結される選別ステーションであって、前記サンプル流の流路に沿って配置される選別ステーションと、
(d)外部磁場と相互に作用して、前記選別ステーション内の傾斜磁場を変化させることにより、前記サンプル流から磁性粒子を偏向させる、及び/又は、捕捉する傾斜磁場発生部と
を備える流体分離装置。 - 請求項44に記載の流体分離装置であって、
前記選別ステーションは、前記選別ステーションを通って流れる流体の境界を形成する実質的に長方形の内部空間を有し、
前記内部空間は、前記サンプル流の流れ方向と交わる第1及び第2の横方向寸法を有し、
前記第2の横方向寸法は、前記第1の横方向寸法の少なくとも約2倍以上であり、
前記少なくとも1つのシース流流入チャネルは、前記第1の横方向寸法に沿った前記サンプル流により互いに分離された2つのシース流を形成するように構成される
流体分離装置。 - 請求項44に記載の流体分離装置であって、
前記選別ステーションは、前記選別ステーションを通って流れる流体の境界を形成する実質的に長方形の内部空間を有し、
前記内部空間は、約2ミリメートル以下の距離だけ離れた、実質的に平行かつ実質的に平面状の2つの表面により、部分的に規定され、
前記少なくとも1つのシース流流入チャネルは、前記平行で平面状の2つの表面に接して流れると共に、前記サンプル流により互いに分離された2つのシース流を形成するように構成される
流体分離装置。 - 請求項46に記載の流体分離装置であって、
前記実質的に平行で実質的に平面状の2つの表面は、約1ミリメートル以下の距離だけ離れている流体分離装置。 - 請求項46に記載の流体分離装置であって、
前記少なくとも1つのシース流流入チャネルは、前記選別ステーションの上流側に位置し、前記内部空間の前記実質的に平面状の2つの表面に実質的に平行に配置される実質的に平面状の表面を有する第1のシース流流入チャネルを備える
流体分離装置。 - 請求項48に記載の流体分離装置であって、
さらに、前記選別ステーションの上流側に位置し、前記内部空間の前記実質的に平面状の2つの表面に実質的に平行に配置される実質的に平面状の表面を有する第2のシース流流入チャネルを備える
流体分離装置。 - 請求項49に記載の流体分離装置であって、
前記少なくとも1つのサンプル流入チャネルは、前記内部空間の前記実質的に平面状の2つの表面に実質的に平行に配置される実質的に平面状の表面を有する流体分離装置。
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