JP2020534142A - マイクロ流体システムにおける粒子選別 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
全てのマイクロ流体デバイスは、2Dコンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェア(AutoCAD 20,Autodesk)を用いて設計された。SU−8をコーティングする前に、4’’シリコンウエハを200℃で少なくとも5分間、ホットプレート上で乾燥させた。
液滴生産および再注入のために、488nm、561nmおよび638nmのレーザー(Omicron,Germany)および対応する帯域フィルター(PMT1:440/40,PMT2:525/40,PMT3:593/46,PMT4:708/75,PMT5:809/81,Semrock)を備える4つの光電子増倍管(PMT)(H10723,Hamamatsu)と接続されて改造されている、倒立落射蛍光顕微鏡(TiE,Nikon,France)で実験を行なった。PMTからのシグナルをFPGAカード(NI−USB7856R,National Instruments)へ送り込んで、プロプライエタリ・ソフトウェア・ルーチン(uDrop 3.5−3.9,HiFiBiO)を用いて液滴データを記録した。
CHO−S(Freestyle,ThermoFisher)細胞株を、標準的な細胞培養インキュベーター(37℃、5%CO2)中、125rpmにて環状シェイカー上で滅菌Erlenmayerフラスコ中で培養した。ペニシリン/ストレプトマイシン、0.5%プルロニックF−68(ThermoFisher)、およびL−グルタミンで補充されたCHO−S Freestyle培地中で細胞を培養した。
Erlenmayerフラスコ中で室温にて、マグネチックスターラーおよびスターラーバー(500RPM〜2000RPM)を用いた攪拌下で2%(w/w)メチル−セルロース(Sigma−Aldrich)をD.I.水中に溶解させた。
細胞を採取して、15um、10umフィルターを通して濾過した。フローサイトメーター(Guava EasyCyte,Millipore)によってカウントして、細胞濃度を10m〜80m細胞/mLに調整した。それから、マイクロ流体デバイスと適合するカスタムメイドのリザーバー内へ細胞を吸引した。連続相は、Novec HFE7500フッ素油中2%(w/w)008−フッ素系界面活性剤(RAN Biotechnologies)から構成された。水相をオンチップ(on−chip)で共に流した。流量(油について約1000〜6000μl/h、および、それぞれの水溶液について約100〜800μl/h)を、80〜400plの典型的に単分散の液滴を生産するように調整して、ローディングの効果を測定した。液滴形成中、ホームメイドのアクセサリを用いて細胞懸濁液を約5℃に冷却して、抗体分泌を遅らせて細胞の生存能力を保存した。レーザー/PMTシステムを用いて、または、毎秒10’000〜100’000フレームの速度で高速イメージングを用いて、データを回収した。レーザー/PMTシステムを測定に用いた場合は、データ処理および分析はuDropによって行われた。静的液滴アレイを用いて液滴をイメージングした場合は、エマルションを2Dチャンバーシステム中に直接注入し、または、氷上(細胞実験)または室温(無細胞実験)で0.1%(w/w)008−フッ素系界面活性剤を有するフッ素油を含む1.5mlエッペンドルフチューブ中に回収した。チューブ内に回収した場合は、カスタムメイドのPDMSバルブを用いて観察チャンバー内に導入する前に、0.1%(w/w)008−フッ素系界面活性剤を含むフッ素油を用いて1:1に液滴を希釈した。750μl/hの流量を用いてチャンバー内に液滴を再注入した。チャンバーを満たし終えた後に、チャンバーを穏やかに閉めて蛍光顕微鏡(Ti Eclipse,Nikon)上に載せた。
高速画像を専売ImageJおよびMatlabルーチンを用いて処理した。ImageJを用いて、目的領域の平均グレーレベルを経時的に抽出して、グレーレベル曲線を得た。Matlabでは、バックグラウンド(曲線全体の平均グレーレベル)の除去によってさらなる画像処理を行ない、シグナルの反転は細胞を表わすピークを有する曲線を生じさせた。
Claims (15)
- 第一のマイクロ流体チャネルシステムにおいて、粒子を整列させる、選別する、および/または、集める方法であって、
前記方法は、以下のステップ:
i.少なくとも第一および第二の入口および第一の出口を備える第一のマイクロ流体チャネルを提供するステップ、
ii.前記の第一の入口を通して前記チャネル内へ第一の流体を注入するステップ、
iii.前記の第二の入口を通して前記のチャネル内へ第二の流体を注入するステップ、
ここで、前記の第一の流体の粘性は、前記の第二の流体の粘性よりも高く、それにより、2つの流体は、混合されずに並んで層状に流れ、前記の2つの流体の一方は、整列される、選別される、および/または、集められるべき粒子を含む、
を含む、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記粒子は、好ましくは前記の第二の流体内に含まれ、前記の第一の流体の粘性は、前記の第二の流体内の前記粒子が、前記の第一の流体によって、前記の第二の流体により占領される空間に制限されるように選択される、
方法。 - 請求項1または2に記載の方法であって、
前記の第一のマイクロ流体チャネルの高さは、2μm〜60μm、5μm〜50μm、10μm〜45μm、15μm〜40μm、25μm〜35μmの群から選択される、
方法。 - 請求項1から4のいずれかに記載の方法であって、
前記の第二の入口に対する前記の第一の入口の角度は、180度以下である、
方法。 - 請求項1から5のいずれかに記載の方法であって、
第一のマイクロ流体チャネル、すなわち整列チャネルは、実質的に一直線であり、1mm〜40mm、2mm〜35mm、5mm〜25mm、8mm〜20mm、10mm〜20mm、〜12mm〜18mmの群から選択される長さを有する、
方法。 - 請求項1から6のいずれかの方法であって、
前記の第一および前記の第二の流体は水性の流体であって、前記の第一の流体の粘性は100cP〜2000cPであり、前記の第二の流体の粘性は0.001cP〜100cPである、または、前記の第一および前記の第二の流体は水性の流体であって、前記の第一および第二の流体の粘性は0.001cP〜100cPである、
方法。 - 請求項1から7のいずれかの方法であって、
前記の水性の第一の流体は、有機高分子、天然高分子、セルロース、グルコース、フルクトースまたは任意の他の糖、DNA、RNA、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)ジアクリレート、ビス−アクリルアミド、ポリアクリルアミド、ストレプトアビジン−アクリルアミド、ポリ−N−アクリルアミド、ポリN−イソプロピルポリアクリルアミド、アガロース、アルギン酸、またはそれらの混合物を含む群から選択される物質を含む、
方法。 - 請求項1から8のいずれかの方法であって、
前記の第一の出口は、エマルション出口であり、少なくとも1つの粒子は、前記の第一の出口を離れるときに液滴内に封入される、
方法。 - 請求項1から9のいずれかの方法であって、
前記マイクロ流体システムは、第三の入口を備える、
方法。 - 請求項1から10のいずれかの方法であって、
第三の流体が前記の第三の入口内に注入されて、3つの流体の粘性は、第一の流体が前記の第二の流体を前記の第三の流体から分離させて、全ての3つの流体が実質的に混合されずに少なくとも前記の整列チャネルの長さを層状に流れるように選択される、
方法。 - 請求項1から11のいずれかの方法であって、
粒子は、単一細胞または細胞凝集体、真核生物細胞、原核生物細胞、ビーズ、抗体またはそのフラグメント、抗原、およびヒドロゲルビーズを含む群から選択されてよい、
方法。 - 粒子を整列させる、選別する、および/または、集める方法であって、
請求項1から12のいずれかに記載の第一のマイクロ流体チャネルシステムは、請求項1から12のいずれかに記載のさらなるマイクロ流体チャネルシステムと組み合わされて、両方のシステムの出口は、1つの共通のチャネルにおいて接続される、
方法。 - マイクロ流体チャネルシステムであって、
i.少なくとも第一および第二の入口および第一の出口を備える第一のマイクロ流体チャネル、
ii.第一の流体、
iii.第二の流体、
を含み、
ここで、前記の第一の流体の粘性は、前記の第二の流体の粘性よりも高く、それにより、2つの流体は混合されずに並んで層状に流れることができ、前記の2つの流体の一方は、整列される、選別される、および/または、集められるべき粒子を含む、
システム。 - 請求項1から13のいずれかに記載の方法または請求項14に記載のシステムの使用であって、
1つの液滴内に異なる粒子を選別するための、
使用。 - 1つの接続点において集合している2以上のマイクロ流体チャネルを備えるシステムであって、
前記の2以上のチャネルの少なくとも2つは、平行に流れる2つの流体がローディングされて、その一方は、他方よりも高い粘性を有する、
システム。
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